Artykuł metodologiczny

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

DOI:

10.3791/56752

⸱

7 marca 2018

 ,  ,  , 
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po aktywacji, komórki szybko zmieniają swoje programy funkcjonalne, a tym samym swój profil ekspresji genów. Ogromne zmiany w ekspresji genów zachodzą, na przykład, podczas różnicowania komórek, morfogenezy i stymulacji funkcjonalnej (takiej jak aktywacja komórek odpornościowych) lub po ekspozycji na leki i inne czynniki z lokalnego środowiska. W zależności od bodźca i typu komórki, zmiany te zachodzą szybko i na każdym możliwym poziomie regulacji genów. Przedstawienie wszystkich procesów molekularnych komórki reagującej na określony rodzaj bodźca/leku jest jednym z najtrudniejszych zadań w biologii molekularnej. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia jednoczesną analizę wielu warstw regulacji genów. Porównujemy w szczególności wiązanie czynników transkrypcyjnych (Chromatyna-immunoprecypitacja-sekwencjonowanie (ChIP-seq)), transkrypcję de novo (sekwencjonowanie 4-tiourydyny (4sU-seq)), przetwarzanie mRNA i obrót, a także translację (profilowanie rybosomów). Łącząc te metody, możliwe jest przedstawienie szczegółowego i obejmującego cały genom przebiegu działania.

Sekwencjonowanie nowo transkrybowanego RNA jest szczególnie zalecane podczas analizy szybko adaptujących się lub zmieniających systemów, ponieważ przedstawia to aktywność transkrypcyjną wszystkich genów w czasie ekspozycji na 4sU (niezależnie od tego, czy są one regulowane w górę czy w dół). Kombinatoryczne zastosowanie całkowitego sekwencjonowania RNA i profilowania rybosomów dodatkowo pozwala na obliczenie szybkości obrotu i translacji RNA. Bioinformatyczna analiza wyników sekwencjonowania wysokoprzepustowego pozwala na wielotorową analizę i interpretację danych. Wygenerowane dane umożliwiają również śledzenie splicingu kotranskrypcyjnego i alternatywnego, by wymienić tylko kilka możliwych wyników.

Opisane tutaj podejście łączone może być stosowane do różnych organizmów modelowych lub typów komórek, w tym komórek pierwotnych. Ponadto zapewniamy szczegółowe protokoły dla każdej zastosowanej metody, w tym kontrole jakości, oraz omawiamy potencjalne problemy i pułapki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) stało się standardowym narzędziem do analizy wszystkich wyrażonych RNA w komórce lub organizmie1. Jednak, aby zrozumieć cały proces adaptacji komórek w odpowiedzi na określony bodziec/lek, konieczne jest pełne określenie wszystkich podstawowych procesów, począwszy od transkrypcji mRNA po przetwarzanie, obrót i translację. Krótkoterminowe zmiany w transkrypcji RNA trudno zmierzyć za pomocą całkowitego RNAseq, ponieważ zmiany całkowitego RNA zależą od czynników, np. okresu półtrwania RNA i aktywności transkrypcyjnej, które są słabym szablonem do odzwierciedlenia adaptacji komórek do efektów środowiskowych2,3. Rzeczywiście, opracowano wiele nowych technik sekwencjonowania, które umożliwiają analizę różnych etapów procesu regulacji genów4, jeśli zostaną połączone we właściwy sposób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć niektóre dość łatwe do zastosowania techniki sekwencjonowania, które umożliwiają śledzenie regulacji istotnych warstw mRNA w sposób porównawczy. Do analizy aktywności transkrypcyjnej opisano różne metody, takie jak analiza Cap ekspresji genów (CAGE)5, sekwencjonowanie transkryptu z natywnym wydłużeniem (NET-seq)6 oraz rozbieg jądrowy całego genomu (GRO-seq)7,8, a także sekwencjonowanie bromourydyny (Bru-seq) i sekwencjonowanie 4-tiourydyny (4sU-seq), które wykorzystują metabolity włączone do nowo transkrybowanego RNA9,10, żeby wymienić tylko kilka. Podczas gdy CAGE identyfikuje dokładne miejsce rozpoczęcia transkrypcji, NET-seq i GRO-seq dostarczają dokładniejszych informacji o kierunkach odczytu, a 4sU-seq (która jest metodą opisaną tutaj) wykrywa tylko nowo transkrybowane RNA. Jednak sekwencja 4sU jest bardzo czuła i może być stosowana w różnych ramach czasowych do pomiaru ilościowej aktywności transkrypcyjnej w aktywnie zmieniających się komórkach, a także ilościowych zmian w przetwarzaniu mRNA (co następuje w ciągu kilku minut)9,11,12. Co więcej, 4sU-seq idealnie nadaje się do połączenia z RNA-seq w celu obliczenia szybkości obrotu RNA dla genów9. Transkrypcja mRNA jest przeprowadzana przez polimerazę RNA II (RNAPII), na którą z kolei wpływa wiele czynników, takich jak czynniki transkrypcyjne, modyfikacje histonów i ogólne aktywatory/represory, które mogą być nawet częścią kompleksu transkrypcyjnego. Aby sprawdzić, ile regionów genu/promotora/wzmacniacza jest związanych przez jeden czynnik, opracowano ChIP-seq, który jest obecnie standardową metodą w tym celu, ze względu na wiele dostępnych na rynku przeciwciał13. Jednakże, chociaż ChIPseq daje jasne informacje o tym, gdzie wiążą się czynniki regulujące, nie odzwierciedla, czy rzeczywiście prowadzi to do zmian w transkrypcji14. Dlatego wykonanie ChIP-seq z 4sU-seq jest idealną kombinacją dla takich pytań biologicznych. Regulacja ekspresji genów może również zachodzić na późniejszym etapie, ponieważ poziomy mRNA i białek niekoniecznie są ze sobą skorelowane15,16, co wskazuje na potencjalnie istotną regulację na poziomie translacyjnym lub potranslacyjnym, w zależności od kontekstu. W roku 2011 profilowanie rybosomów zostało po raz pierwszy połączone z sekwencjonowaniem RNA i jest obecnie metodą z wyboru do ilościowego określania zmian, które szybko zachodzą w białku, ponieważ nadal istnieją pewne granice czułości w przypadku spektrometrii mas17. Rzeczywiście, wykazano, że szybkości translacji uzyskane za pomocą takich metod dostarczają stosunkowo dobrego oszacowania zmian w poziomach białek (przynajmniej mierzonych dla zmian długoterminowych) i pozwalają na jeszcze bardziej szczegółowy wgląd w proces translacji, np. określenie początkowych i alternatywnych ramek translacji17. Kombinatoryczne zastosowanie wszystkich czterech metod może być stosowane w stanie ustalonym, między różnymi typami komórek lub w eksperymencie czasowo-szeregowym szybko zmieniającej się komórki11. To zastosowanie zapewnia przegląd całego genomu zmian w wiązaniu czynników transkrypcyjnych wpływających na transkrypcję, przetwarzanie i translację RNA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody są zgodne i zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi, stanowymi i federalnymi Helmholtz Zentrum München.

1. Przygotowanie

  1. Sporządź szczegółowy plan konfiguracji eksperymentalnej, w tym harmonogram czasowy, kiedy dodać 4sU do pożywki do hodowli komórkowej i kiedy zebrać komórki dla każdej metody. W zależności od pytania biologicznego, należy dokładnie rozważyć punkty czasowe pobierania próbki, czas znakowania 4sU i stężenie (Tabela 1).
    UWAGA: Sprawdź wcześniej wpływ 4sU na żywotność komórek i reakcję na stres (patrz "Sprawdź optymalne warunki znakowania 4sU" w Reprezentatywnych wynikach i Rysunek 1). Zaleca się przeprowadzenie wstępnego badania każdej metody na co najmniej jednej próbce. Sprawdź, czy jakość i ilość RNA/DNA jest wystarczająca do głębokiego sekwencjonowania (patrz dedykowane części protokołu) i przećwicz szybkie, ale delikatne obchodzenie się z komórkami podczas eksperymentu.
  2. Obliczyć liczbę komórek potrzebnych dla każdego punktu czasowego każdej metody (patrz Tabela 2 w celu przybliżonego oszacowania przy użyciu pierwotnych limfocytów T). Rozważ również sekwencjonowanie mniejszej liczby próbek całkowitego RNA niż tylko RNA 4sU (np. należy obliczyć tylko szybkość translacji punktu czasowego lub szybkość obrotu RNA). Aby potwierdzić i zweryfikować istotność wyników (zalecane), należy utworzyć co najmniej jedną kontrpróbę biologiczną.
    UWAGA: Co ważne, dla wszystkich metod i kolejnych punktów czasowych próbki muszą pochodzić z tej samej początkowej puli komórek. Zaleca się co najmniej jednego dedykowanego badacza dla każdej metody.
  3. Przygotuj wcześniej wszystko, co niezbędne (np. porcjowane 4sU, cykloheksymid, bufor do lizy ssaków i 1% formaldehydu). Po dodaniu 4sU unikaj wystawiania komórek na działanie jasnego światła, ponieważ może to prowadzić do sieciowania RNA znakowanego 4sU do białek komórkowych18.
  4. Zbierz wszystkie interesujące nas komórki w jednej kolbie tuż przed leczeniem (Ryc. 2). Policz komórki (np. za pomocą hemocytometru) i użyj wymaganej ilości do kontroli niepoddanej działaniu substancji każdej metody (nie zapomnij również oznaczyć nieleczonej kontroli dla 4sU-seq za pomocą 4sU). Traktuj pozostałe komórki i natychmiast podziel wymaganą liczbę komórek dla każdego punktu czasowego i metody. Z ogniwami należy obchodzić się tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować stres spowodowany zmianami temperatury lub poziomuCO2.
    UWAGA: Na przykład próbki pobiera się 1 godzinę, 2 godziny i 3 godziny po zabiegu, następnie jedna czwarta komórek jest używana do kontroli niepoddanej działaniu substancji, a trzy czwarte są używane do kontroli poddanej działaniu substancji.

