Artykuł metodologiczny

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/56743

⸱

14 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans jest najczęstszym patogenem grzybiczym u ludzi, powodującym około 15% przypadków sepsy nabytej w szpitalu. Główną cechą zjadliwości C. albicans jest jego zdolność do tworzenia biofilmów, strukturalnych zbiorowisk komórek przyczepionych do powierzchni biotycznych i abiotycznych. Biofilmy C. albicans mogą tworzyć się na tkankach gospodarza, takich jak warstwy błony śluzowej, oraz na wyrobach medycznych, takich jak cewniki, rozruszniki serca, protezy i protezy stawów. Biofilmy stanowią poważne wyzwanie kliniczne, ponieważ są wysoce odporne na zakłócenia fizyczne i chemiczne i mogą działać jako rezerwuary do zasiewania rozsianych infekcji. Do badania tworzenia biofilmu C. albicans wykorzystano różne testy in vitro, takie jak testy mikromiareczkowe, pomiary suchej masy, testy żywotności komórek i konfokalna skaningowa mikroskopia laserowa. Wszystkie te testy są testami pojedynczego punktu końcowego, w których tworzenie się biofilmu jest oceniane w określonym punkcie czasowym. W tym miejscu opisujemy protokół badania tworzenia się biofilmu w czasie rzeczywistym za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego w warunkach przepływu laminarnego. Metoda ta pozwala na obserwację powstawania biofilmu w miarę rozwoju biofilmu w czasie, przy użyciu konfigurowalnych warunków, które naśladują warunki gospodarza, takie jak te spotykane w cewnikach naczyniowych. Protokół ten może być wykorzystany do oceny defektów biofilmu mutantów genetycznych, a także hamującego wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na rozwój biofilmu w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans jest komensalnym członkiem ludzkiej mikrobioty, jednak jest również patogenem oportunistycznym, zdolnym do wywoływania powierzchownych i poważnych infekcji grzybiczych1,2. Główną cechą zjadliwości C. albicans jest jego zdolność do tworzenia odpornych i odpornych na leki biofilmów, społeczności komórek przylegających do powierzchni i zamkniętych w materiale macierzy zewnątrzkomórkowej1,3. Biofilmy C. albicans są wysoce ustrukturyzowane, zawierają kilka warstw wielu typów komórek (okrągłe pączkujące komórki w p....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hodowli komórek grzybów

UWAGA: Przeprowadzaj prace związane z hodowlą komórkową (np. otwieranie kriogenicznych probówek do hodowli komórkowych, probówek do hodowli komórkowych i kolb) w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Włącz lampę bakteriobójczą ultrafioletową (UV) szafki co najmniej 1 godzinę przed pracą i wyłącz lampę UV podczas aktywnej pracy w szafie. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy założyć rękawice, okulary ochronne i odpowiednie środki ochrony osobistej, a przed rozpoczęciem eksperymentu odkazić powierzchnię stołu i pipety 70% etanolem. Zaleca się stosowanie sterylnych końcówek filtrujących i znajomość podst....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy opisany tutaj test mikroprzepływowego biofilmu przy użyciu dzikiego szczepu C. albicans w dwóch warunkach pożywki (RPMI-1640 i Spider media), szczepu dzikiego typu w obecności znanego leku przeciwgrzybiczego amfoterycyny B (16 μg/mL) w RPMI, oraz dwóch zmutowanych szczepów, które wcześniej zgłaszały defekty w tworzeniu biofilmu (bcr1Δ/Δ i efg1 Δ/Δ) w pożywkach pająków.

Wideo 1 pokazuj.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj konfigurowalny test biofilmu mikroprzepływowego pozwala na wizualizację tworzenia biofilmu w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki po wystawieniu na działanie przepływu laminarnego o stałej szybkości i stałej temperaturze. Stanowi on potężny środek do badania rozwoju biofilmów w szczepach typu dzikiego i zmutowanego oraz wpływu leczenia środkami przeciwdrobnoustrojowymi na biofilmy w warunkach, które naśladują warunki fizjologiczne obserwowane w warunkach klinicznych. W przeciwieństwie do więk.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clarissa J. Nobile jest założycielką BioSynesis, Inc., firmy zajmującej się opracowywaniem inhibitorów i diagnostyki biofilmów C. albicans .

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Nobile za pomocne dyskusje na temat testów biofilmu. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (dla C.J.N.). Projekt D.L.R. był wspierany przez stypendium doktoranckie w Instytucie Uniwersytetu Kalifornijskiego dla Meksyku i Stanów Zjednoczonych (UC-MEXUS) oraz Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioFlux 1000zFluxionZautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do analizy żywych komórek
48-dołkowa płytka 0-20 dyneFluxion910-0047płytek mikroprzepływowych
Fluxionw wersji 7.8.4.0Oprogramowanie do analizy wizualizacji
Oprogramowanie ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
EkstraktdrożdżowyKryteriumC7341
Pepton baktonowyBD Biosciences211677
Dekstroza (D-glukoza)Fisher ScientificD163
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificP285-500
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
MOPSSigma-AldrichM3183
Bulion odżywczyKryterium C6471
Difco D-MannitolBD Biosciences217020
Kryterium agaroweC5001
Amfoterycyna BCorning30-003-CF
Sterylne pętle inokulacyjneVWR30002-094
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywkąFisher ScientificFB0875712
Kuwety jednorazoweFisher Scientific14-955-127
Papier do soczewekVWR52846-001
Spektrofotometr mikropłytkowy i kuwetowyInkubator wytrząsający BioTekEPOCH2TC
EppendorfM12820004
Oprogramowanie do montażu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
  2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
  3. Fox, E. P., Nobile, C. J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biofilm Candida albicansobrazowanie w czasie rzeczywistymtestowanie przeciwdrobnoustrojowemutanty genetycznecytometria przep ywowamikroskopia konfokalnanapr enie cinaj ceadhezja kom rkowa

Powiązane artykuły