Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56739

⸱

2 kwietnia 2018

 ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Streszczenie

Ludzki gruczolak przysadki (PA) jest powszechnym nowotworem, który występuje w ludzkiej przysadce mózgowej w systemach osi narządów docelowych podwzgórze-przysadka, i może być klasyfikowany jako klinicznie funkcjonalny lub niefunkcjonalny PA (FPA i NFPA). NFPA jest trudna do wczesnej diagnozy i terapii ze względu na ledwo podnoszący poziom hormonów we krwi w porównaniu z FPA. Naszym długoterminowym celem jest wykorzystanie metod proteomicznych do odkrycia wiarygodnych biomarkerów do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych PA i rozpoznania skutecznych markerów diagnostycznych, prognostycznych i celów terapeutycznych. Zaprezentowano efektywną dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu z metodami spektrometrii mas (MS) w celu analizy ludzkich proteomów PA, w tym przygotowania próbek, elektroforezy żelowej 2D, wizualizacji białek, analizy obrazu, trawienia trypsyny w żelu, odcisku palca masy peptydowej (PMF) i tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). Procedury 2-wymiarowej spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą do elektroforezy żelowej PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS i chromatografii cieczowej 2DE (LC) MS/MS zostały z powodzeniem zastosowane w analizie proteomu NFPA. Za pomocą spektrometru mas o wysokiej czułości zidentyfikowano wiele białek metodą 2DE-LC-MS/MS w każdej plamce żelu 2D w analizie złożonej tkanki PA, aby zmaksymalizować pokrycie ludzkiego proteomu PA.

Wprowadzenie

PA to powszechny nowotwór, który występuje w ludzkiej przysadce mózgowej w systemach osi podwzgórze-przysadka, które odgrywają ważną rolę w ludzkim układzie hormonalnym. PA obejmuje klinicznie funkcjonalne i niefunkcjonalne PA (FPA i NFPA)1,2. NFPA jest trudna we wczesnej diagnostyce i terapii ze względu na tylko nieznacznie podwyższony poziom hormonów (np. LH i FSH) we krwi w porównaniu z FPA, który znacznie zwiększył poziom odpowiednich hormonów we krwi3,4,5. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych i odkrycie skutecznych biomarkerów ma istotne znaczenie kliniczne w diagnostyce, terapii i rokowaniu NFPA. Naszym długoterminowym celem jest opracowanie i wykorzystanie metod proteomicznych do badania NFPA w celu odkrycia wiarygodnych biomarkerów, wyjaśnienia jego mechanizmów molekularnych oraz rozpoznania skutecznych celów terapeutycznych, a także markerów diagnostycznych i prognostycznych. 2-DE w połączeniu z metodami MS były szeroko stosowane w naszym długoterminowym programie badawczym dotyczącym ludzkiego proteomu PA 1,2,6,7, w tym ustanowienie map referencyjnych proteomu3,8, analiza profili białek o zróżnicowanej ekspresji9,10,11,12,13, warianty hormonów14,15, modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja14 i nitracja tyrozyny16,17,18, proteomiczna odmiana inwazyjnej w stosunku do nieinwazyjne NFPAs19, oraz heterogeniczność proteomiczna podtypów NFPA13, co doprowadziło do odkrycia wielu ważnych sieci szlaków (dysfunkcja mitochondriów, dysregulacja cyklu komórkowego, stres oksydacyjny i nieprawidłowość systemu sygnalizacji MAPK), które są zmienione w NFPA13,19,20.

2DE rozdziela białka zgodnie z ich punktem izoelektrycznym (pI) (ogniskowanie izoelektryczne, IEF) i masą cząsteczkową (za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu, SDS-PAGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23. Jest to powszechna i klasyczna technika separacji w dziedzinie proteomiki, od czasu wprowadzenia koncepcji proteomu i proteomiki w 1995 roku24. SM jest kluczową techniką ustalania tożsamości białek oddzielonych od 2DE, w tym strategii PMF i MS/MS. Bardzo szybki rozwój instrumentów do MS, szczególnie w aspektach czułości wykrywania i rozdzielczości, w połączeniu z ulepszeniem systemu LC, znacznie poprawia tożsamość białek o niskiej lub bardzo niskiej liczebności w proteomie, aby zmaksymalizować pokrycie proteomu. Rzuca to również wyzwanie naszym tradycyjnym koncepcjom, że tylko jedno lub dwa białka są obecne w plamce żelu 2D w analizie złożonego proteomu tkanki ludzkiej i daje możliwość identyfikacji wielu białek w plamce żelowej 2D w analizie złożonego proteomu tkanki ludzkiej i maksymalizacji pokrycia proteomu NFPA.

Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS i 2DE-LC-MS/MS, które zostały z powodzeniem wykorzystane w analizie ludzkiego proteomu NFPA. Protokoły obejmują przygotowanie próbek, pierwszy wymiar (ogniskowanie izoelektryczne, IEF), drugi wymiar (SDS-PAGE), wizualizację białek (barwienie srebrem i barwienie niebieskim Coomassie), analizę obrazu żelu 2D, trawienie trypsyny w żelu, oczyszczanie peptydów tryptycznych, PMF, MS/MS i nasycanie bazy danych3,8,25,26. Co więcej, protokół ten łatwo przekłada się na analizę innych proteomów tkanek ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Medycznej Szpitala Xiangya Uniwersytetu Środkowo-Południowego w Chinach. Przez cały czas trwania eksperymentu należy nosić czapkę na głowę i rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia keratyną przez skórę i włosy8.

1. Przygotowanie próbek

  1. Pobrać tkanki PA (0,2 - 0,5 mg) z oddziału neurochirurgicznego. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przenieść do -80 °C w celu przechowywania.
  2. Dodaj 2 ml 0,9% NaCl do dejonizowanej wody destylowanej (ddH2O). Użyj tego roztworu, aby delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki (3x).
    Uwaga: ddH2O o przewodności 18,2 MΩ/cm jest używany w całym protokole. Część tkanki może zostać utracona podczas zmywania krwi z powierzchni tkanki.
  3. Dodać objętość (10 ml; 4 °C) roztworu zawierającego 2 M kwas octowy i 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolu na każde 0,5 - 0,6 g tkanki, homogenizować (1 min, 13 000 obr./min, 4 °C, 10x) za pomocą homogenizatora tkankowego, sonikować homogenat przez 20 s, liofilizować i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Zmierzyć zawartość białka w liofilizowanych, homogenizowanych próbkach za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA).
    nuta: Kwantyfikacja BCA nie jest kwantyfikacją bezwzględną, a zmierzony wynik zostanie zmieniony przez innego technika i czynnik eksperymentalny. Do różnych doświadczeń należy stosować wzorzec próbki o stałym stężeniu. W związku z tym ostateczna ilość białek dla każdego żelu 2D zostanie określona za pomocą obrazu o dobrej rozdzielczości zabarwionego srebrem lub Coomassie w wcześniej zaprojektowanych eksperymentach.
    1. Dodać około 300 μg liofilizowanej homogenizowanej próbki do jednej objętości (282 μl) buforu do ekstrakcji białek (8 M mocznika i 4% CHAPS), a następnie odstawić na 2 godziny, sonikować w łaźni wodnej przez 5 minut, obracać przez 1 h, ponownie sonikować w łaźni wodnej przez 5 minut, ponownie obracać przez 1 godzinę, i odwirować przy 15 000 x g przez 20 min.
    2. Przygotować roztwory wzorcowe BSA o stężeniach, jak wspomniano: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1,500, 2,000 μg/ml z dostępnym na rynku wzorcem BSA (2 mg/ml).
    3. Przed użyciem zmieszać odczynnik BCA A i B (A:B = 50:1) jako roztwór roboczy BCA.
    4. Dodać 0,1 ml próbki lub roztworu wzorcowego do 2 ml roztworu roboczego BCA w probówce do mikrofuge, następnie wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Na koniec schłodzić w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zmierzyć wartość średnicy zewnętrznej562 nm.
    5. Obliczyć standardową linię liniową (A562 nm w funkcji stężenia BSA), aby uzyskać równanie regresji do obliczenia zawartości białka w próbce o wartości A562 nm.
  5. Do barwienia srebrem należy użyć 150 μg liofilizowanej próbki równoważnej białku lub 500 μg białka do barwienia Coomassie w celu uzyskania 18-centymetrowego paska o unieruchomionym gradiencie pH (IPG) o pH 3-10 nieliniowym (NL).
    nuta: Suchy pasek IPG ma grubość 0,5 mm i szerokość 3 mm, różne długości, w tym 7, 11, 13, 18 i 24 cm, oraz różne zakresy pH, w tym pH 4-5, 4-7, 6-9 i 3-10 w liniowym lub nieliniowym gradieniu pH. Używany bufor IPG musi pasować do klasy strip27,28.
  6. 1.6. Dodać 250 μl buforu ekstrakcyjnego (7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% (w/v) CHAPS, 100 mM DTT (dodać przed użyciem), 0,5% v/v pharmalyte (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego).
  7. Utrzymuj roztwór w temperaturze poniżej 30 °C, następnie wiruj przez 5 minut, sonikuj przez 5 minut i obracaj przez 50 minut.
  8. Dodać 110 μl buforu nawadniającego (7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% (w/v) CHAPS, 60 mM DTT (dodać przed użyciem), 0,5% v/v buforu IPG (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego). Sonikacja przez 5 minut. Następnie obracać próbkę przez 50 minut, wirować przez 5 minut i wirować przez 20 minut przy 15 000 x g.
  9. Zebrać supernatant (350 μl) jako roztwór próbki białka8.

2. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa

  1. IEF (Pierwszy wymiar): Wykonaj IEF na izoelektrycznym systemie ogniskowania, jak opisano poniżej.
    1. Dodać 350 μl roztworu próbki białka do szczeliny w 18-centymetrowym uchwycie na paski IPG.
    2. Umieść 18-centymetrowy pasek IPG żelową stroną do dołu na roztwór próbki białka (unikaj pęcherzyków).
    3. Dodaj 3-4 ml oleju mineralnego, aby przykryć pasek IPG.
    4. Zamontuj uchwyt paska IPG w izoelektrycznym układzie ustawiania ostrości ze spiczastym końcem na tylnej (+) płytce i kwadratowym końcem na przedniej (−) płytce.
    5. Nawodnij się przez noc (~18 h w temperaturze pokojowej).
    6. Ustaw parametry IEF: maksymalny prąd 30 μA na listwę, 20 °C; 250 V, 1 h, 125 Vh, step and hold; 1 000 V, 1 h, 500 Vh, gradient; 8 000 V, 1 h, 4 000 Vh, gradient; 8 000 V, 4 h, 32 000 Vh, step and hold; oraz 500 V, 0,5 h, 250 Vh, step and hold. Niech działa do całkowitego czasu 7,5 godziny i 36 875 Vh.
    7. Po IEF wyjmij każdy pasek IPG i usuń nadmiar oleju mineralnego nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym. Teraz zawiń pasek w arkusz folii i przechowuj w temperaturze -80 °C.
      nuta: Uchwyt IPGstrip należy czyścić roztworem czyszczącym uchwytu IPGstrip i wodą destylowaną.
  2. SDS-PAGE (drugi wymiar): Wykonaj SDS-PAGE w pionowym systemie elektroforezy komórkowej
    nuta: Każdy rozmiar żelu SDS-PAGE powinien wynosić 255 x 190 x 1 mm.
    1. Użyj wielożelowego kółka, aby odlać żele rozdzielcze 12% PAGE. W przypadku odlewania żeli 12% PAGE należy wykonać następujące czynności.
      1. Dodać 270 ml ddH2O, 150 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 ml 40% (m/v) roztworu podstawowego akrylamidu/bisakryloamidu (29:1, 40% w/v akrylamidu i 1,38% w/v N, N'-metylenobisakryloamidu), 3 ml 10% nadsiarczanu amonu i 150 μl TEMED, aby uzyskać roztwór żelu w zlewce. Delikatnie wymieszaj i unikaj bąbelków.
      2. Delikatnie wlać roztwór żelu do komory multicastingu do oczekiwanej wysokości żelu (19 cm).
      3. Natychmiast dodaj około 3 ml ddH2O na każdy żel rozdzielczy, aby pokryć żele. Pozostaw żel do polimeryzacji przez około 1 godzinę.
    2. Przygotuj 20 l buforu do elektroforezy (25 mM Tris, 192 mM gliceryny i 0,1% SDS). Napełnij zbiornik buforowy jednostki separacji elektroforezy tym buforem.
    3. Wyjmij skoncentrowane paski IPG z zamrażarki i równoważ paski przez 10 minut, delikatnie kołysząc w 4 ml redukującego buforu równowagi (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M mocznika, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerol, 2% w/v DTT (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego).
    4. Równoważyć przez 10 minut, delikatnie kołysząc zredukowanymi paskami IPG w 4 ml buforu równowagi alkilacyjnej (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M mocznika, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glicerol, 2,5% w/v jodoacetamidu (dodać przed użyciem) i śladowe ilości błękitu bromofenolowego).
    5. Podczas równowagi żelu zdemontuj komorę multicastingu i wyjmij przygotowaną kasetę z żelem rozdzielczym. Spłucz 3x ddH2O. Usuń nadmiar ddH2O nierozpuszczalnym ręcznikiem papierowym i umieść w stojaku na żel.
    6. Wypłucz zrównoważone paski IPG buforem do elektroforezy i usuń nadmiar płynu z powierzchni paska IPG za pomocą nierozpuszczalnego ręcznika papierowego.
    7. Umieść pasek IPG na rozdzielczym żelu SDS-PAGE i pozwól, aby plastikowa strona paska IPG stykała się z dłuższą szklaną płytką i spiczastym końcem po lewej stronie.
