Artykuł metodologiczny

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

DOI:

10.3791/56736

⸱

26 lutego 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki rozprzestrzeniania chromatyny były szeroko stosowane do oceny dynamicznej lokalizacji różnych białek podczas gametogenezy, szczególnie dla spermatogenezy. Techniki te pozwalają na wizualizację wzorców lokalizacji białek i DNA podczas zdarzeń mejotycznych, takich jak parowanie chromosomów homologicznych, synapsa i naprawa DNA. Chociaż w literaturze opisano kilka protokołów, ogólne techniki rozprzestrzeniania chromatyny przy użyciu oocytów profazowych ssaków są ograniczone i trudne ze względu na czas inicjacji mejozy w jajnikach płodu. Dla porównania, spermatocyty profazowe można pobrać od młodych samców myszy z większą wydajnością bez konieczności mikrodysekcji. Jednak trudno jest uzyskać czystą zsynchronizowaną populację komórek na określonych etapach ze względu na niejednorodność mejotycznych i postmejotycznych populacji komórek rozrodczych w jądrze młodocianym i dorosłym. W przypadku późniejszych etapów mejozy korzystna jest ocena oocytów poddawanych mejozie I (MI) lub mejozie II (MII), ponieważ grupy dojrzałych oocytów można pobrać od dorosłych samic myszy i stymulować do wznowienia mejozy w hodowli. W tym miejscu opisano metody preparatów rozprowadzania chromatyny mejotycznej przy użyciu oocytów wypreparowanych z jajników płodu, noworodka i dorosłego wraz z towarzyszącymi demonstracjami wideo. Przypadki nieprawidłowej segregacji chromosomów w oocytach ssaków są częste, szczególnie podczas zawału mięśnia sercowego. Techniki te mogą być wykorzystywane do oceny i charakteryzowania skutków różnych mutacji lub ekspozycji środowiskowych na różnych etapach oogenezy. Ponieważ istnieją wyraźne różnice między oogenezą a spermatogenezą, opisane w niej techniki są nieocenione dla zwiększenia naszej wiedzy na temat oogenezy ssaków i dymorficznych płciowo cech dynamiki chromosomów i białek podczas mejozy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas spermatogenezy, duże półsynchroniczne fale mejotycznych komórek rozrodczych są szybko i nieprzerwanie uzupełniane w jądrze na początku dojrzewania i przez całe dorosłe życie1. W przeciwieństwie do mężczyzn, mejoza u kobiet jest inicjowana wyłącznie podczas rozwoju płodu. Po urodzeniu oocyty pozostają zatrzymane w przedłużonym stadium dyktacyjnym profazy I z nienaruszonym pęcherzykiem rozrodczym (GV; otoczka jądrowa) aż do okresu dojrzewania. Na początku okresu dojrzewania podzbiór oocytów jest cyklicznie selekcjonowany do wzrostu i dojrzewania, co oznacza rozpoczęcie wznowienia mejozy. Wznowienie mejotyczne w pełni rozwiniętych oocytach objawia się zanikiem GV w procesie znanym jako rozpad pęcherzyków rozrodczych (GVBD). Następnie oocyt ulega kondensacji i segregacji chromosomów, a następnie wytłaczaniu ciała polarnego. Oocyty zostają zatrzymane po progresji do MII i są stymulowane do zakończenia drugiego i ostatniego podziału mejotycznego dopiero po zapłodnieniu.

