Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kliniki leczenia niepłodności skorzystałyby z możliwości wyboru komórek jajowych kompetentnych rozwojowo i niekompetentnych za pomocą nieinwazyjnych procedur, poprawiając w ten sposób ogólny wynik ciąży. Niedawno opracowaliśmy metodę klasyfikacji opartą na mikroskopowych obserwacjach na żywo oocytów myszy podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego (GV) do etapu metafazy II, a następnie analizie ruchów cytoplazmatycznych występujących w tym okresie poklatkowym. Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły tej procedury. Oocyty izoluje się z w pełni rozwiniętych pęcherzyków antralnych i hoduje przez 15 godzin w mikroskopie wyposażonym do analizy poklatkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zdjęcia wykonywane są w odstępach 8-minutowych. Obrazy są analizowane przy użyciu metody prędkości obrazu cząstek (PIV), która oblicza dla każdego oocytu profil prędkości ruchu cytoplazmatycznego (CMV) występujących w całym okresie hodowli. Wreszcie, CMV każdego pojedynczego oocytu są karmione przez narzędzie klasyfikacji matematycznej (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), które przewiduje prawdopodobieństwo, że gameta będzie kompetentna lub niekompetentna rozwojowo z dokładnością 91,03%. Protokół ten, opracowany dla myszy, może być teraz testowany na oocytach innych gatunków, w tym ludzi.
Wprowadzenie
Niepłodność kobieca to patologia, która dotyka coraz większą liczbę kobiet. Według Światowej Organizacji Zdrowia około 20% par jest bezpłodnych, z czego 40% z powodu niepłodności kobiet. Ponadto u jednej trzeciej kobiet poddawanych leczeniu onkologicznemu (odpowiednio 300 000 rocznie i 30 000 rocznie w USA lub we Włoszech) rozwija się przedwczesna niewydolność jajników.
Strategia zapobiegania niepłodności u pacjentów z rakiem polega na izolacji i kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przed leczeniem onkologicznym, a następnie dojrzewaniu in vitro (IVM) oocytów GV do stadium MII (przejście GV-to-MII). Dostępność nieinwazyjnych mar....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania oraz Etyki na Uniwersytecie w Pawii. Zwierzęta utrzymywano w warunkach 22 °C, wilgotności powietrza 60% i cyklu światło/ciemność trwającego 12:12 godziny.
1.Izolacja jajników
- Wstrzyknąć dootrzewnowo 2 samicom myszy CD1 w wieku od czterech do jedenastu tygodni z 10 j. hormonu folikulotropowego za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml.
- Czekaj 46-48 godzin.
- Zważyć mysz i znieczulić ją wstrzyknięciem domięśniowym 50 mg/kg leku Zoletil (kloridian Tiletamina i Zo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny oocyt rozwojowo kompetentny i niekompetentny, odpowiednio na początku (GV) i na końcu (MII) procedury IVM. IVM w pełni wyrośniętych oocytów mysich odbywa się podczas 15 h hodowli. Obserwacja Time-Lapse rejestruje przebieg mejozy i wykrywa główne zdarzenia mejotyczne, w tym GVBD oraz ekstruzję pierwszego ciałka polarnego.
Analiza i porównanie ponad dwustu oocytów.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka krytycznych kroków, o które należy zadbać podczas wykonywania tego protokołu z oocytami myszy, a także z oocytami innych gatunków. Po wyizolowaniu z pęcherzyków jajniki powinny zostać natychmiast przeniesione do kropli rejestrujących, ponieważ oddzielenie się od towarzyszących komórek wzgórka uruchamia początek przejścia GV do MII. Możliwą modyfikacją obecnego protokołu może być dodanie 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) do pożywki M2 używanej do izolacji COC. IBMX zapobiega natychmiastowemu wyzwoleniu pr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była możliwa dzięki wsparciu przez: Uniwersytet w Pawii FRG 2016; Uniwersytet w Parmie FIL 2014, 2016; i Kinesis w celu dostarczenia wyrobów z tworzyw sztucznych niezbędnych do przeprowadzenia tego badania. Dziękujemy dr Shane'owi Windsorowi (Wydział Inżynierii, Uniwersytet w Bristolu, Wielka Brytania) za dostarczenie Cell_PIV oprogramowania.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Folligon | Intervet | A201A02 | Leczenie hormonalne |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Do barwienia heterochromatyny oocytów |
| Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | Do izolacji COC |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Płyn, z czerwienią fenolową | Merck-Millipore | MR-015-D | Do izolacji COC |
| MEM Alpha Medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | Do dojrzewania oocytów in vitro |
| Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm szklane dno | WillCo | GWSt-3522 | Do eksperymentów obrazowych |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | |
| Pipeta Pasteura | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | Do manipulacji mieszkami |
| włosowymi Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M8410 | Aby zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu pożywki |
| Penicylina / Streptomycyna | Life Technologies | 15070063 | Aby zapobiec zanieczyszczeniu podłoża |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | Do makijażu &alfa; Nośnik MEM |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030 | Do makijażu α Nośnik MEM |
| Tauryna | Sigma-Aldrich | T0625 | Do makijażu &alfa; Nośnik MEM |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | Do makijażu &alfa; Pożywki MEM |
| Pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | P4562 | Do makijażu i alfa; MEM media |
| Zoletil (kloridian Tiletamina i Zolazepan) | Virbac Srl | QN01AX9 | Do znieczulenia myszy |
| Cell_PIV sofware | Dzięki uprzejmości dr Shane'a Windsora, University of Bristol, Wielka Brytania | - | - |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | - | Do wieloparadygmatowych obliczeń numerycznych |
Bibliografia
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a syst....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
