Artykuł metodologiczny

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/56743

⸱

14 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans jest najczęstszym patogenem grzybiczym u ludzi, powodującym około 15% przypadków sepsy nabytej w szpitalu. Główną cechą zjadliwości C. albicans jest jego zdolność do tworzenia biofilmów, strukturalnych zbiorowisk komórek przyczepionych do powierzchni biotycznych i abiotycznych. Biofilmy C. albicans mogą tworzyć się na tkankach gospodarza, takich jak warstwy błony śluzowej, oraz na wyrobach medycznych, takich jak cewniki, rozruszniki serca, protezy i protezy stawów. Biofilmy stanowią poważne wyzwanie kliniczne, ponieważ są wysoce odporne na zakłócenia fizyczne i chemiczne i mogą działać jako rezerwuary do zasiewania rozsianych infekcji. Do badania tworzenia biofilmu C. albicans wykorzystano różne testy in vitro, takie jak testy mikromiareczkowe, pomiary suchej masy, testy żywotności komórek i konfokalna skaningowa mikroskopia laserowa. Wszystkie te testy są testami pojedynczego punktu końcowego, w których tworzenie się biofilmu jest oceniane w określonym punkcie czasowym. W tym miejscu opisujemy protokół badania tworzenia się biofilmu w czasie rzeczywistym za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego w warunkach przepływu laminarnego. Metoda ta pozwala na obserwację powstawania biofilmu w miarę rozwoju biofilmu w czasie, przy użyciu konfigurowalnych warunków, które naśladują warunki gospodarza, takie jak te spotykane w cewnikach naczyniowych. Protokół ten może być wykorzystany do oceny defektów biofilmu mutantów genetycznych, a także hamującego wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na rozwój biofilmu w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans jest komensalnym członkiem ludzkiej mikrobioty, jednak jest również patogenem oportunistycznym, zdolnym do wywoływania powierzchownych i poważnych infekcji grzybiczych1,2. Główną cechą zjadliwości C. albicans jest jego zdolność do tworzenia odpornych i odpornych na leki biofilmów, społeczności komórek przylegających do powierzchni i zamkniętych w materiale macierzy zewnątrzkomórkowej1,3. Biofilmy C. albicans są wysoce ustrukturyzowane, zawierają kilka warstw wielu typów komórek (okrągłe pączkujące komórki w postaci drożdży, owalne pseudostrzępkowe komórki i rurkowe komórki strzępkowe)4. Rozwój biofilmu C. albicans rozpoczyna się od przylegania okrągłych komórek drożdży do powierzchni (wysiewu biofilmu), po czym następuje proliferacja tych komórek na powierzchni, a następnie dojrzewanie niedojrzałej struktury biofilmu do w pełni uformowanego biofilmu, który jest otoczony materiałem macierzy zewnątrzkomórkowej4. Dojrzały biofilm składa się głównie z wydłużonych komórek strzępkowych, które tworzą gęste i łączące się sieci, zapewniając stabilność architektoniczną biofilmu4. Przez cały cykl życia biofilmu okrągłe pączkujące komórki drożdży rozpraszają się z dojrzałego biofilmu i mogą przemieszczać się do innych regionów ciała, powodując rozsiane infekcje lub zasiewając nowe biofilmy w innych miejscach4,5. C. albicans może tworzyć biofilmy na powierzchniach biotycznych, takich jak powierzchnie błony śluzowej i w całej tkance gospodarza, oraz na powierzchniach abiotycznych, takich jak cewniki, rozruszniki serca, protezy i protezy stawów. Ze względu na oporne właściwości biofilmów, są one niezwykle trudne do wyeliminowania, a w wielu przypadkach jedyną skuteczną strategią leczenia jest usunięcie zainfekowanego urządzenia4. Dlatego tak ważne jest zbadanie procesu powstawania biofilmu w warunkach podobnych do tych, które obserwuje się w warunkach klinicznych.

