Artykuł metodologiczny

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

17 listopada 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Streszczenie

Autonomiczne funkcje neuronalne genów mogą zostać ujawnione poprzez spowodowanie utraty lub utraty funkcji genu w małej i nielicznej populacji neuronów. W tym celu konieczne jest stworzenie mozaiki, w której neurony z utratą lub utratą funkcji genu są otoczone genetycznie niezaburzoną tkanką. W tym przypadku łączymy system rekombinacji Cre-lox z elektroporacją in utero w celu wygenerowania mozaiki tkanki mózgowej, którą można wykorzystać do badania autonomicznej funkcji genów w neuronach. Konstrukty DNA (dostępne za pośrednictwem repozytoriów), kodujące znacznik fluorescencyjny i rekombinazę Cre, są wprowadzane do rozwijających się neuronów korowych zawierających geny otoczone miejscami loxP w mózgach zarodków myszy za pomocą elektroporacji in utero. Dodatkowo opisujemy różne adaptacje metody elektroporacji in utero, które zwiększają przeżywalność i odtwarzalność. Metoda ta obejmuje również ustalenie miana dla rekombinacji za pośrednictwem Cre w rzadkiej lub gęstej populacji neuronów. Preparaty histologiczne znakowanej tkanki mózgowej nie wymagają (ale mogą być dostosowane do) immunohistochemii. Zastosowane konstrukty gwarantują, że znakowane fluorescencyjnie neurony są nosicielami genu rekombinazy Cre. Preparaty histologiczne umożliwiają analizę morfologiczną neuronów poprzez obrazowanie konfokalne altanek dendrytycznych i aksonalnych oraz kolców dendrytycznych. Ponieważ utrata lub wzrost funkcji jest osiągany w rzadkiej tkance mozaikowej, metoda ta pozwala na badanie autonomicznej potrzeby i wystarczalności produktów genowych in vivo.

Wprowadzenie

Generowanie genetycznej mozaiki to klasyczny eksperymentalny paradygmat do zrozumienia funkcji interesującego genu. Aby ustalić, czy gen jest niezbędny dla fenotypu komórkowego, najprostszym podejściem jest spowodowanie utraty funkcji genu w całym organizmie (np. nokaut). Jednakże, aby określić, czy gen jest wymagany specyficznie w określonym typie komórki, nokaut genu w całym organizmie nie jest prawidłowym podejściem. Zamiast tego potrzebna jest metoda, która spowoduje utratę funkcji genu w danej komórce, podczas gdy jest ona otoczona tkanką typu dzikiego (tj. genetycznie niezaburzoną) – innymi słowy, tworząc tkankę mozaikową. Jeśli zmutowana komórka wykazuje zmutowany fenotyp, ale otaczające ją komórki typu dzikiego nie, gen działa w sposób autonomiczny dla komórki. Analiza tkanki mozaikowej, w której zmutowane komórki są otoczone tkanką typu dzikiego, jest idealna do zrozumienia autonomicznych funkcji genów w komórkach, zwłaszcza w mózgu, gdzie neurony i komórki glejowe tworzą rozległą sieć połączonych ze sobą tkanek.

Kilka form mozaikowej tkanki mózgowej dostarczyło potężnych modeli do badania autonomicznych funkcji genów w komórkach. Badania skoncentrowane na transplantacji neuronów1, kobiecej mozaikowości sprzężonej z chromosomem X2,3,4 i endogennej mozaiki somatycznej5,6 wyciągnęły swoje wnioski na podstawie mozaiki tkanki mózgowej. Warunkowa delecja genu za pomocą systemu rekombinacji Cre-lox jest metodą, która w pełni wykorzystuje dużą dostępność transgenicznych linii myszy. W tej metodzie dwa miejsca loxP są wprowadzane po obu stronach wymaganej sekwencji genu (takiej jak ekson), pozostawiając go otoczonym przez miejsca loxP, które są skierowane w tym samym kierunku ("floxed"). Rekombinaza Cre wycina sekwencję między miejscami loxP7. Rekombinację za pośrednictwem Cre można osiągnąć poprzez skrzyżowanie myszy z floksami z inną linią myszy wykazującą ekspresję rekombinazy Cre wraz z markerem fluorescencyjnym w podzbiorze komórek ("linia reporterowa Cre"). Wykazano to na wiele sposobów, aby odkryć funkcje genu w podzbiorach komórek, takich jak neurony pobudzające lub astrocyty8. Linie reporterowe Cre mogą wyrażać CreERT2, aby umożliwić rekombinację za pośrednictwem Cre indukowaną lekiem (znakowanie pojedynczego neuronu z indukowalnym nokautem za pośrednictwem Cre lub SLICK)9. W innej strategii zwanej analizą mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)10,11, rekombinacja międzychromosomowa za pośrednictwem Cre umożliwia utworzenie homozygotycznego mutanta wraz z tkanką heterozygotyczną. W tych podejściach nowa linia myszy musi być produkowana za każdym razem dla każdego testowanego genu kandydującego lub podtypu komórkowego. Alternatywnie, rekombinaza Cre może być wprowadzana po urodzeniu przez jonoforezę12 lub przez wektory wirusowe (np. wirusy związane z adenowirusami13 lub lentiwirusy14 przenoszące promotory specyficzne dla podtypu komórkowego). Ta strategia tworzy silne i postnatalne etykietowanie. Aby celować w rozwijające się neurony kory mózgowej rzadko i prenatalnie, idealną strategią jest elektroporacja rekombinazy Cre w macicy za pomocą markera fluorescencyjnego.