    8. Wlej szybko 3-4 ml gorącej 1% agarozy do buforu do elektroforezy SDS (~80 °C), aby uszczelnić pasek IPG na wierzchu każdego żelu SDS-PAGE i połóż górną stronę paska IPG na górze krótszej szklanej płytki bez pęcherzyków, a następnie polimeryzuj przez 10 minut.
    9. Włóż zmontowaną kasetę żelową pionowo między plastikowe uszczelki w pionowym systemie elektroforezy. Umieść górną część żelu z paskiem IPG obok katody (−).
    10. Dostosuj poziom bufora do elektroforezy, aby zanurzyć kasetę z żelem.
    11. Podłącz i ustaw zasilacz/jednostkę sterującą w trybie stałego napięcia i pracuj pod napięciem 200 V przez około 370 minut, monitorując barwnik.
    12. Po uruchomieniu wyjmij kasetę z żelem z systemu elektroforezy i delikatnie wyjmij żel z kasety żelowej, unikając rozerwania żelu, a następnie zabarwienia białek oddzielonych od 2DE.
  3. Barwienie białek oddzielonych od 2DE
    1. Barwienie srebrem
      1. Delikatnie przenieś żel obiema rękami do tacki zawierającej 250 ml roztworu utrwalającego (50% metanolu (v/v) i 5% (v/v) kwasu octowego) i delikatnie potrząsaj żelem przez 20 minut.
      2. Wyrzuć roztwór i dodaj 250 ml 50% (v/v) metanolu do tacki i delikatnie wstrząsaj przez 10 minut.
      3. Wyrzuć metanol i dodaj 250 ml ddH2O do tacy. Wstrząsaj delikatnie przez 10 minut.
      4. Delikatnie wstrząsaj żelem przez 1 minutę w 250 ml buforu uczulającego zawierającego 0,02% (w/v) tiosiarczanu sodu i wyrzuć płyn.
      5. Delikatnie wstrząsaj żelem w 250 ml ddH2O przez 1 minutę (powtórz jeszcze raz). Wylej płyn po każdym kroku.
      6. Delikatnie wstrząsaj żelem przez 20 minut w 250 ml roztworu reakcyjnego srebra (0,1% (w/v) azotanu srebra z 200 μl 37% (v/v) formaldehydu dodanymi przed użyciem).
      7. Delikatnie wstrząsaj żelem w 250 ml ddH2O przez 1 minutę (powtórz jeszcze raz). Wylej płyn po każdym kroku.
      8. Delikatnie wstrząśnij żelem w 250 ml roztworu do wywoływania (3% (w/v) węglanu sodu z 100 μl 37% (v/v) formaldehydu dodanego przed użyciem), aż do uzyskania pożądanej intensywności barwienia (zwykle 1-3 min), a następnie wylać płyn.
      9. Delikatnie wstrząsaj żelem przez 10 minut w 250 ml roztworu zatrzymującego (5% (v/v) kwasu octowego) i wylej płyn.
      10. Delikatnie wstrząsaj przez 5 minut w 250 ml ddH2O i wylej płyn.
      11. Żel należy przechowywać w 250 ml roztworu 8,8% glicerolu w temperaturze 4 °C.
    2. Genialne niebieskie barwienie Coomassie
      1. Przygotować roztwór barwiący Coomassie, rozpuszczając Coomassie brylantowy błękit G250 0,3 g, siarczan amonu 25 g i kwas fosforowy 25 ml w ddH2O i do całkowitej objętości 200 ml. Przed użyciem dodaj metanol 50 ml.
      2. Do żelu dodać 250 ml roztworu barwiącego Coomassie i delikatnie wstrząsać w temperaturze pokojowej, aż pojawią się wyraźne plamki białkowe (~2-4 h). Wylej płyn.
      3. Dodaj 250 ml ddH2O i powoli wstrząsaj przez 5 minut, a następnie jeszcze dwa razy. Wylej płyn.
      4. Dodaj 250 ml roztworu odbarwiającego (20% (v/v) etanolu) i powoli wstrząsaj, aż kolor tła stanie się prawie bezbarwny, a następnie wyrzuć płyn.
      5. Zastąp świeży roztwór odbarwiający, gdy stary stanie się ciemny, i wylej płyn.
      6. Dodać 250 ml ddH2O i powoli wstrząsać przez 5 minut. Wylać płyn.
      7. Dodać 250 ml roztworu do przechowywania (8,8% glicerolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Dwuwymiarowa analiza obrazu elektroforezy żelowej
    1. Zdigitalizuj poplamione żele za pomocą skanera płaskiego.
    2. Wprowadź obraz do systemu analizy obrazu żelu 2D.
    3. Wykryj i określ ilościowo każde miejsce za pomocą oprogramowania do analizy obrazu żelu 2D zgodnie z protokołem producenta.
    4. Dopasuj plamy między różnymi żelami.