2. Etykietowanie 4sU

UWAGA: Ten protokół został zmodyfikowany przez Rädle, et al. 19 Zapoznaj się z ich protokołem, aby uzyskać więcej informacji na temat znakowania metabolicznego za pomocą 4sU. W odniesieniu do wszystkich metod i kolejnych punktów czasowych próbki muszą pochodzić z tej samej początkowej puli komórek.

  1. Rozpoczęcie etykietowania
    1. Rozmrozić podany 4sU tuż przed użyciem. Dodać 4sU w każdym punkcie czasowym bezpośrednio do pożywki zawierającej interesujące komórki (patrz Tabela 2 dla zalecanej liczby limfocytów T, co najmniej 60 μg RNA na punkt czasowy), delikatnie wymieszać i umieścić z powrotem w inkubatorze. Wyrzuć pozostałe 4sU (nie zamrażaj ponownie).
    2. Pod koniec etykietowania zebrać komórki (np. skrobak do komórek) i odwirować przy 330 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w probówkach polipropylenowych (które są odporne na duże siły g). Odessać pożywkę i dodać odczynnik do izolacji RNA (≥1 ml na 3 x 106 komórek, patrz materiały w celu uzyskania zaleceń dotyczących użycia) do każdej probówki. Całkowicie zawiesić osad (≥1 ml na 3 x 106 komórek), inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i zamrażać próbki w temperaturze -20 °C. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 miesiąc.
      ostrożność: Odczynniki używane do izolacji RNA są niezwykle niebezpieczne w kontakcie ze skórą lub oczami. Obchodź się z nimi ostrożnie i postępuj zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa.
  2. Przygotowanie RNA z wykorzystaniem zmodyfikowanego protokołu izolacji RNA
    1. Dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml odczynnika do izolacji RNA i dokładnie wymieszać, wstrząsając przez 15 s. Postępować zgodnie z opisem w protokole znakowania metabolicznego (krok 1 - 12, 2. Preparat RNA przy użyciu zmodyfikowanego protokołu trizolu) z Rädle i wsp. 19
    2. Zmierz stężenie RNA (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj tego RNA również do całkowitego sekwencjonowania RNA (patrz krok 3. Całkowita sekwencja RNA) lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 miesiąc.
  3. Specyficzna dla tiolu biotynylacja nowo transkrybowanego RNA
    1. Zacznij od 30 - 80 μg całkowitego komórkowego RNA. 60 μg RNA powinno dać wystarczającą ilość nowo transkrybowanego RNA.
    2. Przygotuj reakcję etykietowania. Pipetę w następującej kolejności (na μg RNA): 1 μL 10x Bufor biotynylacyjny, 7 μL RNA (zawierające 1 μg RNA rozcieńczone w H2O bez nukleaz) i 2 μL biotyny-HPDP (1 mg/ml). Na końcu dodać biotynę-HPDP i natychmiast wymieszać pipetując. Owiń tuby folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na jasne światło. Zobacz dyskusję, aby uzyskać alternatywę dla biotyny-HPDP. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny z rotacją.
    3. Odwirować odpowiednie probówki o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów) przy 15 000 x g przez 2 minuty. Odpipetować wszystkie biotynylowane RNA do wstępnie odwirowanej probówki o pojemności 2 ml, dodać równą objętość chloroformu i energicznie wymieszać. Inkubuj przez 2 - 3 minuty, aż fazy zaczną się rozdzielać, a pęcherzyki zaczną znikać.
    4. Wirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki.
    5. Powtórz kroki 2.3.3 i 2.3.4 jeden raz. Dodać 10% objętości NaCl (5 M) i równą objętość izopropanolu do fazy wodnej. Wirować przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    6. Dodaj równą objętość świeżo przygotowanego 75% etanolu. Wirować przy 20 000 x g. Odrzucić supernatant, krótko odwirować i usunąć pozostały etanol. Całkowicie zawiesić w 30 - 100 μl H2O (użyć 1 μl H2O na 1 μg wejściowego RNA z kroku 2.3.1) przez mieszanie pipetą.
    7. Sprawdź integralność RNA za pomocą analizy elektroforetycznej lub weź podwielokrotność i zweryfikuj później.
  4. Separacja nowo przepisanego (znakowanego) i wcześniej istniejącego (nieznakowanego) RNA
    1. Wyjmij kulki paramagnetyczne (patrz Tabela materiałów) z przechowywania w temperaturze 4 °C i odstaw na co najmniej 30 minut, aby doprowadzić je do temperatury pokojowej. Podgrzać bufor płuczący 4sU (3 ml na próbkę) do temperatury 65 °C.
    2. Przygotować 100 mM roztwór ditiotreitolu (DTT). Zważ naziemną telewizję cyfrową na bardzo drobnej wadze i dodaj wymaganą ilość wody wolnej od nukleaz. Zawsze przygotowuj świeże. Użyć 200 μl na próbkę.
    3. Próbki biotynylowanego RNA (1 μg/μl) podgrzać do temperatury 65 °C przez 10 minut w celu denaturacji i natychmiast umieścić na lodzie. Dodać 100 μl kulek streptawidyny do biotynylowanego RNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut z rotacją.
    4. Umieścić odpowiednią kolumnę (patrz tabela materiałów w celu uzyskania zaleceń) dla każdej próbki w stojaku magnetycznym i wstępnie zrównoważyć każdą kolumnę za pomocą 1 ml buforu myjącego 4sU o temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zajmie to około 5 - 10 minut. Jeśli którakolwiek z kolumn nie rozpocznie opróżniania po 5 minutach, delikatnie dociśnij górną część kolumny palcem w rękawiczce.
    5. Zastosuj mieszaninę RNA/kulek na środku każdej kolumny. Odrzuć przepływ, chyba że konieczne jest odzyskanie nieznakowanego RNA. Jeśli tak, zbierz przepływ i przynajmniej pierwsze pranie. Przeprowadź regenerację RNA zgodnie z opisem Rädle i wsp. (krok 1 - 7, 7. Odzyskiwanie nieznakowanego, niezwiązanego RNA)19.
    6. Przemyć trzykrotnie odpowiednio 0,9 ml buforu płuczącego 4sU (podgrzanego do 65 °C z kroku 2.4.2) i 0,9 ml buforu płuczącego RT 4sU.
    7. Użyj kulek paramagnetycznych, aby odzyskać nowo transkrybowane RNA. Pobrać pipetą 400 μl dobrze zdyspergowanych kulek paramagnetycznych RT w probówce na próbkę i umieścić pod każdą kolumną. Elute nowo transkrybowane RNA za pomocą 100 μL 100 mM DTT. Odczekaj 3 minuty i wykonaj drugą elucję za pomocą 100 μL 100 mM DTT. (Opcjonalnie: Przeprowadź elucję i odzysk zgodnie z opisem Rädle i wsp.)19
    8. Nowo przepisane RNA/kulki dokładnie wymieszać pipetą, mieszając 10 razy i postępować zgodnie z wytycznymi producenta. Elutować RNA w 11 μl H2O. Określić ilościowo RNA za pomocą odpowiedniego fluorometru (patrz tabela materiałów). RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 miesiąc.
      UWAGA: Nowo transkrybowane RNA można wykorzystać do przygotowania bibliotek cDNA do sekwencjonowania nowej generacji (patrz Tabela materiałów, aby uzyskać sugestię, którego zestawu użyć) lub do dalszych analiz. 100 - 500 ng RNA jest wystarczające dla większości zestawów do przygotowania biblioteki (patrz Dyskusja).

3. Całkowita sekwencja RNA

  1. Bezpośrednio pobrać RNA z RNA znakowanego 4sU po przygotowaniu RNA przy użyciu zmodyfikowanego odczynnika do protokołu izolacji RNA dla całkowitego sekwencjonowania RNA (patrz krok 2.2.2.)
  2. Do przygotowania biblioteki należy rozcieńczyć podwielokrotność RNA do końcowego stężenia 50 - 100 ng/μL. Użyj tego samego zestawu, co do przygotowania biblioteki nowo transkrybowanego RNA. 100 - 500 ng RNA jest wystarczające dla większości zestawów do przygotowania biblioteki.

4. Profilowanie rybosomów

UWAGA: Dla wszystkich metod i kolejnych punktów czasowych, próbki muszą pochodzić z tej samej początkowej puli komórek. Zalecenia dotyczące zestawu do użycia można znaleźć w tabeli materiałów.