Oprócz łączenia rekombinacji Cre-lox poprzez elektroporację in utero w celu wytworzenia tkanki mozaikowej in vivo, wprowadzamy kilka adaptacji do procedur z innych opublikowanych protokołów15,16,17,18,19,20,21. Dostarczamy informacji, które pomogą nam odnieść sukces w hodowli samic w ciąży w czasie. Przedstawiamy również nasze dwie strategie wprowadzania rzadkiego i jasnego znakowania neuronów w tkance korowej: Jedną ze strategii jest miareczkowanie poziomów pojedynczego konstruktu kodującego rekombinazę Cre i markera fluorescencyjnego22. Inną strategią jest użycie systemu "Supernova", zaprojektowanego specjalnie z myślą o tych parametrach23,24. Ponadto oferujemy ulepszenia w zakresie produkcji spójnych pipet do mikroiniekcji i uproszczenia w chirurgii elektroporacji in utero. Na koniec przedstawiamy krytyczne etapy uproszczonego preparatu histologicznego, który umożliwia analizę kolców dendrytycznych oraz altan dendrytycznych i aksonalnych, bez dalszego barwienia lub immunohistochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (ACUC) Uniwersytetu Jamesa Madisona i są zgodne ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi.

1. Konfiguracja myszy

  1. Umieść młodego (>P60) samca i samicę homozygotycznej myszy floksowej razem, aby utworzyć parę hodowlaną25.
    UWAGA: Dobrą kontrolą ujemną jest ustawienie dodatkowej pary hodowlanej myszy typu dzikiego, w której wyrażenie rekombinazy Cre nie spowoduje powstania mosaic26.
  2. Pozwól samicy urodzić i wychować swój pierwszy miot z samcem. Trzymaj samca razem z samicą, aby zwiększyć przeżywalność miotu. Po odsadzeniu miotu, np. w 21. dniu po urodzeniu (P) 21, należy rozdzielić samicę i samca.
  3. Hodowla myszy
    1. Ustaw krycie na czas między samicą a samcem25. Użyj wskazówek wizualnych, aby określić cykl rujowy samicy27 i sprawdź, czy nie ma czopów dopochwowych rano po kryciu25.
    2. Jeśli zostanie znaleziona wtyczka, oddziel i zważ samicę. Policz dzień jako dzień embrionalny (E) 0,5.
    3. Kontynuuj ważenie samicy co 3-5 dni, aby ustalić, czy jest w ciąży. Kobiety w ciąży będą miały 10-20% wzrost masy ciała 7-10 dni po zapłodnieniu (E0).
      UWAGA: Ten krok potwierdza ciążę wcześniej i bardziej wiarygodnie niż oględziny25.
    4. Jeśli samica nie jest w ciąży, powtórz kroki 1.3.1-1.3.3.
  4. Po potwierdzeniu ciąży wybierz datę elektroporacji in utero. Aby celować w progenitory neuronów piramidowych warstwy II/III, wykonaj elektroporację w E15.5.

2. Konfiguracja DNA

  1. Wybierz pojedynczy konstrukt DNA, który koduje rekombinazę Cre, a także marker fluorescencyjny, taki jak białko zielonej fluorescencji (GFP)28,29. Alternatywnie można skorzystać z systemu "Supernova", opisanego szczegółowo w poprzednich publikacjach23,24. Zobacz listę materiałów, aby zapoznać się z przykładowymi konstrukcjami.
  2. Amplifikuj konstrukt DNA z kroku 2.1 u E. coli przy użyciu standardowych technik mikrobiologicznych30.
  3. Oczyść konstrukt DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn zgodnie z instrukcjami producenta. Usunąć konstrukt wodą wolną od endotoksyn.
    UWAGA: Wybór zestawu do oczyszczania bez endotoksyn zamiast standardowego zestawu do oczyszczania ma kluczowe znaczenie.
  4. Zagęścić eluat DNA do 1-3 mg/ml w zależności od pożądanej gęstości znakowania26.
    UWAGA: Podczas pracy z nowym konstruktem DNA zawsze należy ustalić miano, biorąc pod uwagę, że mają one różne długości i promotory. Rozważ wstrzyknięcie konstruktu w kilku różnych stężeniach i/lub ilościach, aby ocenić ekspresję. Na przykład wstrzyknięcie 1 μl lub 1,5 μl 2,0 mg/ml GFP. Cre jest w stanie powodować rzadkie (1 μL) lub gęste (1,5 μL) znakowanie neuronów piramidowych wzrokowych warstwy II/III26.
  5. Dodać 0,4% błękitu trypanowego w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 w H2O, dostosowanej do pH 7,4 z HCl) 1:10 do stężonego roztworu DNA.
  6. Dodaj 10x PBS 1:10 do stężonego roztworu DNA.
  7. Przechowywać stężony roztwór DNA w temperaturze 4 °C. Roztwór może być przechowywany przez czas nieokreślony.