Płodność kobiet jest w dużym stopniu zależna od powodzenia progresji mejotycznej profazy I. Kluczem do tego jest tworzenie fizycznego połączenia między homologicznymi chromosomami, znanego jako chiasmata, w którym pośredniczy naprawa indukowanych pęknięć podwójnej nici DNA (DSB) poprzez rekombinację krzyżową2. Proces ten zachodzi w kontekście dynamicznego, bogatego w białka rusztowania znanego jako kompleks synaptonemalny (SC), który tworzy się między homologicznymi chromosomami, aby ułatwić ich synapsis3. SC jest trójdzielną strukturą przypominającą zamek błyskawiczny, która składa się z dwóch równoległych elementów bocznych połączonych białkami regionu centralnego, które utrzymują homologi razem podczas trwającej naprawy DNA. Przed synapsą między chromatydami siostrzanymi tworzą się prekursory elementów bocznych, zwane elementami osiowymi. Białka kompleksu synaptonemalnego, takie jak SYCP2 i SYCP3, tworzą elementy osiowe, które kolokalizują się w osiach kohezji siostrzanej chromatydy podczas wczesnej profazy. Służą one później jako miejsca wiązania dla białka włókna poprzecznego, SYCP1, które ułatwia składanie elementów centralnych i synapsę między wyrównanymi homologami4. W oocytach myszy na pełną synapsę wskazuje obecność 20 całkowicie nakładających się na siebie odcinków SYCP3 i SYCP1, które można uwidocznić za pomocą preparatów do rozprowadzania chromatyny. Synapsa jest zakończona po wejściu do podetapu pachytenu, w którym dojrzałe skrzyżowania, które są przeznaczone do tworzenia chiasmatów między homologami, są ozdobione dimerami mutL homolog (MLH1/3), aby promować ich dokładne przetwarzanie5,6,7. Strukturalne utrzymanie kompleksów chromosomów (SMC), w tym kohezyny, kondensyny i kompleksu SMC5/6, jest ważne dla regulacji dynamiki i struktury chromosomów podczas mejozy8,9,10,11,12. Łącznie zdarzenia te zapewniają prawidłową dwukierunkowość chromosomów homologicznych do przeciwległych biegunów wrzeciona po demontażu SC.

Mejotyczny cykl komórkowy to potężny model do badania ról różnych białek w utrzymaniu genomu dzięki programowanej indukcji i późniejszej naprawie DSB DNA. Co więcej, mejoza ssaków jest również istotnym modelem do badania modyfikacji epigenetycznych i imprintingu13. Jednak technicznie trudno jest ocenić te zdarzenia podczas mejozy żeńskiej, która ma miejsce w jajnikach płodowych i noworodkowych u ssaków (Ryc. 1). Profazę I można podzielić na 5 podetapów: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema i dictyate. W tym artykule opisujemy, jak wyizolować i rozróżnić jajniki i jądra płodu i noworodka (Rysunek 2). Adaptacja wcześniej opisanych metod, manuskrypt ten przedstawia również protokół (krok 1) z demonstracją wideo do przygotowania żeńskiej mejotycznej profazy I chromatyny rozprzestrzenia się14,15,16,17. W połączeniu ze znakowaniem immunologicznym, jak opisano w krokach 6-7, protokół ten umożliwia szczegółową analizę mikroskopową zdarzeń profazy I w oocytach.

Oogeneza jest podatna na błędy, a przypadki błędnej segregacji chromosomów podczas pierwszego podziału mejotycznego stanowią najczęstsze źródło chorób genetycznych u potomstwa18,19. W tym manuskrypcie (krok 2 protokołu) opisujemy protokół, w którym dojrzałe oocyty w stadium GV są ekstrahowane z przygotowanych jajników dorosłych samic myszy. W warunkach sprzyjających w pełni rozwinięte oocyty przechodzą niezależne od hormonu luteinizującego wznowienie mejozy po izolacji i hodowli20. Po wznowieniu mejozy oocyty przechodzą przez mejozę I, a następnie zatrzymują się w metafazie II. Oocyty pozostają zatrzymane w metafazie II, chyba że zostaną zapłodnione. W krokach 2–5 dostosowujemy wcześniej zgłoszone protokoły z demonstracją wideo, aby opisać, jak zbierać, hodować i przygotowywać oocyty MI i MII do preparatów rozprowadzających chromatynę21. Ta technika rozprzestrzeniania chromatyny pozwala na wyraźne znakowanie immunologiczne białek związanych z chromosomami. Co więcej, protokół ten może być również stosowany do rozróżniania chromosomów dwuwartościowych i jednowartościowych, a także może dodatkowo rozdzielać chromatydy pojedynczej siostry, aby ułatwić ocenę ploidii oocytów. Dlatego, oprócz ujawnienia wzorców lokalizacji białek mejotycznych, protokół ten może również służyć jako nieocenione narzędzie do wyjaśniania potencjalnych przyczyn nieprawidłowej segregacji chromosomów podczas MI i MII.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa. Eksperymenty przeprowadzono na myszach C57BL/6J typu dzikiego.