Istnieje kilka krytycznych modeli zwierzęcych in vivo wykorzystywanych do badania tworzenia biofilmu C. albicans6,7,8; jednak te badania mogą być kosztowne, czasochłonne i ograniczone przez liczbę szczepów i środków przeciwdrobnoustrojowych, które można przetestować w danym momencie. Z drugiej strony, testy biofilmu in vitro pozwalają na szybką, wysokoprzepustową ocenę związków przeciwgrzybiczych i zmutowanych szczepów oraz są znacznie bardziej opłacalne i etyczne niż testy biofilmu przeprowadzane na modelach zwierzęcych9,10,11,12,13,14. Tutaj opisujemy test in vitro, który opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy, aby obserwować czasowe tworzenie się biofilmu pod przepływem laminarnym za pomocą konfigurowalnego urządzenia mikroprzepływowego14,15. Test pozwala na wizualizację każdego etapu tworzenia biofilmu, w tym początkowego etapu przylegania, proliferacji komórek, dojrzewania biofilmu i dyspersji komórek. Test jest również przydatny do wizualizacji zmian morfologii komórek w trakcie rozwoju biofilmu.

Płytki mikromiareczkowe, które są zazwyczaj używane do testów biofilmu in vitro, mimo że są wysokoprzepustowe, nie pozwalają na kontrolowane warunki przepływu. Tradycyjne systemy komórek z przepływem laminarnym pozwalają na ciągłą ocenę tworzenia się biofilmu w warunkach kontrolowanego przepływu, ale ich konfiguracja jest często czasochłonna i zwykle mają ograniczoną kontrolę zakresu dynamiki i przepustowość. Zastosowane tutaj urządzenie mikroprzepływowe pokonuje te ograniczenia, łącząc płytki o wysokiej przepustowości (zawierające 48 dołków) z wbudowaną komorą przepływu laminarnego i jest wysoce powtarzalne, wszechstronne i konfigurowalne.

Tutaj opisujemy protokół użycia dostępnego na rynku automatycznego urządzenia mikroprzepływowego do oceny tworzenia biofilmu dzikiego szczepu C. albicans, wpływu znanego środka przeciwgrzybiczego na rozwój biofilmu oraz tworzenie biofilmu w dwóch zmutowanych szczepach (bcr1Δ/Δ i efg1 Δ/Δ), które wcześniej zgłaszano jako posiadające defekty biofilmu in vitro i in vivo16, 17,18. Opisany protokół może być wykorzystany do zbadania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych w hamowaniu tworzenia biofilmu przez cały okres rozwoju biofilmu oraz do identyfikacji genów wymaganych do prawidłowego rozwoju biofilmu poprzez badania przesiewowe bibliotek mutantów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hodowli komórek grzybów

UWAGA: Przeprowadzaj prace związane z hodowlą komórkową (np. otwieranie kriogenicznych probówek do hodowli komórkowych, probówek do hodowli komórkowych i kolb) w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Włącz lampę bakteriobójczą ultrafioletową (UV) szafki co najmniej 1 godzinę przed pracą i wyłącz lampę UV podczas aktywnej pracy w szafie. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy założyć rękawice, okulary ochronne i odpowiednie środki ochrony osobistej, a przed rozpoczęciem eksperymentu odkazić powierzchnię stołu i pipety 70% etanolem. Zaleca się stosowanie sterylnych końcówek filtrujących i znajomość podstawowych aseptycznych technik mikrobiologicznych.

  1. Szczepy Streak C. albicans (typ dziki, bcr1 Δ/Δ i efg1 Δ/Δ) na pożywkach agarowych z ekstraktem drożdżowym i dekstrozą peptonową (YPD) (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy; pH 6,8). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin, zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi19.
  2. Wybrać pojedynczą izolowaną kolonię z płytki do zaszczepienia w 4 ml płynnej pożywki YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy; pH 6,8) i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min w standardowym inkubatorze z wytrząsaniem przez 12 - 15 godzin, zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi19.
  3. Określ gęstość komórek hodowli, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 600 nm w kuwecie (1 ml, 1 cm długości ścieżki), postępując zgodnie ze standardowymi praktykami mikrobiologicznymi19.
  4. Rozcieńczyć kulturę komórkową do końcowego OD600 0,5, co odpowiada 2 x 107 komórek/ml, w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (zawierającej 165 mM kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS), L-glutaminy i bez wodorowęglanu sodu, pH 7,0) lub pożywce pająka (1% bulionu odżywczego, 1% mannitolu, 0,4%K2HPO4, pH 7,2).
    UWAGA: Alternatywne podłoża mogą być używane do wspierania specyficznego wzrostu szczepów będących przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Nie należy rozcieńczać komórek zbyt wcześnie. Zaleca się rozpoczęcie rozcieńczania po kroku 3.3 (opisanym poniżej), aby zapobiec inicjacji tworzenia strzępek przed wysiewem komórek w kanale obserwacji.