3. Konfiguracja pipety

  1. Za pomocą szklanego ściągacza kapilarnego wyciągnij pipetę z bardzo długim (10-15 mm) stożkiem i bardzo cienką końcówką, typową dla pipet do wstrzykiwania embrionalnych komórek macierzystych lub transferu jądra31.
    UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu pipet przez zanieczyszczenia, należy je wykonać w ciągu 2 dni od zabiegu.
    1. Skalibruj ściągacz do szklanych kapil, wykonując test rampy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj wynikowej wartości ciepła, aby zaprogramować protokół ciągnięcia przy użyciu następujących parametrów: ciepło = (wartość testu rampy + 15), ciągnięcie = 30, vel = 120, czas = 100, ciśnienie = 200. Włóż szklaną kapilarę, przymocuj do zacisków na ściągaczu i aktywuj zaprogramowany protokół ciągnięcia, tworząc stożek na szklanej kapilarze.
    2. Upewnij się, że długość stożka wynosi od 10 do 15 mm za pomocą złożonego mikroskopu świetlnego (np. obiektyw 10X)31.
  2. Odłamać pipetę, aby utworzyć końcówkę o szorstkich krawędziach o średnicy 20-25 μm.
    1. Wyśrodkuj jednowarstwową chusteczkę zadaniową (patrz lista materiałów) na zlewce o pojemności 50 ml i jedną ręką rozciągnij chusteczkę. Drugą ręką przytrzymaj i wepchnij pipetę (zwężającą się stroną do dołu) prostopadle i całkowicie przez środek chusteczki, powodując wyraźne pęknięcie w stożku 31.
      UWAGA: Całkowite przepchnięcie pipety przez chusteczkę spowoduje wytworzenie końcówki o średnicy 20-25 μm w około 70% przypadków.
    2. Potwierdzić pod mikroskopem światła złożonego (np. obiektyw 20x).
      Ostrzeżenie: Używaj ochrony oczu podczas rozbijania szkła.
  3. Skalibruj pipetę, odsysając 1 μl 0,4% błękitu trypanowego w 1x PBS do częściowo napełnionej pipety, a następnie stopniując pipetę z oznaczeniami 1 μl na podstawie wysokości 1 μl w pipecie, używając markera odpornego na alkohol z cienką końcówką. Użyj skalibrowanej pipety, aby wyskalować pozostałe pipety przed wyrzuceniem. Pipety należy przechowywać w uchwycie na pipety w stanie wolnym od kurzu i innych cząstek.