1. Pobieranie jajników płodowych lub noworodków i przygotowanie profazowych rozprzestrzeniania chromatyny

  1. Aby pobrać zarodki w 14,5–19,5 dniu po stosunku (dpc), należy złożyć ciężarne samice w ofierze poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2 zgodnie z wytycznymi IACUC.
    UWAGA: W przypadku jajników w 1. i 5. dobie porodowej przejdź do kroku 1.3. Rysunek 1 podsumowuje etapy profazy mejotycznej wzbogacone w różnym wieku embrionalnym i postnatalnym.
  2. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc otwór w kształcie litery V. Wyciąć róg macicy matki, oddzielić zarodki od łożyska i przenieść zarodki na szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierające 3 ml wstępnie podgrzanego 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Do utrzymywania temperatury można użyć inkubatora typu fliptop ustawionego na 37 °C. Ponadto szklany stolik o regulowanej temperaturze może być również używany do utrzymywania temperatury podczas manipulacji jajników.
  3. Za pomocą 3,5-calowych nożyczek chirurgicznych składaj w ofierze zarodki lub młode poprzez dekapitację zgodnie z wytycznymi IACUC. Umieść pozbawione głów zarodki lub młode we wstępnie podgrzanym PBS przed dalszą sekcją.
  4. Wycinaj po jednym zarodku lub młodym na raz na oddzielnej szalce Petriego o średnicy 35 mm, zawierającej 3 ml wstępnie ogrzanego PBS w temperaturze 37 °C. Kontynuuj, przecinając wzdłuż brzusznej linii środkowej tylnej połowy zarodka, wzdłuż przedniej połowy poniżej kończyn przednich i bezpośrednio nad tylnymi kończynami i ogonem, jak opisano w Rysunek 2A–B.
  5. Otwórz brzuch za pomocą 3,5-calowych nożyczek chirurgicznych. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przemieszcz lub usuń wątrobę i pętle jelit, odsłaniając jajniki na nowej szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej 3 ml wstępnie podgrzanego PBS w temperaturze 37 °C (patrz przewodnik w Rysunek 2B). Jajniki znajdują się bezpośrednio poniżej i za nerką w kierunku tylnej ściany jamy otrzewnej (Ryc. 2B–C). Przewodnik do rozróżniania gonad męskich i żeńskich znajduje się w Rysunek 2D.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne warunki, należy szybko wyciąć jajniki po złożeniu ciężarnej samicy w ofierze.
  6. Usunąć oba jajniki z każdego płodu żeńskiego za pomocą pary kleszczy z cienką końcówką pod lunetą preparacyjną i umieścić w okularach zegarkowych lub oddzielnych studzienkach wielodołkowej płytki zawierającej 0,5 do 1,0 ml wstępnie ogrzanego PBS i utrzymywać w temperaturze 37 °C.
  7. Umieść każdą parę jajników w 0,5 ml buforu hipoekstrakcyjnego (17 mM dwuwodnego cytrynianu trisodu, 50 mM sacharozy, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM tris-HCl, inhibitor proteazy, pH 8,2) w czystym szkiełku zegarkowym lub małym dołku z 9-dołkową płytką, upewniając się, że jajniki są całkowicie zanurzone. Inkubować przez co najmniej 15 minut, ale nie dłużej niż 30 min.
    UWAGA: Przygotuj świeży bufor hipoekstrakcyjny i zużyj w ciągu 2 godzin od dodania DTT.
  8. Podczas inkubacji, używając długopisu PAP z barierą hydrofobową, narysuj dwa kwadraty o wymiarach 22 x 22 mmna czystym szkle o grubości 25 x 75 mm2 i grubości 1 mm, jak pokazano w Rysunek 3A.
    UWAGA: Slajdy można przygotować z wyprzedzeniem.
  9. Odpipetować 45–50 μl 100 mM sacharozy na czysty szkiełko i przenieść jedną parę jajników do kropli.
  10. Używając ostrych końców dwóch igieł 27 G, rozsuń jajniki, aby uwolnić komórki do roztworu sacharozy. Za pomocą kleszczy usuń duże kawałki jajnika i ostrożnie odpipetuj roztwór sacharozy, aby rozproszyć komórki.
  11. Umieścić 40 μl roztworu utrwalającego (1% paraformaldehydu (PFA), 0,2% detergentu (patrz tabela materiałów), pH 9,2) w każdym kwadracie przygotowanego szkiełka. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl równomiernie rozprowadzić roztwór utrwalający na powierzchni szkiełka.
  12. Odpipetować pipetą 20 μl mieszaniny sacharozy na każdy kwadrat szkiełka zawierającego utrwalacz.
    UWAGA: Jest to równoznaczne z użyciem jednej pary jajników na szkiełku.
  13. Inkubować szkiełka w zamkniętej wilgotnej komorze przez noc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Inkubacja przez noc może trwać około (12-15 godzin) w temperaturze pokojowej.
  14. Otwórz pokrywę komory i pozwól szkiełkom całkowicie wyschnąć na powietrzu.
  15. Umyj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 0,4% roztworu środka zwilżającego PBS (patrz tabela materiałów) przez 2 minuty, wysusz na powietrzu i przejdź do protokołu znakowania immunologicznego (krok 6).
    UWAGA: Możliwe jest przechowywanie szkiełek w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, ale różni się to w zależności od interesującego białka. W celu uzyskania optymalnych wyników należy natychmiast przejść do protokołu znakowania immunologicznego (krok 6).