3. Identyfikacja białek oddzielonych od 2DE w SM

  1. Przygotowanie mieszaniny peptydów tryptycznych
    nuta: Należy używać silikonowanych lub o niskiej retencji probówek i końcówek do pipet, aby uniknąć utraty białek lub peptydów.
    1. Odbarwianie w żelu srebrnym
      1. Wyciąć plamy żelu do 1,5 ml silikonowanej probówki i przemyć w 500 μl ddH2O 6 razy.
      2. Umyty żel przełożyć do nowej silikonowanej tubki o pojemności 1,5 ml i zmielić na wiele małych kawałków (0,5-1 mm3).
      3. Przed użyciem odbarwić kawałki żelu w 20 μl roztworu odbarwiającego, który miesza część 30 mM żelazocyjanku potasu i część 100 mM tiosiarczanu sodu (1:1), aby brązowawy kolor zniknął (zwykle 1-2 min). Wylej płyn.
      4. Umyj kawałki żelu 20 μl ddH2O 5-6 razy, aby żółty kolor zniknął. Wylej płyn po każdym kroku.
      5. Do kawałków żelu dodać 20 μl 200 mM wodorowęglanu amonu i pozostać przez 20 minut. Umyć kawałki żelu ddH2O (20 μL, 1 raz). Wylej płyn.
      6. Odwodnić kawałki żelu za pomocą 30 μl acetonitrylu co najmniej dwa razy, aby kawałki żelu zmieniły kolor na nieprzezroczysty biały, a następnie odwirować próżniowo do suszenia przez 30 minut.
    2. Coomassie brylantowy niebieski żel odbarwiający
      1. Pokrój plamy żelu do silikonowanej probówki o pojemności 1,5 ml i przemyj 500 μl ddH2O co najmniej 3 razy.
      2. Umyty żel przełożyć do nowej silikonowanej probówki o pojemności 1,5 ml i zmielić na kilka kawałków (0,5-1 mm3) końcówką pipety.
      3. Odbarwić żel w 50-100 μl roztworu odbarwiającego (1:1 v/v zmieszać 200 mM NH4HCO3 z acetonitrylem) w zależności od objętości żelu, inkubować w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Powtórz i dodaj świeży roztwór odbarwiający, aż kolor zniknie (~1 h). Wylej płyn po każdym kroku.
      4. Umyj kawałki żelu raz 20 μl ddH2O.
      5. Odwodnić kawałki żelu w 100 μl acetonitrylu (co najmniej dwa razy), aby kawałki żelu zmieniły kolor na nieprzezroczysty biały.
      6. Suszyć próżniowo przez 30 min.
    3. Trawienie trypsyny w żelu białek w wysuszonych kawałkach żelu
      1. Rozpuścić 20 μg (833 pmol) liofilizowanej trypsyny w proszku w 100 μl 50 mM kwasu octowego.
      2. Rozcieńczyć 20 μl roztworu trypsyny (200 ng/μl) do 16 ng/μl w 230 μl 50 mM wodorowęglanu amonu.
      3. Dodać 20-30 μl (0,32-0,48 μg) rozcieńczonego roztworu trypsyny do każdej probówki zawierającej wysuszone kawałki żelu. Inkubować przez 18-20 godzin w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Pozostawić roztwór w temperaturze 4 °C na 30 minut.
      4. Delikatnie odwirowywać roztwór przez 10 s. Sonikować w łaźni wodnej przez 5-6 minut w temperaturze 30 °C, a następnie wirować przy 12 000 x g przez 2 minuty.
      5. Zebrać supernatant zawierający mieszaninę peptydów tryptycznych do 0,5 ml silikonowanej probówki.
    4. Oczyszczanie mieszaniny peptydów tryptycznych za pomocą mikrokolumny C18.
      1. Przemyć każdą kolumnę C18 acetonitrylem (10 μl, 5 razy), a następnie 50% acetonitrylem (10 μl, 5 razy).
      2. Zrównoważyć 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA) (10 μl, 5 razy).
      3. Odpipetować próbkę w górę i w dół przez przygotowaną kolumnę C18 15 razy.
      4. Przemyć próbkę 2x 10 μL 0,1% TFA.
        UWAGA: Oczyszczone peptydy tryptyczne są zatrzymywane w kolumnie C18.
