Artykuł metodologiczny

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

DOI:

10.3791/56693

⸱

22 lutego 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System przejściowej ekspresji genów jest jedną z najważniejszych technologii do przeprowadzania analizy funkcjonalnej białek w systemie hodowli komórkowych bakulowirusa in vitro. System ten został opracowany do ekspresji obcych genów pod kontrolą promotora bakulowirusa w plazmidach o przejściowej ekspresji. Co więcej, system ten można zastosować do testu funkcjonalnego zarówno samego bakulowirusa, jak i obcych białek. Najszerzej i najszerzej dostępny na rynku system ekspresji genów przejściowych został opracowany w oparciu o promotor genu natychmiastowo wczesnego (IE) wirusa polihedrozy jądrowej Orgyia pseudotsugata multicapsid (OpMNPV). Zaobserwowano jednak niski poziom ekspresji obcych genów w komórkach owadów. W związku z tym skonstruowano przejściowy system ekspresji genów w celu poprawy ekspresji białek. W tym systemie rekombinowane plazmidy zostały skonstruowane tak, aby zawierały sekwencję docelową pod kontrolą promotora szoku cieplnego Drosophila 70 (Dhsp70). Protokół ten przedstawia zastosowanie tego opartego na szoku cieplnym systemu pDHsp / V5-His (epitop V5 z 6 histydyną) / komórki Spodoptera frugiperda (komórka sf9); System ten jest dostępny nie tylko do ekspresji genów, ale także do oceny aktywności antyapoptotycznej białek kandydujących w komórkach owadów. Co więcej, system ten może być transfekowany jednym rekombinowanym plazmidem lub kotransfekowany dwoma potencjalnie funkcjonalnie antagonistycznymi rekombinowanymi plazmidami w komórkach owadów. Protokół demonstruje skuteczność tego systemu i przedstawia praktyczny przypadek zastosowania tej techniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa systemy ekspresji białek były powszechnie używane do produkcji białek: systemy ekspresji białek prokariotów (system ekspresji genów Escherichia coli) i systemy ekspresji białek eukariotów. Jednym z popularnych systemów ekspresji białek eukariotycznych jest system wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS)1. Bakulowirusy zostały po raz pierwszy użyte na całym świecie jako środki kontroli biologicznej szkodników rolniczych i leśnych. W ciągu ostatnich kilku dekad bakulowirusy zostały opracowane jako narzędzia biotechnologiczne dla wektorów ekspresji białek. Genomy bakulowirusów składają się z dwuniciowego kolistego DNA i otoczkowych nukleokapsydów2. Do tej pory zsekwencjonowano ponad siedemdziesiąt osiem izolatów bakulowirusa3. Opierając się na kaskadzie czasowej ekspresji genów bakulowirusa w komórkach owadów gospodarza, transkrypcję genu można podzielić na cztery kaskady czasowe, w tym geny natychmiastowo-wczesne, opóźnione-wczesne, późne i bardzo późne4.

BEVS zostały wyznaczone tak, że bardzo późne promotory genów (np. wielościan lub promotor p10) były używane do kierowania genami docelowymi, podczas gdy rekombinowany bakulowirus był generowany przez rekombinację homologiczną. Ekspresja obcych białek w komórkach owadów przez rekombinowanego bakulowirusa jest podobna do ekspresji białek ssaków w modyfikacjach potranslacyjnych (odpowiednich do produkcji glikoproteiny). W związku z tym bakulowirus jest szeroko stosowany5,6,7. Jednak jednym z ograniczeń jest obecność różnych szlaków N-glikozylacji w komórkach owadów7.

Dlatego też opracowano nowy system ekspresji wirusa bakulowirusa, system przejściowej ekspresji genów. System ten ulega ekspresji obcych genów pod wpływem promotorów natychmiast-wczesnych bakulowirusów (tj. promotora 1) w komórkach owadów. Dzięki zastosowaniu tego systemu, białko docelowe może być natychmiast wyrażane pod kontrolą promotora ie-1, jednocześnie modyfikując szlak N-glikozylacji w komórkach owadów, co skutkuje lepszymi oligosacharydami sprzężonymi z N7. Co więcej, geny bakulowirusa są transkrybowane przez polimerazę II RNA komórki gospodarza i nie wymagają żadnego czynnika wirusowego do aktywacji4. Dlatego obce białka mogą ulegać ekspresji w komórkach owadów w krótkim czasie. Do tej pory system przejściowej ekspresji genów jest jedną z najważniejszych technologii wykonywania testów funkcjonalnych białek w systemie hodowli komórkowych bakulowirusa in vitro. System może być stosowany do analizy funkcji bakulowirusa lub obcych białek. Jeden z dostępnych na rynku przejściowych systemów ekspresji genów opiera się na promotorach genu o natychmiastowej wczesnej fazie (IE) wirusa polihedrozy jądrowej Orgyia pseudotsugata multicapsid (OpMNPV) (promotory OpIE2 i OpIE1).

Jednak niższy poziom ekspresji obcych genów w komórkach owadów nadal stanowił problem, gdy zastosowano system ekspresji przejściowych genów oparty na promotorze OpIE8,9,10. W ten sposób skonstruowano kolejny przejściowy system ekspresji genów w oparciu o promotor genu białka szoku cieplnego Drosophila 70 (hsp70) 8,9. Promotor hsp70 działa skuteczniej niż bakuroliwirusowy promotor IE, gdy jest indukowany szokiem cieplnym w komórkach owadów10. W tym systemie geny docelowe ulegały ekspresji pod wpływem promotora szoku cieplnego Drosophila 70 (Dhsp70). Obce geny można łatwo sklonować do plazmidu o przejściowej ekspresji genów za pomocą metod klonowania opartych na PCR. Co więcej, kontrola czasu ekspresji genów może być przeprowadzona przez indukcję szoku cieplnego.

W tym raporcie, stosujemy podejście i wyrażamy trzy różne skrócenia genu bakulowirusa (inhibitor apoptozy 3, iap3 z Lymantria xylina MNPV) za pomocą systemu ekspresji białek przejściowych opartego na szoku cieplnym i dalej stosujemy te wyrażone białka do analizy aktywności antyapoptotycznej. System ten może albo szybko eksprymować obce białka, albo być dalej stosowany do oceny aktywności antyapoptotycznej białek w komórkach sf9, a jednocześnie może być stosowany do innych testów aktywności białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

  1. Hodowla komórek owadów
    1. Przygotować 50 ml pożywki do hodowli komórkowych. W tym celu należy dodać 500 μl antybiotyków (amfoterycyna B = 0,25 μg/ml, penicylina = 100 jednostek/ml, streptomycyna = 100 μg/ml) i 5 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w pożywce do hodowli komórek bez surowicy (bez FBS lub antybiotyków).
      nuta: Przed użyciem podgrzać płodową surowicę bydlęcą w temperaturze 65 °C przez 30 minut w łaźni wodnej.
    2. Utrzymuj Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), komórki owadów sf9. Oderwać ok. 80% komórek od kolby do hodowli komórkowej o średnicy 25cm2 poprzez potrząśnięcie kolbą i sprawdzić pod mikroskopem świetlnym. Następnie przenieść 50% zawiesiny komórek do nowej kolby do hodowli komórkowych o średnicy 25cm2 i pozostawić komórki do przyłączenia się na 15 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp pożywkę 5 ml pożywką do hodowli świeżych komórek i hoduj w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Komórki pasażowe należy przeprowadzać co 2 do 3 dni, w zależności od wzrostu komórek.
  2. Przygotowanie plazmidów do transfekcji komórek
    1. Wstawić docelowe fragmenty DNA (np. gen iap3 Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) i jego konstrukty delecji) do pDHsp/V5-His metodą klonowania opartą na PCR11. Sprawdź wzrost przekształconych kolonii przez PCR kolonii za pomocą PCR Master Mix (2X) i zestawu starterów pDhsp-F2/Op-IE2R. Potwierdź sekwencje plazmidu za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania.
      UWAGA: W tabeli 1 wymieniono startery używane do PCR i odpowiadające im konstrukty.
    2. Hodowla jednosekwencjonowanych kolonii bakteryjnych, które zawierają wyżej wymienione struktury plazmidowe (krok 1.2) w pożywce o pojemności 200 ml LB zawierającej odpowiednio wybrane antybiotyki (50 μg/ml).
    3. Wyodrębnij plazmidy z hodowanej E. coli za pomocą zestawu plazmidów Midi zgodnie z instrukcjami producenta12.
  3. Przygotować pożywkę galwaniczną, mieszając 1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych i 8,5 ml pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy.
  4. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych aktynomycyny D (ActD), dodając 1,5 μl materiału wyjściowego ActD (1 mg/ml) do 10 ml pożywki do hodowli komórkowej (stężenie końcowe = 150 ng/ml). Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przejściowa ekspresja białka

  1. Wysiewanie komórek
    1. Zebrać komórki sf9 przez wytrząsanie kolby hodowlanej, przewrócić i upuścić zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml i przenieść 10 μl do hemocytometru za pomocą pipety P10. Policz liczbę komórek pod mikroskopem świetlnym.
    2. Płytka 3 × 105 komórek sf9 do każdej studzienki na 24-dołkowej płytce przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zastąp pożywkę 0,5 ml podłoża galwanicznego.
  2. Transfekcja plazmidów
    1. Rozcieńczony odczynnik do transfekcji komórek: Rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji komórek w 100 μl pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i mieszać przez wirowanie przez 1 s.
    2. Dodaj 2 μg plazmidowego DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His) do 100 μl pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy i mieszaj przez wirowanie przez 1 s (Ryc. 2).
    3. Połączyć rozcieńczony plazmidowy DNA i rozcieńczony odczynnik do transfekcji komórek (210 μl) i mieszać przez wirowanie przez 1 s. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Dodać kroplami 210 μl mieszaniny odczynników do transfekcji DNA na komórki za pomocą pipety P1000. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 5 godzin.
    5. Zastąp pożywkę galwaniczną 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowych za pomocą pipety P1000. Uszczelnić 24-dołkową płytkę taśmą i inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 16 godzin.
  3. Szok cieplny transfekowanych komórek: Umieść płytkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C (unoszącej się na powierzchni wody). Podgrzewać przez 30 minut i umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 28 °C.
  4. Wykrywanie ekspresji białek
    1. Po 1 h lub 5 h szoku cieplnym umyj komórki 0,5 ml 1x buforu PBS krótko trzy razy.
      UWAGA: Rozcieńczyć bufor 10x PBS do 1x buforu PBS, dodając 1 ml buforu 10x PBS do 9 ml wysterylizowanego ddH2O
    2. Zneutralizować komórki za pomocą 40 μl barwnika ładującego 1x SDS, pipetując w górę iw dół.
      UWAGA: Rozcieńczyć 4x barwnik ładujący SDS, mieszając 30 μl 1x buforu PBS i 10 μL 4x buforu próbki SDS.
    3. Podgrzewać próbki białek w temperaturze 98 °C przez 10 minut w bloku grzewczym, wirować przez 1 minutę i umieszczać na lodzie do testu Western blot.
    4. Test Western blot
      Postępuj zgodnie z procedurą testu Western blot z Eslami i Lujan13. Uruchom SDS-PAGE gels14: jeden żel poddany barwieniu Coomassie na niebiesko (kontrola obciążenia w celu sprawdzenia, czy ilość próbek białka załadowanych do każdej studzienki jest równa pod względem ilości), a drugi poddany testowi Western blot, zgodnie z Eslami i Lujan13.
    5. Wykryć białka fuzyjne znakowane V5 za pomocą króliczego przeciwciała anty-V5 (5 mg / ml) (rozcieńczenie 1:5000 w buforze TBST do stężenia roboczego 1 μg / ml) i koniugatu koziej anty-króliczej peroksydazy IgG-chrzanowej (HRP) (0,8 mg / ml) (rozcieńczenie 1:10000 w buforze TBST do stężenia roboczego 0,08 μg / ml).
      nuta: Dostosuj zawartość procentową poliakrylamidu do 17,5%, gdy masa cząsteczkowa białka ma wynosić <17 kDa.

3. Test aktywności antyapoptotycznej

  1. Apoptoza komórek wywołana genem: Powtórz powyższą procedurę od 2.1 do 2.3. Kotransfekcja 1 μg plazmidowego DNA pDHsp/D-rpr/FLAG-His (zawierającego gen induktora apoptozy) z 1 μg plazmidowego DNA [odpowiednio wektor pDHsp70/V5-His (kontrola ujemna), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (kontrola pozytywna), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His.]. Po 5 godzinach po leczeniu szokiem cieplnym przeprowadź test żywotności komórek (Rysunek 2).
  2. Apoptoza komórek wywołana chemicznie: Powtórz wyżej wymienioną procedurę od 2.1 do 2.3. W kroku 2.1.2 umieść 1 x 106 komórek sf9 w każdym dołku na płytce 6-dołkowej. Transfekcja 4 μg plazmidowego DNA [odpowiednio wektor pDHsp70/V5-His (kontrola negatywna), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (kontrola pozytywna), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His lub pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-His.]. Po 5 godzinach od szoku cieplnego potraktuj komórki sf9 2 ml pożywki do hodowli komórek ActD przez 16 godzin i przeprowadź test żywotności komórek (Rysunek 2).
    nuta: Minimalna objętość do pokrycia jednego dołka płytki 6-dołkowej wynosi 1 ml.
  3. Wykonaj powyższe eksperymenty z testem aktywności antyapoptotycznej, w tym 3.1 i 3.2 w trzech powtórzeniach.

4. Test żywotności komórek

  1. Umyj leczone komórki, dodając 1 ml buforu 1x PBS przez 1 minutę 3 razy. Ponownie zawiesić komórki, pipetując 1 ml 1x bufor PBS zawierający 0,04% błękitu trypanowego i barwić przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Rozcieńczyć 0,4% roztwór błękitu trypanowego, mieszając 9 ml buforu 1x PBS i 1 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego.
  2. Przenieść 10 μl trypanowej zawiesiny komórek zabarwionych na niebiesko do hemocytometru za pomocą pipety P10 i policzyć żywotne nienaruszone komórki pod mikroskopem świetlnym.
  3. analiza statystyczna
    1. Oblicz zarejestrowane dane i przedstaw jako środki ± S.D. dla wszystkich obliczeń.
    2. Analizuj dane za pomocą dwustronnego testu t Studenta za pomocą programu Microsoft Excel. Zdefiniuj statystycznie istotne dane jako wartość P <0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełnowymiarowe białko oraz dwie inne wersje skrócone (domeny BIR i RING) Ly-IAP3 z LyxyMNPV wykazano nadekspresję w komórkach sf9, wykorzystując system pDHsp/V5-His/Spodoptera frugiperda oparty na szoku termicznym. Wektor pDHsp/V5-His zawiera promotor białka szoku termicznego Drosophila, który steruje ekspresją genu w temperaturze 42 °C przy udziale komórkowych czynników transkrypcyjnych i systemu translacji (Rysunek 1)8

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koncepcja systemu komórkowego pDHsp/V5-His/sf9 opartego na szoku cieplnym została po raz pierwszy opisana przez Clem i wsp. w 1994 r.8. Porównanie promotora genu bakulowirusa (IE1) i Drosophila hsp70 wykazało, że hsp70 miał wyższą skuteczność w komórkach komarów10. Ponadto, ze względu na indukcję szoku cieplnego, czas ekspresji białek może być precyzyjnie kontrolowany po obróbce szoku cieplnego. System ten został następnie zastosowany do ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Jian-Horng Leu z Instytutu Biologii Morskiej, National Taiwan Ocean University za dostarczenie 3 konstrukcji plazmidowych. Badania te były wspierane przez Grant 106-2311-B-197 -001 - z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antybiotyk-Antybiotyk, 100XGibco15240-062do hodowli komórek owadów
Certyfikowana płodowa surowica bydlęcaBioind04-001-1A
Sf-900 IISFM Thermo Fisher10902096pożywka do hodowli komórkowych bez surowicy
Komórki Sf9ATCCCRL-1711
25cm2 kolba do hodowli komórkowychNunc, Thermo Fisher156340
Mikroskopia w świetle odwróconymWHITEDWHITED WI-400
RBC HIT Competent CellBiomanRH618-J80Escherichia coli (DH5α)
L.B. Bulion (Miller)BiomanLBL407
Agar, klasa bakteriologicznaBiomanAGR001
ZeocinInvitrogenAntybiotyk anty-zn-1
selekcja PCR Master Mix (2X)ThermoFisherK0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (bez endotoksyn)GeneaidPIE25
Actinomycin DSIGMAA9415
Corning 50 ml probówki wirówkoweSIGMACLS430829-500EA50 ml
HemocytometrGizmo Supply CoB-CNT-SLDE-V2
24-dołkowy wielotalerzowyNunc, Thermo Fisher14247524-dołkowa płytka
Odczynnik Cellfectin IIThermo Fisher10362100odczynnik transfektyny komórkowej
PBS-buforowany fosforanem Sól fizjologiczna (10X) pH 7,4Thermo FisherAM9624
4 razy; SDS Loading DyeBiomanP1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)Membrany Merck MiliporeIPVH00010PVDF
System Mini Trans-Blot CellBIO-RED1703930Blottion
Roztwór PąsekS SIGMA6226-79-5
Anty-V5SIGMAV8137królicze przeciwciało
anty-V5Kozia peroksydaza chrzanowa anty-królikowa IgG (HRP)Jackson111-035-003
Tween 20Merck817072
6-dołkowy MultidishNunc, Thermo Fisher145380
0,4 % roztwór błękitu trypanowegoAMRESCOK940-100ML
P10 pipetmanGilsonF144802
P1000 pipetmanGilson
F123602 TaśmaSymbioPPS724-dołkowa taśma ( 19 mm i razy; 36 mln zł)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przej ciowa ekspresja gen windukcja szokiem termicznymanaliza Western blottest ywotno ci kom rekgen induktor apoptozyplazmidy do kotransfekcjiaktywno antyapoptotycznabakulowirusowy system ekspresyjny

Powiązane artykuły