2. Kolekcja oocytów metafazy I

  1. Aby zmaksymalizować liczbę pęcherzyków antralnych wyizolowanych od każdej myszy, dootrzewnowo wstrzyknąć dojrzałym płciowo dziewiczym samicom myszy 5 IU gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG, znanej również jako gonadotropina kosmówkowa koni (eCG)).
    UWAGA: Aby uzyskać optymalną wydajność oocytów, myszy powinny mieć od 1 do 3 miesięcy, ponieważ liczba zebranych oocytów będzie się zmniejszać wraz z wiekiem. Aby przygotować PMSG, rozpuścić butelkę o stężeniu 5 000 j.m. w 100 ml sterylnego PBS (5 j./0,1 ml) Przechowywać w jednorazowych porcjach 600 μl w temperaturze -20 °C.
  2. Po 44–48 godzinach przygotować pożywkę, minimalną pożywkę niezbędną alfa (MEMα) uzupełnioną 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 3 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA; MEMα/BSA/FBS). Sterylizuj media przez filtr porów 0,2 μm. Zdekantować 2,5 ml pożywki MEMα/BSA/FBS do jednego szklanego naczynia na mysz i ogrzać do 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    UWAGA: Inne pożywki do zbierania i hodowli, które są dostępne na rynku (M2 i M16), są również powszechnie używane.
    Ostrzeżenie: Zalecamy wyjmowanie naczyń hodowlanych z inkubatora 5% CO2 pojedynczo przez ograniczony czas, aby zminimalizować narażenie na powietrze otoczenia podczas etapów manipulacji.
  3. Uśmierc myszy poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie CO2 zgodnie z wytycznymi IACUC.
  4. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc duży otwór w kształcie litery V. Za pomocą kleszczy przemieszcz jelita w kierunku głowy myszy. Zlokalizuj każdy róg macicy; Jajniki są obecne proksymalnie do klatki piersiowej. Przytrzymaj jajowód cienkimi kleszczami i odetnij tłuszcz nad jajnikiem za pomocą nożyczek preparacyjnych (Ryc. 4). Kontynuuj trzymanie jajowodu i za pomocą kolejnego zestawu drobnych kleszczyków uwolnij jajnik z kaletki i umieść w naczyniu zbiorczym zawierającym pożywkę MEMα/BSA/FBS.
    UWAGA: Podobnie jak w kroku 1, konieczne jest utrzymanie jajników w temperaturze 37 °C i utrzymanie na poziomie 5% CO2 . Można użyć inkubatora typu fliptop z podłączoną mieszanką do 5%CO2, aby umożliwić optymalne utrzymanie temperatury i poziomuCO2. Ponadto należy również zastosować szklany stolik o regulowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę podczas manipulacji oocytami.
  5. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 27 (lub podobnym rozmiarze) uwolnij kompleksy oocytów wzgórka, ręcznie nakłuwając duże pęcherzyki antralne.
  6. Obserwując przez mikroskop preparacyjny, zbierz oocyty w stopniu zaawansowania GV za pomocą szklanej pipety lub kapilary obsługiwanej przez usta lub ręcznej strzykawki mikrometrycznej (Ryc. 5). Pobieraj tylko te oocyty, które są uwalniane z pęcherzyków antralnych. Oocyty GV mają średnicę około 90 μm. oocyty GV mogą być otoczone 2-3 warstwami komórek ziarnistych, a ich łączna średnica wynosi około 200 μm.
  7. Hodować oocyty w czystym szkiełku zegarkowym lub 9-dołkowej płytce zawierającej pożywkę MEMα/BSA/FBS przez 6 godzin, aby osiągnąć metafazę I w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  8. Przejdź do kroku 4.