      5. Dodaj objętość (6 μl) roztworu (85% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego) do czystej 0,5 ml silikonowanej probówki, delikatnie i powoli pipetować ten roztwór w górę iw dół przez kulki peptydu-C18 przez 10x, aby przemyć peptydy wiążące do roztworu, wysuszyć na powietrzu i przechowywać (−20 °C) do analizy MS.
  2. Analiza stwardnienia rozsianego
    1. Analiza PMF MALDI-MS
      1. Dodać 4 μl 85% v/v acetonitrylu/0,1% v/v TFA, aby rozpuścić oczyszczoną mieszaninę peptydów tryptycznych. Załadować 2 μl rozpuszczonej mieszaniny peptydów tryptycznych na płytkę MALDI i natychmiast dodać 2 μl roztworu kwasu cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) zawierającego 10 g/l w 500 ml/l acetonitrylu 1 mL/L TFA, a następnie wysuszyć na powietrzu.
      2. Załadować płytkę MALDI z mieszaniną peptydów tryptycznych do spektrometru mas MALDI-MS.
        nuta: Parametry przyrządu są ustawione jako tryb reflektora z napięciem przyspieszającym 20 kV, dodatnią polaryzacją i czasem opóźnienia ekstrakcji 160 ns. Każde widmo MS jest pozyskiwane za pomocą 200 strzałów laserowych o zakresie m/z od 1 000 do 4 000 po zewnętrznej kalibracji ze standardową masą peptydu.
      3. Użyj oprogramowania do przetwarzania widma MS, aby przetworzyć każde widmo MS, w tym korekcję linii bazowej, usuwanie szumów (5%) i deizotopowanie pików.
      4. Skoryguj listę mas z każdego widma MS z usunięciem mas zanieczyszczających z trypsyny, matrycy, keratyny i innych nieznanych zanieczyszczeń równolegle z eksperymentami z żelem ślepym.
      5. Wprowadź skorygowaną listę mas do oprogramowania do wyszukiwania białek opartego na PMF, aby zidentyfikować białka w bazie danych białek Swiss-Prot z następującymi parametrami wyszukiwania, w tym typ wyszukiwania PMF, człowiek, trypsyna z 1 maksymalnym pominiętym rozszczepieniem, stała karbamidometylocysteina, zmienne utlenianie metioniny, monoizotop, tolerancja masy peptydu 50 ppm, stan naładowania peptydu (1+) i sygnał do szumu (S / N) 5.0.
      6. Zidentyfikuj białka ze statystycznie istotnymi wynikami białek, a gdzie wynik białka = -10 × log(p), gdzie p jest prawdopodobieństwem, że obserwowane dopasowanie jest zdarzeniem losowym.
    2. Analiza MALDI-MS/MS
      1. Dodać 4 μl 50% v/v acetonitrylu/0,1% v/v TFA, aby rozpuścić oczyszczoną mieszaninę peptydów tryptycznych. Każda oczyszczona mieszanina peptydów tryptycznych (0,5 μl) została namierzona na 384-dołkowej płytce MALDI, natychmiast wykryta 0,5 μl nasyconej matrycy CHCA w 50% acetonitrylu/0,1% TFA na wierzchu próbki peptydu, a następnie wysuszona na powietrzu.
      2. Pozwól, aby MALDI-TOF-TOF MS/MS był zarządzany automatycznie, wykorzystując 100 strzałów laserowych do uzyskania jednego widma MS1 i gromadząc 6 powtarzających się widm MS1 w jednym syntetycznym widmie MS1.
      3. Ustaw 4 najbardziej intensywne jony prekursorowe z każdego syntetycznego widma MS1 do analizy MS/MS. Użyj 100 strzałów laserowych dla każdego jonu prekursorowego, aby uzyskać jedno widmo MS / MS i zgromadzić 4 powtarzające się widma MS / MS w jednym syntetycznym widmie MS / MS.
