Method Article

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kliniki leczenia niepłodności skorzystałyby z możliwości wyboru komórek jajowych kompetentnych rozwojowo i niekompetentnych za pomocą nieinwazyjnych procedur, poprawiając w ten sposób ogólny wynik ciąży. Niedawno opracowaliśmy metodę klasyfikacji opartą na mikroskopowych obserwacjach na żywo oocytów myszy podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego (GV) do etapu metafazy II, a następnie analizie ruchów cytoplazmatycznych występujących w tym okresie poklatkowym. Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły tej procedury. Oocyty izoluje się z w pełni rozwiniętych pęcherzyków antralnych i hoduje przez 15 godzin w mikroskopie wyposażonym do analizy poklatkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zdjęcia wykonywane są w odstępach 8-minutowych. Obrazy są analizowane przy użyciu metody prędkości obrazu cząstek (PIV), która oblicza dla każdego oocytu profil prędkości ruchu cytoplazmatycznego (CMV) występujących w całym okresie hodowli. Wreszcie, CMV każdego pojedynczego oocytu są karmione przez narzędzie klasyfikacji matematycznej (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), które przewiduje prawdopodobieństwo, że gameta będzie kompetentna lub niekompetentna rozwojowo z dokładnością 91,03%. Protokół ten, opracowany dla myszy, może być teraz testowany na oocytach innych gatunków, w tym ludzi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niepłodność kobieca to patologia, która dotyka coraz większą liczbę kobiet. Według Światowej Organizacji Zdrowia około 20% par jest bezpłodnych, z czego 40% z powodu niepłodności kobiet. Ponadto u jednej trzeciej kobiet poddawanych leczeniu onkologicznemu (odpowiednio 300 000 rocznie i 30 000 rocznie w USA lub we Włoszech) rozwija się przedwczesna niewydolność jajników.

Strategia zapobiegania niepłodności u pacjentów z rakiem polega na izolacji i kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przed leczeniem onkologicznym, a następnie dojrzewaniu in vitro (IVM) oocytów GV do stadium MII (przejście GV-to-MII). Dostępność nieinwazyjnych markerów kompetencji rozwojowej oocytów poprawiłaby procesy zapłodnienia i rozwoju oraz ogólny sukces ciąży1,2.

Na podstawie konfiguracji chromatyny zaobserwowanej po barwieniu supravital fluorochromem Hoechst 33342, w pełni rozwinięte oocyty ssaków są klasyfikowane jako Otoczone Jąderko (SN) lub Nieotoczone Jąderko (NSN)3. Oprócz odmiennej organizacji chromatyny, te dwa typy oocytów wykazują wiele różnic morfologicznych i funkcjonalnych3,4,5,6,7,8,9, w tym ich kompetencje mejotyczne i rozwojowe. Po wyizolowaniu z jajnika i osiągnięciu dojrzałości in vitro, oba typy oocytów osiągają stadium MII, a po inseminacji plemników rozwijają się do stadium 2-komórkowego, ale tylko te z organizacją chromatyny SN mogą rozwinąć się do term9. Chociaż jest dobra jako metoda klasyfikacji do wyboru kompetentnych i niekompetentnych oocytów, główną wadą jest mutagenny efekt, jaki sam fluorochrom, a przede wszystkim światło UV używane do jego wykrywania może mieć na komórki.

Z tych wszystkich powodów szukaliśmy innych nieinwazyjnych markerów związanych z konformacją chromatyny SN lub NSN, które mogłyby zastąpić użycie Hoechst, zachowując przy tym tę samą wysoką dokładność klasyfikacji. Obserwacja poklatkowa prędkości ruchu cytoplazmatycznego (CMV) staje się cechą charakterystyczną dla stanu komórki. Na przykład ostatnie badania wykazały związek między CMV zarejestrowanymi w momencie zapłodnienia a zdolnością mysich i ludzkich zygot do ukończenia preimplantacji i pełnego rozwoju10,11.