2. Przygotowanie kanałów mikroprzepływowych płytki mikroprzepływowej

UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi systemu mikroprzepływowego (patrz tabela materiałów), aby uzyskać informacje na temat płyt i ustawień instrumentu.

  1. Przed przeprowadzeniem eksperymentu mikroprzepływowego należy ogrzać 20 ml pożywki RPMI-1640 lub pożywki Spider w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Na podstawie obliczeń w kroku 2.8 może być wymagana dodatkowa objętość pożywki. Media do wstępnego podgrzewania zapobiegają tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas eksperymentu.
  2. Włącz system mikroprzepływowy, który składa się ze sterownika, dwóch zasilaczy, mikroskopu, kamery i komputera podłączonego do systemu. Otwórz oprogramowanie sterujące systemem (patrz tabela materiałów) z menu programu na komputerze. Po otwarciu programu pojawią się dwa okna.
  3. Znajdź numer kodu kreskowego używanej tabliczki i wprowadź numer, gdy pojawi się monit w oprogramowaniu. Użyj dwóch oddzielnych ekranów komputera, aby wyświetlić oprogramowanie w dwóch oknach. Jedno okno (moduł sterujący) zawiera elementy sterujące płytką, a drugie okno (Montaż, moduł obrazowania) zawiera elementy sterujące mikroskopu i kamery.
  4. Włączyć przycisk zasilania grzałki na sterowniku i ustawić temperaturę układu mikrofluidycznego na 37 °C za pomocą przycisków strzałek na regulatorze temperatury.
  5. Wyczyść płytkę interfejsu ( Rysunek 1) za pomocą sterylnej wody w następujący sposób. Spryskaj spód płytki sterylną wodą i użyj papieru do soczewek, aby usunąć brud/kurz. Połóż płytkę interfejsu stroną zadrukowaną do dołu na czystym papierze do soczewek do wyschnięcia na powietrzu. Wyczyść górną część płytki interfejsu za pomocą 70% izopropanolu i papieru do soczewek.
    UWAGA: Płytka interfejsu łączy układ mikroprzepływowy z płytą, która będzie zawierać ogniwa i media. Upewnij się, że nie pozostał żaden płyn i że wszystkie włókna i brud zostały usunięte. Niewłaściwe czyszczenie może skutkować niską jakością zdjęć i filmów.
  6. Usuń kondensację z rurek na płycie interfejsu.
    1. Pozostaw płytkę stroną zadrukowaną do dołu, spoczywającą na papierze do soczewek. W oknie modułu sterującego kliknij na tryb ręczny dla płyty. W sekcji menu kontroli ścinania kliknij wybór płynu dla kolumn 1 - 4 i 5 - 8, a następnie wybierz 37 °C z menu rozwijanego. W sekcji kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na 2 dyn/cm2 (0,2 Pa) (Rysunek 2A).
    2. Kliknij studzienki wlotowe, aby rozpocząć przepływ sterylnego powietrza przez rurki z płytą interfejsową w celu usunięcia kondensatu. Po 5 minutach kliknij przycisk stop w sekcji sterowania płytą studzienki (Rysunek 2A). Obserwuj rurki w płycie interfejsu, aby upewnić się, że cała kondensacja została usunięta. Jeśli kropelki są nadal widoczne, powtórz przepływ sterylnego powietrza, jak wspomniano powyżej, przez kolejne 5 minut.
      UWAGA: Rurki wlotowe są podłączone do filtrów 0,22 mikrona, aby zapewnić, że do systemu mikroprzepływowego wprowadzane jest tylko sterylne powietrze. Przepływ może być monitorowany przez dziennik zdarzeń na ekranie w oknie modułu sterującego.
  7. Umieść 48-dołkową płytkę mikroprzepływową 0-20 dynową na stoliku mikroskopu.