      4. Użyj syntetycznych danych MS/MS do wyszukiwania białek za pomocą oprogramowania do wyszukiwania białek opartego na MS/MS z parametrami takimi jak wyszukiwanie jonów MS/MS, ludzka baza danych Swiss-Prot, trypsyna z maksymalnie 1 pominiętym rozszczepieniem, stały karbamidometyl (C), zmienne utlenianie (M), monoizotopowa wartość masy, tolerancja masy peptydu ± 100 ppm i tolerancja masy fragmentu ± 0,7 Da.
      5. Zidentyfikuj białko o statystycznie istotnym prawdopodobieństwie na podstawie wyniku Mowse'a, a wynik jonów = -10 x Log(P), gdzie p jest prawdopodobieństwem, że obserwowane dopasowanie jest zdarzeniem losowym.
    3. Analiza LC-ESI-MS/MS
      1. Dodać 6 μl 5% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego, aby rozpuścić oczyszczoną mieszaninę peptydów tryptycznych.
      2. Do zarządzania całą operacją należy używać systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonego online ze spektrometrem mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI)-MS/MS z oprogramowaniem do zarządzania danymi pozyskanymi przez MS/MS.
      3. Użyć kolumny pułapki C18 (średnica wewnętrzna 300 μm × długości 5 mm) i kolumny C18 z odwróconymi fazami (średnica wewnętrzna 75 μm x długość 15 cm) ze stopniem separacji przy 98% rozpuszczalniku A (0,1% kwasu mrówkowego) i 2% rozpuszczalniku B (0,1% kwasu mrówkowego w 100% acetonitrylu) przez 2 min, 2% do 40% rozpuszczalnika B przez 45 min, 40% do 95% rozpuszczalnika B przez 5 minut i 95% rozpuszczalnika B przez 10 minut (łącznie 65 minut przy 300 nL/min).
      4. Ustaw tryb jonów dodatnich i tryb automatycznego przeglądu zależny od danych, aby uzyskać widma MS i MS/MS oraz ustaw dysocjację wywołaną zderzeniem (CID) dla fragmentacji jonów.
      5. Ustaw każdy skan MS na zakres masowy m/z 350-1 800 z rozdzielczością 100 000 przy m/z 400. Wykonaj skanowanie w poszukiwaniu 7 najbardziej intensywnych jonów w skanowaniu MS.
      6. Użyj oprogramowania do wyszukiwania białek I, opartego na MS/MS, aby przeszukać bazę danych w celu identyfikacji białek.
        1. Wybierz bazę danych białek ludzkich.
        2. Wybierz trypsynę z dozwolonym jednym pominiętym miejscem rozszczepienia.
        3. Ustaw tolerancję peptydów (±10 ppm), tolerancję jonów fragmentacyjnych (±0,8 Da), ładunek peptydowy (2+, 3+ i 4+), ustaloną karbamidometylację w cysteinie i zmienne utlenianie w metioninie.
        4. Ustaw wskaźniki fałszywych odkryć (FDR) <1%, a akceptowane są tylko peptydy o randze 1.
        5. Zidentyfikuj białko za pomocą PSM≥1 (PSM: Całkowita liczba zidentyfikowanych sekwencji peptydowych (PSM) białka, łącznie z sekwencjami zidentyfikowanymi nadmiarowo) i co najmniej dwoma unikalnymi peptydami na białko.
      7. Użyj również oprogramowania do wyszukiwania białek opartego na MS/MS II, aby przeszukać bazę danych w celu identyfikacji białek.
        1. Przekonwertuj nieprzetworzony plik MS na plik .mgf.
        2. Wybrano bazę danych białek ludzkich (uniprothuman_20161031.fasta, która zawiera 70940 sekwencji i 23897047 reszt).
        3. Wybierz trawienie trypsyny z maksymalnie 2 pominiętymi cięciami.
        4. Ustaw stały karbamidometyl (C), zmienny deamid (NQ) i utlenianie (M), tolerancja masy jonów prekursorowych 10 ppm, tolerancja masy jonów potomnych 0,8 Da i pik monoizotopowy.
        5. Zidentyfikuj białka o progu istotności 0,05 i co najmniej 2 unikalnych peptydach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