3. Kolekcja oocytów Metaphase II (MII)

  1. Aby zmaksymalizować liczbę oocytów wyizolowanych z każdej myszy, dootrzewnowo wstrzyknij dojrzałym płciowo dziewiczym samicom myszy 5 IU PMSG. Po 44–48 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG).
    UWAGA: Aby uzyskać optymalną wydajność oocytów, myszy powinny mieć od 1 do 3 miesięcy, ponieważ liczba zebranych oocytów będzie się zmniejszać wraz z wiekiem. Aby przygotować hCG, rozpuść butelkę o zawartości 10 000 j. w 200 ml PBS (5 j./0,1 ml). Przechowywać w jednorazowych porcjach 600 μl w temperaturze -20 °C.
  2. Po 12-14 godzinach przygotuj pożywkę do zbierania MEMα/BSA/FBS, jak opisano w kroku 2.2 powyżej.
  3. Uśmierc myszy poprzez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie CO2 zgodnie z wytycznymi IACUC.
  4. Otwórz jamę brzuszno-miedniczną za pomocą sterylnych nożyczek, tworząc duży otwór w kształcie litery V. Za pomocą kleszczy przemieszcz jelita w kierunku głowy myszy. Zlokalizuj każdy róg macicy, jajniki są obecne proksymalnie do klatki piersiowej. Przytrzymaj jajowód cienkimi kleszczami i odetnij tłuszcz nad jajnikiem za pomocą nożyczek preparacyjnych (Ryc. 4). Następnie usunąć jajnik i jajowód i umieścić w naczyniu zbiorczym zawierającym pożywkę MEMα/BSA/FBS.
    UWAGA: Podobnie jak w krokach 1 i 2, konieczne jest utrzymanie jajników w temperaturze 37 °C i utrzymanie na poziomie 5% CO2 . Można użyć inkubatora typu fliptop z podłączoną mieszanką do 5%CO2, aby umożliwić optymalne utrzymanie temperatury i poziomuCO2. Ponadto należy również zastosować szklany stolik o regulowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę podczas manipulacji oocytami.
  5. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z 27 g (lub podobnym rozmiarem) lub ostrymi kleszkami, wyrwij otwór w bańce jajowodu, aby uwolnić oocyty MII.
    UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić oocytów w bańce. Bańka będzie wyglądała na spuchniętą i przezroczystą, tak że oocyty będą widoczne (Ryc. 4).
  6. Pobrać oocyty MII z bańki jajowodu do nowego naczynia z pożywką za pomocą szklanej pipety lub kapilary obsługiwanej przez usta lub ręcznej strzykawki mikrometrycznej (Ryc. 5).
  7. Przejdź do kroku 4.

4. Usuwanie komórek jajowych i osłony przejrzystej

  1. Przygotować 300 j.m./ml hialuronidazy w pożywce MEMα uzupełnionej 3 mg/ml BSA w celu usunięcia oocytów z otaczających komórek wzgórka (2,5 ml/mysz) w szkiełku zegarkowym i utrzymywać w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Skuteczność hialuronidazy gwałtownie spada po 1 godzinie przygotowania. W przypadku oocytów zakwasowych MII leczenie hialuronidazą nie jest wymagane.
  2. Wystaw kompleksy komórek oocyta-wzgórek na działanie 300 j.m./ml hialuronidazy w MEMα/BSA przez 3 minuty w celu usunięcia oocytów z otaczających komórek wzgórka.
    Uwaga: Nie należy przekraczać 3 minut ekspozycji na hialuronidazę, ponieważ spowoduje to uszkodzenie oocytów.
  3. Aby umyć oocyty, przenieś oocyty do świeżo ogrzanego naczynia z pożywką MEMα/BSA. Za pomocą małej szklanej pipety lub kapilary obsługiwanej przez usta (nieco większej niż średnica oocytu, która wynosi około 90 μm), pipetuj kompleksy w górę iw dół, aby całkowicie odłączyć wzgórki. Pozwól oocytom zregenerować się w inkubatorze, przygotowując się do następnego kroku.
  4. Podgrzej kwaśny roztwór Tyrode'a, MEMα/BSA i pożywkę Waymouth do 37 °C (500 μL/mysz). Umieścić 300 μl w każdym dołku małych 9-dołkowych szklanych płytek.
  5. Aby usunąć osłonkę przejrzystą (ZP), przenieś 5–10 oocytów do roztworu Tyrode'a. Wystaw oocyty tylko na 30-45 s na działanie roztworu.
    UWAGA: Zbyt mała ekspozycja na roztwór nie usunie całkowicie ZP, co zapobiegnie pękaniu oocytów i rozprzestrzenianiu się chromosomów. Zbyt duża ekspozycja uszkodzi i zabije oocyt. Obserwowanie, jak ZP rozpuszcza się pod mikroskopem preparacyjnym, może pomóc w optymalizacji czasu ekspozycji.
    Uwaga: Stosowanie świeżego roztworu Tyrode ma kluczowe znaczenie, ponieważ jego funkcja pogarsza się wraz z wiekiem. Dla każdej grupy oocytów poddanych działaniu środka należy użyć świeżej studzienki z roztworem Tyrode'a, aby zapewnić równomierne trawienie ZP.
  6. Bezpośrednio po usunięciu ZP należy umyć oocyty, przenosząc je do podgrzanej pożywki MEMα/BSA/FBS. Powtórz ten krok prania.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przenoszenia, ponieważ oocyty łatwo sklejają się ze sobą i do szklanej pipety lub kapilary po usunięciu ZP. Wstępne zwilżenie szklanej pipety lub kapilary w pożywce Waymouth zminimalizuje sklejanie się oocytów.
  7. Przenieść i pozostawić oocyty do regeneracji przez 30 minut w pożywce Waymouth w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  8. Przejdź do kroku 5.