4. Elektroporacja in utero

  1. Umieść kleszcze Graefe, nożyczki do tęczówki, kleszczyki do komarów Hartmana, gąbki z włókniny, kleszcze z pierścieniową końcówką i szalki Petriego na tacy ze stali nierdzewnej i zawiń w folię aluminiową. Umieść tacę i 1 l 0,9% soli fizjologicznej (0,9% wag./obj. NaCl w wodzie) w autoklawie. Autoklaw w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 3,5 kPa przez 40 min. Wyjąć z autoklawu i umieścić w zdezynfekowanym miejscu chirurgicznym.
    UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie sterylnych warunków podczas zabiegu.
  2. Podgrzej autoklawowaną butelkę z solą fizjologiczną o pojemności 1 l w małej łaźni wodnej do temperatury 38 °C co najmniej 2 godziny przed zabiegiem.
  3. Podłącz elektrody typu pęseta i pedał nożny do generatora (patrz lista materiałów). Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, ustaw generator tak, aby dostarczał pięć impulsów 50 ms napięcia 50 V (w odstępie 950 ms) po wyzwoleniu pedałem nożnym. Zdezynfekuj elektrody typu pęseta i umieść je na zdezynfekowanej powierzchni operacyjnej.
  4. Wykonaj stożek nosowy do znieczulenia, jak wcześniej opublikowano32, ale użyj końca palca rękawicowego z nitrylu lub lateksu, aby uformować membranę, która bezpiecznie przylega do otworu stożka nosowego. Wytnij otwór w membranie wystarczająco duży, aby zmieścił się nad pyskiem myszy.
  5. Głęboko znieczulić ciężarne myszy przy E15,5 w komorze indukcyjnej wypełnionej izofluranem (2-4%) w czystym tlenie płynącym z prędkością 1 l/min. Po ~1 min przetestuj odruch prostujący (delikatnie przechyl komorę indukcyjną i upewnij się, że mysz sama się nie wyprostuje). Zważ mysz, aby określić dawki środka przeciwbólowego podawanego później podczas operacji.
  6. Przenieś mysz na obszar operacyjny i podaj wziewny izofluran (1-2%) w czystym tlenie przepływającym z prędkością 1 l/min przez stożek nosowy, aby utrzymać mysz w płaszczyźnie operacyjnej. Użyj kleszczyków, aby przetestować odruch pedałowania (delikatnie uszczypnij łapę i upewnij się, że mysz nie oddaje odruchu), aby zweryfikować znieczulenie. Monitoruj częstość oddechów i wysiłek, szukając głębokiego, regularnego oddechu (~70-100 oddechów/min) oraz tego, czy błony śluzowe są różowe i wilgotne.
  7. Nałóż na oczy taką ilość weterynaryjnej maści okulistycznej, aby całkowicie je zakryć w celu ochrony przed wysuszeniem podczas zabiegu.
  8. Zegnij metalowy dysk aktywatora szczelnie zamkniętej torebki wypełnionej przesyconym roztworem soli (patrz lista materiałów), aktywując egzotermiczną krystalizację soli. Połóż 2 jednowarstwowe chusteczki zadaniowe na woreczku i umieść mysz na woreczku, aby utrzymać temperaturę ciała.
  9. Wmasuj krem do depilacji w okolicę brzucha wacikami, aż sierść na brzuchu się rozpuści (około 20-40 s), a następnie zetrzyj sierść na brzuchu. Ostrożnie usuń wszelkie pozostałości i krem do depilacji za pomocą 70% etanolu i wacików. Umieść sterylną serwetę chirurgiczną z fenestracją na okolicy brzucha.
  10. Stosując technikę aseptyczną, pociągnij skórę do góry i odsuń ją od brzucha za pomocą kleszczy Graefe i wykonaj ~2 cm brzuszne nacięcie linii środkowej na skórze za pomocą nożyczek do tęczówki, upewniając się, że leżący pod spodem mięsień nie został przecięty.
    UWAGA: Akceptowalną alternatywą dla wykonywania nacięcia za pomocą kleszczy Graefe i nożyczek do tęczówki jest użycie skalpela, jak opublikowano wcześniej17.
  11. Znajdź linię białą, aby uwidocznić linię środkową mięśnia prostego brzucha. Pociągnij mięśnie do góry i odsuń je od brzucha za pomocą kleszczy Graefe'a i wykonaj tam kolejne ~2 cm nacięcie linii środkowej nożyczkami do tęczówki, odsłaniając jamę brzuszną (macica jest przezroczysta, a pod spodem będą widoczne zarodki). Upewnij się, że leżąca pod spodem tkanka macicy i jelit nie została przecięta. Wykonaj nacięcie tylko na tyle duże (zwykle ~ 2 cm), aby wygodnie wyciągnąć i odsłonić macicę.
    UWAGA: Akceptowalną alternatywą dla wykonywania nacięcia za pomocą kleszczy Graefe i nożyczek do tęczówki jest użycie skalpela, jak opublikowano wcześniej17.
  12. Za pomocą sterylnej końcówki mikropipety o pojemności 10 μl dozować karprofen (rozpuszczony w sterylnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej) w dawce 4 mg/kg do jamy brzusznej w celu zniebólu.
  13. Zacisnąć jeden kleszczyk komarów Hartmana na lewej krawędzi nacięcia mięśnia prostego brzucha. Oprzyj kleszcze na przewróconej szalce Petriego po lewej stronie nacięcia, pozostawiając lewą stronę nacięcia otwartą. Zacisnąć kolejne kleszczyki na komary Hartmana na prawej krawędzi nacięcia mięśnia prostego brzucha i oprzeć kleszcze na przewróconej szalce Petriego po prawej stronie nacięcia, utrzymując prawą stronę nacięcia otwartą. Umieść gąbkę z gazy wokół obszaru nacięcia.