1. 2DE-MALDI MS PMF: Zgodnie z opisaną powyżej procedurą eksperymentalną, z tkanek NFPA wykazujących ekspresję FSH (kobieta; 50 lat, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+) i TSH (-)) wyekstrahowano łącznie 150 µg białek, które rozdzielono za pomocą paska IPG o długości 18 cm (pH 3-10 NL) oraz żelu SDS-PAGE w dużym formacie, a następnie wizualizowano za pomocą barwienia srebrem. Uzyskano powtarzalny i wysokiej jakości wzór żelu 2DE proteomu tkanki NFPA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

2DE, w połączeniu z metodami MS, w tym 2DE-MS PMF i 2DE-MS/MS, został z powodzeniem wykorzystany w naszym długoterminowym programie - wykorzystaniu proteomiki do badania ludzkich zmian proteomicznych NFPA i zmian sieci molekularnych w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych i odkrycia skutecznych biomarkerów dla NFPA. Proteomika porównawcza oparta na 2DE o dobrej odtwarzalności odgrywa ważną rolę w identyfikacji zmian proteomicznych NFPA 9,10,11,12,13,19, a 2DE w połączeniu z metodą ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81572278 i 81272798 dla XZ), granty z chińskiego projektu planu "863" (Grant nr 2014AA020610-1 dla XZ), Fundusze Szpitala Xiangya na Wprowadzenie Talentów (do XZ) oraz Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hunan (Grant nr 14JJ7008 dla XZ). Autorzy doceniają również wkład naukowy dr Dominica M. Desiderio z Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee. Począwszy od 2001 roku, X.Z. stale rozwijał i stosował metody 2DE-MS do analizy proteomu gruczolaka przysadki, opracował koncepcję niniejszego manuskryptu, napisał i poprawił manuskrypt, koordynował odpowiednie prace i był odpowiedzialny za wsparcie finansowe i odpowiednie prace. Y.L. brał udział w rewizji rękopisu. Y.H brał udział w zbieraniu piśmiennictwa i rewizji rękopisu. Ostateczny tekst został zatwierdzony przez wszystkich autorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ettan IPGphor 3 Izoelektryczny system ustawiania ostrościGE Healthcare
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone
System Ettan DALT IIAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany ZjednoczonePionowy system elektroforezy
Ettan IPGphor uchwyt na paskiAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Stany ZjednoczoneKółko Multigel
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City, CAMALDI-MS
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, spektrometr masowy BrukerMALDI-MS/MS
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, Stany ZjednoczoneSpektrometr masowy ESI-MS/MS
System EASY-nano LC Proxeon Biosystems, Odense, DaniaWysokosprawny system chromatografii cieczowej
Kolumna pułapkowa PepMap C18 300 μ m i.d. & czasy; Długość 5 mm; Dionex Corp., Sunnyvale, Kalifornia, USA
RP C18 kolumna75 &; m i.d., długość 15 cm; Dionex Corp., Sunnyvale, Kalifornia, Stany Zjednoczone
KimWipeKimvipe Nierozpuszczalny ręcznik papierowy
WatterWykonane przez elastyczny instrument
Homogenizator Polytron Model P710/35Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CAOprogramowanie do analizy obrazu żelu 2D
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (wersja nr 1.3.0.339)
OprogramowanieOprogramowanie do przetwarzania widma MS
OprogramowanieOprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na PMF   
maskotkaOprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na MS/MS
Oprogramowanie Proteome Discoverer v.1.3 betaOprogramowanie Thermo Scientific
Xcalibur v.2.1Oprogramowanie do zarządzania danymi pozyskanymi przez MS/MS 
Uniprot wersja 201410.1_HUMAN.fastaBaza danych białek ludzkich
SEQUEST (wersja nr 1.3.0.339) Oprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na MS/MS I
MASCOT (wersja 2.3.02) Oprogramowanie do wyszukiwania białek oparte na MS/MS II
C18 ZipTip mikrokolumnaMillipore
PeptideMass Standard kit BCA Pierce Perspective Biosystems
 Termo  Fisher Scientific23227
Zestaw 2-D Quant GEHealthcare80-6483-56
BIS-AKRYLAMIDAMRESCO0172
AKRYLAMIDAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
TiomocznikSigma-AldrichT8656
MocznikVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Nadsiarczan amonuAMRESCOM133
TrypsynaPromega, Madison, WI, USAV5111
Bufor IPG pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01
. PMFPURELAB DataExplore (ver. 4.0.0.0) Mascot Oprogramowanie Zestaw do oznaczania białek

Bibliografia

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteom gruczolaka przysadkiprzygotowanie pr bek bia ekogniskowanie izoelektryczneel SDS PAGEwizualizacja bia ektrawienie trypsyn w eluodcisk masy peptydowejtandemowa spektrometria mas
Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.