5. Rozprzestrzenianie się chromatyny oocytów MI i MII

  1. Za pomocą pisaka PAP narysuj prostokąt o wymiarach 11 x 44 mm2 na szkiełku, jak pokazano na Rysunek 6A.
  2. Pokryj szkiełko cienką warstwą utrwalacza (1% paraformaldehydu, 0,2% Triton-X 100 w H2O, pH 9,2), odpipetowując 100 μl utrwalacza na szkiełko i kołysząc szkiełkiem w przód i w tył. Stuknij w slajd, aby pozbyć się nadmiaru utrwalacza.
  3. Pobrać od 5 do 10 oocytów za pomocą małej igły do pipety doustnej z jak najmniejszą ilością pożywki i przeciągnąć igłę w linii przez szkiełko pokryte utrwalaczem, jednocześnie umieszczając oocyty z 1 cm powyżej szkiełka w roztworze utrwalającym. Wykonaj ten krok za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że oocyty zostały zdeponowane i że pękły.
    UWAGA: Oocyty powinny natychmiast pęknąć na szkiełku. Wysokość, na której odkładają się oocyty, wpływa na stopień rozprzestrzeniania się chromatyny. Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 6, aby uzyskać więcej informacji.
  4. Inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej w zamkniętej wilgotnej komorze przez noc, aby chromatyna mogła przylegać.
  5. Pozostawić szkiełka do całkowitego wyschnięcia na powietrzu i spłukać szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 0,4% środka zwilżającegoH2O, pH 8,0.
  6. Przejdź do kroku 6.

6. Znakowanie immunologiczne

  1. Przygotować bufor do rozcieńczania przeciwciał (ADB) opisany w Tabeli 1.
  2. Przygotuj dwa słoiki Coplin zawierające 50 ml roztworu buforu do płukania (WB) (10% ADB rozcieńczony w PBS) i jeden słoik Coplin zawierający 50 ml WB i 0,05% roztworu detergentu (np. dodać 250 μl 10% detergentu do 50 ml WB).
  3. Szkiełka przygotowane w sekcji 1 i 5 niniejszego protokołu myć przez 10 minut w jednym słoiku Coplin zawierającym 50 ml WB.
    Uwaga: Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek w żadnym momencie podczas znakowania immunologicznego.
  4. Myj szkiełka przez 10 minut w słoiku Coplin zawierającym 50 ml WB i 0,05% roztworu detergentu. Następnie umyj szkiełka w pozostałym słoiku Coplin zawierającym 50 ml roztworu WB przez 10 minut.
  5. Stuknąć nadmiar płynu i przykryć szkiełko 100 μl wybranych przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w ADB. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w zamkniętej wilgotnej komorze.
    UWAGA: Inkubację można skrócić do 2 do 3 godzin w temperaturze 37 °C. Należy użyć mniejszych objętości przeciwciał (np. 50 μl), przykrywając szkiełko szkiełkiem nakrywkowym lub parafilmem.
  6. Spłukać szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 0,2% roztworu środka zwilżającego PBS, pH 8,0.
  7. Powtórz kroki od 6.2 do 6.5.
  8. Strząśnij nadmiar płynu i przykryj szkiełko 100 μl wybranych przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w ADB. Inkubować szkiełka podstawowe przez 1–2 godziny w temperaturze 37 °C w zamkniętej komorze wilgotnej.
  9. Umyj szkiełka 2 razy przez 10 minut w słoikach Coplin zawierających 50 ml 0,2% roztworu środka zwilżającego PBS, pH 8,0.
  10. Myć szkiełka 2 razy przez 5 minut w słoikach Coplin zawierających 50 ml 0,2% środka zwilżającego - roztwór H2O, pH 8,0.