3. Tworzenie biofilmu Candida albicans w układzie mikroprzepływowym

  1. Aby zarejestrować tworzenie się biofilmu, dodaj 600 μl wstępnie podgrzanego podłoża RPMI-1640 lub pożywki pająka do studzienek wlotowych (patrz Rysunek 1 dla układu płytek). Posiadać dwie kontrpróby dla każdego warunku doświadczalnego.
    1. W celu zbadania tworzenia biofilmu szczepów C. albicans typu dzikiego i zmutowanego, należy dodać 600 μl pożywki Spider do studzienek wlotowych płytki doświadczalnej.
    2. W celu zbadania tworzenia biofilmu w obecności leków przeciwgrzybiczych (lub innych interesujących związków) dodać 600 μl pożywki RPMI-1640 do dwóch studzienek (kontrola ujemna) i 600 μl pożywki RPMI-1640 uzupełnionej amfoterycyną B (16 μg/ml) (lub lekiem z wyboru w pożądanym stężeniu) do dwóch innych studzienek wlotowych.
      UWAGA: W przypadku 12-godzinnego eksperymentu tworzenia biofilmu dodaj 600 μl wstępnie podgrzanego podłoża do studzienek wlotowych. W przypadku dłuższych eksperymentów należy dodać dodatkowe media (50 μl/h) do studzienek wlotowych. Nie przekraczać maksymalnej objętości studzienki (1 500 μL).
  2. Powoli opuść oczyszczoną płytkę interfejsu na 48-dołkową płytkę mikroprzepływową. Przesuń płytkę interfejsu lekko w lewo, aż rurki na płycie międzyfazowej zostaną umieszczone na górze studni wlotowej i wylotowej. Obróć dźwignię na płycie interfejsu od lewej do prawej, aby zablokować płytkę interfejsu na miejscu, upewniając się, że eksperyment jest szczelny.
    UWAGA: Przepływ sterylnego powietrza z rurek w płytce interfejsu spowoduje wypchnięcie cieczy do studzienek wlotowych lub wylotowych (w zależności od kierunku wybranego za pomocą oprogramowania na komputerze), tak że ciecz przepływa przez viewkanał między studnią wlotową i wylotową w niestandardowym kierunku i prędkości podyktowanej przez użytkownika.
  3. W sekcji kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na 1 dyn/cm2 (0,1 Pa). Kliknij na studzienki wlotowe z mediami, aby rozpocząć przepływ mediów ze studni wlotowych do wylotowych (Rysunek 2A), aby zalać kanał. Po 5 minutach kliknij przycisk stop w sekcji kontroli płytki studziennej. Zdejmij płytkę interfejsu i obserwuj dołki płytek mikroprzepływowych. Po zalaniu kanałów w studzienkach wylotowych powinna być widoczna tylko niewielka kropla media. Jeśli kropla nie jest widoczna, zalewaj kanały w odstępach 2-minutowych, aż będzie widoczna niewielka kropla mediów w studzienkach wylotowych.
    UWAGA: Zalewanie jest wymagane do usunięcia powietrza z viewkanały i upewnić się, że kanały są wypełnione żądanymi mediami.
  4. Wyjmij płytkę interfejsu z płytki mikroprzepływowej i odłóż ją na bok na sterylnej powierzchni. Dodać 50 μl hodowli komórkowej (opisanej w kroku 1.5) do każdego dołka wylotowego.
    1. W celu zbadania szczepów C. albicans typu dzikiego i zmutowanego, dodać 50 μl hodowli komórkowej typu dzikiego (SC5314) w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych, bcr1 Δ / Δ w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych i efg1 Δ/Δ w pożywce pająka do dwóch studzienek wylotowych. Umieść płytkę interfejsu z powrotem na płytce mikroprzepływowej i zablokuj pokrywę (patrz Rysunek 1 dla układu płytki).
      UWAGA: Jak opisano w kroku 3.1.1, wszystkie odpowiednie studzienki wejściowe zawierają media pająków.
    2. W celu zbadania tworzenia biofilmu C. albicans w obecności amfoterycyny B lub innego związku będącego przedmiotem zainteresowania, dodać 50 μl hodowli komórkowej typu dzikiego (SC5314) w pożywce RPMI-1640 do czterech dołków wylotowych. Umieść płytkę interfejsu z powrotem na płytce mikroprzepływowej i zablokuj pokrywę (patrz Rysunek 1 dla układu płytki).
      UWAGA: Jak opisano w kroku 3.1.2, wszystkie odpowiednie studzienki wejściowe zawierają media RPMI-1640 z amfoterycyną B lub innym związkiem zainteresowania lub bez nich.
  5. W sekcji kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na 2 dyn/cm2 (0.2 Pa). Kliknij na studzienki wylotowe z komórkami, aby rozpocząć przepływ pożywki od studzienek wlotowych do studni wylotowych (Rysunek 2A), aby rozpocząć wysiew C. albicans. Po 3 sekundach kliknij przycisk stop w sekcji kontrolnej płytki studzienki, aby zapobiec przedostawaniu się komórek do studzienek wejściowych.
    UWAGA: Ogniwa są przesuwane ze studzienek wylotowych w kierunku studni wlotowych; Istotne jest, aby przepływ został zatrzymany, zanim komórki dotrą do studzienek wlotowych. Gwarantuje to, że studzienki wlotowe nie zostaną zanieczyszczone kulturą komórkową i że pożywki w studzienkach wlotowych pozostaną sterylne przez cały czas trwania eksperymentu. Potrzebna siła ścinająca i czas zależą od lepkości użytych mediów i wielkości komórek.
  6. Pozwól komórkom pozostać nieruchomymi bez przepływu (0 dyn/cm2) przez 10 - 20 minut w kanale vieww celu początkowego przylegania komórek. Podczas tego 10-20-minutowego kroku przylegania skonfiguruj komputer tak, aby rejestrował pozycje stage kamery i rozpocznij rejestrowanie obrazów przed płukaniem (opisanych szczegółowo w sekcjach 4 - 6).

