Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56670

⸱

18 listopada 2017

 , 
1School of Molecular Biosciences, Center for Reproductive Biology, College of Veterinary Medicine, Washington State University

W tym artykule

Podsumowanie

Upłynnienie nasienia jest niezbędne do uwolnienia nasienia z żelu nasiennego. W badaniu przedstawiono procedury pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego po stosunku płciowym oraz pomiaru czasu upłynnienia nasienia.

Streszczenie

U myszy wytrysk nasienia deponuje się w macicy. Po wytrysku nasienie zmienia konsystencję z żelowej na wodnistą, w procesie zwanym upłynnieniem. W tym badaniu pokazujemy, jak pobrać nasienie po wytrysku z żeńskiego układu rozrodczego w modelu mysim. Po pierwsze, dorosłe samice myszy w stadium rui były trzymane na noc w klatce samca. Następnego ranka kopulacja została potwierdzona przez obecność czopa kopulacyjnego przy wejściu do pochwy. Samice myszy z czopami kopulacyjnymi poddano eutanazji, a każdy układ rozrodczy pobrano jako całość (pochwę, macicę, jajowody, jajniki), zapewniając zamknięty system zatrzymujący nasienie. Układ rozrodczy umieszczono w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a pochwę odcięto, aby uwolnić nasienie do probówki. Aby zapewnić maksymalną objętość nasienia do analizy, użyto bezzębnych kleszczy do ściskania rogów macicy od końca jajnika do końca pochwy, usuwając pozostałe nasienie. Cały układ rozrodczy został wtedy wyrzucony. Rurka zawierająca nasienie została na krótko odwirowana. Pipetę kapilarną o pojemności 25 μl umieszczono w probówce pod kątem 180° (równolegle do ścianki probówki). Zarejestrowano czas potrzebny na napełnienie rurki kapilarnej do linii o pojemności 25 μl. Nasienie od sprawdzonego hodowcy płci męskiej zwykle potrzebuje około 60-180 s, aby wypełnić rurkę kapilarną o pojemności 25 μl. Ta technika pobierania nasienia może być również wykorzystywana w innych dalszych zastosowaniach, takich jak obrazowanie plemników i analiza ruchliwości.

Wprowadzenie

Żeński układ rozrodczy składa się z górnego i dolnego odcinka. Górny układ rozrodczy obejmuje jajowody, macicę i szyjkę macicy. Dolny układ rozrodczy obejmuje szyjkę macicy i pochwę. U ludzi wytrysk nasienia odkłada się na przedniej ścianie pochwy, w sąsiedztwie ectocervivix1. Jednak u myszy nasienie jest zamiatane do macicy w ciągu kilku minut po kryciu2.

Nasienie zawiera żel nasienny, który krzepnie w ciągu kilku sekund od wytrysku, powodując uwięzienie i unieruchomienie plemników3. Upłynnienie uwalnia unieruchomione plemniki poprzez zmianę konsystencji z żelowej na wodnistą. Proces ten ma zasadnicze znaczenie dla ruchliwości plemników i reprodukcji ssaków. Wiedza na temat upłynniania nasienia opiera się głównie na badaniach in vitro, w których nasienie ulega upłynnieniu w naczyniu hodowlanym. U ludzi aktywność enzymatyczna antygenu swoistego dla prostaty lub PSA (znanego również jako peptydaza 3 związana z kalikreiną lub KLK3) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do upłynnienia poprzez hydrolizę semenogelin (białek tworzących żel obecnych w nasieniu)4,5,6. Degradacja semenogelin uwalnia plemniki z krzepu nasiennego, zwiększając ruchliwość plemników. Uwolnione plemniki płyną w kierunku jajowodu, aby zapłodnić komórkę jajową. Testy upłynniania (lub lepkości nasienia) są jednym ze standardowych wstępnych badań przesiewowych do analizy nasienia w klinikach leczenia niepłodności w celu oceny męskiej płodności7.