  1. Przygotowanie i izolacja fragmentów chronionych rybosomem (RPF):
    1. Użyj odpowiedniej liczby komórek dla każdego punktu czasowego (patrz Tabela 2, aby uzyskać zalecaną liczbę komórek T). Leczone przylegające komórki cykloheksymidem zgodnie z opisem w protokole producenta.
      Uwaga: Cykloheksymid jest wysoce toksyczny i może powodować mutacje. Unikać kontaktu ze skórą i wdychania.
    2. Zebrać i połączyć nieprzylegające lub częściowo przylegające komórki z każdego punktu czasowego w jednej probówce polipropylenowej i dostosować końcowe stężenie do 1 x 106 komórek na ml pożywki specyficznej dla komórki (np. uzupełnionego RPMI dla limfocytów T). Dodać cykloheksymid o końcowym stężeniu 0,1 mg/ml, wymieszać odwracając rurkę polipropylenową i inkubować przez 1 minutę. Odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 330 x g w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę i przepłukać komórki co najmniej 10 ml PBS uzupełnionego cykloheksymidem (końcowe stężenie 0,1 mg/ml).
    3. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 330 x g w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę i dodać 100 μl buforu do lizy komórek ssaków na 10 x10 6 komórek. Wymieszać pipetując i wypuścić przez sterylną igłę o rozmiarze 22 i rozmiarze 25 do całkowitej lizy komórek.
    4. Przenieś lizat komórkowy do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować przez 10 minut na lodzie z okresowymi inwersjami. Wirować przez 10 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C w celu sklarowania lizatu. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
    5. Przygotować rozcieńczenie lizatu w stosunku 1:10 wodą wolną od nukleaz i zapisać odczyt A260za pomocą spektrofotometru. Jako ślepą próbę należy użyć wody wolnej od nukleaz, a jako standardu roztworu buforowego do lizy komórek ssaków w stosunku 1:10. Obliczyć stężenie A260/ml lizatu zgodnie z następującym równaniem:
      (Lizat260 komórek - Bufor do lizy260 ssaków) x 10 współczynnik rozcieńczenia = A260 / ml
    6. Utworzyć 200 μl podwielokrotności lizatu na lodzie i przystąpić do leczenia nukleazą.
      UWAGA: Opcjonalnie należy przygotować 100 μl podwielokrotności dla całkowitego RNA, dodać 10 μl 10% SDS i wymieszać. Przechowywać w temperaturze 4 °C i postępować zgodnie z ppkt 4.3.2. Zaleca się stosowanie całkowitego RNA z RNA znakowanego 4sU (patrz krok 3. Całkowita sekwencja RNA).
  2. Ślad rybosomów
    1. Zabieg nukleazą należy wykonać natychmiast bez zamrażania lizatu. Dodaj 7,5 jednostki nukleazy (zawartej w zalecanym zestawie) na każde A260 lizatu. Na przykład: 80 A260 / ml lizatu x 0,2 ml lizatu x 7,5 U / A260nukleazy = 120 U nukleazy.
      UWAGA: Opcjonalnie miareczkować nukleazę do trawienia zgodnie z opisem producenta.
    2. Inkubować reakcję nukleazy przez 45 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Zamrozić 200 μl podwielokrotności lizatu ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C lub zatrzymać reakcję nukleazy przez dodanie 15 μl inhibitora RNazy do każdej podwielokrotności 200 μl i kontynuować etap 4.3.2.
  3. Oczyszczanie RPF
    1. Rozmrozić jedną próbkę RPF trawionych przez nukleazy i dodać 15 μl inhibitora RNazy. Próbki należy przechowywać na lodzie.
    2. Oczyść RPF zgodnie z protokołem producenta (zalecane jest oczyszczanie kolumny) i zmierz stężenie RNA na spektrofotometrze.
  4. Zubożenie rRNA
    1. Użyj 5 μg oczyszczonych RPF do zubożenia rRNA.
    2. Postępuj zgodnie z protokołem producenta (krok 1 - 2, Pierwotne wyczerpanie rRNA) w celu wyczerpania rRNA. Zmierz stężenie RNA RPF zubożonych w rRNA na spektrofotometrze.
  5. STRONA Oczyszczanie RPF
    1. Użyj 500 ng RPF zubożonych w rRNA do oczyszczania PAGE.
    2. Przygotuj kontrolę RNA, próbki i drabinkę do oczyszczania PAGE. Wymieszaj 5 μl RNA Control i 5 μl denaturującego barwnika ładującego żel w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Zmieszaj odpowiednio 10 μl każdego RPF z 10 μl żelu denaturującego. Przygotować podwielokrotność drabinki (4 μl drabinki 20/100, 1 μl wody wolnej od nukleaz i 5 μl denaturującego barwnika ładującego żel). Załaduj go między każdą próbkę a kontrolę, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    3. Próbki i drabinkę poddać denaturacji przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 5 minut i natychmiast umieścić na lodzie. Załadować 20 μl każdej próbki (opcjonalnie załadować 10 μl i zamrozić pozostałe próbki w temperaturze 20 °C) oddzielone 10 μl przygotowanej drabinki na 12% lub 15% żelu mocznikowo-poliakryloamidowym. Załadować 10 μl kontroli RNA. Uruchom żel do momentu, gdy niebieska wstęga bromofenolu dotrze do dna żelu (180 V, ~70 min) (Rysunek 3).
    4. Wybarwić żel zgodnie z protokołem producenta w temperaturze 4 °C. Do wizualizacji RNA należy użyć transiluminatora ciemnego pola, który emituje niebieskie światło. Plastry żelu akcyzowego dla każdej próbki o długości odpowiadającej ~28 i 30 nt. Weź kontrolę RNA jako odniesienie i wytnij ją.
      UWAGA: Pliki RPF są prawie niewidoczne. Plastry akcyzowe o rozmiarze wskazanym przez RNA Control - zawierające dwa olikleotydaże o długości 28 i 30 nt - nawet jeśli próbki nie są widoczne.
    5. Przebić otwór w dnie probówek do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml sterylną igłą o rozmiarze 20 rozmiarów. Przenieś każdy plasterek żelu do osobnej probówki i umieść zakorkowane probówki w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 2 minuty przy 12 000 x g. Powtórz wirowanie, jeśli plastry żelu nie zostaną całkowicie rozdrobnione do probówki o pojemności 1,5 ml.
    6. Eluować RNA z rozdrobnionych plastrów żelu za pomocą 400 μl wody wolnej od nukleaz, 40 μl octanu amonu (5 M) i 2 μl SDS (10%) przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Przenieś gnojowicę do probówek filtracyjnych o pojemności 1,5 ml (dostarczonych z zalecanym zestawem) z końcówką do pipety o pojemności 1 ml (końcówka o szerokim otworze lub samodzielnie wykonana końcówka o pojemności 1 ml z odciętym końcem). Wirować przez 3 minuty przy 2,000 x g, aby oddzielić eluowany RNA od plastrów żelu. Delikatnie odpipetować roztwór wodny do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 2 μl glikogenu (dostarczonego z zalecanym zestawem) i 700 μl 100% izopropanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
    8. Wirować w temperaturze 4 °C przez 20 minut przy 13 000 x g. Odrzucić supernatant. Umyj granulat wstępnie schłodzonym, świeżo przygotowanym 80% etanolem w temperaturze 4 °C przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g. Odrzucić supernatant i wysuszyć na powietrzu. Zawiesić każdą próbkę w 20 μl, a kontrolę RNA w 8 μl wody wolnej od nukleaz. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Fragmentacja, naprawa końcówek, ligacja adaptera 3', odwrotna transkrypcja
    1. Wykonaj procedurę zgodnie z opisem w protokole producenta (fragmentacja i naprawa końca, podwiązanie adaptera 3' i odwrotna transkrypcja).
  7. STRONA Oczyszczanie cDNA
    1. Przygotuj próbki, kontrolę RNA i drabinkę do oczyszczania PAGE: Zmieszaj 10 μl każdej próbki i kontrolę RNA z odpowiednio 10 μl denaturującego barwnika ładującego żel. Przygotować podwielokrotność drabinki (4 μl 20/100 drabinki, 1 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl denaturującego barwnika w żelu). Załaduj go między każdą próbkę a kontrolę, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    2. Próbki i drabinkę poddać denaturacji przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 5 minut i natychmiast umieścić na lodzie. Załadować 20 μl każdej próbki (opcjonalnie załadować 10 μl i zamrozić pozostałe próbki w temperaturze 20 °C) oddzielone 10 μl przygotowanej drabinki na 10% poliakrylamid/7 - 8 M mocznik/żel TBE. Załadować 10 μl kontroli RNA. Uruchom żel do momentu, aż błękit bromofenolowy całkowicie wyprowadzi się z żelu (180 V, ~60 min).
    3. Wybarwić żel zgodnie z protokołem producenta w temperaturze 4 °C. Użyj transiluminatora ciemnego pola, który emituje niebieskie światło, aby uwidocznić RNA i wyciąć plastry żelu dla każdej próbki odpowiadającej ~70 - 80 nt.
    4. Postępować zgodnie z opisem w krokach 4.5.5 - 4.5.8 i ponownie zawiesić każdą próbkę w 10 μl wody wolnej od nukleaz.
  8. Cyrkularyzacja cDNA
    1. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki cyrkularyzacji dla wszystkich reakcji, łącząc następujące odczynniki dla każdej próbki na lodzie: 4,0 μl mieszaniny reakcyjnej cyrkularyzacji, 2,0 μl ATP, 2,0 μl MnCl2 i 2,0 μl ligazy.
    2. Do każdej próbki dodać 10 μl mieszanki wzorcowej. Delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj. Próbki inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Natychmiast umieścić próbki na lodzie.
  9. Amplifikacja PCR
    1. Postępuj zgodnie z protokołem producenta (kroki 1 - 3, amplifikacja PCR) w celu amplifikacji PCR. Użyj 4 μl cyrkularyzowanego cDNA do amplifikacji z 9 cyklami PCR dla pierwotnych limfocytów T, aby osiągnąć najlepsze wyniki.
    2. Oczyść biblioteki i sprawdź ich rozkład rozmiarów, zgodnie z protokołem producenta (krok 4 - 8, amplifikacja PCR). Oczekiwany rozmiar wzmocnionej biblioteki to 140 - 160 bp (patrz Rysunek 4).
    3. Aby uzyskać informacje o bibliotekach sekwencjonowania, zapoznaj się z protokołem producenta i funkcją sekwencjonowania, aby uzyskać dalsze wskazówki.