Na podstawie tych wcześniejszych badań, opisujemy tutaj platformę do rozpoznawania w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo5,6,7,8. Platforma opiera się na trzech głównych etapach: 1) Oocyty wyizolowane z pęcherzyków antralnych są najpierw klasyfikowane na podstawie ich konfiguracji chromatyny jako jąderko otoczone (SN) lub jąderko nieotoczone (NSN); 2) Zdjęcia poklatkowe CMV występujące podczas przejścia GV do MII każdego pojedynczego oocytu są wykonywane i analizowane za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV); oraz 3) dane uzyskane za pomocą PIV są analizowane za pomocą sztucznej sieci neuronowej (FANN) do ślepej klasyfikacji12,13. Podajemy szczegółowe informacje na temat najbardziej krytycznych etapów procedury zaprojektowanej dla myszy, aby była gotowa do przetestowania i użycia u innych gatunków ssaków (np. bydła, małp i ludzi).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania oraz Etyki na Uniwersytecie w Pawii. Zwierzęta utrzymywano w warunkach 22 °C, wilgotności powietrza 60% i cyklu światło/ciemność trwającego 12:12 godziny.

1.Izolacja jajników

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 2 samicom myszy CD1 w wieku od czterech do jedenastu tygodni z 10 j. hormonu folikulotropowego za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml.
  2. Czekaj 46-48 godzin.
  3. Zważyć mysz i znieczulić ją wstrzyknięciem domięśniowym 50 mg/kg leku Zoletil (kloridian Tiletamina i Zolazepan). Eutanazja przez zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Chwyć skórę pokrywającą ścianę brzucha za pomocą kleszczy preparacyjnych. Przetnij skórę i ścianę ciała nożyczkami i rozciągnij nacięcie kleszczami.
  5. Za pomocą pęsety odsuń wnętrzności na bok, wskaż rogi macicy i zlokalizuj jajniki na ich końcu.
  6. Delikatnie przytrzymaj jajnik za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i nożyczkami przetnij jego więzadło do macicy. Powtórz z drugim jajnikiem.
  7. Przenieść pobrane jajniki na 35-milimetrową płytkę Petriego z hodowlą komórkową zawierającą 1 ml pożywki izolacyjnej M2 podgrzanej w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w powietrzu.
  8. Usuń tłuszcz i jajowód za pomocą cienkich nożyczek pod mikroskopem stereoskopowym.

2. Izolacja kompleksów oocytów cumulusa

  1. Nakłuj powierzchnię jajnika za pomocą sterylnej pęsety i sterylnej igły insulinowej 1G, aż do biernego uwolnienia kompleksów oocytów antralnych wzgórków jajowych (COC).
  2. Zebrać COC z więcej niż trzema warstwami komórek wzgórka za pomocą sterowanej ustami, ręcznie ciągniętej mikropipety Pasteura (o średnicy 200 μm) i przenieść je do 300 μl kropli świeżej pożywki M2.
  3. Usunąć wzgórki otaczające oocyty za pomocą ręcznie wyciągniętej mikropipety Pasteura (o średnicy 80 μm), delikatnie pipetując przez kilka sekund,
  4. Wielokrotnie przenoś oocyty z 20 μl kropli pożywki M2 do innej, aż komórki wzgórka zostaną całkowicie wyeliminowane.

3. Klasyfikacja oocytów na podstawie organizacji chromatyny

  1. Przygotować roztwór barwiący Hoechst 33342 o końcowym stężeniu 0,05 μg/ml w pożywce M2, zaczynając od roztworu macierzystego o stężeniu 5 mg/ml rozcieńczonego w 1x PBS.
  2. Umieść 3,5 μl mikrokropelek roztworu barwiącego Hoechst na dnie pokrywki szalki Petriego o średnicy 35 mm.
  3. Przenieś każdy pojedynczy oocyt do kropli barwiącej Hoechst, umieść naczynie na wstępnie podgrzanej (37 °C) płycie grzewczej i przykryj ją ciemną pokrywką, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  4. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej obserwuj oocyty pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 10-krotnym powiększeniu w świetle UV (330-385 nm), nie dłużej niż 1-2 s.
  5. Klasyfikuj oocyty jako otoczone jąderko (SN) (Figura 1A), jeśli prezentują pierścień chromatyny Hoechst-dodatniej otaczający jąderko.
  6. Klasyfikuj oocyty jako jąderko nieotoczone (NSN), jeśli ich jąderko nie jest otoczone chromatyną Hoechst-dodatnią i wykazuje rozproszone plamki heterochromatyczne w jądrze (Figura 1B).