  14. Za pomocą kleszczy pierścieniowych (bez dołączonej ograniczającej) pociągnij macicę między dowolnymi dwoma sąsiednimi zarodkami, nie miażdżąc ani nie uszkadzając żadnej tkanki. Zacznij wyciągać wszystkie zarodki przez nacięcie, kładąc je na gąbce z gazy. Podczas wyciągania ostatnich zarodków z jamy brzusznej należy uważać, aby nie ciągnąć za jajniki ani szyjkę macicy. Po wystawieniu na działanie promieni słonecznych bardzo ważne jest, aby macica była wilgotna za pomocą ciepłej soli fizjologicznej. Macica zawiera zazwyczaj od 5 do 8 zarodków.
    UWAGA: Możliwe jest dodanie penicyliny i streptomycyny do soli fizjologicznej17.
  15. Podłączyć skalibrowaną pipetę do zespołu rurki aspiratora (patrz wykaz materiałów) i wstrzyknąć dokładnie 1 μl roztworu DNA przygotowanego w kroku 2 przez ścianę macicy do bocznej komory każdego zarodka. Komory boczne pojawiają się jako dwie plamy na grzbietowej kresomózgowiu zarodka (plamy są ciemniejsze niż otaczająca tkanka kresomózgowia). Podczas mikroiniekcji i elektroporacji należy używać kciuka i palca wskazującego, aby manipulować zarodkami, odsłaniając boczne komory i umożliwiając delikatne dociskanie zarodków do ściany macicy podczas wstrzykiwania. Potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia, obserwując, że błękit trypanowy wypełnia komorę boczną.
  16. Umieść katodę elektrod typu pęseta (patrz lista materiałów) na macicy, bezpośrednio nad korą przyśrodkową i ogonową, aby celować w korę wzrokową (celowanie w alternatywne obszary mózgu będzie wymagało innego umieszczenia elektrod)16,26. Umieść anodę na macicy, tuż poniżej i z przodu głowy zarodka.
  17. Upewnij się, że anoda i katoda dotykają macicy otaczającej zarodek w odpowiednich miejscach. Za pomocą pedału nożnego wyzwolić dostarczenie pięciu impulsów 50 ms napięcia 50 V (w odstępie 950 ms) przez elektrody.
    UWAGA: Wstrzyknięte, ujemnie naładowane DNA przesunie się w kierunku katody i zostanie włączone do komórek strefy komorowej znajdujących się najbliżej katody.
  18. Przywróć macicę do jamy brzusznej w tej samej orientacji, w której została znaleziona. Użyj soli fizjologicznej do smarowania macicy, prowadząc ją ręcznie i bardzo delikatnie, uważając, aby nie przesunąć zarodków z ich pozycji w macicy.
  19. Zamknij mięśnie brzucha wchłanialnymi szwami (patrz lista materiałów) za pomocą prostego przerywanego szwu, wiążąc końce węzłem chirurgicznym. Nie przycinaj końców zbyt blisko węzła, ponieważ węzeł zostanie odpięty.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zszyć mięśnie brzucha w taki sposób, aby krawędzie rany były całkowicie zamknięte, ale bez powodowania blednięcia mięśnia. Węzły powinny być ciasne, aby nie można było ich rozpiąć.
  20. Zamknij warstwę skóry za pomocą wchłanialnych szwów (prosty przerywany szew, węzeł chirurga, jak w kroku 4.19). Nałóż niewielką ilość kleju tkankowego, aby uszczelnić ranę. Nałóż klej tkankowy na węzły, aby zapobiec rozpinaniu. Użyj mikropipety, aby usunąć klej tkankowy otaczający ranę, który może zostać odessany przez mikropipetę.
  21. Obniżenie poziomu izofluranu do 0,5-1,5%. Po wyschnięciu kleju tkankowego (test, dotykając rękawicy kleju), usuń go z izofluranu i pozwól samicy dojść do siebie samodzielnie w ciepłej klatce. Buprenorfinę podawać dootrzewnowo w dawce 0,03 mg/kg mc. za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 g 1/2".
  22. Kontynuuj monitorowanie myszy, aż mysz w pełni wyzdrowieje i będzie zachowywać się normalnie (tj. pielęgnować, eksplorować klatkę, jeść lub pić). Po odzyskaniu zdrowia umieść samicę z powrotem w klatce z samcem.
    UWAGA: Jeśli wszystkie kroki zostaną wykonane, mysz zazwyczaj odzyska przytomność w ciągu 2 minut i natychmiast zacznie poruszać się po klatce, nie wykazując żadnych oznak dyskomfortu.
  23. Jeśli mysz wykazuje oznaki dyskomfortu (np. zgarbiona postawa, wydzielanie porfiryny)33, podawaj karprofen w dawce 0,1 mg/ml w wodzie. Jeśli występuje kilka objawów dyskomfortu lub jeśli dyskomfort utrzymuje się dłużej niż 4 godziny pomimo podania karprofenu, natychmiast poddaj mysz eutanazji, podając dootrzewnowe śmiertelne wstrzyknięcie koktajlu ketamina (240 mg / kg) - ksylazyna (48 mg / kg) - acepromazyna (1,85 mg / kg) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, 1/2", a następnie zatwierdzoną wtórną formę eutanazji33.
  24. Aby zwiększyć przeżywalność zarodków poddanych elektroporacji po urodzeniu, trzymaj klatkę w cichym pomieszczeniu, wolnym od hałasów i wibracji. Wzbogać środowisko o plastikowe igloo, materiały do budowy gniazd i suplementy diety, takie jak nasiona słonecznika (patrz lista materiałów). Nie przesuwaj ani nie naruszaj klatki, szczególnie w ciągu pierwszych 3 dni po porodzie.

5. Przygotowanie histologiczne do mikroskopii fluorescencyjnej

UWAGA: Ten protokół histologiczny jest zoptymalizowany do przygotowania tkanek od zwierząt starszych niż dzień poporodowy (P) 13, które zostały poddane elektroporacji w macicy. Aby przygotować tkankę od młodszych zwierząt po urodzeniu (P0-P13), zaleca się wykonanie wszystkich kroków (w tym perfuzji przezsercowej), chociaż mózg powinien być osadzony w agarze przed przygotowaniem skrawków (krok 5.9). Tkanki można nawet przygotować z zarodków w ciągu 1-2 dni po elektroporacji, stosując metody opisane wcześniej18,20.

  1. Przygotować roztwór paraformaldehydu (PFA).
    UWAGA: Konieczne jest przygotowanie świeżego PFA w ciągu jednego dnia od eksperymentu.
    Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w dygestorii przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
    1. Aby uzyskać 50 ml 4% PFA, podgrzej 40 ml wody do 60 °C. Dodaj 2 g PFA, mieszając szklaną pałeczką lub mieszadłem. Dodawać 10 μl 10 M NaOH co 2 minuty, aż PFA się rozpuści.
    2. Dodać 5 ml 10x PBS i doprowadzić roztwór do końcowej objętości 50 ml wodą.
    3. Po doprowadzeniu roztworu do 50 ml w razie potrzeby doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 10 M HCl. Pozostawić roztwór do ostygnięcia i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Poddaj mysz eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia koktajlu ketaminy (240 mg / kg) - ksylazyny (48 mg / kg) i acepromazyny (1,85 mg / kg) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, 1/2 ". Przezskórnie perfuzjuj 10 lub 20 ml lodowatego 1x PBS, a następnie 25 lub 40 ml świeżo przygotowanego, lodowatego 4% PFA17. Używaj mniejszych objętości dla młodych myszy po urodzeniu (P0-P13) i większych objętości dla starszych myszy (P14 i więcej).
  3. Natychmiast po perfuzji odetnij głowę myszy między kością potyliczną a kręgiem C1 dużymi nożycami oraz oderwij i odrzuć większość skóry otaczającej czaszkę za pomocą nożyczek do tęczówki, szczególnie skóry otaczającej kości czołowe, ciemieniowe i potyliczne. Utrzymuj czaszkę i mózg w stanie nienaruszonym.
  4. Umieścić czaszkę i mózg w 10 ml 4% PFA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na 24 godziny w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia tkanki. Następnie dodać 30 ml 1x PBS do stożkowej probówki, aby rozcieńczyć roztwór do 1% PFA do przechowywania w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Użyj oddzielnej stożkowej rurki dla każdej czaszki i mózgu, które mają być zamocowane po słupku. Nie inkubuj mózgu w 1% PFA dłużej niż 2 tygodnie, w przeciwnym razie fluorescencja zacznie zanikać.
  5. Umieść mózg i czaszkę na płaskiej powierzchni za pomocą jednowarstwowych chusteczek zwilżonych 1x PBS. Użyj pęsety (patrz lista materiałów), aby usunąć pozostałą skórę lub błonę otaczającą czaszkę.
  6. Za pomocą pęsety najpierw usuń kość potyliczną, a następnie ostrożnie usuń kości ciemieniowe, wysuwając pęsetę i odsuwając ją od powierzchni mózgu. Ostrożnie usuń wszelkie opony mózgowe, aby zapobiec uszkodzeniu kory.
  7. Wciśnij tylną część pęsety pod mózg wzdłuż czaszki, aby przeciąć nerwy czaszkowe i usunąć mózg.
  8. Dla młodych mózgów po urodzeniu (P0-P13)
    1. Przygotować 25 ml 4% agaru przez podgrzanie 25 ml 1x PBS do 80 °C. Wymieszać i rozpuścić 1 g agaru za pomocą szklanej pałeczki lub mieszadła).
    2. Schłodzić roztwór do temperatury 35 °C, kontynuując mieszanie. Umieścić mózg w małym pojemniku (np. nakrętkę stożkowej probówki o pojemności 50 ml) i zalać mózg roztworem agaru. Pozwól agarowi stwardnieć.
  9. Wykonaj cięcie koronalne ręcznie za pomocą jednoostrzowej żyletki przez mózg, około 0,5 mm rostral do bregma. Wykonaj kolejne koronalne przecięcie przez mózg około 0,5 mm ogonowo do kory wzrokowej. Umieść kałużę kleju cyjanoakrylowego o tej samej średnicy co rostralny koniec mózgu na środku wibrującego dysku próbki mikrotomu. Umieść rostralny koniec mózgu na wierzchu kałuży kleju, upewniając się, że cała powierzchnia rostralna tkanki jest połączona z krążkiem próbki za pomocą kleju.
  10. Zamontuj tacę buforową na wibrującym mikrotomie i zabezpiecz wbudowaną dźwignią zaciskową. Włóż ostrze do uchwytu noża i zamontuj uchwyt noża na wibrującym mikrotomie za pomocą wbudowanej zaciskowej. Przymocuj krążek próbki z mózgiem do tacy buforowej za pomocą wbudowanego urządzenia zaciskowego. Ustaw prędkość na 5.70 (= 0.285 mm/s), a ustawienie częstotliwości na 5.33 (53.3 Hz).
  11. Napełnij komorę powyżej poziomu mózgu 1x PBS i opuść ostrze do PBS. Rozpocznij pobieranie 100 μm odcinków koronalnych przez tkankę.
  12. Jeśli nie wymaga dalszego przetwarzania, takiego jak barwienie jądrowe 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) lub immunohistochemia.
    1. Za pomocą pędzla z cienką końcówką przenieś skrawki bezpośrednio z wibrującego mikrotomu na szkiełko mikroskopowe, dopasowując 4-6 sekcji do każdego szkiełka.
    2. Pozostaw sekcje do wyschnięcia, odprowadzając roztwór pędzlem z cienką końcówką, tak aby plasterki mózgu nie dryfowały już po szkiełkach.
    3. Następnie umieść jedną kroplę materiału montażowego (patrz lista materiałów) na każdej sekcji szkiełka.
    4. Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 50 mm na wierzchu, upewniając się, że 1) na sekcjach nie tworzą się pęcherzyki powietrza, 2) sekcje się nie poruszają i 3) mocowanie całkowicie zakrywa obszar między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić mocowanie do utwardzenia przez co najmniej 24-48 godzin.
  13. Barwienie jąder DAPI do badania histologicznego blaszek korowych
    1. Za pomocą pędzla z cienką końcówką przenieś każdą sekcję do roztworu zawierającego 10 μg/ml DAPI (patrz lista materiałów) rozcieńczonego w 1x PBS z roztworu podstawowego (20 mg/ml DAPI w wodzie).