5. Sekwencja ChIP-T

UWAGA: Ten protokół jest zmodyfikowany przez Blecher-Gonen, et al. 14 Zapoznaj się z ich protokołem, aby uzyskać więcej informacji na temat ChIP-seq. Dla wszystkich metod i kolejnych punktów czasowych próbki muszą pochodzić z tej samej początkowej puli komórek.

  1. Sieciowanie i zbieranie komórek
    1. Usieciuj odpowiednią liczbę komórek (patrz tabela 2 dla zalecanej liczby komórek T) dla każdego punktu czasowego z końcowym stężeniem 1% formaldehydu w pożywce specyficznej dla komórki (np. uzupełnionym RPMI dla komórek T) przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Zatrzymać reakcję sieciowania przez dodanie glicyny do końcowego stężenia 0,125 M.
    2. Odwirować komórki przy 330 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i umyć komórki w lodowatym PBS. Powtórzyć krok 5.1.2 dwukrotnie i zamrozić granulki komórkowe w temperaturze -80 °C. Zamrożone granulki można przechowywać przez co najmniej 6 miesięcy.
  2. Liza komórek i sonikacja
    UWAGA: Podczas wszystkich etapów lizy komórek i sonikacji, próbki muszą być przechowywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować odwrócenie usieciowania i degradację białka.
    1. Zawiesić granulki komórkowe w 1 ml lodowatego buforu do lizy komórek ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy w celu wyizolowania jąder (opcjonalnie dodać inhibitory fosfatazy). Inkubować przez 10 minut na lodzie i odwirowywać przy 2 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad jąder w 1 ml lodowatego buforu do lizy jąder ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy (opcjonalnie: dodać inhibitory fosfatazy). Inkubować przez 10 minut na lodzie. Sonikacja komórek w celu wygenerowania średniej frakcji wielkości DNA wynoszącej 0,2 - 1,0 kb (patrz Rysunek 5).
      UWAGA: Warunki sonikacji muszą być zoptymalizowane w zależności od typu komórki i innych warunków (np. liczby komórek, objętości i bufora). W przypadku pierwotnych limfocytów T zaleca się sonikację przez 20 - 25 cykli (szczegółowy opis znajduje się w materiałach).
    3. Pobrać 20 - 50 μl podwielokrotności ściętej chromatyny i podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 95 °C i 1,000 obr./min wstrząsając, aby wykonać szybkie odwrotne sieciowanie krzyżowe i zweryfikować wielkość chromatyny. Dodać 2 - 5 μl proteinazy K i inkubować przez 20 minut w temperaturze 56 °C i wstrząsaniu 1 000 obr./min. Przeprowadzić inaktywację cieplną przez 10 minut w temperaturze 95 °C i wytrząsaniu 1 000 obr./min. Oczyść chromatynę za pomocą odpowiedniego zestawu (patrz tabela materiałów). Sprawdź rozmiar chromatyny na 1% żelu agarozowym i użyj markera Plus 100 pz.
    4. Odwirować ściętą chromatynę o średniej frakcji wielkości DNA 0,2 - 1,0 kb przez 10 minut w temperaturze 20 000 x g i 4 °C w celu osadzenia nierozpuszczalnej chromatyny i zanieczyszczeń. Przenieść supernatant do nowej probówki i trzymać na lodzie.
    5. Zachowaj 5 - 10% sonikowanej chromatyny jako wejście. Zamrażać w temperaturze -20 °C (użyte w kroku 5.5.2).
  3. Para przeciwciał do koralików
    1. Połączyć 10 μg przeciwciała (np. anty-RNA Pol II; anty-Histon H3K36me3) w 220 μl PBS (z 0,5% BSA i 0,5% Tween 20) z 80 μl superparamagnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G (patrz tabela materiałów) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej z rotacją.
    2. Umieść rurki na magnesie. Poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną związane z magnesem i usuń supernatant. Dalej blokuj 6 μl sonikowanego DNA plemników łososia w PBS (z 0,5% BSA i 0,5% Tween 20) przez 30 minut w temperaturze pokojowej z rotacją.
    3. Umieść rurki na magnesie. Poczekaj, aż wszystkie koraliki zostaną związane z magnesem i usuń przezroczysty supernatant. Umyj koraliki buforem ChIP IP trzy razy.
  4. Immunoprecypitacja chromatyny
    1. Rozcieńczyć chromatynę do 1 ml całkowitej objętości w buforze do lizy jąder świeżo dodanymi inhibitorami proteazy (opcjonalnie dodać inhibitory fosfatazy). Dodać bufor ChIP IP ze świeżo dodanymi inhibitorami proteazy (opcjonalnie dodać inhibitory fosfatazy) do końcowej objętości 3 ml. Przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, podczas gdy przeciwciało jest sprzężone z kulkami.
    2. Dodać rozcieńczoną chromatynę do kulek sprzężonych z przeciwciałami z kroku 5.3.3 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnymi rotacjami.
    3. Przemyć następującymi (po 1 ml każdy, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 5 minut z rotacją, umieścić probówki z powrotem na magnesie i usunąć supernatant: odpowiednio bufor do płukania I, bufor do przemywania II, bufor do płukania III i odpowiednio 2x TE pH 8,0.
    4. Wyrzucić supernatant i schnąć na powietrzu przez ~5 min.
  5. Odwrotne sieciowanie
    1. Usuń próbki z magnesu. Dodać 50 μl buforu elucyjnego i mieszać pipetując, aby wymyć kompleksy białko-DNA z kulek.
    2. Uwzględnij próbki wejściowe z tego kroku. Dodać bufor elucyjny do próbki wejściowej (próbek) o końcowej objętości 50 μl (w celu utrzymania składu buforu podobnego do próbek ChIP) i poddać działaniu razem z próbkami ChIP.
    3. Zmieszać 3 μl buforu elucyjnego i 2 μl RNazy (bez DNaz). Dodać 5 μl mieszaniny do każdej próbki i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Wymieszać 2,5 μl proteinazy K, 1 μl glikogenu i 1,5 μl buforu elucyjnego na próbkę. Dodać 5 μl mieszaniny do każdej próbki (1 U proteinazy K i 20 μg glikogenu na próbkę) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    5. Próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C przez noc (co najmniej 4 godziny) z wytrząsaniem w celu przeprowadzenia odwrotnego sieciowania.
    6. Umieść probówki na magnesie na co najmniej 30 s i przenieś supernatant do nowej probówki. Próbki można zamrażać w temperaturze -20 °C przez okres do 12 miesięcy.
  6. Oczyszczanie DNA
    1. Dodać 140 μl dobrze zdyspergowanych kulek paramagnetycznych do 60 μl próbki (stosunek 2,3:1). Ostrożnie pipetować w górę i w dół 25 razy, aby dokładnie wymieszać. Upewnij się, że płyn w każdej probówce jest jednorodny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść probówki na magnesie na 4 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki zostaną związane z magnesem i wyrzuć supernatant.
    2. Pozostaw rurki na magnesie i dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu. Inkubuj probówki przez 30 sekund, nie naruszając kulek. Odrzucić supernatant i powtórzyć ten krok jeszcze raz. Całkowicie odessać etanol i pozostawić kulki paramagnetyczne do wyschnięcia na powietrzu przez 4 min.
      UWAGA: Niepełne usunięcie etanolu może poważnie zmniejszyć odzysk DNA i wydajność. Suszyć granulki tylko do momentu wyschnięcia. Nadmierne suszenie osadu może zmniejszyć odzysk DNA i wydajność.
    3. Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 20 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 25 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść probówki z powrotem na magnesie na 4 minuty i przenieś supernatant do innej probówki.
    4. Zmierzyć ilość DNA za pomocą odpowiedniego fluorometru (patrz tabela materiałów).
    5. Sprawdzić, czy ChIP powiódł się za pomocą qPCR (rozcieńczyć 1 μL w 100 μl H2O i użyć 2 - 5 μl do qPCR). Stosować specyficzne startery dla kontroli dodatniej (znane miejsce wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania) i negatywnej (np. genu, który jest cichy i/lub nie jest celem białka będącego przedmiotem zainteresowania).
      UWAGA: Przygotowanie biblioteki można wykonać przy użyciu 2 ng DNA ChIP w zależności od zestawu (patrz Tabela materiałów, aby uzyskać sugestię, którego zestawu użyć).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4Etykietowanie sU: Sprawdź optymalne warunki znakowania 4 sU (apoptoza, stres jądrowy, stres cytoplazmatyczny), czas i stężenie: Wysoki poziom 4sU może hamować produkcję i przetwarzanie rRNA oraz indukować stres cytoplazmatyczny i jądrowy30. Dlatego komórki będące przedmiotem zainteresowania powinny być testowane pod kątem stresu wywołanego przez 4sU, a także apoptozy. Analiza Western blot jest zalecana do wizualizacji akumulacji p53, która wskazuje na stres jądrowy, zwiększając poziomy fosfo-EIF2a, które wykazują stres cytoplazmatyczny i analizę sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) pod kątem apoptozy. Wysokie poziomy i długotrwała ekspozycja na 4sU lub leki takie jak thapsigargin lub arsenit mogą być stosowane do wywoływania stresu komórkowego. Aby wywołać apoptozę lub śmierć komórki, komórki traktowano BH3I-1 (500 ng / μL) lub inkubowano przez 5 minut w temperaturze 95 °C (szok cieplny). Barwienie aneksyną V/7-AAD zastosowano do określenia komórek apoptotycznych (Aneksyna V) i martwych (7-AAD). Znakowanie pierwotnych komórek Th1 generowanych in vitro przez 0,5 godziny za pomocą 500 μM 4sU (stężenie końcowe) lub 1 godzinę za pomocą 200 μM 4sU ani nie indukuje oznak stresu komórkowego ani apoptozy (Rysunek 1), ale prowadzi do wystarczającej inkorporacji 4sU.