4. Klasyfikacja oocytów na podstawie sieci neuronowych

  1. Przygotuj cztery kropelki pożywki α-MEM o pojemności 2 μl uzupełnione 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 5 mM tauryny, 100 μg/ml penicyliny, 75 μg/ml streptomycyny i 23,5 μg/μl pirogronianu sodu na płytce Petriego o średnicy 35 mm i przykryj je wstępnie podgrzanym (37 °C) i wstępnie zrównoważonym olejem mineralnym, aby uniknąć parowania pożywki.
    UWAGA: Jeśli korzystasz z systemu przesiewania komórek na żywo, utrzymuj krople w określonej odległości, używając narysowanej siatki o wymiarach 7 mm x 7 mm jako wskazówki.
  2. Przenieś 3-4 oocyty do każdej kropli.
  3. Umieść szalkę Petriego ze szklanym dnem w systemie przesiewowym komórek na żywo, wyposażonym w oprogramowanie do nagrywania poklatkowego (patrz tabela materiałów), które umożliwia obserwację dojrzewania oocytów w środowisku o stabilnej temperaturze (37 °C) i stężeniu CO2 (5%).
  4. Otwórz oprogramowanie do nagrywania poklatkowego. Na ekranie pojawia się okno z ujęciem na żywo oocytu po lewej stronie i wszystkimi przyciskami ustawień po prawej stronie.
  5. Wybierz środek oocytu, aby ustawić go na środku ekranu. W razie potrzeby wyreguluj ostrość.
  6. Wybierz przycisk Ph i ustaw lampę DIA na 192, czas ekspozycji na 1/125 s, wzmocnienie na 1,99, a rozdzielczość na 1600 x 1200.
  7. Wybierz FL2 i ustaw lampę DIA na 5, czas ekspozycji na 3 s, wzmocnienie na 2,37, a rozdzielczość na 1600 x 1200.
  8. Wybierz przycisk Nowy punkt, aby zarejestrować pozycję oocytu w kropli hodowli. Powtórz tę samą procedurę dla każdego oocytu w kropli hodowlanej.
  9. Wybierz Czas i ustaw Cykl akwizycji na 8 minut, a Całkowity czas na 15 godzin.
  10. Wybierz opcję Rozpocznij film poklatkowy, aby rozpocząć cykl nagrywania.
  11. Otwórz oprogramowanie MATLAB i napisz >>cell_piv; a następnie wybierz narzędzie PIV Tool.
  12. Wybierz folder zawierający nagrany film i wybierz dowolny z .jpeg plików, aby załadować całą sekwencję obrazów. Dla każdej komórki jajowej wybierz obszar zainteresowania (ROI), klikając narzędzie Wybierz obszar.
  13. Wybierz opcję Process PIV (Przetwarzaj PIV) w menu File (Plik). Wybierz przycisk narzędzia przeglądarki.
    UWAGA: Program obliczy wektory prędkości w ROI i automatycznie utworzy plik danych, zapisany jako plik .mat.
  14. Wybierz plik .mat do otwarcia. Wybierz przycisk Wybierz narzędzie ROI i narysuj okrąg wokół konturu oocytu. Kliknij Zapisz w menu Plik.
    UWAGA: Wektory w tym regionie są teraz wyświetlane, a dane średniej wielkości w oknie wykresu są aktualizowane dla tego nowego zwrotu z inwestycji.
  15. Otwórz zebrane dane dotyczące średniej wielkości wszystkich klatek poklatkowych zarejestrowanych w arkuszu kalkulacyjnym, z sekwencją klatek w wierszach, a w kolumnach każdą analizowaną pojedynczą oocytą.
  16. Uporządkuj dane oocytów NSN i SN w 10 podgrupach.
  17. Użyj 9 podgrup, aby iteracyjnie trenować sztuczną sieć neuronową typu feed-forward (FANN) i 1 podgrupy do testowania ślepego.
    1. Powtórz kolejne 9 razy, zmieniając ślepą próbkę testową (10-krotna walidacja krzyżowa).
  18. Otwórz MATLAB, uruchom niestandardowy skrypt główny i na żądanie wstaw nazwę pliku z danymi treningowymi (train.txt), liczbą oocytów NSN i SN używanych do treningu oraz interwałem poklatkowym do analizy (zazwyczaj od klatki # 1-2 do klatki # 112-113).
  19. Naciśnij Enter, aby przeprowadzić szkolenie.
  20. Wstaw nazwę pliku z danymi testowymi (test.txt).
  21. Otwórz test_outputs_cyt wektorowe w programie MATLAB workspace.
    UWAGA: Na ekranie pojawi się okno pokazujące, w pierwszym wierszu, prawdopodobieństwo uzyskania wyników prawdziwie dodatnich (TP lub True NSN) i fałszywie dodatnich (FP lub False NSN) odpowiednio dla oocytów NSN i SN; zamiast tego w drugim wierszu prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie ujemnych (FN lub fałszywy SN) i prawdziwie ujemnych (TN lub True SN) odpowiednio dla oocytów NSN i SN.
  22. Użyj wzoru: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), aby obliczyć dokładność FANN, wyrażoną w procentach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywny rozwojowo kompetentny i niekompetentny oocyt, odpowiednio na początku (GV) i na końcu (MII) procedury IVM. IVM w pełni rozwiniętych oocytów myszy występuje podczas 15 godzinnej hodowli. Obserwacja poklatkowa rejestruje postęp mejozy i wykrywa główne zdarzenia mejotyczne, w tym GVBD i wytłoczenie pierwszego ciała polarnego.