7. Montaż prowadnic

  1. W przypadku rozprzestrzeniania się chromatyny profazy przygotowanych w kroku 2 dodać 100 μl podłoża montażowego zawierającego 4', 6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI, 1,5 μg/ml). W przypadku rozsiewaczy chromatyny MI i MII przygotowanych w kroku 5 dodaj 50 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (1,5 μg/ml). Delikatnie zetrzyj nadmiar płynu.
  2. Na wierzch ułóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 60 mm i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Przechowywać w pudełku ze szkiełkami w temperaturze 4 °C lub -20 °C do czasu oceny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    UWAGA: Lekko postukaj w szkiełko nakrywkowe, aby pozbyć się nadmiaru medium montażowego przed uszczelnieniem lakierem do paznokci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy dwie techniki wizualizacji i oceny chromosomów mejotycznych w oocytach. Pierwsza technika jest przeznaczona do oceny progresji profazy w jajnikach zarodkowych i noworodkowych. Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny profatycznej są niezwykle cenne w wizualizacji wielu dynamicznych procesów podczas mejozy, w tym parowania chromosomów, synapsy i desynapsy, rekombinacji homologicznej i epigenetycznej przebudowy chromosomów. Tutaj wykazaliśmy użyteczność tej metody do solidnej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny pozwalają naukowcom chronologicznie badać mejozę samic ssaków i dynamiczną lokalizację zaangażowanych białek. Rozprzestrzenianie się chromatyny embrionalnej i noworodkowej pozwala na dokładną analizę zdarzeń w całej profazie mejotycznej. Rozprzestrzenianie się chromatyny w metafazie I i metafazie II można wykorzystać do odróżnienia chromatyd pojedynczej siostry od sparowanych sióstr i sparowanych chromosomów homologicznych, a także do oceny ploidalności. Dla porównania, opisany ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIGMS (R01GM11755) dla P.W.J oraz przez stypendium szkoleniowe od National Cancer Institute (NIH) (CA009110) dla G.H. i J.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4Jakość Biologiczna119-069-161
Szalki Petriego 60 mm x 15 mmDenvilleT1106
35mm x 12mmszalki Petriego DenvilleT1103
Kleszcze drobnoziarnisteVWR300-050
Nożyczki do mikropreparacjiTed Pella1340
Preparacja  nożyczki, ostra końcówka, 41/2"VWR82027-578
Kwadrat szklany zegarka 1 5/8Carolina Biological Supply Company742300Autoklaw przed każdym użyciem
SacharozaSigmaS8501
Cytrynian trisodowy dwuwodnySigmaS1804
EDTASigmaE6758
Trizma BaseSigmaT1503
1,4-Ditiothreitol (DTT)Sigma646563Dodać do buforu hipotonicznego bezpośrednio przed użyciem
50x Inhibitor proteazyRoche11873580001Dodać do buforu hipotonicznego bezpośrednio przed użyciem
Strzykawka Turberculin z igłą (1cc, 27 G x 1/2 cala)Becton, Dickinson (BD)309623
Szkiełka ze szkła ultra frost ze złotą uszczelką (25X75mm, grubość 1mm)Thermo3063-002
Długopis Super PAP, duży (bloker cieczy)Mikroskopia elektronowa Nauki (EMS)71310
16% wodny paraformaldehydMikroskopia elektronowa Nauki (EMS)15710
Triton X-100SigmaT8787Detergent w rękopisie
Komora wilgotnościowa do barwienia immunologicznegoEvergreen240-9020-Z10
Słoiki z kopinyFisher08-815
Photo-flo 200Mikroskopia elektronowa Nauki (EMS)74257Środek zwilżający w rękopisie
Gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy (PMSG)SigmaG4877Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20C
Ludzka gonadotropina kosmówkowa (HCG)SigmaC0434Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20C
PYREX Płytki punktowe z dziewięcioma wklęsłymi wgłębieniamiFisher13-748BAutoklaw przed każdym użyciem
Szklana kapilaraFisher22260943Do produkcji igieł do pobierania oocytów
Marka Parafilm MSigmaBR701501Do produkcji igieł do pobierania oocytów
Rurka z gumy lateksowej (średnica wewnętrzna 3,2 mm x średnica zewnętrzna 6,4 mm)Fisher14-178-5BDo produkcji igieł
do pobierania oocytówRurka z gumy lateksowej (średnica wewnętrzna 6,4 mm x średnica zewnętrzna 11,1 mm)Fisher14-178-5DDo produkcji igieł do pobierania oocytów
Elastyczny nosek z gumy silikonowej, ustnik z twardego plastiku i 15 cali rurki lateksowejSigmaA5177-5EADo produkcji igieł do pobierania oocytów