    2. Inkubować w roztworze DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej, następnie użyć pędzla z cienką końcówką, aby przenieść sekcję z roztworu DAPI do 1x PBS i inkubować w 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś sekcję jeszcze dwa razy do świeżej 1x PBS na 5 minut każdy. Następnie za pomocą pędzla z cienką końcówką przenieś wycinek na szkiełko mikroskopowe, wykonaj kroki 5.11.2-5.11.4 i przejdź do kroku 5.13.
  14. Podgrzej szklaną szalkę Petriego zawierającą Valap (równe części wazeliny, lanoliny i parafiny) na płycie grzejnej na małym ogniu, aż do całkowitego rozpuszczenia. Uszczelnij odsłonięte krawędzie szkiełek za pomocą pędzla na stopionym Valap.
  15. Do badania fluorescencji w tkance należy użyć mikroskopu świetlnego lub mikroskopu konfokalnego (patrz wykaz materiałów) oraz zestawu filtrów odpowiednich do oglądania fluoroforu (np. DAPI: wzbudzenie 325-375 nm, emisja 435-485 nm; GFP: wzbudzenie 450-490 nm, emisja 500-550 nm)17. Obrazy konfokalne mogą być wykonywane obiektywami o niskiej (4X, przysłona numeryczna, NA = 0,20), średnim (20X, NA = 0,75) i dużej mocy (60X, NA = 1,40).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pojedynczy konstrukt GFP.Cre (patrz lista materiałów) został wprowadzony metodą elektroporacji w dniu E15.5 i zwizualizowany w dniu P14. W zależności od stężenia konstruktu oraz objętości iniekcji można uzyskać wynik rzadki lub gęsty2,26. Na przykład iniekcja 1 µL GFP.Cre o stężeniu 2 mg/mL skutkuje rzadkim rozkładem znakowanych komórek, z których niektóre mogą być jasne (Rycina 1A) i zlokalizowane w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj wprowadzamy połączenie elektroporacji in utero z rekombinazą Cre u myszy z klapami w celu wytworzenia mozaiki tkanki mózgowej. Zaletą tego podejścia jest to, że nowa linia myszy nie musi być generowana za każdym razem, gdy celem ma być inny podtyp komórkowy: elektroporacja in utero może być stosowana do celowania w neurony pobudzające, neurony hamujące lub glej, w zależności od czasu i miejsca elektroporacji 15,16,17,18,19,20,21...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za hojne wsparcie Wydziału Biologii Uniwersytetu Jamesa Madisona oraz Ośrodka Mikroskopii i Obrazowania Światła Uniwersytetu Jamesa Madisona. Dr Markowi L. Gabriele za pomocne porady dotyczące przygotowania młodych tkanek po porodzie, oraz dr Justinowi W. Brownowi i Coreyowi L. Clelandowi za hojną koordynację materiałów chirurgicznych i przestrzeni. Badania te zostały częściowo sfinansowane z grantu badawczego 4-VA, partnerstwa na rzecz rozwoju Wspólnoty Wirginii (G.S.V.) oraz z grantu badawczego Virginia Academy of Science Small Project Research Grant (GSV). Wsparcie zostało hojnie udzielone przez stypendium Betty Jo Loving Butler '58 Endowment for Undergraduate Research Scholarship (dla K.M.B.), stypendium Farrell Summer Research Scholarship (dla KMB), stypendium James Madison University Second Century Scholarship (dla KMB), stypendium James Madison University Centennial Scholarship (dla C.J.H.), stypendium James Madison University Lucy Robinson Search '30 Memorial Scholarship (dla Z.L.H.), oraz stypendium na pomoc wydziałowi James Madison University College of Science and Mathematics (dla GSV).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6JLaboratorium Jacksona#000664Patrz "1. Konfiguracja myszy" (krok 1.1, "myszy typu dzikiego")
GFP. Cre pusty wektorAddGene#20781Zobacz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.1 "pojedynczy konstrukt DNA kodujący rekombinazę Cre oraz marker fluorescencyjny"). Dobra praktyka rolnicza. Cre pusty wektor był prezentem od Tylera Jacksa.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138Patrz "2. Instalacja DNA" (krok 2.1 System "Supernowa") i http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) był prezentem od Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136Patrz "2. Instalacja DNA" (krok 2.1 System "Supernowa") i http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) była prezentem od Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006Patrz "2. Instalacja DNA" (krok 2.1 System "Supernowa") i http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) był prezentem od Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.3 "zestaw do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn")
Trypan Blue w proszku, klasa BioReagentSigmaT6146-5GPatrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "błękit trypanowy")
Chlorek sodu, ACS, 2,5 kgVWRBDH9286-2,5 kgPatrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "NaCl")
Chlorek potasu, ACS, 500 gVWR#97061-566Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "KCl")
Fosforan sodu dwuzasadowy, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GPatrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "Na2HPO4")
Fosforan potasu jednozasadowy, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GPatrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "KH2PO4")
Kwas solny, odczynnik ACS, 500 mlFisher ScientificA144-500Patrz "2. Konfiguracja DNA" (krok 2.5 "HCl")
P-97 Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentP-97Patrz "3. Konfiguracja pipety" (krok 3.1 "ściągacz do szklanych kapil")
Filament z włóknem o szerokości 3,0 mmSutter InstrumentFT330BPatrz "3. Konfiguracja pipet" (krok 3.1 "ściągacz do szklanych kapil")
Szklane kapilary cienkościenne, 4", 1 / 0,75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4Patrz "3. Konfiguracja pipety" (krok 3.1.1 "szklana kapilara")
Jednowarstwowe chusteczki Soft-Tech, 4,5"PhenixLW-8148Patrz "3. Konfiguracja pipet" (krok 3.2.1 "jednowarstwowe wycieranie zadaniowe"); Można stosować inne chusteczki jednowarstwowe (np. Kimwipes).