4. Ustawianie pozycji sceny dla eksperymentu mikroprzepływowego

UWAGA: Pozycje etapu i kalibracja płytki powinny być ustawione tuż przed rozpoczęciem eksperymentu. Ta konfiguracja umożliwia komputerowi przechowywanie pozycji każdego kanału oglądania w celu przechwytywania obrazów podczas eksperymentu. Płytka mikroprzepływowa nie powinna być naruszona po ustawieniu pozycji stolika. Jeśli płyta zostanie przesunięta, pozycje stage będą musiały zostać zresetowane przed rozpoczęciem eksperymentu.

  1. Użyj oprogramowania do analizy wizualizacji (patrz tabela materiałów), aby ustawić pozycje sceny; każdy kanał oglądania jest etapem (1 - 24) (Rysunek 1D), a każdy etap ma trzy podetapy (1 - 3) do przechwytywania obrazu w różnych miejscach wzdłuż kanału oglądania (Rysunek 1C). W oknie modułu obrazowania otwórz moduł 'Multi-dimensional Acquisition' (MDA), klikając zakładkę MDA (Rysunek 2B).
  2. W module MDA kliknij zakładkę 'Stage' w menu po lewej stronie (Rysunek 2B). W sekcji stage załaduj główną listę etapów dla 48-dołkowej płytki mikroprzepływowej 0 - 20 dyne. Każdy kanał oglądania powinien mieć trzy etapy pozyskiwania obrazu.
  3. Otwórz moduły 'Sample Reload Adjustment' () i 'Move Stage to Absolute Position' (MAP), klikając na zakładkę i zakładkę MAP (Rysunek 2B). W module naciśnij przycisk "Na żywo", aby zobaczyć podgląd obrazu z krzyżykiem.
  4. Za pomocą joysticka ustaw płytkę studzienki tak, aby końcówka strzałki (fizycznie znajdująca się na płytce) przylegająca do viewkanał 4 jest wyrównana z krzyżykiem na oprogramowaniu. W menu MAP naciśnij przycisk 'Set Origin' (Rysunek 2B). Bieżąca pozycja powinna teraz wskazywać 0 w X, Y i Z.
  5. W module kliknij sekcję "Początkowe punkty odniesienia" w menu po lewej stronie (Rysunek 2B). Kliknij "Ustawienia ładowania" i załaduj plik dla 48-dołkowej płytki mikroprzepływowej 0 - 20 dyne.
  6. W sekcji sceny modułu MDA kliknij dwukrotnie na "Pozycja sceny 22,2". Pozycja ta wskazuje środek (podstopień 2) kanału nadawania numer 22. Spowoduje to, że mikroskop viewstage i kamera ustawią ostrość w bliskiej odległości od znacznika strzałki, patrząc na kanał 22. Za pomocą joysticka ustaw płytkę studzienki tak, aby czubek strzałki (fizycznie znajdującej się na płytce) przylegający do viewkanał 22 zrównał się z krzyżem nitkowym.
  7. Skopiuj współrzędną Y w module MDA do pozycji Y w punkcie 2 w zakładce "Aktualizuj punkty odniesienia" modułu (Rysunek 2B).
  8. W zakładce 'Update Stage Positions' kliknij na 'Apply to MDA Stage List' (Rysunek 2B).
    UWAGA: Spowoduje to aktualizację wszystkich viewstage pozycje na płytce (1-24), które mają być skalibrowane do określonej pozycji płytki mikroprzepływowej na stoliku mikroskopu. Płyta jest teraz gotowa do akwizycji obrazu i będzie wykorzystywać skalibrowane pozycje stolika do poruszania się, jednocześnie rejestrując obrazy z trzech pozycji we wszystkich 24 kanałach view.

5. Ustawianie akwizycji obrazu podczas eksperymentu mikroprzepływowego

  1. W oknie modułu obrazowania użyj modułu MDA i kliknij zakładkę "Zapisz" w menu po lewej stronie (Rysunek 2B). Wybierz nazwę pliku eksperymentu i folder, w którym mają być przechowywane uzyskane obrazy na komputerze.
  2. W module MDA kliknij zakładkę "Timelapse" w menu po lewej stronie i ustaw ją tak, aby uzyskać łącznie 145 obrazów; ustaw timelapse między obrazami na 5 minut. Spowoduje to 1 obraz co 5 minut w 12-godzinnym eksperymencie rozwoju biofilmu.
    UWAGA: Przedział czasu między obrazami i całkowitą liczbę obrazów można dostosować w zależności od wymagań eksperymentalnych. W przypadku obrazowania trwającego dłużej niż 12 godzin, należy dodać dodatkowe podłoża do studzienek wlotowych w kroku 3.1, aby upewnić się, że studzienki nie wyschną. W przypadku dłuższych eksperymentów należy w razie potrzeby dodać dodatkowe podłoże (50 μl/h) do studzienek wlotowych.
  3. W module MDA kliknij zakładkę "długości fal" w menu po lewej stronie (Rysunek 2B) i ustaw liczbę długości fal dla eksperymentu na 1. Ustaw długość fali do przechwytywania na 50% jasnego pola i 50% kamery z czasem naświetlania 12 - 20 ms, wzmocnieniem 0,6 i digitizerem 20 MHz.
    UWAGA: Można użyć dodatkowych długości fal, w tym długości fal do obrazowania fluorescencyjnego (na przykład udało nam się zwizualizować szczepy C. albicans oznaczone mCherry i GFP za pomocą tego urządzenia mikroprzepływowego). Parametry akwizycji mogą być również zmieniane w oparciu o wymagania eksperymentalne. Na przykład ustawienie drugiej długości fali i wybranie opcji "Autofokus w każdym punkcie czasowym" oraz trzeciej długości fali i wybranie opcji "Automatyczna ekspozycja w każdym punkcie czasowym" jest zalecane dla początkujących, aby zmaksymalizować możliwości pozyskiwania obrazu, który jest ostry.
  4. W module MDA wybierz zakładki z listą etapów w menu po lewej stronie. Zostaną wyświetlone stopnie 1,1 – 24,3. Jeden po drugim klikaj każdy etap i użyj precyzyjnych ustawień ostrości, aby ręcznie ustawić ostrość na komórkach w kanale wyświetlania dla każdego etapu. Gdy pole widzenia jest już ostre, kliknij czarną strzałkę obok listy etapów, aby zaktualizować i zapisać ustawienia dla każdego etapu. Komputer użyje tych ręcznie zdefiniowanych ustawień pozycji i ustawień ogniskowej do uzyskiwania obrazów w każdym punkcie czasowym. Usuń wszystkie nieużywane etapy z listy za pomocą strzałki 'Usuń'.
    UWAGA: Moduł MDA i program odnoszą się zamiennie do kanałów view, a oprogramowanie używa tej samej terminologii.