Czas znakowania RNA może być również skrócony (≤5 min), co prowadzi do zwiększenia krótkotrwałych sekwencji intronowych w porównaniu do dłuższych czasów znakowania. Aby zobrazować szybkość splicingu kotranskrypcyjnego, czas znakowania 4sU nie powinien przekraczać 30 minut. Więcej informacji na temat oznakowania 4sU można znaleźć w Rädle et al. 19

Kontrola jakości: Integralność RNA ma ogromne znaczenie podczas przetwarzania RNA. Najwygodniej jest sprawdzić jakość RNA RNA znakowanego 4sU po biotynylacji za pomocą analizy elektroforetycznej (patrz tabela materiałów). Rozważ weryfikację wyizolowanego RNA z kroku 2.2.2, zwłaszcza gdy używasz go do sekwencjonowania całkowitego RNA. Numer integralności RNA (RIN) powinien wynosić ≥8, aby zapewnić integralność RNA do dalszego przetwarzania (Rysunek 3).

Analiza elektroforetyczna może być również wykorzystana do weryfikacji nowo przepisanego RNA. Należy pamiętać, że nowo transkrybowane RNA zawiera znacznie mniej dojrzałych rRNA w porównaniu do całkowitego RNA, przy czym typowe prążki rRNA są znacznie mniej widoczne.

Profilowanie rybosomów: Amplifikacja PCR biblioteki cDNA: amplifikacja cDNA (krok 4.9.1) jest kluczowym krokiem zapewniającym dobre wyniki sekwencjonowania. Analiza amplifikowanych bibliotek za pomocą analizy elektroforetycznej. Dobra próbka wzmocnionych bibliotek pokazuje szczyt około 140 - 160 pz (Rysunek 4A). Należy unikać nadmiernych ilości dimerów adapterowych (Rysunek 4B), a próbki te powinny być dalej oczyszczane przy użyciu procedury oczyszczania PAGE zgodnie z protokołem producenta (PAGE oczyszczanie produktów PCR). Zbyt duża ilość matrycy lub zbyt wiele cykli PCR może spowodować nadmierną amplifikację charakteryzującą się pojawieniem się pasm o wyższej niż oczekiwano masie cząsteczkowej, rozmazanych produktów PCR i produktów dimerów adapterowych (Rysunek 4C). W przypadku większości próbek 1 - 5 μl cyrkularyzowanego cDNA i 9 cykli PCR do amplifikacji zazwyczaj dają wystarczające ilości właściwego produktu PCR.

ChIP: Strzyżenie chromatyny: Optymalne warunki ścinania muszą być dostosowane do każdego typu komórki. Określ warunki ścinania (np. liczbę cykli, wysoką lub niską moc) z wyprzedzeniem. Do celów testowych należy używać tej samej liczby komórek i tej samej objętości, ponieważ mniejsza gęstość komórek zwiększa wydajność ścinania. Staraj się unikać nadmiernego lub niedostatecznego ścinania chromatyny. Duże fragmenty chromatyny mogą dramatycznie wpływać na wyniki ChIP poprzez zatykanie, a nadmierne ścinanie może niszczyć epitopy na białku będącym przedmiotem zainteresowania, prowadząc do niższej skuteczności wiązania przeciwciała. W tym eksperymencie najlepsze wyniki osiągnięto, gdy główna frakcja ściętej chromatyny wynosiła około 1000 pz lub nieco mniej (Rysunek 5A).

Weryfikacja ChIP przez qPCR: Przed rozpoczęciem ChIP zaleca się sprawdzenie, czy użyte przeciwciało jest odpowiednie dla ChIP (jeśli to możliwe, użyj przeciwciał klasy ChIP) za pomocą ChIP-qPCR. Przed rozpoczęciem przygotowywania biblioteki sprawdź ChIP pod kątem sekwencjonowania metodą qPCR (patrz krok 5.6.5). Zaprojektuj startery, które wiążą się ze znanym miejscem docelowym białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli dokładne miejsce docelowe w genie jest nieznane, można użyć kilku par starterów do skanowania genu i powiązanych elementów regulatorowych. W przypadku RNAPII ChIP komórek Th1 Ifng, który jest regulowany transkrypcyjnie w górę po stymulacji, a startery aktynowe mogą być stosowane jako kontrola pozytywna. Sox9 i insulina służą jako kontrola negatywna, ponieważ geny te nie ulegają ekspresji w komórkach Th1 (Figura 5B). Pamiętaj, aby nie używać starterów obejmujących egzony, które są zwykle używane do qPCR mRNA. Kontrola IgG może być również wykorzystana do udowodnienia swoistości zastosowanego przeciwciała. Immunoprecypitowane DNA można zmierzyć za pomocą odpowiedniego fluorometru (patrz Tabela Materiałów). Ilości nieswoiście związanego DNA przez kontrolę IgG powinny być znacznie niższe w porównaniu z ilością DNA związanego przez badane przeciwciało.

Replikuje: dowód znaczenia biologicznego: Zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie eksperymentu kinetycznego dla wszystkich metod, zaczynając od tej samej puli komórek, aby upewnić się, że komórki mają tę samą tożsamość dla wszystkich próbek nietraktowanych i poddanych działaniu środka (Rysunek 2). Niemniej jednak zaleca się pobieranie małych porcji głównych punktów czasowych dla każdej metody w celu porównania próbek z kontrpróbą biologiczną (np. metodą qPCR, analiza FACS). Pozwala to na przybliżone oszacowanie, czy leczenie dla obu kontrprób było powtarzalne i można było przystąpić do sekwencjonowania. Walidacja kontrprób powinna być przeprowadzana za pomocą analizy bioinformatycznej. Odtwarzalność wyników może być oceniana pod kątem korelacji między wartościami FPKM między powtórzeniami i wizualizowana za pomocą wykresów punktowych (Rysunek 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Weryfikacja optymalnych warunków znakowania 4sU bez zakłócania fizjologii komórek (rysunek z Davari et al.11)
(A) Wykrywanie apoptozy komórek za pomocą analizy FACS: Komórki Th0 wygenerowane in vitro traktowano różnymi stężeniami 4sU (wskazanymi w nawiasach) odpowiednio przez 0,5 godziny, 1 godzinę i 2 godziny. Leczenie BH3I-1 zastosowano w celu wywołania apoptozy oznaczonej aneksyną V, podczas gdy szok termiczny (5 min w temperaturze 95 °C) zastosowano w celu wywołania śmierci komórki określonej przez 7-AAD. (B) Analiza Western blot dla p53 limfocytów T traktowanych i aktywowanych 4sU: próbki znakowano 200 μM 4sU przez wskazany czas aktywacji, z wyjątkiem punktu czasowego 0,5 godziny, który był znakowany 500 μM 4sU. (C) Analiza Western blot fosfo-EIF2a i całkowitego EIF2a w aktywowanych komórkach Th1 z takimi samymi warunkami znakowania jak w (B). Thapsigargin stosowano jako kontrolę pozytywną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczny przegląd układu kinetycznego do śledzenia zmian w całym genomie
Ten schemat ilustruje konfigurację łączenia 4sU-seq, całkowitego sekwencjonowania RNA, profilowania rybosomów i sekwencji ChIP-w celu zbadania zmian w całym genomie po leczeniu komórki. Połączyć komórki i odłożyć na bok wymaganą liczbę komórek do kontroli niepoddanej działaniu substancji. Traktuj pozostałe komórki i dziel je dla każdej metody i punktu czasowego. Oznacz nieleczone/poddane działaniu substancji komórki pod kątem 4sU-seq z 4sU zgodnie z opisem. Punkty czasowe i próbki dla każdej metody zależą od konkretnego badanego zagadnienia biologicznego. Pobieraj próbki dla każdego punktu czasowego i metody, a następnie postępuj zgodnie z dedykowaną częścią protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Kontrola jakości RNA
znakowanego 4sU Całkowite RNA i biotynylowane RNA uzyskane z aktywowanych komórek Th1 analizowano na bioanalizatorze. Pokazano 18S rRNA i 28S rRNA, a numer integralności RNA (RIN) jest podawany przez instrument w celu określenia integralności RNA. RIN powinien wynosić ≥8, aby zapewnić integralność RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Profile bioanalizatorów bibliotek profilowania rybosomów
(A) Dobra biblioteka: Próbka wykazuje pik w oczekiwanym zakresie wielkości (140 - 160 pz) i nie jest potrzebne dalsze oczyszczanie. (B) Ta próbka pokazuje nadmierny produkt wzmocniony dimerem adaptera (120 pz) w stosunku do pożądanego produktu (140 - 160 pz). Biblioteka ta wymaga dalszego oczyszczania. (C) Próbka z nadmierną amplifikacją: widoczne są wyższe niż oczekiwano piki masy cząsteczkowej i rozmazane amplikony PCR (oznaczone strzałkami). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Optymalna wielkość chromatyny po ścinaniu i weryfikacji ChIP za pomocą qPCR
(A) Obraz żelu agarozowego pokazuje optymalną wielkość fragmentu ściętej chromatyny z trzech próbek, które były ścinane przez 25 cykli na sonikatorze i oczyszczane zgodnie z wcześniejszym opisem w protokole. (B) Wyniki Q-PCR całkowitego RNAPII ChIP (anty-RNA Pol II, 8WG16, ab817) są reprezentowane jako procent danych wejściowych. Startery Ifng i aktyny zostały użyte jako pozytywne, podczas gdy Sox9 i insulina są kontrolami negatywnymi (oba geny nie ulegają ekspresji w aktywowanych komórkach Th1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Porównanie kontrprób biologicznych (rysunek z Davari i wsp. 11)
Reprezentatywny wykres punktowy porównujący wartości ekspresji (FPKM) między powtórzeniami nowo transkrybowanego (4sU) RNA 4 godziny po stymulacji aktywowanych komórek Th1. Zielona linia oznacza równe wartości FPKM, a korelacja rang jest wskazywana na każdym wykresie.