Głowica mikrometryczna Mitutoyo Mituoyo150-208Do wytwarzania igieł do pobierania oocytów
Strzykawka 5 mlBD Biosciences309646Do wytwarzania igieł do pobierania oocytów
Filtr strzykawkowy 0,45 μ m filtrCorning431220Do robienia igieł do pobierania oocytów
Szklana pipeta Pasteura 5 3/4"Fisher13-678-6ADo robienia igieł do pobierania oocytów
Końcówka do pipet 83 x 0,5 mmDenvilleP3080Do produkcji igieł do pobierania oocytów
α-MEMInvitrogen11415049
media WaymouthTechnologie życia
Płodowa surowica bydlęcaFisherA3160602
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA3311Do pożywki do hodowli oocytów
500 ml jednostki filtrujące 0,22umDenvilleF5227
HialuronidazaSigmaH3506
Tyrode' s roztwórSigmaT1788Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20C
Surowica końskaSigmaH-1270Do ADB / buforu płuczącego
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA1470Do ADB/buforu płuczącego
VECTASHIELD antifade medium montażowe z DAPIVector LabsH-1200
Szkiełka podstawowe mikroskopu (22mmx60mm)Fisher12-544-G
Bezbarwny lakier do paznokciAmazonN/A
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
mikroskopy
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Obserwator Z1Zeiss
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Primary Przeciwciała
Mouse anty-MLH1Life TechnologiesMA5-15431Współczynnik rozcieńczenia- 1:100
Królik anty-SYCP1Life TechnologiesPA1-16763Współczynnik rozcieńczenia- 1:1000
Kozioł anty-SCP3Santa Cruzsc-20845Współczynnik rozcieńczenia- 1:50
Ludzkie przeciwciała przeciwko białku anty-centromerowemu15-235Współczynnik rozcieńczenia- 1:100
Królik anty-TOPOIIAbcamab109524Współczynnik rozcieńczenia- 1:100
Mysz anty-histon H4 (di metylo K20, tri metylo K20)Abcamab78517Współczynnik rozcieńczenia- 1:500
Królik anty-Rec8Dzięki uprzejmości dr Karen SchindlerNie dotyczyWspółczynnik rozcieńczenia- 1:10 000
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała wtórne
Osioł anty-kozi IgG (H+L) Alexa Fluor 568 koniugatThermo-Fisher ScientificA-11057Współczynnik rozcieńczenia - 1:500
Osioł anty-mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488 sprzężonyThermo-Fisher ScientificA-21202Współczynnik rozcieńczenia- 1:500
Osioł anty-królik IgG (H+L) Alexa Fluor 647 koniugatThermo-Fisher ScientificA-31573Współczynnik rozcieńczenia - 1:500
Kozia anty-mysia IgG (H + L) Alexa Fluor 568 sprzężonaThermo-Fisher ScientificA-11004Współczynnik rozcieńczenia - 1:500
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-ludzkie IgG (H + L) z adsorbcją, Alexa Fluor 488Thermo-Fisher ScientificA-11013Współczynnik rozcieńczenia - 1:500
Kozia anty-królicza IgG (H+L) Alexa Fluor 568 sprzężonyThermo-Fisher ScientificA-11011Współczynnik rozcieńczenia - 1:500
11220035

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  2. Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
  3. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
  4. Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
  5. Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
  6. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
  7. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
  8. Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
  9. Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
  10. Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
  11. Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413(2014).
  12. Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
  13. Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
  14. Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
  15. Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
  16. Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
  17. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  18. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  19. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
  20. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  21. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
  22. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pozyskiwanie oocyt wprogresja mejozyoocyty mysielokalizacja bia ekmorfologia chromosom wsegregacja chromosom w w mejozieparowanie chromosom w homologicznychanaliza synapsisocena naprawy DNA

Powiązane artykuły