6. Przeprowadzanie eksperymentu mikroprzepływowego

  1. W oknie modułu obrazowania, korzystając z modułu MDA, wybierz opcję "Acquire" (Pobieraj), aby rozpocząć przechwytywanie obrazów przylegających komórek przed płukaniem dla wszystkich podetapów ( Rysunek 2B).
    UWAGA: Okno modułu obrazowania i elementy sterujące kamery będą teraz pokazywać przechwytywane obrazy, a moduł MAP, i MDA nie będzie już widoczny. Na przechwyconych obrazach pojawi się również licznik czasu z boku, wskazujący numer przechwytywanego obrazu i upływ czasu przed rozpoczęciem następnego cyklu przechwytywania obrazu. Poczekaj na przechwycenie jednej rundy obrazów, zanim przejdziesz do następnego kroku.
    UWAGA: Nie należy używać przycisków "Pauza" lub "Oznacz zdarzenie" na ekranie okna modułu obrazowania. Od tego momentu podczas eksperymentu trzymaj mysz tylko na oknie modułu sterującego na drugim ekranie komputera (Rysunek 2A). Jest to ważne, aby uniknąć zakłóceń w oknie modułu obrazowania.
  2. W oknie modułu sterującego pozostań włączony tryb ręczny dla płyty. W sekcji kontroli ścinania ustaw tryb przepływu na stały i ustaw maksymalne ścinanie na 1 dyn/cm2 (0,1 Pa). Kliknij studzienki wylotowe O1, O7, O13 i O19, aby rozpocząć przepływ mediów ze studni wlotowych do studni wylotowych (Rysunek 2A) w celu usunięcia nieprzylegających komórek. Po 5 minutach kliknij przycisk stop w sekcji kontroli płytki studziennej. Poczekaj na uzyskanie drugiej rundy obrazów. Obrazy mogą być wizualizowane, a upływ czasu może być monitorowany na drugim ekranie w oknie modułu obrazowania.
  3. W sekcji kontroli ścinania dostosuj maksymalny przepływ ścinania do 0.5 dyn/cm2 (0.5 Pa), klikając liczbę w kolumnie maksymalnego ścinania i używając klawiatury, aby wprowadzić 0.5. Naciśnij Enter na klawiaturze i potwierdź zmianę natężenia przepływu w dzienniku zdarzeń w oknie modułu sterującego (Rysunek 2A). Pozostaw eksperyment w spokoju w ciemności na 12 godzin
    UWAGA: Ekspozycja na światło i ruch/wibracje może znacznie obniżyć jakość obrazów uzyskanych podczas eksperymentu. Pod koniec eksperymentu mikroprzepływowego okno modułu obrazowania nie pokaże żadnych obrazów i powróci do wyświetlania modułów, MAP i MDA. Oprogramowanie modułu obrazowania może być używane do przeglądania obrazów, montażu filmów i ilościowego określania powstałych biofilmów (opisanych poniżej).

7. Analiza wyników

  1. W oknie modułu obrazowania wybierz zakładkę "Narzędzia analityczne" i z menu rozwijanego kliknij "Przejrzyj dane wielowymiarowe" (RMD). W module RMD kliknij "Wybierz plik podstawowy". Spowoduje to otwarcie okna "Narzędzia do tworzenia wielowymiarowych zestawów danych".
  2. Kliknij przycisk "Wybierz katalog" i wybierz folder, który został użyty do zapisania eksperymentu w kroku 5.1. Z listy "Zestawy danych" wybierz dziennik pliku eksperymentu (rozszerzenie .nd). Po załadowaniu dziennika kliknij przycisk "widok".
  3. Wybierz długość fali, klikając opcje w menu "Długości fal" po lewej stronie i wybierz pozycję sceny do wyświetlenia z menu rozwijanego. Wybierz obraz do załadowania z liczb w górnej części modułu, klikając prawym przyciskiem myszy numer obrazu. Po wybraniu kliknij przycisk "załaduj obraz(y)", aby załadować obrazy. Możesz wyświetlić jeden obraz lub wszystkie obrazy jednocześnie.
  4. Wybierz wszystkie obrazy, aby nagrać film poklatkowy. Wybrane obrazy otworzą się jako wideo w nowym oknie. Kliknij zakładkę "plik" w oknie modułu obrazowania i wybierz "zapisz jako" z menu rozwijanego. Zapisz wynikowe wideo jako plik domyślny (TIFF/MetaSeries).
  5. Otwórz i załaduj zapisany plik wideo za pomocą oprogramowania ImageJ. W ImageJ kliknij kartę "plik" i kliknij "zapisz jako". Wybierz ".avi" z menu rozwijanego i przekonwertuj plik na plik .avi przy użyciu konwersji JPEG ustawionej na 10 klatek/s.
    UWAGA: Szybkość wideo można regulować, zmieniając klatki/s.
  6. Aby określić ilościowo biofilmy, powtórz kroki 7.2, 7.3 i 7.4. Wybierz ostatni obraz (numer 144) i kliknij przycisk "załaduj obraz(y)", aby załadować obraz. Obraz otworzy się w nowym oknie. Kliknij przycisk "obraz progu" i wybierz próg "Włącznie". Przesuwaj kursor, aż komórki biofilmu zostaną pokolorowane na czerwono, a obszary bez komórek nie zostaną pokolorowane.
  7. Kliknij przycisk "Otwórz dziennik", aby zarejestrować pomiary (przycisk będzie wyświetlał "Otwórz dziennik" tylko na początku; gdy dziennik jest aktywny, nazwa przycisku zostanie zmieniona na "F9: Dane dziennika"). W oknie "Otwórz dziennik danych" wybierz "Dynamiczna wymiana danych" i kliknij "ok".
  8. W oknie modułu obrazowania wybierz zakładkę "Narzędzia analityczne" i kliknij "Pokaż statystyki regionu". Spowoduje to otwarcie nowego okna wyświetlającego pomiary z obrazu. Wybierz "Cały obraz" w dostępnych opcjach "Pomiar" i kliknij "F9: Dane dziennika". Zostanie wyświetlony plik Excel ze wszystkimi pomiarami. Zlokalizuj wartości dla "Powierzchnia" i "Powierzchnia progowa" i podziel tę drugą przez pierwszą, aby uzyskać wartość liczbową dla obszaru zajmowanego przez biofilm.
    UWAGA: "Obszar" dla każdego obrazu uzyskanego podczas eksperymentu jest identyczny, a zatem pomiar "Obszar progowy" może być wykorzystany do oceny różnic w tworzeniu biofilmu między szczepami typu dzikiego a szczepami zmutowanymi lub do oceny skuteczności badanego leku w tworzeniu biofilmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy opisany tutaj test mikroprzepływowego biofilmu przy użyciu dzikiego szczepu C. albicans w dwóch warunkach pożywki (RPMI-1640 i Spider media), szczepu dzikiego typu w obecności znanego leku przeciwgrzybiczego amfoterycyny B (16 μg/mL) w RPMI, oraz dwóch zmutowanych szczepów, które wcześniej zgłaszały defekty w tworzeniu biofilmu (bcr1Δ/Δ i efg1 Δ/Δ) w pożywkach pająków.