szt. szt. Rozdział szt. szt. szt.
Czas trwania etykietowania (min)Zalecane stężenie 4sU (μM)
120od 100 do 200
60200 - 500
15 - 30500 - 1000
<10500 - 2000

Tabela 1: Zalecane stężenia 4sU (od Rädle, et al.19)
Zakres zalecanych stężeń 4sU jest wskazany dla różnych czasów etykietowania.

metodaNumer komórkiIlość RNA
Oznakowanie 4sU≥2 x 107≥60μg
Profilowanie rybosomów≥2 x107
ChIP-seq≥2 x 107 - 3 x 107

Tabela 2: Wymagana ilość pierwotnych limfocytów T<br /> Minimalna ilość wymaganych pierwotnych limfocytów T dla każdej metody. Kwoty mogą być mniejsze w przypadku korzystania z innych typów komórek.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza całego procesu regulacji genów jest konieczna, aby w pełni zrozumieć adaptacje komórkowe w odpowiedzi na określony bodziec lub leczenie. Połączenie całkowitego sekwencjonowania RNA, sekwencji 4sU, profilowania rybosomów i sekwencjonowania ChIP-w różnych punktach czasowych prowadzi do kompleksowej analizy głównych procesów regulacji genów w czasie. Dogłębne zrozumienie procesów biologicznych jest wymagane do zdefiniowania konfiguracji eksperymentu, a także optymalnych punktów czasowych.

Ponieważ metody badania regulacji genów szybko się poprawiają, protokoły te można dostosować do szybkich zmian. Niemniej jednak dostarczają one najważniejszych metod badania podstawowych mechanizmów regulacji genów w każdym typie komórki. Tutaj omawiamy niektóre pułapki i fakty, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z tych metod.

Komórek: Komórki muszą być wysoce żywotne, a w przypadku stosowania pierwotnych izolowanych komórek musi być zagwarantowana czystość populacji komórek (np. analiza FACS dla pierwotnych limfocytów T). Nawet lekko zestresowane komórki mogą wpływać na wyniki tych bardzo czułych metod sekwencjonowania i zmniejszać ilość nowo transkrybowanego lub translowanego RNA, a także prowadzić do niepożądanych odczytów reakcji na stres w wynikach sekwencjonowania. Prędkość wirowania wspomniana w tym protokole do komórek osadzających jest zoptymalizowana dla pierwotnych limfocytów T. W ten sposób dostosuj prędkość do typu komórki.

Wpływ 4sU na fizjologię komórki: Oprócz wyżej wymienionych opcji weryfikacji minimalnych zaburzeń fizjologii komórkowej po dodaniu 4sU, można przeprowadzić dalszą i/lub dodatkową analizę, zwłaszcza gdy liczba komórek jest ograniczona. Wpływ na proliferację komórek można przetestować, weryfikując czas podwajania komórek, po prostu licząc komórki znakowane i nieznakowane. Indukcję stresu jąderkowego można również przetestować, analizując morfologię komórek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego nukleoliny i jąder. Aby dokładniej zweryfikować wpływ 4sU, zmienioną globalną ekspresję genów można zmierzyć poprzez korelację liczby odczytów z znakowanego całkowitego RNA do nieznakowanego całkowitego RNA.

Numery komórek: W przypadku limfocytów T wytwarzanych in vitro zalecamy rozpoczęcie od co najmniej liczby komórek wskazanej w Tabeli 2. Wybierz odpowiednie liczby dla każdej metody w zależności od typu komórek. Ponieważ limfocyty T mają mniej cytoplazmy i RNA w porównaniu z innymi komórkami, najprawdopodobniej wystarczająca będzie mniejsza ilość innych komórek. W przypadku ChIP-seq liczba komórek w dużym stopniu zależy od użytego przeciwciała i poziomu ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach. W przypadku histonów lub RNAPII ChIP można użyć komórek fewe, podczas gdy liczba komórek musi zostać zwiększona, gdy stosowane są czynniki transkrypcyjne, zwłaszcza jeśli ulegają one ekspresji na niskich poziomach.

Znakowanie 4 sU i biotynylacja RNA: W przypadku stosowania komórek adherentnych, znakowanie 4sU można kierować zgodnie z opisem Rädle i wsp. 19 Ponieważ komórki bardzo szybko zawierają 4sU, można go dodać bezpośrednio do podłoża komórek zawiesinowych, adherentnych lub częściowo przylegających.

Zaleca się rozpoczęcie biotynylacji od 60 - 80 μg RNA. Niemniej jednak można stosować mniejsze ilości RNA, chociaż nie testowaliśmy mniej niż 30 μg. Dodać współprecypitent (np. GlycoBlue) podczas wytrącania RNA, jeśli osadek jest trudny do zobaczenia. Duffy i wsp. wykazali również, że biotyna aktywowana metylotiosulfonianem (biotyna MTS) skuteczniej reaguje z RNA znakowanym 4sU niż HPDP-biotyna31. W związku z tym warto rozważyć przejście na MTS-biotynę, w szczególności w celu odzyskania małych RNA, które mają tendencję do zawierania mniejszej ilości reszt urydyny (patrz protokół biotynylacji wspomniany przez Duffy'ego i wsp.; patrz Oczyszczanie RNA znakowanego 4sU, Procedury eksperymentalne).

Do odzyskania nowo przepisanego RNA możliwe jest użycie kulek paramagnetycznych lub kulek RNA Cleanup według własnego uznania. Zawsze bierz pod uwagę, że te zestawy mogą, ale nie muszą, oczyszczać się pod kątem określonych RNA. Na przykład, jeśli interesują Cię miRNA, rozważ użycie specjalnych zestawów do wychwytywania i sekwencjonowania miRNA.

Kwantyfikacja nowo transkrybowanego RNA: Aby dokładnie określić ilościowo nowo transkrybowane RNA, pomiar należy wykonać za pomocą odpowiedniego fluorometru (patrz Tabela materiałów). W ciągu 1 godziny od ekspozycji na 4sU nowo transkrybowane RNA stanowi około 1 - 4% całkowitego RNA. Nowo transkrybowane RNA znakowane 1 h, aktywowane limfocyty T składają się z ~90 - 94% rRNA11.

Profilowanie rybosomów: Opracowując metodę, ustaliliśmy, że użycie 1,5 razy większej ilości nukleazy niż sugerowano w pierwotnym protokole gwarantuje prawidłowe trawienie. Nie zgłoszono również żadnych działań niepożądanych w przypadku zwiększonych ilości nukleazy. Ponieważ dość trudno jest nadmierne trawienie RPF, gdy są one częścią RNA związanego przez białka rybosomalne, nadal można nieznacznie zwiększyć ilość, aby miareczkować optymalne trawienie nukleazy.

Jeśli w kroku 4.4.2 odzyskano mniej niż 500 ng RNA RPF, powtórz zubożenie rRNA i połącz oczyszczone RPF z kolumnami RNA Clean & Concentrator-5. Alternatywnie, załadować dwie identyczne próbki obok siebie na żel (krok 4.5.3) i połączyć plastry żelu podczas elucji RNA z żelu (krok 4.5.6).

Zalecamy przycięcie RPF na żelu tak ciasno, jak to możliwe, do pasm 28 i 30 nt. Pomaga to w eliminowaniu niechcianych fragmentów z rRNA i tRNA, które później staną się częścią Twojej biblioteki i zmniejszą odczyty sekwencjonowania dla Twoich RPF.

Zaleca się również unikanie światła UV podczas oczyszczania żelu. Może to powodować powstawanie nacięć we fragmentach RNA, a także dimerów pirymidynowych, które w końcu mogą poważnie wpłynąć na przygotowanie biblioteki i wyniki sekwencjonowania.

Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie danych: Protokół profilowania rybosomów umożliwia wygenerowanie biblioteki cDNA odpowiedniej do sekwencjonowania. Próbki wygenerowane przez znakowanie 4sU mogą być bezpośrednio wykorzystane do przygotowania biblioteki za pomocą dowolnego odpowiedniego zestawu do sekwencjonowania RNA. Ponieważ nowo transkrybowane RNA, zwłaszcza przy użyciu krótkich czasów znakowania, może nie być jeszcze poliadenylowane, nie należy przeprowadzać selekcji poli-A. Zamiast tego zdecydowanie zalecamy zubożenie rRNA, aby zapobiec zmniejszeniu głębokości sekwencjonowania dla rzeczywistej próbki. Używając limfocytów T, zaczęliśmy od 400 ng nowo transkrybowanego i całkowitego RNA (w zależności od zestawu, patrz materiały), przeprowadziliśmy zubożenie rRNA i zredukowaliśmy cykle amplifikacji PCR, aby zminimalizować błąd PCR. Przygotowanie biblioteki można wykonać przy użyciu mniejszej ilości materiału wyjściowego. Aby uwzględnić złożoność biblioteki, należy zoptymalizować liczbę cykli PCR.

Dla ChIP-seq dostępnych jest również wiele zestawów do przygotowania biblioteki. W naszych rękach przygotowanie biblioteki działało dobrze, zaczynając od 2 ng DNA ChIP (zobacz materiały, aby uzyskać sugestię, którego zestawu użyć). Pamiętaj, aby sprawdzić indeksy balansu kolorów podczas sekwencjonowania. Zalecamy głębokość sekwencjonowania ≥40 x 106 odczytów dla próbek 4sU-seq, total RNA-seq i ChIP-seq oraz ≥80 x 106 odczytów dla próbek profilowania rybosomów. Głębokość sekwencjonowania zależy od próbki i dalszej analizy bioinformatycznej i powinna być dokładnie rozważona. Aby przeanalizować odczyty introniczne pod kątem splicingu kotranskrypcyjnego, należy wybrać sekwencjonowanie sparowanych końców 100 pz.

Błąd systematyczny sekwencjonowania: Sekwencjonowanie stało się złotym standardem przy określaniu globalnych zmian w transkrypcji, translacji lub wiązaniu czynników transkrypcyjnych. W ostatnich latach dotychczasowe metody zostały doprowadzone do granic możliwości lub opracowano nowe techniki sekwencjonowania coraz mniejszych początkowych ilości RNA. Wymaga to amplifikacji cDNA, co wprowadza szum lub odchylenie. Niedawno opracowano unikalne identyfikatory molekularne (UMI) w celu eksperymentalnej identyfikacji duplikatów wprowadzonych przez PCR. Niedawno wykazano, że UMI tylko nieznacznie poprawiają moc sekwencjonowania i wskaźnik fałszywych odkryć dla zróżnicowanej ekspresji genów32. Niemniej jednak rozważ użycie unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) dla wszystkich bibliotek sekwencjonowania w celu kontrolowania złożoności biblioteki, zwłaszcza gdy zaczynasz od małych ilości RNA i gdy potrzebnych jest wiele cykli PCR.

Roztwory buforowe i podstawowe: Wszystkie do sekwencji 4sU i profilowania rybosomów muszą być przygotowane w ścisłych warunkach wolnych od RNaz przy użyciu wody wolnej od nukleaz. Zaleca się kupowanie gotowych NaCl bez nukleaz, Tris-HCl, EDTA, cytrynianu sodu i wody. Aby zapewnić warunki wolne od nukleaz, do czyszczenia pipet lub powierzchni można użyć roztworu odkażającego RNazę. Wszystkie dla ChIP-seq muszą być co najmniej wolne od DNaz i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Zawsze dodawaj inhibitory proteazy i opcjonalnie inhibitory fosfatazy bezpośrednio przed użyciem i trzymaj na lodzie.

Bioinformatyka: Analiza wszystkich danych sekwencjonowania (tj. sekwencjonowania ChIP, sekwencjonowania RNA i profilowania rybosomów) obejmuje kontrolę jakości (np. przy użyciu FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), przycinanie adapterem (np. za pomocą cutadapt20), a następnie mapowanie do genomu referencyjnego dla badanych komórek. W przypadku danych sekwencyjnych RNA (zarówno całkowitych, jak i sekwencyjnych 4sU), a także danych profilowania rybosomów, wymagany jest mapowanie sekwencjonowania RNA, takie jak ContextMap 221. W przypadku niepołączonych wyrównań danych ChIP-seq wystarczy użyć BWA-MEM22 . Ekspresję genów można obliczyć za pomocą modelu RPKM (Reads per Kilobase of Exon per Million Fragments Mapped)1, po określeniu liczby odczytów na gen za pomocą programu, np. featureCounts23. Dla szczytowych połączeń z danych ChIP-seq dostępnych jest wiele programów, np. MACS24 lub GEM25. Dalsze analizy można przeprowadzić w odniesieniu do R26, w szczególności przy użyciu narzędzi dostarczonych w ramach projektu Bioconductor27.

W tym przypadku głównym wyzwaniem w integracji poziomów 4sU i całkowitego RNA oraz aktywności translacyjnej z profilowania rybosomów jest normalizacja. Klasycznym podejściem do rozwiązania tego problemu jest normalizacja do poziomu genów odpowiedzialnych za utrzymanie domu. Aby zredukować szum spowodowany losowymi fluktuacjami dla poszczególnych genów związanych z prowadzeniem domu, zaleca się nie tylko użycie kilku genów związanych z prowadzeniem domu, ale także średnich poziomów dla większego zestawu, np. >3000 genów utrzymania domu opracowanych przez Eisenberga i Levanona28. W celu obliczenia szybkości obrotu RNA na podstawie stosunku 4sU- do całkowitego RNA, normalizacja opiera się na medianie szybkości obrotu (np. przy założeniu okresu półtrwania RNA wynoszącego 5h)29. Ponieważ jednak zakłada to brak ogólnych zmian w genach zajmujących się utrzymaniem porządku, zalecamy stosowanie podejść analitycznych niezależnych od normalizacji, np. opartego na korelacji grupowania szeregów czasowych różnych typów danych w celu zidentyfikowania grup genów o odmiennym zachowaniu w transkrypcji i translacji podczas aktywacji. Szczegółowy opis bioinformatycznej integracji różnych typów danych znajduje się w oryginalnej publikacji11.

Analiza wskaźników rotacji i integracja danych: Niedawno opublikowana praca33 porównująca okresy półtrwania wyznaczone za pomocą multipleksowanej kontroli genów (MGC) z metodami globalnymi może wykazać, że okresy półtrwania najlepiej korelują z tymi uzyskanymi za pomocą metod znakowania metabolicznego w porównaniu z innymi metodami (np. ogólnym hamowaniem transkrypcji przez leki). Należy jednak wspomnieć, że mogą wystąpić różnice między obliczeniami okresu półtrwania, które zostały opisane 15,34. Uwzględniamy większość problemów i różnic, które są wprowadzane przez reakcję na stres z powodu długotrwałej ekspozycji na 4sU. Dlatego niezbędne jest wykluczenie reakcji na stres wprowadzonej przez oznakowanie 4sU. Aby dokładniej zweryfikować wskaźniki rotacji, zalecamy użycie MGC.