Niedawno opublikowany artykuł pokazuje, że analiza płynu nasiennego pobranego z układu rozrodczego samicy myszy po kryciu może być wykorzystana do zilustrowania niedoboru upłynnienia, który może następnie powodować zaburzenia płodności8. Wadliwe upłynnienie, takie jak nadmierna lepkość nasienia, przyczynia się do 11,8-32,3% przypadków niepłodności u mężczyzn9, co sugeruje, że normalne upłynnienie jest niezbędne do reprodukcji ssaków. Jednak badania i leczenie wad upłynniania koncentrowały się wyłącznie na male7. Możliwość, że żeński układ rozrodczy odgrywa rolę w upłynnianiu nasienia, nie została zbadana. W związku z tym metody pobierania nasienia i pomiaru czasu skraplania dostarczą naukowcom nowatorskiego narzędzia diagnostycznego do określenia, czy upłynnienie może być jedną z przyczyn niepłodności w organizmie modelowym, który jest przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta i procedury użyte w tym badaniu były traktowane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Waszyngton (WSU) oraz zgodnie z zatwierdzonymi przez WSU protokołami dla zwierząt #4702 i #4735.

1. Myszy

  1. Użyj standardowych dorosłych myszy płci męskiej C57BL/6J lub innych interesujących szczepów. Utrzymuj zwierzęta w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności, z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.
    1. Używaj samców w wieku od 8 tygodni do 10 miesięcy. W eksperymentach używaj tylko sprawdzonych hodowców.
  2. Należy użyć dorosłych samic myszy z tkankową selektywną delecją α receptora estrogenowego układu rozrodczego (kodowanego przez gen Esr1) w komórkach nabłonkowych10 (Wnt7aCre/+;Esr1f/f, zwany nokautem lub "KO") i kontrolny rodzeństwo z miotu (Esr1f/f, zwany "CTRL") w tym badaniu.
    1. Użyj 8 tygodniowych samic. Wiek kobiet różnił się w zależności od eksperymentu, który był przedmiotem zainteresowania.
  3. Określ etapy cyklu rujowego rano o godzinie 08:00. Używaj tylko samic na etapie rui cyklu. Szczegółowe metody rozmazywania pochwy i analizy cytologicznej można znaleźć w wcześniej opublikowanych procedurach11.

2. Łączenie i ocena zatyczek kopulacyjnych

  1. W dniu rui (16:00) umieść samicę w klatce samca.
  2. Następnego ranka (08:00) oddziel samicę od samca myszy.
  3. Użyj adaptacji wcześniej opublikowanej metody12, aby uzyskać dostęp do obecności lub braku czopa dopochwowego lub kopulacyjnego jako wskaźnika krycia.
  4. Przytrzymaj samicę myszy od nasady ogona, aby na krótko unieść tylne kończyny.
  5. Znajdź czop kopulacyjny na podstawie obecności białawego skrzepu nasiennego przy otworze pochwy za pomocą wykałaczki. Jeśli czop kopulacyjny jest obecny, wykałaczka nie będzie mogła zostać wprowadzona do kanału pochwy.

3. Przygotowanie przed pobraniem tkanek

  1. Przygotuj 10 ml pożywki L-15 Leibovitz, uzupełnionej 1% płodową surowicą bydlęcą (zwaną pożywką L15 + 1% FBS) w probówce o pojemności 15 ml. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut w łaźni wodnej.
  2. W celu zachowania żywotności tkanek i plemników do dalszych zastosowań, podwielokrotność 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki L15 + 1% FBS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml w celu pobrania tkanek.
  3. Rozgrzać stolik mikroskopu stereoskopowego do 37 °C. Ustawić blok grzewczy na 37 °C i umieścić w nim pustą probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml.
  4. Jeśli dalsze zastosowania wymagają obrazowania ruchliwości plemników, należy ogrzać szkiełko do temperatury 37 °C.