Wideo 1 pokazuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj konfigurowalny test biofilmu mikroprzepływowego pozwala na wizualizację tworzenia biofilmu w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczej komórki po wystawieniu na działanie przepływu laminarnego o stałej szybkości i stałej temperaturze. Stanowi on potężny środek do badania rozwoju biofilmów w szczepach typu dzikiego i zmutowanego oraz wpływu leczenia środkami przeciwdrobnoustrojowymi na biofilmy w warunkach, które naśladują warunki fizjologiczne obserwowane w warunkach klinicznych. W przeciwieństwie do więk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clarissa J. Nobile jest założycielką BioSynesis, Inc., firmy zajmującej się opracowywaniem inhibitorów i diagnostyki biofilmów C. albicans .

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Nobile za pomocne dyskusje na temat testów biofilmu. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (dla C.J.N.). Projekt D.L.R. był wspierany przez stypendium doktoranckie w Instytucie Uniwersytetu Kalifornijskiego dla Meksyku i Stanów Zjednoczonych (UC-MEXUS) oraz Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BioFlux 1000zFluxionZautomatyzowane urządzenie mikroprzepływowe do analizy żywych komórek
48-dołkowa płytka 0-20 dyneFluxion910-0047płytek mikroprzepływowych
Fluxionw wersji 7.8.4.0Oprogramowanie do analizy wizualizacji
Oprogramowanie ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
EkstraktdrożdżowyKryteriumC7341
Pepton baktonowyBD Biosciences211677
Dekstroza (D-glukoza)Fisher ScientificD163
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificP285-500
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
MOPSSigma-AldrichM3183
Bulion odżywczyKryterium C6471
Difco D-MannitolBD Biosciences217020
Kryterium agaroweC5001
Amfoterycyna BCorning30-003-CF
Sterylne pętle inokulacyjneVWR30002-094
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywkąFisher ScientificFB0875712
Kuwety jednorazoweFisher Scientific14-955-127
Papier do soczewekVWR52846-001
Spektrofotometr mikropłytkowy i kuwetowyInkubator wytrząsający BioTekEPOCH2TC
EppendorfM12820004
Oprogramowanie do montażu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
  2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
  3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
  4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828(2010).
  6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
  9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
  10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
  11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
  12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
  14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
  15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
  16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
  18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
  19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biofilm Candida albicansobrazowanie w czasie rzeczywistymtestowanie przeciwdrobnoustrojowemutanty genetycznecytometria przep ywowamikroskopia konfokalnanapr enie cinaj ceadhezja kom rkowa

Powiązane artykuły