Method Article

Oparta na sieci neuronowej identyfikacja w pełni rozwiniętych oocytów myszy kompetentnych lub niekompetentnych rozwojowo

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do nieinwazyjnej oceny kompetencji rozwojowych oocytów przeprowadzanej podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego do etapu metafazy II. Metoda ta łączy obrazowanie poklatkowe z prędkością obrazu cząstek (PIV) i analizami sieci neuronowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kliniki leczenia niepłodności skorzystałyby z możliwości wyboru komórek jajowych kompetentnych rozwojowo i niekompetentnych za pomocą nieinwazyjnych procedur, poprawiając w ten sposób ogólny wynik ciąży. Niedawno opracowaliśmy metodę klasyfikacji opartą na mikroskopowych obserwacjach na żywo oocytów myszy podczas ich dojrzewania in vitro od pęcherzyka rozrodczego (GV) do etapu metafazy II, a następnie analizie ruchów cytoplazmatycznych występujących w tym okresie poklatkowym. Poniżej przedstawiamy szczegółowe protokoły tej procedury. Oocyty izoluje się z w pełni rozwiniętych pęcherzyków antralnych i hoduje przez 15 godzin w mikroskopie wyposażonym do analizy poklatkowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zdjęcia wykonywane są w odstępach 8-minutowych. Obrazy są analizowane przy użyciu metody prędkości obrazu cząstek (PIV), która oblicza dla każdego oocytu profil prędkości ruchu cytoplazmatycznego (CMV) występujących w całym okresie hodowli. Wreszcie, CMV każdego pojedynczego oocytu są karmione przez narzędzie klasyfikacji matematycznej (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), które przewiduje prawdopodobieństwo, że gameta będzie kompetentna lub niekompetentna rozwojowo z dokładnością 91,03%. Protokół ten, opracowany dla myszy, może być teraz testowany na oocytach innych gatunków, w tym ludzi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niepłodność kobieca to patologia, która dotyka coraz większą liczbę kobiet. Według Światowej Organizacji Zdrowia około 20% par jest bezpłodnych, z czego 40% z powodu niepłodności kobiet. Ponadto u jednej trzeciej kobiet poddawanych leczeniu onkologicznemu (odpowiednio 300 000 rocznie i 30 000 rocznie w USA lub we Włoszech) rozwija się przedwczesna niewydolność jajników.

Strategia zapobiegania niepłodności u pacjentów z rakiem polega na izolacji i kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przed leczeniem onkologicznym, a następnie dojrzewaniu in vitro (IVM) oocytów GV do stadium MII (przejście GV-to-MII). Dostępność nieinwazyjnych mar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania oraz Etyki na Uniwersytecie w Pawii. Zwierzęta utrzymywano w warunkach 22 °C, wilgotności powietrza 60% i cyklu światło/ciemność trwającego 12:12 godziny.

1.Izolacja jajników

  1. Wstrzyknąć dootrzewnowo 2 samicom myszy CD1 w wieku od czterech do jedenastu tygodni z 10 j. hormonu folikulotropowego za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml.
  2. Czekaj 46-48 godzin.
  3. Zważyć mysz i znieczulić ją wstrzyknięciem domięśniowym 50 mg/kg leku Zoletil (kloridian Tiletamina i Zo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywny rozwojowo kompetentny i niekompetentny oocyt, odpowiednio na początku (GV) i na końcu (MII) procedury IVM. IVM w pełni rozwiniętych oocytów myszy występuje podczas 15 godzinnej hodowli. Obserwacja poklatkowa rejestruje postęp mejozy i wykrywa główne zdarzenia mejotyczne, w tym GVBD i wytłoczenie pierwszego ciała polarnego.

Analiza i porównanie ponad dwustu rozwojow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka krytycznych kroków, o które należy zadbać podczas wykonywania tego protokołu z oocytami myszy, a także z oocytami innych gatunków. Po wyizolowaniu z pęcherzyków jajniki powinny zostać natychmiast przeniesione do kropli rejestrujących, ponieważ oddzielenie się od towarzyszących komórek wzgórka uruchamia początek przejścia GV do MII. Możliwą modyfikacją obecnego protokołu może być dodanie 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) do pożywki M2 używanej do izolacji COC. IBMX zapobiega natychmiastowemu wyzwoleniu pr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była możliwa dzięki wsparciu przez: Uniwersytet w Pawii FRG 2016; Uniwersytet w Parmie FIL 2014, 2016; i Kinesis w celu dostarczenia wyrobów z tworzyw sztucznych niezbędnych do przeprowadzenia tego badania. Dziękujemy dr Shane'owi Windsorowi (Wydział Inżynierii, Uniwersytet w Bristolu, Wielka Brytania) za dostarczenie Cell_PIV oprogramowania.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FolligonIntervetA201A02Leczenie hormonalne
Hoechst 33342 Sigma-AldrichB2261Do barwienia heterochromatyny oocytów
Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm x 10 mm Corning 430165Do izolacji COC
EmbryoMax M2 Medium (1X), Płyn, z czerwienią fenolowąMerck-MilliporeMR-015-DDo izolacji COC
MEM Alpha Medium (1X) + Glutamax Sigma-AldrichM4526Do dojrzewania oocytów in vitro
Hodowla komórkowa szalka Petriego 35 mm szklane dno WillCo GWSt-3522Do eksperymentów obrazowych
BioStation IM-LM NikonMFA91001 
Pipeta PasteuraDelchimica Scientific Glassware6709230Do manipulacji mieszkami
włosowymi Olej mineralnySigma-AldrichM8410Aby zapobiec zanieczyszczeniu i parowaniu pożywki
Penicylina / StreptomycynaLife Technologies15070063Aby zapobiec zanieczyszczeniu podłoża 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichML16141079Do makijażu &alfa; Nośnik MEM 
L-glutamina Life Technologies25030Do makijażu α Nośnik MEM 
TaurynaSigma-AldrichT0625Do makijażu &alfa; Nośnik MEM 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3310Do makijażu &alfa; Pożywki MEM
Pirogronian sodu Sigma-Aldrich  P4562Do makijażu i alfa; MEM media
Zoletil (kloridian Tiletamina i Zolazepan)Virbac SrlQN01AX9Do znieczulenia myszy
Cell_PIV sofware Dzięki uprzejmości dr Shane'a Windsora, University of Bristol, Wielka Brytania                             -                             -
MATLABMathWorks, Natick, MA                              -Do wieloparadygmatowych obliczeń numerycznych
System badań przesiewowych komórek na żywo firmy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a syst....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles