Artykuł metodologiczny

Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek

DOI:

10.3791/56701

⸱

27 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Orthopaedic Surgery, Duke University Medical Center, 3Duke Molecular Physiology Institute, 4Center for Translational Pain Medicine, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje mysi model chirurgii ortopedycznej, który był używany do badania mechanizmów pooperacyjnego zapalenia nerwów i zmian w zachowaniu, a w połączeniu z parabiozą, do badania regeneracji tkanek podczas starzenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgia jest powszechnie stosowana w celu poprawy i utrzymania jakości życia. Niestety, u wrażliwych pacjentów, takich jak osoby starsze, mogą wystąpić powikłania i znacznie pogorszyć wynik. Rzeczywiście, po rutynowej operacji ortopedycznej w celu naprawy złamania aż 50% starszych pacjentów cierpi na powikłania neurologiczne, takie jak majaczenie. Ponadto zdolność do gojenia i regeneracji tkanek po operacji zmniejsza się wraz z wiekiem i może wpływać na jakość naprawy złamań, a nawet integracji kostnej implantów. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów, które napędzają te zależne od wieku zmiany, może zapewnić strategiczne cele w celu zminimalizowania ryzyka takich powikłań i optymalizacji wyników. W tym miejscu przedstawiamy klinicznie istotny mysi model złamania kości piszczelowej. Zmiany pooperacyjne u tych myszy naśladują niektóre z zaburzeń poznawczych powszechnie obserwowanych po rutynowych operacjach ortopedycznych u ludzi. Krótko mówiąc, nacięcie wykonuje się w prawej kończynie tylnej w ściśle aseptycznych warunkach. Mięśnie są rozłączone, a szpilka ze stali nierdzewnej o średnicy 0,38 mm jest wkładana do górnego grzebienia kości piszczelowej, wewnątrz kanału śródszpikowego. Następnie wykonywana jest osteotomia, a rana jest zszywana. Wykorzystaliśmy ten model do zbadania wpływu urazu chirurgicznego na pooperacyjne zapalenie nerwów i zmiany w zachowaniu. Stosując ten model złamania w połączeniu z parabiozą, modelem chirurgicznym, w którym 2 myszy są zespolene, zbadaliśmy komórki i wydzielane czynniki, które ogólnoustrojowo odmładzają funkcję narządów i regenerację tkanek po urazie. Postępując zgodnie z naszym protokołem krok po kroku, modele te mogą być odtwarzane z dużą wiernością i mogą być przystosowane do badania wielu szlaków biologicznych, które zostały zmienione przez uraz chirurgiczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgia przekształciła system opieki zdrowotnej i nieustannie przyczynia się do rozwoju technologii, poprawy bezpieczeństwa i utrzymania jakości życia. Niestety, operacja wywołuje również reakcje patofizjologiczne, które mogą prowadzić do powikłań pooperacyjnych, w tym infekcji ran, zaburzeń neurologicznych, a nawet śmiertelności, szczególnie u pacjentów w podeszłym wieku1,2. Chirurgia ortopedyczna jest wykonywana rutynowo, zwłaszcza u osób starszych, w celu poprawy jakości życia i naprawy typowych urazów kości. Jednak nawet 50% pacjentów po operacjach ortopedycznych w wieku 65 lat i starszych doświadcza zaburzeń neurologicznych, takich jak majaczenie pooperacyjne. To konsekwentnie koreluje ze złym rokowaniem, tj. 5-krotnym wzrostem ryzyka śmiertelności po 6 miesiącach, utrzymującym się pogorszeniem funkcjonalnym, wydłużeniem czasu opieki nad pacjentem, wydłużeniem czasu pobytu w szpitalu i wyższymi wskaźnikami umieszczania w domach opieki3,4,5. Zidentyfikowano pewne czynniki ryzyka, w tym zaawansowany wiek, ale niewiele wiadomo na temat mechanizmów odpowiedzialnych za zaburzenia neurologiczne po operacji.

Ponieważ złamania są bardzo częste u osób starszych, stworzyliśmy mysi model złamania kości piszczelowej, aby określić wpływ urazów obwodowych na powrót do zdrowia po operacji, w tym zapalenie nerwów i zdrowie mózgu (funkcje poznawcze)6,7. Model ten, pierwotnie opisany przez Harry'ego i wsp.8, składa się z śródszpikowego unieruchomienia i złamania piszczeli w znieczuleniu ogólnym i analgezji, a tym samym naśladuje uraz skóry, uraz mięśni i naprawę kości związane z powszechnymi złamaniami i naprawą kości długich u ludzi. Po tej procedurze myszy wykazują zmiany w markerach stanu zapalnego podobne do zmian obserwowanych u ludzi9,10, a także aktywację mikrogleju w hipokampie, co jest związane z deficytami pamięci deklaratywnej i neuroplastycznością hipokampa6,7,11. Wcześniej połączyliśmy ten model złamania z parabiozą. Parabioza to model chirurgiczny, w którym 2 myszy są zespolene, a tym samym mają wspólny układ krążenia. Model ten przyniósł przełom w zrozumieniu regulacyjnego wpływu krążących komórek i czynników humoralnych na funkcjonowanie narządów w kontekście wieku i choroby12,13,14. Korzystając z tego podejścia, niedawno odkryliśmy czynniki ogólnoustrojowe związane z gojeniem się złamań w zależności od wieku12.

Tutaj wprowadzamy protokół, który łączy model złamania kości piszczelowej z parabiozą, aby badać mechanizmy zależne od wieku od kości do mózgu, które są istotne dla medycyny regeneracyjnej i neuroimmunologii. Protokół 1A opisuje procedurę parabiozy, a Protokół 1B szczegółowo opisuje procedurę złamania kości piszczelowej (Ryc. 1A). Mogą one być wykonywane niezależnie lub w połączeniu, w zależności od charakteru przesłuchania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Duke'a.

1. Zwierzęta doświadczalne

  1. Trzymaj myszy w klimatyzowanym środowisku z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności i odpowiednim dostępem do standardowego jedzenia i wody. Nie więcej niż 5 rodzeństwa z miotu w klatce i unikaj warunków, które mogłyby zachęcać do walki.
  2. Użyj samic myszy C57BL6/J w wieku 3 miesięcy (młode) lub 18 miesięcy (stare).
  3. W przypadku parabiozy aklimatyzuj 2 myszy razem przez co najmniej dwa tygodnie przed zabiegiem. Myszy są albo typu dzikiego C57BL6/J, albo eGFP+.
  4. Codziennie sprawdzaj stan ciała i ogólny wygląd myszy.

2. Przygotowanie przedoperacyjne do parabiozy i chirurgii ortopedycznej

  1. Zważ 2 myszy.
  2. Znieczulenie ogólne należy podawać za pomocą systemu anestezjologicznego przy stałym natężeniu przepływuO2 wynoszącym 0,2 l/min. Do indukcji w komorze indukcyjnej należy użyć 5% izofluranu.
    UWAGA: Głębokość znieczulenia można potwierdzić za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  3. Umieść myszy na podgrzewanej podkładce w pozycji leżącej. Użyj sondy doodbytniczej, aby monitorować temperaturę ciała przez cały zabieg chirurgiczny.
  4. Aby utrzymać znieczulenie, należy obniżyć stężenie izofluranu wdychanego do 2,0% w ciągu 0,2 l/min przez maskę na twarz. Monitoruj, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
  5. Monitoruj parametry fizjologiczne (częstość oddechów, saturację tlenem i bicie serca) nieinwazyjnie za pomocą pulsoksymetru (opcjonalnie).

3. Chirurgia parabiozy (Protokół 1A)

  1. Analgezję należy podawać (buprenorfina, SR/o powolnym uwalnianiu, 0,1 mg/kg podskórnie) po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną. Wstrzyknąć bupiwakainę (0,25%) w boki tuż przed otwarciem. Zastosuj lubrykant do oczu.
    UWAGA: Protokół parabiozy może być wykonany niezależnie od złamania kości piszczelowej.
  2. Do wszystkich wewnętrznych szyć ciała należy używać materiału do szycia z polidioksanonu 4-0. Do wszystkich szyć zewnętrznych należy używać materiału do szycia polipropylenowego 4-0.
  3. Ogol każdą z 2 myszy wzdłuż ciągłej linii od łokcia, boku i kolana po stronie, która ma być połączona. Dezynfekuj jodem + 70% alkoholowym peelingiem do skóry w 3 naprzemiennych cyklach w ramach przygotowań do nacięcia.
    Używaj narzędzi sterylizowanych w autoklawie i utrzymuj sterylne pole.
    UWAGA: Umieść mysz typu dzikiego po prawej stronie myszy eGFP i przygotuj lewą flankę myszy typu dzikiego oraz prawą flankę myszy eGFP do operacji (Rysunek 1).
  4. Na każdej myszy użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż boku, rozciągając się od proksymalnego kolana do tylko proksymalnego łokcia i bez naruszania mięśni pod skórą.
  5. Połącz triceps zwierząt za pomocą 2 przerwanych szwów.
  6. Połącz ściany ciała wzdłuż boków za pomocą biegnącego, ciągłego szwu składającego się z 7-9 przejść.
  7. Połącz mięsień czworogłowy uda zwierzęcia za pomocą 2 przerwanych szwów.
  8. Zamknij skórę 2 parabiontów za pomocą przerwanych szwów.
  9. Pozwól myszom obudzić się w otaczającym powietrzu.
  10. Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, zdrowie par musi być utrzymane: monitoruj pary codziennie, wykonuj ocenę kondycji ciała dwa razy w tygodniu i waż pary dwa razy w tygodniu><. UWAGA: Każda para jest przechowywana indywidualnie.
    UWAGA: Jeśli używasz zwykłej buprenorfiny (tj. Nie SR/o powolnym uwalnianiu), podawaj 0,1 mg/kg podskórnie w 1 ml soli fizjologicznej na mysz dwa razy dziennie przez 3 dni.
  11. Odczekaj 4 tygodnie rekonwalescencji, aby zapewnić wspólne krążenie między parabiontami podczas wykonywania operacji złamania kości piszczelowej.

4. Operacja złamania kości piszczelowej (Protokół 1B)

  1. Analgezję (buprenorfina, 0,1 mg/kg mc. podskórnie) należy podawać po indukcji i przed manipulacją chirurgiczną. Wstrzyknąć bupiwakainę (0,25%) w miejsce operowane proksymalnie do kolana tuż przed otwarciem. Nałóż smar do oczu.
  2. Ogol przyśrodkową część prawej tylnej kończyny myszy, aby odsłonić obszar chirurgiczny, i zdezynfekuj jodem + 70% alkoholowym peelingiem skóry w 3 naprzemiennych cyklach. Utrzymuj sterylne pole operacyjne przez cały czas trwania zabiegu. Aby ograniczyć zanieczyszczenie; używać autoklawowanych narzędzi i rękawiczek; przeprowadzić operację pod mikroskopem preparacyjnym (opcjonalnie); i używaj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.
    UWAGA: Jeśli protokół jest wykonywany na parabiontach, tylko 1 mysz jest złamana w parze (prawa kość piszczelowa prawej myszy). Zobacz Rysunek 1B dla schematycznego schematu złamania na parabiontach.
  3. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż przyśrodkowej części prawej kończyny tylnej proksymalnie do kolana w dół do środkowej części kości piszczelowej po prawej stronie.
  4. Odsłoń środkową część kości piszczelowej i wizualnie zlokalizuj trzon. Zegnij kolano i uwidocznij płaskowyż piszczelowy, używając więzadła rzepkowo-udowego jako punktu orientacyjnego.
  5. Wizualizacja ścięgna rzepki; ręcznie wywierć, tocząc kciukiem i palcem wskazującym otwór o średnicy 0,5 mm w kanale śródszpikowym za pomocą igły o rozmiarze 25.
    UWAGA: Wywiercony otwór będzie przebiegał równolegle wzdłuż kości piszczelowej, przez płaskowyż piszczelowy.
  6. Włóż szpilkę ze stali nierdzewnej o średnicy 0,38 mm przez otwór na około 15 mm do jamy szpikowej, aż poczujesz opór, i przetnij równo z płaskowyżem kości piszczelowej za pomocą przecinaka do drutu (patrz film uzupełniający 1, aby zapoznać się z rekonstrukcją 3D).
  7. Za pomocą prostych nożyczek Bonn złam trzon środkowy kości piszczelowej (trzon). Zobacz Rysunek 1C dla schematycznego schematu złamania.
  8. Obserwuj wzrokowo miejsce złamania i sąsiednie tkanki, aby sprawdzić, czy wzrok złamania jest stabilny.
  9. Zamknij zszywkami skórnymi.
  10. Umieść myszy na podgrzewanych podkładkach, aby się zregenerowały, zanim włożysz je do czystej klatki domowej. Wstrzyknąć podskórnie 1 ml podgrzanej (37 °C) soli fizjologicznej w celu uzupełnienia płynów.
  11. Codziennie sprawdzaj myszy pod kątem oznak kulawizny, infekcji lub krwawienia.
    UWAGA: W przypadku stosowania zwykłej buprenorfiny (tj. Nie SR/o powolnym uwalnianiu) należy podawać 0,1 mg/kg podskórnie w 1 ml soli fizjologicznej dziennie przez 3 dni.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po starannym wykonaniu osteotomii poprzecznej w sterylnych warunkach, ze stałym wprowadzaniem szpilek i prawidłowym szyciem, myszy nie wykazywały żadnych oznak kulawizny, infekcji lub krwawienia w lewej nodze po operacji. Gojenie ortopedyczne oceniano za pomocą analizy radiograficznej i histomorfometrii po barwieniu Safraniną-O (Ryc. 2). Zdjęcia rentgenowskie złamanych kości piszczelowych trzonu wykazały więcej odkładania się tkanek w modzelach po złamaniach młodych myszy niż w modzelach po złamaniach u starszych myszy. Modzele złamań odwapniono i zatopiono w parafinie w celu przygotowania do analizy histologicznej. Skrawki wybarwiono Safraniną-O, a osadzanie tkanek określono ilościowo za pomocą analizy histomorfometrycznej. Modzele złamaniowe młodych myszy zawierały więcej kości i mniej tkanki zwłóknieniowej niż modzele złamaniowe u starszych myszy.

Złamanie kości piszczelowej wywołuje ogólnoustrojowe i ośrodkowe zapalenie6,7,11,15,16. Rzeczywiście, obwodowe poziomy cytokin prozapalnych i wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem (DAMP) są gwałtownie podwyższone po operacji ortopedycznej, zarówno u myszy, jak i ludzi7,17,18. Przyczynia się to do aktywacji komórek mikrogleju w mózgu poprzez kilka mechanizmów sygnalizacyjnych obejmujących szlaki humoralne, komórkowe i neuronalne7,15,19,20,21. Po operacji dysfunkcja śródbłonka, otwarcie bariery krew-mózg i naciek makrofagów obwodowych przyczyniają się do ostrego zapalenia nerwów hipokampa u dorosłych RFP/+ Cx3cr1GFP/+ sup class="xref">15,19 i są związane z późniejszymi deficytami pamięci, które przypominają ludzkie majaczenie i pooperacyjną dysfunkcję poznawczą15,19,22. Ta reakcja neurozapalna nasila się u starszych zwierząt, ze znaczącymi zmianami w morfologii mikrogleju, co wykrywa się za pomocą barwienia immunologicznego IBA-1 (Ryc. 3).

Korzystając z opisanego tutaj modelu złamania kości piszczelowej, znaleźliśmy również przejściowo upośledzoną neurogenezę hipokampa, o czym świadczy zmniejszenie podwójnego barwienia immunologicznego kortyny (DCX) w zakręcie zębatym20. Elektrofizjologiczne pomiary długotrwałego wzmocnienia (LTP), substytutu funkcji pamięci, ujawniły zależne od czasu zakłócenie neuroplastyczności po operacji11. Myszy po operacji wykazują również upośledzenie funkcji pamięci zależnej od hipokampa, na przykład przy użyciu oceny behawioralnej warunkującej strach (Ryc. 4). W warunkowaniu strachu myszy umieszcza się w komorze i wystawia na działanie sygnału słuchowego, po którym następuje bodziec awersyjny (tj. Wstrząs stopowy). Trzy dni po operacji piszczelowej myszy są testowane w komorze kondycjonującej, tym razem bez żadnej stymulacji słuchowej lub awersyjnej, a zachowanie podczas zamrożenia jest rejestrowane jako indeks pamięci (szczegółowy protokół znajduje się23).

Zaawansowany wiek jest krytycznym czynnikiem ryzyka pogorszenia pamięci. Jednak wraz z wiekiem zdolność do naprawy i regeneracji tkanek również maleje, chociaż mechanizmy te pozostają słabo poznane. W związku z tym użyliśmy opisanych tutaj protokołów do przeprowadzenia heterochronicznej parabiozy (parowanie młodych/starych zwierząt) i oceniliśmy gojenie się złamań u starszej myszy (szczegółowy protokół parabiozy znajduje się24). Potwierdzono podział krwi między parami parabiotyków i stwierdzono, że jest równy12. Ekspozycja na młodzieńcze krążenie poprawiła naprawę kości z wcześniejszym zrostem, zwiększonym odkładaniem się kości i zmniejszonym zwłóknieniem (Ryc. 5)12. To odmłodzenie regeneracji kości nastąpiło niezależnie od endogennych osteokalcynowo-dodatnich osteoblastów (Ryc. 5, brązowe komórki), ale raczej polegało na komórkach CD45-dodatnich, które migrowały z młodego parabiontu (Figura 5, niebieskie komórki). Wyniki te wskazują, że komórki krwiotwórcze CD45-dodatnie wydzielają młodzieńczą i zdrową niszę, która jest w stanie sygnalizować starzejącym się komórkom osteoblastycznym, indukując je do większej aktywności.

figure-results-1
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie parabiozy i operacji złamania kości piszczelowej. (A) Harmonogram wykonania parabiozy i złamania kości piszczelowej (protokół 1A) lub samego złamania kości piszczelowej (protokół 1B). (B) Piszczele 20-miesięcznych myszy w izochronicznych lub heterochronicznych parach parabiotycznych zostały złamane (prawa noga prawej myszy jest złamana, co oznaczono znakiem X). Szare myszy przedstawiają myszy typu dzikiego, podczas gdy zielone myszy przedstawiają myszy eGFP. (C) Schemat ideowy modelu złamania kości piszczelowej z unieruchomieniem śródszpikowym i złamaniem środkowej części trzonu. Zobacz także Dodatkowy film 1, aby zapoznać się z rekonstrukcją 3D tylnej kończyny i przypinaniem kości piszczelowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Gojenie złamań kości piszczelowej w młodych i starych modelach myszy. Piszczele młodych lub starych myszy były złamane, a modzele były badane 21 dni po urazie. (A) Obrazowanie radiograficzne i barwienie histologiczne (Safranina-O) zastosowano do oceny modzeli złamanych 21 dni po złamaniu. Barwienie pokazuje tkanki kolagenowe na niebiesko i proteoglikany (zawarte w chrząstce) na czerwono. Linie przerywane wskazują przybliżoną lokalizację modzela po złamaniu. (B) Histomorfometrię zastosowano do oceny ilości kości, chrząstki i tkanki zwłóknieniowej zdeponowanej w kalusie złamania 21 dni po złamaniu. Dane są wyrażone jako średnia ± 95% przedziałów ufności, *P<0,05, istotne statystycznie (jednoczynnikowa ANOVA, test Dunnetta), podziałka liniowa wynosi 2 mm, a obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu, obiektywu 1,25x. n = 9 dla każdej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Operacja indukowała zależną od wieku aktywację mikrogleju w hipokampie. Operacja złamania kości piszczelowej wywołuje większe zapalenie nerwów hipokampa u starszych myszy (20 miesięcy) w porównaniu z 4-miesięcznymi myszami C57BL6 / J. Barwienie wycinków mózgu markerem mikrogleju IBA-1 wykazuje więcej pozytywnych komórek i zmian morfologicznych w grupach chirurgicznych 24 godziny po zabiegu. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego o powiększeniu 100x.; Podziałka skali reprezentuje 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Upośledzona neurogeneza, długotrwałe wzmocnienie i funkcja pamięci po operacji złamania piszczeli. (A) DCX, ilościowy marker neurogenezy, jest znacznie zmniejszony w zakręcie zębatym hipokampa po 24 godzinach od operacji. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego obiektywu laserowo-skaningowego o powiększeniu 10x; Podziałka skali wynosi 10 μm. (B) Elektrofizjologia w wycinkach hipokampa od grupy kontrolnej lub myszy 24 godziny po operacji. Długotrwałe wzmocnienie (LTP) było indukowane przez stymulację o wysokiej częstotliwości (HFS) i rejestrowane przez 1 godzinę. Pobudzające potencjały postsynaptyczne pola (fEPSP) rejestrowano z warstwy promieniowej CA1 za pomocą zewnątrzkomórkowej pipety rejestrującej wypełnionej zwykłym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Po 24 godzinach od zabiegu indukcja LTP jest znacznie zmniejszona w porównaniu z myszami kontrolnymi. Dane są wyrażone jako średnia ± s.e.m. n = 3, * p < 0,05 1-kierunkowa ANOVA. (C) Funkcja pamięci zależnej od hipokampa (zdefiniowana jako % zamrożenia przy użyciu warunkowania śladowego strachu) jest upośledzona u myszy po operacji w porównaniu z grupą kontrolną i zwierzętami wystawionymi tylko na znieczulenie. Dane są wyrażone jako średnia ± s.e.m. n = 9-10, * p < 0,05 1-czynnikowa ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Chirurgia parabiozy prowadzi do odmłodzenia gojenia złamań, dzielenia się krwią i wszczepienia komórek dawcy. Ustalono pary parabiozy izochronicznej i heterochronicznej, a starzejąca się mysz w każdej parze została złamana i oceniona pod kątem gojenia się kości. (A) Modzele złamane badano za pomocą obrazowania radiologicznego. Linie przerywane wskazują przybliżoną lokalizację modzela po złamaniu. (B) Potwierdzono wszczepienie komórek eGFP+ w szpiku kostnym. (C) Immunohistochemię modzela po złamaniu wykorzystano do identyfikacji komórek dawcy eGFP+ (niebieskie) i komórek osteobalcynowych + osteoblastycznych (brązowe) z parabiontu. Paski skali reprezentują 50 μm, a obrazy uzyskano przy użyciu obiektywu 40x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Rekonstrukcja 3Dtylnej kończyny i przypięcie kości piszczelowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złamania są powszechnym problemem klinicznym i pozostają główną przyczyną zachorowalności, szczególnie w szybko rosnącej populacji seniorów. W tym miejscu wprowadzamy protokół krok po kroku dla mysiego modelu złamania kości piszczelowej w celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za pooperacyjne zapalenie nerwów i upośledzenie funkcji poznawczych. Model ten można połączyć z chirurgią parabiozy w celu zbadania interakcji neuroimmunologicznych, regeneracji tkanek i innych procesów sygnalizacyjnych. Zrozumienie tych mechanizmów pozwoli na określenie celów strategicznych w celu zminimalizowania ryzyka powikłań pooperacyjnych i optymalizacji wyników.

Opracowano kilka modeli ortopedycznych do badania naprawy kości u gryzoni25. Przyjęliśmy i zmodyfikowaliśmy tę procedurę złamania kości piszczelowej, pierwotnie opisaną przez Harry'ego i wsp.8, w celu zbadania wpływu chirurgii ortopedycznej na funkcjonowanie mózgu. Wykorzystaliśmy również ten model złamania w połączeniu z naszym modelem parabiozy, aby zbadać czynniki odpowiedzialne za gojenie się kości i regenerację tkanek w zależności od wieku. Wykonywana w znieczuleniu ogólnym w lotnym znieczuleniu ogólnym, ta procedura złamania kości piszczelowej wymaga tylko około 15 minut na zwierzę, powoduje zerową lub minimalną śmiertelność (w zależności od wieku myszy i podstawowej podatności genetycznej) i podsumowuje typowe urazy związane ze złamaniem kości długiej i ortopedycznym urazem chirurgicznym. W związku z tym model ten jest idealny do badania szlaków biologicznych i przeprowadzania ocen podłużnych. Jednak bardzo ważne jest, aby osteotomia i szpilkowanie były powtarzalne, a uszkodzenia tkanek miękkich były spójne. Uszkodzenie tkanek miękkich można modulować, na przykład poprzez zdzieranie okostnej i szczypanie otaczających mięśni, aby operacja była bardziej traumatyczna. Modele złamań urazowych wywołanych nieutrwalonym urazem lub zgięciem trzypunktowym nie zapewniłyby takiej spójności i dokładności. Zabiegi te często prowadzą do ponownego urazu, co prowadzi do przedłużonej reakcji zapalnej. I odwrotnie, modele złamań polegających na sztywnym unieruchomieniu mają bardziej umiarkowany stan zapalny, który nie oddaje w pełni uszkodzeń związanych z chirurgią ortopedyczną26,27.

Inne modele wykorzystujące pinowanie ze stopu tytanu zostały opracowane w celu ścisłego naśladowania ludzkiej endoprotezoplastyki i mogą być bardziej istotne w badaniu niestabilności protezy, osteolizy i powikłań związanych z protezą u myszy28,29. Modele z otworami wiertniczymi, takie jak ten przedstawiony tutaj, zapewniają odpowiednią stabilizację, a myszy mogą być testowane w paradygmatach behawioralnych bez znaczących deficytów, które mogłyby zakłócić takie zadania, jak warunkowanie strachu lub testowanie lokomocji/lęku w otwartym polu 6,7,11,15,19,20 . Jednak deformacje rotacyjne mogą wystąpić, jeśli fiksacja nie jest prawidłowo zablokowana. Niektóre modele wykorzystują zewnętrzny stabilizator, który zapewnia doskonałą stabilizację, ale jest trudny do wdrożenia w kości piszczelowej myszy, chociaż można go z powodzeniem zaimplementować w kości udowej myszy27.

Upośledzenie funkcji poznawczych, w tym majaczenie i pooperacyjne dysfunkcje poznawcze, są częstymi powikłaniami po operacjach ortopedycznych w celu naprawy złamań, zwłaszcza u pacjentów w podeszłym wieku i słabych30. Ten klinicznie istotny mysi model operacji złamania kości piszczelowej pokazuje, że pooperacyjne ogólnoustrojowe uwalnianie cytokin 6,7,17, upośledzona funkcja bariery krew-mózg15,19 i zmieniona morfologia mikrogleju16,22 przyczyniają się do upośledzenia pamięci i mogą stanowić krytyczne cechy pooperacyjnych powikłań neurologicznych obserwowanych u wielu pacjentów po ortopedii chirurgia. Należy zauważyć, że inne procedury chirurgiczne zostały wykorzystane do modelowania pooperacyjnej dysfunkcji poznawczej u myszy. Należą do nich chirurgia jamy brzusznej 31,32,33 i chirurgii naczyniowej34, a także urazy powierzchowne 35,36. Technika parabiozy ma zastosowanie do wszystkich tych modeli, które mają podobne punkty końcowe, w tym stan zapalny, aktywację glejową i deficyty behawioralne, w których mogą pośredniczyć wspólne mechanizmy.

Badania, które obejmują parabiozę, ujawniły nowe role czynników krążących, które mogą wpływać na funkcje poznawcze, zapalenie nerwów i odmładzanie tkanek u starszych zwierząt 37,38,39,40,41,42. Wykazaliśmy, że parabiozę można z powodzeniem połączyć z opisanym tutaj modelem złamania kości piszczelowej w celu zbadania szlaków regeneracyjnych i zbadania mechanizmów obejmujących czynniki przenoszone przez krew, które wpływają na gojenie i naprawę złamań12. Tutaj wykazaliśmy, że zdolność do naprawy złamań u starszego zwierzęcia może zostać odmłodzona, gdy starzejące się zwierzę zostanie zespolene z młodym zwierzęciem. To odwrócenie wieku było zakorzenione w wszczepieniu komórek krwiotwórczych w miejscu złamania. Co ciekawe, takie odmłodzenie można również osiągnąć poprzez przeszczepienie młodego szpiku kostnego starszym myszom. W związku z tym przeszczep szpiku kostnego można uznać za bardziej bezpośrednie i prostsze alternatywne podejście do parabiozy. Jednak parabioza jest bardziej solidnym modelem do badania funkcji krążących komórek i czynników. Oczekujemy, że połączenie modeli parabiozy i chirurgii ortopedycznej odegra ważną rolę w udzielaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące opieki okołooperacyjnej i biologii starzenia się.

Podsumowując, wprowadzamy protokół krok po kroku dla mysiego modelu złamania piszczeli w celu zbadania mechanizmów odpowiedzialnych za pooperacyjne zapalenie nerwów i upośledzenie funkcji poznawczych po ortopedycznych zabiegach chirurgicznych. Model ten można połączyć z procedurą parabiozy w celu zbadania interakcji neuroimmunologicznych, regeneracji tkanek i innych szlaków. Zdefiniowanie tych mechanizmów zapewni strategiczne cele w celu zminimalizowania ryzyka powikłań pooperacyjnych i optymalizacji wyników.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Kathy Gage, BS (Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, Durham, NC) za pomoc redakcyjną. NT dziękuje za wsparcie z grantu DREAM Innovation Grant od Duke Anesthesiology i NIH/NIA R01 AG057525-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluranePiramal HealthcareNDC 66794-017-25Można również stosować inne środki lotne lub znieczulenie iniekcyjne
BuprenorfinaReckitt-Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-6757-1Opcjonalnie i w zależności od indywidualnych zaleceń Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt
EtanolFisher Scientific04-355-45170% roztwór do leczenia antyseptycznego skóra i oczyszczanie
10% powidon JodDynarexDo antyseptycznego leczenia skóry
SomnoSuiteKent ScientificSS-01Low Flow  System anestezjologiczny
MouseSTATKent ScientificPS1161Pulsoksymetr i Golarka do monitora pracy serca
Wahl9854L
Mikroskop stereoskopowyLeicaMZ6
Rękojeść skalpelaNarzędzia do nauki precyzyjnej10003-12
Ostrza skalpela - #11Narzędzia do nauki precyzyjnej10011-00
Kleszcze AdsonNarzędzia do nauki precyzyjnej11006-12Potrzebne do usuwania okostnej
tęczówki KleszczePrecyzyjne narzędzia naukowe11066-07Przydatne (zęby 1x2) do powodowania miejscowego urazu mięśni/tkanek miękkich
Nożyczki Bonn (proste)Narzędzia do nauki14084-08Dobre do osteotomii, należy pamiętać, aby regularnie zmieniać, gdy staje się
Cienkie nożyczkiPrecyzyjne narzędzia naukowe14058-09Ostre nożyczki do przecinania szwów
22G x 3,5 In Quincke  Igła rdzeniowaBD405181Użyj wewnętrznego pręta do przypinania
Uchwyty igiełPrecyzyjne narzędzia naukowe12001-13
Wyglądszwu1079B
C57BL6/JJackson Laboratory  nr katalogowy 000664
eGFP+ (wszechobecna ekspresja wzmocnionego białka zielonej fluorescencji)Laboratorium Jacksona  Nr magazynowy 003291

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terrando, N., et al. Perioperative cognitive decline in the aging population. Mayo Clin Proc. 86 (9), 885-893 (2011).
  2. Lord, J. M., et al. The systemic immune response to trauma: an overview of pathophysiology and treatment. Lancet. 384 (9952), 1455-1465 (2014).
  3. Inouye, S. K., Westendorp, R. G., Saczynski, J. S. Delirium in elderly people. Lancet. 383 (9920), 911-922 (2014).
  4. Han, J. H., et al. Delirium in the emergency department: an independent predictor of death within 6 months. Ann Emerg Med. 56 (3), 244-252 (2010).
  5. Marcantonio, E. R., Flacker, J. M., Wright, R. J., Resnick, N. M. Reducing delirium after hip fracture: a randomized trial. J Am Geriatr Soc. 49 (5), 516-522 (2001).
  6. Cibelli, M., et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 68 (3), 360-368 (2010).
  7. Terrando, N., et al. Tumor necrosis factor-alpha triggers a cytokine cascade yielding postoperative cognitive decline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20518-20522 (2010).
  8. Harry, L. E., et al. Comparison of the healing of open tibial fractures covered with either muscle or fasciocutaneous tissue in a murine model. J Orthop Res. 26 (9), 1238-1244 (2008).
  9. Hirsch, J., et al. Perioperative cerebrospinal fluid and plasma inflammatory markers after orthopedic surgery. J Neuroinflammation. 13 (1), 211(2016).
  10. Neerland, B. E., et al. Associations Between Delirium and Preoperative Cerebrospinal Fluid C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Interleukin-6 Receptor in Individuals with Acute Hip Fracture. J Am Geriatr Soc. 64 (7), 1456-1463 (2016).
  11. Terrando, N., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 prevents surgery-induced cognitive decline. FASEB J. 27 (9), 3564-3571 (2013).
  12. Baht, G. S., et al. Exposure to a youthful circulaton rejuvenates bone repair through modulation of beta-catenin. Nat Commun. 6, 7131(2015).
  13. Brack, A. S., et al. Increased Wnt signaling during aging alters muscle stem cell fate and increases fibrosis. Science. 317 (5839), 807-810 (2007).
  14. Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90(2011).
  15. Terrando, N., et al. Resolving postoperative neuroinflammation and cognitive decline. Ann Neurol. 70 (6), 986-995 (2011).
  16. Terrando, N., et al. Stimulation of the alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Protects against Neuroinflammation after Tibia Fracture and Endotoxemia in Mice. Mol Med. 20 (1), 667-675 (2015).
  17. Vacas, S., Degos, V., Tracey, K. J., Maze, M. High-mobility group box 1 protein initiates postoperative cognitive decline by engaging bone marrow-derived macrophages. Anesthesiology. 120 (5), 1160-1167 (2014).
  18. Zhang, Q., et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464 (7285), 104-107 (2010).
  19. Degos, V., et al. Depletion of bone marrow-derived macrophages perturbs the innate immune response to surgery and reduces postoperative memory dysfunction. Anesthesiology. 118 (3), 527-536 (2013).
  20. Zhang, M. D., et al. Orthopedic surgery modulates neuropeptides and BDNF expression at the spinal and hippocampal levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (43), E6686-E6695 (2016).
  21. Lu, S. M., et al. S100A8 contributes to postoperative cognitive dysfunction in mice undergoing tibial fracture surgery by activating the TLR4/MyD88 pathway. Brain Behav Immun. 44, 221-234 (2015).
  22. Feng, X., et al. Microglia mediate postoperative hippocampal inflammation and cognitive decline in mice. JCI Insight. 2 (7), e91229(2017).
  23. Lugo, J. N., Smith, G. D., Holley, A. J. Trace fear conditioning in mice. J Vis Exp. (85), (2014).
  24. Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Ning, B., et al. Surgicallyinduced mouse models in the study of bone regeneration: Current models and future directions (Review). Mol Med Rep. 15 (3), 1017-1023 (2017).
  26. Giannoudis, P. V., Einhorn, T. A., Marsh, D. Fracture healing: the diamond concept. Injury. 38, Suppl 4. S3-S6 (2007).
  27. Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
  28. Yang, S. Y., et al. Murine model of prosthesis failure for the long-term study of aseptic loosening. J Orthop Res. 25 (5), 603-611 (2007).
  29. Zhang, T., et al. The effect of osteoprotegerin gene modification on wear debris-induced osteolysis in a murine model of knee prosthesis failure. Biomaterials. 30 (30), 6102-6108 (2009).
  30. AGS/NIA Delirium Conference Writing Group, Planning Committee and Faculty. The American Geriatrics Society/National Institute on Aging Bedside-to-Bench Conference: Research Agenda on Delirium in Older Adults. J Am Geriatr Soc. 63 (5), 843-852 (2015).
  31. Li, Y., et al. Deferoxamine regulates neuroinflammation and iron homeostasis in a mouse model of postoperative cognitive dysfunction. J Neuroinflammation. 13 (1), 268(2016).
  32. Tang, J. X., et al. Modulation of murine Alzheimer pathogenesis and behavior by surgery. Ann Surg. 257 (3), 439-448 (2013).
  33. Ren, Q., et al. Surgery plus anesthesia induces loss of attention in mice. Front Cell Neurosci. 9, 346(2015).
  34. Fan, D., Li, J., Zheng, B., Hua, L., Zuo, Z. Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment of Learning, Memory, and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression. Mol Neurobiol. 53 (1), 344-354 (2016).
  35. Rosczyk, H. A., Sparkman, N. L., Johnson, R. W. Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery. Exp Gerontol. 43 (9), 840-846 (2008).
  36. Zhang, X., et al. Surgical incision-induced nociception causes cognitive impairment and reduction in synaptic NMDA receptor 2B in mice. J Neurosci. 33 (45), 17737-17748 (2013).
  37. Villeda, S. A., et al. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 477 (7362), 90-94 (2011).
  38. Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med. 20 (6), 659-663 (2014).
  39. Smith, L. K., et al. beta2-microglobulin is a systemic pro-aging factor that impairs cognitive function and neurogenesis. Nat Med. 21 (8), 932-937 (2015).
  40. Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
  41. Sinha, M., et al. Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle. Science. 344 (6184), 649-652 (2014).
  42. Castellano, J. M., et al. Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice. Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model parabiozyoperacja z amania ko ci piszczelowejocena neurostanu zapalnegotest warunkowania l kowegom ody i stary myszefekty urazu chirurgicznegoanaliza naprawy ko cipami zale na od hipokampa

Powiązane artykuły