4. Pobieranie tkanek

  1. Przynieś wstępnie ogrzaną pożywkę L15 + 1% podwielokrotność FBS do obszaru pobierania tkanek.
  2. Poddaj kobietę eutanazji (~08:30h) za pomocą uduszenia dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
    UWAGA: Jest to około 8 godzin po kryciu, przy założeniu, że krycie odbywa się o północy.
  3. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, aby odsłonić obszar brzucha.
  4. Spryskaj 70% alkoholem brzuch w pobliżu kończyn tylnych.
  5. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wykonać małe nacięcie (~1 cm) na skórze dolnej części brzucha.
  6. Użyj ręki dominującej, aby pociągnąć za ogon (i kończyny tylne, jeśli to konieczne), podczas gdy ręka niedominująca ciągnie skórę w przeciwnym kierunku (w kierunku głowy), aby odsłonić mięśnie brzucha. Ta metoda jest stosowana w celu zminimalizowania ilości zanieczyszczenia narządów trzewnych włosami.
  7. Przetnij mięsień brzucha w kształcie litery V u podstawy brzucha, w sąsiedztwie pochwy, aby odsłonić narządy trzewne.
  8. Przesuń jelita i tłuszcz brzuszny na bok, aby odsłonić układ rozrodczy.
  9. Odetnij pęcherz moczowy i inne tkanki powyżej obszaru pochwy.
  10. Rozetnij spojenie łonowe, aby uzyskać dostęp do tkanki pochwy.
  11. Podnieś tkankę pochwy przy wejściu do pochwy i za pomocą nożyczek oddziel kanał pochwy od tkanki odbytnicy.
  12. Ostrożnie odetnij tłuszcz krezkowy z obu stron macicy za pomocą nożyczek sprężynowych.
    UWAGA: Macica jest bardzo delikatna z nasieniem w środku. Uważaj, aby nie przebić macicy, w przeciwnym razie nasienie zostanie utracone.
  13. Podnieś dolny układ rozrodczy i odetnij poduszeczkę tłuszczową jajnika z obu stron.
  14. Przenieść cały układ rozrodczy do probówki z podgrzaną pożywką L-15 firmy Leibovitz + 1% FBS.

5. Pomiar upłynnienia nasienia (lepkości) z kolekcji zawartości macicy

  1. Na podgrzewanym stoliku mikroskopu stereoskopowego przenieś tkanki do sterylnego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm wypełnionego 3,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki L-15 + 1% FBS, aby oczyścić tkanki z krwi i innych zanieczyszczeń.
    UWAGA: Podczas mycia chwyć chusteczki za tłuszcz, a nie za macicę. W tym momencie oczekuje się, że nasienie będzie nienaruszone w macicy.
  2. Osusz tkanki z nadmiaru pożywki za pomocą chusteczek laboratoryjnych.
  3. Przytrzymaj tkankę na końcu pochwy, jednocześnie umieszczając końce jajników w podgrzanej probówce do mikrowirówki. Trzymając koniec pochwy, odetnij rogi macicy u podstawy macicy, pozwalając rogom macicy wpaść do probówki mikrowirówki.
  4. Pozwól nasieniu wypłynąć z rogów macicy do rurki. Użyj bezzębnych kleszczy, aby delikatnie ścisnąć rogi macicy od końca jajnika do końca pochwy, wydalając resztki nasienia.
  5. Wyrzuć tkanki do torby na zagrożenia biologiczne i sspalaj.
  6. Krótko odwiruj nasienie w miniwirówce (~1-2 s).
  7. Połóż rurkę równolegle do podgrzanego etapu - nasienie nie wyleje się.
  8. Przygotuj minutnik i ustaw go na "odliczanie".
  9. Wprowadzić rurkę kapilarną o pojemności 25 μl do próbki nasienia pod kątem 180° (równolegle do ścianki probówki). Ma to na celu zminimalizowanie zmienności między każdym badaczem wynikającej z trzymania rurki kapilarnej pod różnymi kątami.
  10. Naciśnij timer, gdy tylko rurka kapilarna zetknie się z nasieniem.
  11. Zapisać czas (s) potrzebny do osiągnięcia przez nasienie objętości 25 μl.
  12. Po zakończeniu pomiaru natychmiast umieść probówkę zawierającą nasienie z powrotem w bloku suchego ciepła w celu dalszej analizy funkcjonalnej, takiej jak obrazowanie wideo ruchliwości plemników.
  13. Zdezynfekuj rurkę kapilarną zawierającą nasienie, zanurzając probówkę w 10% roztworze wybielacza na 20 minut i wyrzuć rurkę kapilarną do pojemnika na ostre przedmioty.