Dodatkowo, wygenerowany tutaj zestaw danych może być również wykorzystany do bardziej zintegrowanej analizy danych (np. regulacji długich niekodujących RNA)35,36.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Larsowi Dölkenowi za radę dotyczącą ustanowienia znakowania 4sU dla pierwotnych limfocytów T; Elisabeth Graf i Thomasowi Schwarzmayrowi za krytyczną pomoc w tworzeniu bibliotek i sekwencjonowaniu; Dirk Eick i Andrew Flatley za dostarczenie przeciwciał przeciwko RNAPII i limfocytom T; N. Henriette Uhlenhaut i Franzisce Greulich za pomoc w przygotowaniu biblioteki do ChIP-seq; Caroline C. Friedel otrzymała wsparcie w postaci grantów FR2938/7-1 i CRC 1123 (Z2) od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher otrzymała wsparcie w postaci grantu GL 870/1-1 od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) i Niemieckiego Centrum Badań nad Diabetologią (DZD), Helmholtz Zentrum München.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4sU-znakowanie
4-tiourydyna (100 mg)Carbosynth13957-31-8Przygotuj 50 mM zapasu w sterylnym H2O/PBS; Przechowuj w – 20&stopni; C w podwielokrotnościach 50-500 &mikro; l; Nie zamrażaj ponownie.
Probówki Safe-lock 1,5 mlEppendorf30121589Opcjonalnie
1,5 ml zakręcane probówki polipropylenoweSarstedt72692005Kompatybilne z dimetyloformamidem
Probówki 15 mlBD Falcon352096Kompatybilne z dimetyloformamidem
2,0 ml Zakręcane rurki polipropylenoweSarstedt72694005Kompatybilne z dimetyloformamidem
50 ml rurkiBD Falcon352070Kompatybilne z dimetyloformamidem
Agencourt RNAClean XPBeckman CoulterA63987Zalecamy stosowanie tych koralików paramagnetycznych. Porcja i przechowywać w 4° C
ChloroformSigma Aldirch372978OSTRZEŻENIE – NIEBEZPIECZNE DLA ZDROWIA
DimetyloformamidSigma AldrichD4551
Ditiothreitol (DTT)Roth6908.1Przygotuj jako 100 mM DTT w wolnym od nukleaz H2O; zawsze przygotuj świeży
EtanolMerck1.00983.1000
EZ-Link Biotyna-HPDP (50 mg)Pierce21341Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając 50 mg Biotyny-HPDP w 50 ml DMF. Delikatne ocieplenie wspomaga solubilizację. Przechowywać w 4° C w podwielokrotnościach 1 ml. DMF rozpuszcza niektóre tworzywa sztuczne. Zalecamy używanie szklanych pipet do przenoszenia DMF ze szklanej butelki do 50 ml probówek Falcon.
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-4626
IzopropanolMerck1.09634.1011
NaCl (5M)Sigma Aldrich71386Roztwór podstawowy
EDTA wolny od nukleaz (500 mM), pH 8,0Invitrogen15575-020Roztwór podstawowy
Bez nukleaz H2OSigma AldrichW4502Roztwór podstawowy
wolny od nukleaz Tris Cl (1M), pH 7,4Lonza51237Roztwór podstawowy
Żel Phase Lock Ciężkie probówki (2,0 ml)5Skierować2302830Użyć w kroku 1.3.4.
Polipropylen 15  ml probówki wirówkoweGreiner Bio-One188271Lub równoważny; muszą tolerować do 15 000 &razy; g
Odczynnik do lizy QIAzol (200 ml)Qiagen79306Użyj tego lub równoważnego odczynnika TRI do izolacji RNA, OSTRZEŻENIE &NDASH; I NIEBEZPIECZNE DLA ZDROWIA! Zapewnij natychmiastowy dostęp do antidotum fenolowego (PEG-Metanol)
Zestaw do oznaczania Qubit RNA HSLife TechnologiesQ32852Użyj tego zestawu do ilościowego określania ilości RNA w kroku 1.4.11
Zestaw RNeasy MinEluteQiagen74204Opcjonalnie; zawiera Bufor RLT
Cytrynian soduSigma AldrichC8532Przygotuj 1,6 M roztwór podstawowy, używając wody wolnej od nukleaz
Tween 20Sigma AldrichP1379
i mikro; Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Sklep pod adresem 4° C, zawiera i mikro; Kolumny komputerów Mac używane w kroku 1.4.6. (sklep w RT)
Test żywotności komórek i stresu
PE Zestaw do wykrywania apoptozy Aneksyna V IBD Biosciences559763Opcjonalnie
ThapsigarginSigma-AldrichT9033Opcjonalnie
P53ABCAMAB26Opcjonalnie
p-EIF2a (Ser51)Sygnalizacja komórkowa9721Opcjonalnie
BH3I-1Sigma-AldrichB 8809Opcjonalnie
Buffers
4sU Buforprzechowywać w temperaturze RT100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 w wolnym od nukleaz buforze biotynylacyjnym H2O
(10x)przechowywać w temperaturze 4 stopni; C100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA w wodzie wolnej od nukleaz; zrobić porcje 1 ml; przechowywać w temperaturze 4° Bufor
wytrącania C RNAprzechowywać w RT1,2 M NaCl, 0,8 M cytrynian sodu w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj się z wyprzedzeniem w warunkach wolnych od nukleaz. Przechowywać w temperaturze pokojowej w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.
Equipment
2100 Instrument do bioanalizowaniaAgilentG2939BA
RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511Użyj tego zestawu, aby zweryfikować integralność RNA w kroku 1.3.10
RNA 6000 Zestaw PicoAgilent5067-1513Opcjonalny
spektrofotometr UV/VISThermo ScientificNanoDrop 1000Lub równoważny. Użyj w kroku 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
Wirówka szybkoobrotowaThermo ScientificHeraeus Multifuge X3RLub równoważne urządzenie o zdolności do osiągnięcia 13 000  &czasy;   g
Wirnik szybkoobrotowyThermo ScientificFiberlite F15-6 x 100y
Adaptery do probówek 15 ml Wirówka
stołowa z chłodzeniemEppendorf5430R Lub odpowiednik.
ThermomixerEppendorfThermomixer CLub odpowiednik.
Stojak magnetycznyMiltenyi Biotec130-042-109Jeden stojak mieści 8 i mikro; Kolumny komputerów Mac.
Ultra-dokładna wagaMettler ToledoML204TLub równoważna.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKDo żeli RNA; lub równoważny.
E-Gel EX 1% prefabrykaty agarozoweInvitrogenG4020-01Do żeli RNA; lub równoważne.
DynaMag-2 Magnet-1 każdyLife Technologies12321D
RNaseZapSigmaR2020Opcjonalny
zestaw do przygotowania całkowitej biblioteki RNA TruSeqIlluminaRS-122-2201Lub odpowiednik. W przypadku limfocytów T użyliśmy 400 ng 4sU i całkowitego RNA z 11 cyklami do amplifikacji PCR. Zubożenie rRNA jest zawarte w tym zestawie
NanodropThermo Scientificużyj Nanodrop lub równoważnego przyrządu do pomiaru stężenia RNA
Profilowanie rybosomów
TruSeq Zestaw profili rybosomów (ssaki lub drożdże)IlluminaRPYSC12116 (drożdże)
Zestaw profilowy TruSeq Ribo (ssaki lub drożdże)IlluminaRPHMR12126 (ssaki)
Ilustruj kolumny MicroSpin S-400 HRGE Healthcare27-5140-01
RNA Clean & Koncentrator-25 zestawZymo ResearchR1017
RNA Clean & Zestaw Concentrator-5Zymo ResearchR1015
Zestaw do usuwania rRNA Ribo-Zero Gold (człowiek/mysz/szczur)IlluminaMRZG126 lub MRZG12324
(zestaw DNA o wysokiej czułości)Agilent Technologies5067-4626Już potrzebne do 4sU-seq
Wszystkie inne materiały eksploatacyjne i sprzęt są wymienione w Podręczniku użytkownika!!Uważnie przeczytaj instrukcję obsługi i zamów wymagane materiały eksploatacyjne z wyprzedzeniem (weź pod uwagę długi czas dostawy niektórych materiałów eksploatacyjnych, np. żeli)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8,0)gereral lab supplier
100 pz Plus MarkerThermo FisherSM0323
16 % FormaldehydThermo Fisher28908Dodać do końcowego stężenia 1 %
70% EtOHgereral lab dostawcaZawsze przygotowuj świeże
Agarozagereral lab dostawca
Agencourt RNAClean XP koralikiBeckman CoulterA63987Zalecamy stosowanie tych paramagnetycznych kulek. Porcja i przechowywać w 4° C
Zestaw do przygotowania biblioteki ChIPKapaBiosystemsKK8504Lub użyj wybranego zestawu
Probówki do mikrowirówek DNA o niskim poziomie wiązaniaEppendorfZ666548-250EAlub równoważne
Dynabeads Protein GInvitrogen10004DUżyj tych superparamagnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G w kroku 4.3.1.; Przynieś do RT przed użyciem
laboratoryjny GlycinegereralPrzygotuj 2M roztwór podstawowy
GlycogenRoche10-901-393-001
MinElute PCR Purification KitQiagen28004Użyj tego zestawu (lub odpowiednika) do oczyszczenia chromatyny w kroku 4.2.4.
Inhibitor fosfatazy (PhosStop)Roche4906837001Dodaj świeżo do buforu i trzymaj na lodzie
Power SYBRgreen Master mixThermo Fisher4367659
Inhibitor proteazy (cOmplete, EDTA-free)Roche11873580001Dodaj świeżo do buforu i trzymaj na lodzie
Proteinaza KInvitrogen25530049
Qubit dsDNA HS Zestaw testowyInvitrogenQ32851Użyj tego zestawu do ilościowego określania ilości DNA w kroku 4.6.4. na fluorometrze kubitowym
Rnaza, wolne od DNazyRoche11-119915001
Nasienie łososia (sonikowane do około 100 pz)SigmaD1626
TE pH 8.0dostawca laboratorium
Przeciwciała (stopień ChIP, jeśli to możliwe)
anty-RNA Pol II [8WG16]abcamab817
anty-histon H3K36me3abcamab9050
lub przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania
Buffers
Binding/Blocking bufferPrzechowywać w RTPBS z 0,5% BSA i 0,5
buforem do lizy komórkowejPrzechowywać wRT 5 mM Pipes [pH 8,0], 85 mM KCl i 0,5 % NP40
ChIP IP bufferPrzechowywać w RT0,01 % SDS; 1. 1% Triton X-100; 1.2  mM EDTA; 16,7  mM Tris-HCl, pH 8,1; 16,7  mM Bufor
elucyjnyPrzechowywać w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA (pH 8,0), 300 mM NaCl i 0,5
buforPrzechowywać w temperaturze RT50 mM Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA i 1 % SDS
Bufor płuczący IPrzechowywać w RT0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8,1; 150 mM NaCl
Bufor płuczący IIPrzechowywać w RT0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2  mM EDTA; 20  mM Tris-HCL pH 8,1; 500  mM NaCl
Bufor płuczący IIIPrzechowywać w temperaturze RT0,25  M LiCl; 1% NP-40; 1  mM EDTA; 10  mM Tris-HCl, pH 8,1
Sprzęt
2100 Instrument do bioanalizacjiAgilentG2939BAużywaj tego przyrządu do analizy elektroforetycznej
NanodropThermo Scientific
Bioruptor TBX mikroprobówki 1,5 mlDiagenodeC30010010
lub probówki specjalnie dla Twojego urządzenia do sonikacji
Urządzenie do sonikacji Bioruptor lub urządzenie do sonikacji do wyboruSonikacja limfocytów T za pomocą Bioruptor: 20 - 25 cykli (30 s wł., 30 s off na wysokim poziomie w dwóch mikroprobówkach Bioruptor o pojemności 1,5 ml z 500 &mikro; l każda probówka)
Stojak magnetyczny do probówek
Thermomixer
Elektroforeza w żelu agarozowym
Fluorometr kubitowyThermo ScientificUżyj tego fluorometru do ilościowego oznaczania niewielkich ilości RNA / DNA
myjący Dostawca gereral% Tween 20 NaCl % do lizy jąder SDS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126(2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638(2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533(2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

sekwencjonowanie 4sUprofilowanie rybosom wsekwencjonowanie ChIPobr t RNAtempo translacjiregulacja gen wsekwencjonowanie wysokoprzepustowesplicing kotranskrypcyjny

Powiązane artykuły