Kleszcze Graefe, 7 cm, proste, 0,7 mm 1x2 zębyWorld Precision Instruments#14140Zobacz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "Kleszcze Graefe")
Nożyczki do irysa, 11,5 cm, proste, 12-pakWorld Precision Instruments#503708-12Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "nożyczki do tęczówki")
Kleszcze do komarów Hartman, 9 cm, proste, 12-pakWorld Precision Instruments#503728-12Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "Kleszcze komarów Hartmana")
Gąbki włókninowe ogólnego przeznaczenia, 2" x 2", 4-warstwoweMedrepexpress#2204-cPatrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "gąbki z włókniny")
Kleszcze z końcówką pierścieniową, 10 cm, proste, 2,2 mm IDWorld Precision Instruments#503203Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.1 "kleszcze z pierścieniową końcówką")
Płytki Petriego z Pyrexu kompletne, OD i razy; H 100 mm i razy; 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EAPatrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "Szalki Petriego")
Płaska taca na instrumenty, stal nierdzewna, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHAZobacz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.1 "taca ze stali nierdzewnej")
Pęseta platynowa, 5 mmBTX#45-0489Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.3 i 4.16 "elektrody typu pęseta")
ECM 830 Pedał nożnyBTX#45-0211Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.3 i 4.17 "pedał nożny")
Generator ECM 830BTX#45-0052Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.3 "generator")
System znieczulenia izofluranem dla pojedynczych zwierząt z małą skrzynką indukcyjnąAparat Harvard72-6468Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.4 i 4.6 "stożek nosa", krok 4.4 "komora indukcyjna")
Maść okulistycznaHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.7 "weterynaryjna maść okulistyczna")
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.8 "szczelnie zamknięta torebka wypełniona przesyconym roztworem soli")
Żel do depilacji w kremie, formuła wrażliwaVeet#062200809951Patrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.9 "krem do depilacji")
10ul Rozrusznik końcówki o niskiej retencji (960 końcówek / pk)Produkty badawcze PhenixTSP-10LKITPatrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.12 "sterylne 10 & mikro; L końcówka do mikropipet
")Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigma-AldrichA5177Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.15 "Zespół rurki aspiratora")
Pleciony szew wchłanialny, 4-0, Igła NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.19 "szwy wchłanialne")"
LiquiVet Rapid" Klej tkankowyMedrepexpressVG3Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.20 "klej tkankowy")
Strzykawki podskórne, polipropylen, końcówka Luer lock, pojemność 1,0 mlSigma-AldrichZ551546-100EAPatrz "4. Elektroporacja w macicy" (krok 4.21 "Strzykawka 1 ml")
Igły do strzykawek BD Precisionglide o grubości 26, L 1/2 cala.Sigma-AldrichZ192392-100EAPatrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.21 "26G, ½ ” igła")
Gniazda Materiał zagnieżdżającyAncareNES3600Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.24 "Materiały do gniazdowania")
Nasiona słonecznika, olej, sterylnyBio-ServS5137Patrz "4. Elektroporacja in utero" (krok 4.24 "nasiona słonecznika")
Paraformaldehyd, 97%Alfa AesarA11313Patrz "5. Histologia" (krok 5.1.1 "PFA")
Pęseta ekonomiczna #3, końcówki 11 cm, 0,2 x 0,4 mmWorld Precision Instruments#501976Patrz "5. Histologia" (krok 5.5 "pęseta")
Agar w proszkuAlfa Aesar#10752Patrz "5. Histologia" (krok 5.8.1 "agar")
Ostrza do golenia z pojedynczą krawędzią, ostrze #9Stanley Tools#11-515Patrz "5. Histologia" (krok 5.9 "żyletka jednoostrzowa")
Tarcza z próbką S D 50 mmLeica#14046327404Patrz "5. Histologia" (krok 5.9 "wibrujący krążek z próbką mikrotomu")
Taca buforowa Zespół SLeica#1404630132Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "taca buforowa")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "wibrujący mikrotom")
Żyletki z podwójną krawędziąPersonnaBP9020Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "ostrze")
Uchwyt noża SLeica#14046230131Patrz "5. Histologia" (krok 5.10 "uchwyt na nóż")
Studio Elements Golden Taklon Zestaw okrągłych szczotek z krótką rączkąAmazonB0089KU6XEZobacz "5. Histologia" (krok 5.12.1 "pędzel z cienką końcówką")
Superfrost Plus SlidesUsługi mikroskopii elektronowej#71869-11Patrz "5. Histologia" (krok 5.12.1 "szkiełko mikroskopowe")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 mlThermofisherP36970Patrz "5. Histologia" (krok 5.12.3-5.12.4 "mocowanie")
Szkło nakrywkowe, 24 x 50 mm, nr 1Phenix Research ProductsMS1415-10Patrz "5. Histologia" (krok 5.12.4 "szkiełko nakrywkowe")
4′,6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu (DAPI)Sigma-AldrichD9542Patrz "5. Histologia" (krok 5.13.1 "DAPI")
Mikroskop pionowy OlympusBX51WIPatrz "5. Histologia" (krok 5.15 "mikroskop świetlny")
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyNikonTE2000/C2siPatrz "5. Histologia" (krok 5.15 "mikroskop konfokalny")4x
obiektyw, NA = 0,20NikonCFI Plan Apo Lambda 4XPatrz "5. Histologia" (krok 5.15 "obiektyw małej mocy")obiektyw
20x, NA = 0,75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XPatrz "5. Histologia" (krok 5.15 "obiektyw średniej mocy")
Obiektyw 60x, NA = 1.40Olej NikonCFI Plan Apo VC 60XPatrz "5. Histologia" (krok 5.15 "obiektyw o dużej mocy")
#

Bibliografia

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641(2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747(2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza mozaikowato ci genetycznejbadanie fenotypu neuronalnegowstrzykiwanie konstruktu DNAkalibracja b kitem trypanowymanaliza obrazowania konfokalnegotechnika rzadkiego znakowaniacelowanie w warstwy korowe

Powiązane artykuły