6. Obrazowanie wideo ruchliwości plemników

  1. Włącz mikroskop i oprogramowanie do obrazowania wideo.
  2. Odpipetować 20 μl pozostałego nasienia na wstępnie podgrzane szkiełko podstawowe, podczas gdy szkiełko umieszczono na podgrzewanym stoliku.
  3. Przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Umieść szkiełko nakrywkowe stroną do dołu na mikroskopie.
  5. Użyj obiektywu 20X, aby znaleźć obszar zainteresowania.
  6. Zmień obiektyw na 100X do obrazowania wideo.
  7. Nagrywaj wideo z prędkością 12 klatek/s (fps) przez 30 s.
  8. Losowo nagrywaj filmy w co najmniej 3 różnych obszarach na zwierzę.
  9. Wykonaj obrazowanie szybko i zminimalizuj ekspozycję na światło na szkiełko, aby zachować ruchliwość i żywotność plemników.
    UWAGA: Ta procedura obrazowania powinna być wykonana w ciągu 2-3 minut.
  10. Przeprowadź analizę danych za pomocą oprogramowania ImageJ, jak opisano wcześniej8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasienie pobrano od samic CTRL i KO około 8 h po kopulacji z płodnymi samcami CTRL. Upłynnienie (lub lepkość nasienia) określono na podstawie czasu potrzebnego do wypełnienia kapilary o pojemności 25 μL nasieniem. Nasienie pobrane z macic CTRL wypełniło kapilarę w czasie 2,06 ±0,12 min (średnia±S.E.M, n = 5) (Rycina 1). Natomiast w przypadku nasienia pobranego z macic KO czas ten przekroczył 60 min (60,0 ±0,0, średnia±S.E.M, n = 5) czasu eksperymentalnego. Dane te sugerują,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pobieranie nasienia z macicy myszy może mieć przewagę nad analizą nasienia in vitro , ponieważ ta pierwsza może zilustrować fizjologiczne interakcje między nasieniem a wydzielinami z żeńskiego układu rozrodczego. Techniki przedstawione w tym badaniu pozwalają naukowcom określić jakość nasienia, a także żywotność i ruchliwość plemników w idealnych warunkach fizjologicznych. Ponadto istnieją różne dalsze analizy, które można przeprowadzić przy użyciu nasienia pobranego z macicy, na przykład plemniki można...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez fundusz startowy College of Veterinary Medicine (WSU) dla WW. Autorzy dziękują Sierra Olsen (WSU) za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
WykałaczkaDiamond750-FlatAutoklawizowana sterylna, użyj wykałaczki. Nie używaj
nożyczek preparacyjnychFisher08-940
Nożyczki sprężynoweRobozRS-5600
Kleszcze drobnoziarnisteRobozRS-5045
25-μ L szklana rurka kapilarnaVWR53432-761
Leibovitz' s L-15 mediaLife Technologies11415064Suplement z 1% FBS
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio-Products100-106
1,5-ml probówka do mikrowirówekAxygenMCT-150-C
2-mlAxygenMCT-200-A
Cyfrowa sucha nagrzewnica blokowaVWR13259-052Do podgrzewania probówki mikrowirówki przed pobraniem nasienia
MiniwirówkaCorningLSE 6765
35-milimetrowe naczynie hodowlaneVWR10861-656
15-mL polipropylenowa probówka wirówkowaVWR10025-686
Kąpiel wodnaPrecyzyjnaTSGP05
Podgrzewany mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsMZ10FAby utrzymać ciepło tkanki przed pobieranie nasienia
Mikroskop BrightfieldLeica MicrosystemsDMi8Opcjonalnie. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników
KameraLeica MicrosystemsDMC2900opcjonalna. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników
Szkiełkapodstawowe Fisher12-552-3Opcjonalnie. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników
Szkiełko nakrywkoweVWR48393-059Opcjonalnie. Do obrazowania wideo ruchliwości plemników
Wybielaczrozcieńczyć w stężeniu dH2O do stężenia 10%
z końcówką punktową

Bibliografia

  1. Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
  2. Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
  3. Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
  4. Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
  5. Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
  6. Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
  7. Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
  8. Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).
  9. Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
  10. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  11. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  12. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , Cambridge, MA (2017).
  13. Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
  14. Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pobieranie nasieniakorek kopulacyjnykapilarap seta bezz bnaruchliwo plemnik wobrazowanie wideomodel mysiswoisty antygen prostatyczny
Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.