Analiza i porównanie ponad dwustu rozwojow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka krytycznych kroków, o które należy zadbać podczas wykonywania tego protokołu z oocytami myszy, a także z oocytami innych gatunków. Po wyizolowaniu z pęcherzyków jajniki powinny zostać natychmiast przeniesione do kropli rejestrujących, ponieważ oddzielenie się od towarzyszących komórek wzgórka uruchamia początek przejścia GV do MII. Możliwą modyfikacją obecnego protokołu może być dodanie 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) do pożywki M2 używanej do izolacji COC. IBMX zapobiega natychmiastowemu wyzwoleniu pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była możliwa dzięki wsparciu przez: Uniwersytet w Pawii FRG 2016; Uniwersytet w Parmie FIL 2014, 2016; i Kinesis w celu dostarczenia wyrobów z tworzyw sztucznych niezbędnych do przeprowadzenia tego badania. Dziękujemy dr Shane'owi Windsorowi (Wydział Inżynierii, Uniwersytet w Bristolu, Wielka Brytania) za dostarczenie Cell_PIV oprogramowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02Leczenie hormonalne
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261Do barwienia heterochromatyny oocytów
Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm x 10 mm Corning 430165Do izolacji COC
EmbryoMax M2 Medium (1X), Płyn, z czerwienią fenolowąMerck-MilliporeMR-015-DDo izolacji COC
MEM Alpha Medium (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526Do dojrzewania oocytów in vitro
Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm szklane dno WillCo GWSt-3522Do eksperymentów obrazowych
BioStation IM-LM NikonMFA91001 
Pipeta PasteuraDelchimica Scientific Glassware6709230Do manipulacji mieszkami
włosowymi Olej mineralnySigma-AldrichM8410Aby zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu pożywki
Penicylina / StreptomycynaLife Technologies15070063Aby zapobiec zanieczyszczeniu podłoża 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichML16141079Do makijażu &alfa; Nośnik MEM 
L-glutamina Life Technologies25030Do makijażu α Nośnik MEM 
TaurynaSigma-AldrichT0625Do makijażu &alfa; Nośnik MEM 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3310Do makijażu &alfa; Pożywki MEM
Pirogronian sodu Sigma-Aldrich  P4562Do makijażu i alfa; MEM media
Zoletil (kloridian Tiletamina i Zolazepan)Virbac SrlQN01AX9Do znieczulenia myszy
Cell_PIV sofware Dzięki uprzejmości dr Shane'a Windsora, University of Bristol, Wielka Brytania                             -                             -
MATLABMathWorks, Natick, MA                              -Do wieloparadygmatowych obliczeń numerycznych
System badań przesiewowych komórek na żywo firmy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380(2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417(2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles