Artykuł metodologiczny

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56760

⸱

15 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 2Nanomedicine Science and Technology Center, Northeastern University, 3Department of Physics, Northeastern University, 4Departments of Bioengineering, Northeastern University, 5Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Streszczenie

Nanocząsteczki złota (AuNPs) były szeroko stosowane w badaniach medycznych ze względu na ich rozmiar, biokompatybilność i modyfikowalną powierzchnię. Specyficzne celowanie i dostarczanie leków to tylko niektóre z zastosowań tych AuNPs, ale właściwości obronne śródbłonkowych macierzy zewnątrzkomórkowych utrudniają wychwyt cząstek. Aby rozwiązać ten problem, opisujemy metodę syntezy ultramałych nanocząstek złota w celu poprawy dostarczania naczyniowego, z konfigurowalnymi grupami funkcyjnymi i długościami polimerów w celu dalszych dostosowań. Protokół daje AuNP o długości 2,5 nm, które są pokryte chlorkiem tetrakis(hydroksymetylo)fosfoniowym (THPC). Zastąpienie THPC heterofunkcyjnym glikolem polietylenowym (PEG) na powierzchni AuNP zwiększa promień hydrodynamiczny do 10,5 nm, zapewniając jednocześnie różne grupy funkcyjne na powierzchni. Ostatnia część protokołu obejmuje opcjonalne dodanie fluoroforu, aby umożliwić wizualizację AuNP pod wpływem fluorescencji w celu śledzenia wychwytu nanocząstek. Dializa i liofilizacja zostały wykorzystane do oczyszczenia i wyizolowania AuNPs. Te fluorescencyjne nanocząstki można wizualizować zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo dzięki biokompatybilnej powłoce PEG i sondom fluorescencyjnym. Dodatkowo, zakres rozmiarów tych nanocząstek sprawia, że są one idealnym kandydatem do badania glikokaliksu bez zakłócania normalnej funkcji naczyń krwionośnych, co może prowadzić do poprawy dostarczania i terapii.

Wprowadzenie

Nanocząsteczki zostały zastosowane do dostarczania leków i obrazowania ze względu na ich zdolność do poruszania się po ciele w celu dotarcia do docelowych obszarów zainteresowania1,2. Cząstki mogą gromadzić się w guzach przez nieszczelne naczynia krwionośne lub lokalizować się w miejscu, w którym docelowy ligand jest nadmiernie eksprymowany i odsłonięty. Złoto, w szczególności, stało się powszechnie stosowanym materiałem nanocząsteczkowym ze względu na jego unikalne właściwości chemiczne i fizyczne, które wpływają na transport i uwalnianie środków terapeutycznych3. Złoto jest skutecznym materiałem nanocząsteczkowym, ponieważ jego powierzchnia może być modyfikowana w celu wiązania się z tiolami i ma wysoką biokompatybilność ze względu na niską toksyczność4. AuNP mogą być nośnikami dużych leków biomolekularnych i odniosły sukces w dostarczaniu peptydów, kwasów nukleinowych i białek, dzięki czemu AuNP są korzystne dla celu2,4.

Niestety, skuteczność dostarczania leków przez nanocząsteczki została ograniczona przez ujemnie naładowany glikokaliks, który jest zewnątrzkomórkową powłoką na błonie większości komórek ssaków i ma rozmiary porów do 7 nm5,6. Ta wielkość porów jest mniejsza niż w przypadku większości nanocząsteczkowych nośników leków, które mają typowe średnice w zakresie 50-200 nm. W warunkach chorobowych te pory glikokaliksu stają się większe w wyniku degradacji, zwiększając przepuszczalność do komórek śródbłonka. Jednak większość nanocząstek jest nadal zbyt duża, aby wykorzystać tę zmianę strukturalną w glikokaliksie. Jedną z implikacji tego niedopasowania wielkości jest to, że cząsteczki o konwencjonalnych rozmiarach nie oddziałują korzystnie z komórkami śródbłonka wyściełającymi naczynia krwionośne. Wpływa to na dostarczanie cząstek podawanych dożylnie do śródbłonka, a także można to powiedzieć o transporcie cząstek przez barierę krew-mózg7,8,9,10.

Jednym z podejść do walki z tym problemem jest wykorzystanie mniejszych cząsteczek do przejścia przez małe pory w glikokaliksie. Tutaj syntetyzujemy ultramałą nanocząsteczkę złota o długości fali 10,5 nm, która normalnie powinna być odstraszana przez nienaruszony, zdrowy glikokaliks. Gdy glikokaliks zacznie być zagrożony, nanocząsteczka powinna łatwo przenikać do komórek przez zwiększający się rozmiar porów. Protokół opisany w tym artykule szczegółowo opisuje syntezę ultramałego złotego rdzenia pokrytego PEG, który zwiększa biokompatybilność i zmniejsza klirens ogólnoustrojowy4. PEG może również zawierać kilka typów grup funkcyjnych, otwierając drogi do koniugacji docelowych ligandów, fluoroforów i środków terapeutycznych. Wcześniej opublikowane wyniki wskazują, że te ultramałe nanocząstki mają tendencję do korzystniejszego wychwytywania w regionach zakłóconej funkcji glikokaliksu śródbłonka, nawet bez aktywnego ukierunkowania4,11. Wskazuje to na wykonalność i znaczenie wykorzystania cząstek o odpowiedniej wielkości do zastosowań związanych z dostarczaniem. Poniższy protokół przedstawia syntezę, oczyszczanie i charakterystykę AuNP pokrytych PEG (PEG-AuNP), z dyskusją na temat dostosowania grup funkcyjnych i koniugacji do innych zastosowań.

Protokół

1. Przygotowanie lub zaopatrzenie w roztwory podstawowe (do przechowywania w temperaturze pokojowej lub zamrożone do momentu użycia)

  1. Przygotować 1 M roztwór podstawowy wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 400 mg NaOH w 10 ml ultraczystej wody o temperaturze pokojowej i dobrze mieszając materiały.
    UWAGA: Woda ultraczysta jest definiowana jako woda bez zanieczyszczeń, takich jak cząstki stałe, bakterie, nukleazy, jony lub śladowe ilości substancji organicznych. Do uzyskania ultraczystej wody stosuje się system oczyszczania, w wyniku którego jej rezystywność wynosi do 18,2 mΩ·cm, co wskazuje na niskie zanieczyszczenie anionowe. Nie zaleca się używania dostępnej na rynku butelkowanej wody ultraczystej. Odtąd ta ultraczysta woda będzie nazywana wodą, chyba że określono inaczej.
  2. Przygotować 6 M roztwór podstawowy NaOH, rozpuszczając 2,4 g NaOH w 10 ml wody i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować 250 mM roztwór podstawowy kwasu chloroaurowego (HAuCl4), rozpuszczając 1 g wysuszonego HAuCl4 w 10,16 ml wody. Rozcieńczyć 1 ml 250 mM HAuCl4 9 ml wody, aby uzyskać stężenie robocze 25 mM HAuCl4. Roztwór HAuCl4 należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 0,1 M bufor węglanowy o pH 8,8, rozpuszczając 84 mg wodorowęglanu sodu w 10 ml wody i dostosowując pH do 8,8 przez dodanie 6 M NaOH z kroku 1.2. Przechowywać bufor węglanowy w temperaturze pokojowej.
  5. Zmieszać 20 ml soli tetrazolowej, 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-soli tetrazolowej (MTS) ze środkiem stabilizującym, etosiarczanem fenazyny (PES) (patrz tabela materiałów). Mieszaninę MTS/PES należy przechowywać w porcjach (maksymalnie przez 10 cykli zamrażania i rozmrażania) w temperaturze -20 °C w ciemności.

2. Synteza rdzeni nanocząstek złota

  1. Przygotować rozcieńczony roztwór THPC, dodając 12 μl 80% THPC w wodzie do 1 ml wody w probówce mikrowirówkowej o temperaturze pokojowej.
  2. Zabezpiecz kolbę okrągłodenną o pojemności 100 ml na środku magnetycznej płytki mieszającej. Wlej 45 ml wody do kolby i mieszaj wodę z prędkością 300 obr./min za pomocą małego mieszadła magnetycznego w kształcie jajka. Dodać 0,5 ml 1 M NaOH i 1 ml rozcieńczonego roztworu THPC. Kontynuuj energiczne mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez 5 minut.
  3. Kontynuuj mieszanie mieszaniny i dodaj 2 ml 25 ml 25 mM roztworu HAuCl4. Kolor mieszaniny zmieni się z żółtego na ciemnobrązowy w ciągu kilku sekund, co wskazuje na tworzenie się AuNP z THPC z ładunkiem ujemnym. Mieszaj mieszaninę przez dodatkowe 15 minut, aby umożliwić całkowite uformowanie złotych rdzeni.

3. Dodanie korony polimerowej wokół nanocząstek złota

  1. W ciągu 15 minut opisanych w kroku 2.3 należy przygotować roztwory PEG, rozpuszczając każdy z następujących składników w 1 ml wody w szklanych fiolkach o pojemności 4 ml: 30 mg NH 2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.
    UWAGA: Otrzymane stężenia powinny wynosić 8,8 M NH 2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH i 3,75 M COOH-PEG-SH.
  2. Po zmniejszeniu prędkości mieszania roztworu w kolbie okrągłodennej do 100 obr./min, należy kroplami dodawać roztwory PEG do roztworu AuNP z zaślepką THPC. Kontynuuj delikatne mieszanie mieszaniny przez noc, w temperaturze pokojowej, aby zapewnić skuteczne usunięcie THPC i zastąpienie go PEG.
  3. Przez następne 72 godziny należy użyć membrany celulozowej o masie cząsteczkowej 12-14 kDa do dializowania mieszanej mieszaniny w 4-litrowym wiadrze z wodą mieszaną z prędkością 60 obr./min. Związać końce membran klipsami do dializy i przenieść roztwór za pomocą pipety.
    UWAGA: Ten proces dializy z membraną odcinającą 12-14 kDa usuwa tylko nieprzereagowane PEG, THPC i inne reagenty chemiczne poprzez dyfuzję wzdłuż gradientu stężeń.
  4. Aby utrzymać wysoki gradient stężenia i sprzyjać ciągłej dyfuzji, należy wymieniać wodę co 2 godziny przez pierwsze 6 godzin i co 6-12 godzin przez pozostałe 66 godzin.
    UWAGA: Celem tego harmonogramu wymiany wody jest dostosowanie się do szybkiej dyfuzji, która zachodzi na wczesnym etapie, ze względu na początkowo wysokie stężenie w próbce. Opisany powyżej proces dializy pozostawia roztwór nanocząstek częściowo oczyszczony, ponieważ nanocząstki, osady, agregaty i inne zanieczyszczenia o dużych rozmiarach nie mogą przejść przez pory membrany odcinającej 12-14 kDa.
  5. Przefiltruj częściowo oczyszczony roztwór nanocząstek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby usunąć pozostałe osady, agregaty i inne zanieczyszczenia o dużych rozmiarach.
  6. Umieścić probówkę stożkową w zamrażarce o temperaturze -80 °C i pozostawić oczyszczony roztwór PEGylowanego AuNP (PEG-AuNP) do zamrożenia przez około 5 godzin.
  7. Za pomocą liofilizatora liofilizować oczyszczony PEG-AuNP.
  8. Suchy, oczyszczony PEG-AuNP należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

4. Sprzęganie fluoroforów za pomocą estru N-hydroksysukcynimidu (NHS) z grupami NH2 na PEG-AuNP

  1. Umieść kolbę okrągłodenną o pojemności 50 ml na środku magnetycznej płytki mieszającej. Napełnij kolbę 18 ml wody i mieszaj wodę z prędkością 100 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego w kształcie jajka.
  2. Zważyć 2 mg liofilizowanego PEG-AuNP w stożkowej probówce o pojemności 4 ml, używając bardzo precyzyjnej wagi stołowej. Za pomocą pistoletu antystatycznego należy wyeliminować ładunki elektrostatyczne i przywieranie proszku PEG-AuNP do powierzchni tuby. Dodaj 2 ml wody do probówki. Wlać 2 ml roztworu PEG-AuNP do kolby okrągłodennej w celu dalszego rozpuszczenia w sumie 20 ml wody. Kontynuuj mieszanie mieszaniny z prędkością 100 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego w kształcie jajka.
  3. Dodać 1 ml buforu węglanowego o pH 8,8 o 0,1 M do 20 ml odtworzonego AuNP znajdującego się w kolbie okrągłodennej. Kontynuuj mieszanie.
  4. Dodać 5 μl 10 mg/ml fluorescencyjnego estru NHS w dimetylosulfotlenku.
    UWAGA: W tym procesie można użyć dowolnego barwnika fluorescencyjnego. Mieszaj fluorescencyjny PEG przez noc. Przechowywać w temperaturze pokojowej i przykryć folią.
  5. Przez następne 72 godziny należy usuwać nadmiar fluoroforów zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.3. Krótko dializować wymieszaną mieszaninę za pomocą 4 l wiadra z wodą i membrany celulozowej o masie cząsteczkowej 12-14 kDa. Zmieniaj wodę co 2 h przez pierwsze 6 h i co 6-12 h przez pozostałe 66 h.
  6. Otrzymać 1 ml oczyszczonego roztworu fluorescencyjnego PEG-AuNP, który zostanie użyty do charakterystyki opisanej poniżej w sekcji 5. Pozostały roztwór należy zamrozić i poddać liofilizacji w celu otrzymania nanocząstek fluorescencyjnych w postaci sproszkowanej do przechowywania w temperaturze 4 °C, jak opisano w krokach 3.5–3.7.
  7. Użyj filtra strzykawkowego 0,2 μm, aby wysterylizować i usunąć wszelkie potencjalne osady po rozpuszczeniu do zastosowań w hodowlach komórkowych.

5. Charakterystyka fluorescencyjnych pegylowanych nanocząstek złota

  1. Wykorzystanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do wizualizacji rdzenia nanocząstek złota i ilościowego określenia rozmiarów
    1. Upuść 10 μl oczyszczonego roztworu fluorescencyjnego PEG-AuNP na siatkę TEM pokrytą węglem.
    2. Po 5 minutach za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej ostrożnie odsunąć nadmiar płynu z krawędzi kratki TEM, aż do pozostawienia filmu zawierającego fluorescencyjne PEG-AuNPs.
    3. Zobacz fluorescencyjne PEG-AuNP przy napięciu 80 kV i powiększeniu 50 000-150 000. Rób zdjęcia cyfrowe.
      UWAGA: Widoczny będzie tylko złoty rdzeń, ponieważ PEG nie ma gęstości elektronów na TEM.
    4. Za pomocą oprogramowania pomiarowego ustaw skalę pomiarową w korelacji z podziałką liniową. Oblicz średnice około 20 złotych rdzeni, a następnie określ średnią średnicę złotego rdzenia.
      UWAGA: System obrazowania TEM automatycznie umieszcza podziałkę liniową na zdjęciach cyfrowych.
  2. Pomiar hydrodynamicznej wielkości nanocząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
    1. Przenieść 1 mg liofilizowanych AuNP pokrytych THPC do probówki mikrowirówkowej, stosując metodę opisaną w kroku 4.2. Przenieść 1 mg liofilizowanego PEG-AuNP w osobnej probówce. Dodaj 1 ml wody do każdej probówki i przenieś każdy roztwór AuNP do przezroczystego plastiku o pojemności 1 ml.
    2. Umieść kuwetę w przyrządzie DLS i zmierz sferyczne średnice hydrodynamiczne za pomocą oprogramowania analizatora cząstek, które jest wbudowane w system DLS.
    3. Wykreślić zmierzone średnice hydrodynamiczne w formacie histogramu.
      UWAGA: Histogram pogrupuje nanocząstki według wielkości. Największa grupa nanocząstek wyjaśni średnicę, która najlepiej opisuje wielkość AuNP zsyntetyzowanych w tym protokole.
  3. Potwierdzenie fluorescencji fluorometrycznej
    UWAGA: Ta sama próbka i kuweta z kroku 5.2 mogą być używane do pomiaru sygnału fluorescencyjnego.
    1. Wyjmij kuwetę z DLS i włóż do spektrofluorometru. Ustaw długość fali wzbudzenia na 633 nm i odczytuj emitowane sygnały fluorescencyjne w zakresie długości fal 650-800 nm.
    2. Upewnij się, że szczyt wynosi około 665 nm, co koreluje ze szczytem emisji dla NHS.
      UWAGA: Dostosuj długości fal wzbudzenia i emisji zgodnie z fluoroforem użytym w procesie.
  4. Test MTS11 do oceny biokompatybilności
    1. Na 96-dołkowej, przezroczystej, sterylnej płytce poddanej hodowli tkankowej, odpipetować 100 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM; uzupełnione 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) i 3,2 x 103 komórek do każdej studzienki.
      UWAGA: W tym badaniu wykorzystano komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura. Łącznie wykorzystuje się 21 studzienek, aby umożliwić przeprowadzenie 3 powtórzeń dla każdego z 7 różnych stężeń nanocząstek (patrz krok 5.4.3 w celu uzyskania konkretnych stężeń będących przedmiotem zainteresowania).
    2. Pozwól komórkom rosnąć do zbiegu w inkubatorach o kontrolowanej wilgotności i 5% CO2 w temperaturze 37 °C11.
    3. Przygotuj pojedyncze probówki do mikrowirówek, z których każda zawiera 300 μl DMEM z nanocząstkami o różnych stężeniach. To badanie wymaga 7 różnych probówek DMEM o następujących stężeniach PEG-AuNP: 0 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/ml i 1,000 μg/ml.
    4. Odessać DMEM z probówki. Wypełnić studzienki trzykrotnie 100 μl pożywki DMEM zawierającej 0, 10, 50, 100, 250, 500 lub 1,000 μg/ml AuNP.
    5. Pozwól komórkom i nanocząstkom na wspólną inkubację przez określony czas, tutaj przez 16 godzin.
    6. Pod koniec okresu inkubacji rozmrozić mieszaninę MTS/PES z kroku 1.5.
    7. Po inkubacji odessać DMEM i zawieszone, luźno przyczepione nanocząstki z dołków. Dodać 100 μl świeżego DMEM wraz z 20 μL roztworu MTS/PES, aby uzyskać stosunek 1:5 MTS/PES do DMEM zgodnie z protokołem producenta. Inkubować komórki z MTS/PES w temperaturze 37 °C przez 2 godziny
      UWAGA: Ten 2-godzinny czas inkubacji zależy od aktywności metabolicznej komórek śródbłonka i może być zwiększony do 4 godzin w przypadku innych typów komórek. W ciągu 2 godzin MTS jest metabolizowany przez komórki śródbłonka do kolorowego formazanu, który miesza się z DMEM. Biokompatybilność PEG-AuNP i prawdopodobieństwo żywotności komórek zostaną wykazane przy użyciu bardziej kolorowego formazanu. Toksyczność PEG-AuNP i szansa na to, że komórki umierają, będą pokazane za pomocą mniej intensywnego koloru.
    8. Przeprowadzić analizę kolorymetryczną każdej studzienki, odczytując absorbancję przy 492 nm za pomocą kompatybilnego czytnika płytek.
    9. Dla każdego stężenia nanocząstek należy obliczyć średnią absorbancję na podstawie trzykrotnych wartości absorbancji. Podzielić średnią absorbancję przez wartość uzyskaną z uśrednienia absorbancji w studzienkach zawierających 0 μg/ml nanocząstek.
      UWAGA: Te studzienki, które nie zawierają AuNP, służą jako kontrole do obliczania procentowej żywotności komórek w odpowiedzi na traktowanie nanocząstkami podawanymi w innych studzienkach.
  5. Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna ocena wychwytu nanocząstek w przylegających komórkach śródbłonka z nienaruszonym lub dysfunkcyjnym glikokaliksem11
    1. Wysiew 1,0 x 104 komórki/cm,2 komórki śródbłonka poduszeczki tłuszczowej szczura na sterylnych 12 mm szklanych szkiełkach nakrywkowych i komórki paszowe z DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną. Pozwól komórkom rosnąć do pełnej konfluencji w inkubatorach o kontrolowanej wilgotności i CO2 w temperaturze 37 °C przez około 3 dni.
    2. Dodaj zabiegi, aby zmodyfikować glikokaliks, jeśli ma to zastosowanie. Na przykład 2-godzinne traktowanie hodowanych komórek śródbłonka enzymem heparynazy III o stężeniu 2,5 x 10-6 j.m. rozkłada glikokaliks, specyficznie rozszczepiając jego składnik siarczanu heparanu.
      UWAGA: Zdrowy glikokaliks można modelować poprzez hodowlę komórek śródbłonka, jak opisano w kroku 5.5.1, bez dodawania enzymów degradacyjnych.
    3. Gdy glikokaliks śródbłonka pozostaje nienaruszony lub stanie się dysfunkcyjny, inkubuj komórki śródbłonka z fluorescencyjnymi AuNP w stężeniu 550 μg/ml przez 16 godzin lub inny pożądany czas.
    4. Delikatnie przemyć komórki 2 ml 1% albuminy surowicy bydlęcej o temperaturze 37 °C w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS; zawierającej 100 mg/l wapnia i 100 mg/l magnezu). Zanurz komórki w 2 ml 2% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego w PBS i pozwól komórkom utrwalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń roztwór utrwalający aldehyd i myj komórki PBS o temperaturze pokojowej przez trzy 5-minutowe cykle.
    6. Przed zastosowaniem przeciwciała pierwotnego należy wystawić komórki śródbłonka na działanie 2% surowicy koziej w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Komórki muszą być całkowicie pokryte roztworem blokującym.
    7. Inkubować komórki śródbłonka przez noc z 1% pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko siarczanowi anty-heparanu w 2% surowicy koziej w PBS w temperaturze 4 °C w celu oznaczenia składnika siarczanu heparanu glikokaliksu. Upewnij się, że utrwalone komórki są w pełnym kontakcie z roztworem przeciwciała.
    8. Następnego dnia wypłucz przeciwciało PBS o temperaturze pokojowej przez trzy 10-minutowe cykle.
    9. Inkubować komórki śródbłonka w rozcieńczeniu 1:1 000 odpowiedniego fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności lub przykryte folią aluminiową.
    10. Przepłukać przeciwciało drugorzędowe PBS o temperaturze pokojowej przez trzy cykle po 10 minut.
    11. Zamocuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu zawierającego dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do barwienia jąder. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci.
    12. Zobrazuj fluorescencyjne, wybarwione immunologicznie próbki komórek śródbłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej, używając kanałów niebieskich, zielonych i dalekiej czerwieni do wizualizacji jąder, odpowiednio jąder, glikokaliksu siarczanu heparanu i nanocząstek.

Wyniki

Zsyntetyzowane AuNP, powlekane THPC lub PEG (Rycina 1A i Rysunek 1B(odpowiednio), obrazuje się za pomocą TEM, a rozmiary cząstek mierzy się przy użyciu TEM i DLS, aby zapewnić właściwy rozkład wielkości nanocząstek. Rycina 2 przedstawia obraz TEM próbki THPC-AuNP przy napięciu 80 kV i powiększeniu 150 000x. Średnice cząstek THPC-AuNP mieszczą się w zakresie 2–3 nm, w oparciu o pasek kalibracyjny na obrazach TEM. Rozmiar THPC-AuNP jest również widoczny na histogramie pomiaru wielkości metodą DLS przedstawionym w Rysunek 2, na którym pokazano, że nanocząsteczki AuNP powlekane THPC wykazują piki przy 2,5 nm. PEGylacja nie jest widoczna w TEM, ponieważ polimery nie są gęste elektronowo. Obrazowanie TEM próbek PEG-AuNP jedynie potwierdza obecność pojedynczych, rozproszonych cząsteczek, co jest spodziewane, gdyż korona polimeru PEG wokół nanocząsteczek zapobiega ich agregacji. Dla tych próbek PEG-AuNP histogram pomiaru rozmiaru DLS wykazuje przesunięcie piku do około 10,5 nm w DLS. Przyłączenie kolejnych ligandów lub leków do grup funkcyjnych również wpłynie na rozmiar nanocząsteczki i powinno zostać uwzględnione podczas pomiaru średnicy.

Dodanie fluoroforu (Rycina 1C) potwierdza się za pomocą fluorometru, mierząc sygnał fluorescencji z próbki nanocząsteczek, co przedstawiono na Rycynie 3. Przy wzbudzeniu falą o długości 633 nm zmierzono emisję z maksimum w zakresie od 660 do 672 nm, co jest zgodne z informacjami producenta o maksymalnej emisji przy 665 nm. Przyłączenie innych sond fluorescencyjnych należy sprawdzić w podobny sposób, aby upewnić się co do odpowiedzi fluorescencyjnej.

Biokompatybilność cząstek oraz powiązana z nią żywotność komórek są oceniane przy użyciu testu MTS w celu sprawdzenia względnego metabolizmu komórkowego po 16 h inkubacji z różnymi stężeniami nanocząstek. AuNPs pegylowane z koniugatem fluoroforu nie wykazują znaczącej toksyczności, co potwierdzają podobne poziomy żywotności komórek dla wszystkich stężeń do 1 mg/mL (Rysunek 4A). Biokompatybilność ta może ulec zmianie w zależności od zastosowanego leku terapeutycznego lub ligandu przyłączonego do pozostałych grup funkcyjnych w celu dalszej modyfikacji cząstek. Przyłączanie leków ma tendencję do zwiększania toksyczności, jednak w zależności od stężeń roboczych może to nie wpływać na żywotność w sposób znaczący.

Wchłanianie fluorescencyjnych, PEGylowanych AuNP (Rysunek 1C) przez komórki adherentne oceniano przy użyciu hodowlanych komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej szczura z nienaruszonym lub dysfunkcyjnym glikokaliksem (Rysunek 4B). Warunki dysfunkcji glikokaliksu uzyskano poprzez dodanie do hodowli enzymu heparynazy III, co doprowadziło do degradacji komponentu siarczanu heparanu glikokaliksu i naruszenia macierzy12. Rysunek 4B przedstawia różne poziomy wchłaniania PEG-AuNP w postaci czerwonych kropek na przekroju reprezentatywnych komórek śródbłonka. Zdrowy glikokaliks hamuje wchłanianie tych nanocząsteczek złota, jednak po zastosowaniu enzymu obserwuje się znaczny wzrost tego procesu11. Wynik ten podkreśla potencjał tych ultrasmałych nanocząsteczek w dostarczaniu leków do komórek śródbłonka w sposób kontrolowany przez specyficzne oddziaływania zależne od stanu glikokaliksu.

Schemat procesu funkcjonalizacji nanocząstek cząsteczkami organicznymi, ilustrujący modyfikację powierzchni.
Rycina 1: Schematy nanocząstek złota. (A) Nanosfera AuNP powleczona THPC przed zastąpieniem PEG. (B) PEGylana AuNP z 3 typami zakończeń PEG, w tym COOH, NH2 i CH3. Niebieskie fale reprezentują polimer. (C) Koniugowane nanocząstki do obrazowania fluorescencyjnego. Czerwone gwiazdki wskazują fluorofory skoniugowane z grupami funkcyjnymi NH2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład wielkości nanocząsteczek; obraz TEM i wykres histogramu; analiza AuNP vs PEG-AuNP.
Rycina 2: Pomiary wielkości nanocząsteczek złota. Po lewej: TEM nanocząsteczek złota przed dodaniem PEG przy 80 kV i powiększeniu 150,000X, z naniesioną skalą. Po prawej: Histogram wielkości nanocząsteczek pomierzonych metodą DLS przed (AuNP) i po (PEG-AuNP) zastąpieniu THPC przez PEG. Wyniki DLS dla AuNP powlekanych THPC ilościowo potwierdzają obraz z TEM. Wyniki DLS dla AuNP powlekanych PEG rozwiązują problem braku możliwości wizualizacji PEG za pomocą TEM, ponieważ polimery nie są gęste elektronowo. Obraz TEM PEG-AuNP pokaże jedynie złote rdzenie nanocząsteczek i będzie wyglądał tak samo jak AuNP z otoczką THPC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres emisji fluorescencji; sygnał w funkcji długości fali, analiza spektralna w badaniach optycznych.
Rycina 3: Dane fluorescencyjne fluorescencyjnych PEG-AuNP. the piki fluorescencji przy 667 nm odpowiada emisji fluoroforu sprzężonego z PEG-AuNP. A.U.: jednostki umowne.

Wykres żywotności komórek w zależności od stężeń PEG-AuNP oraz obraz z fluorescencyjnego mikroskopu próbek tkanek.
Rysunek 4: Interakcje komórek z fluorescencyjnymi PEG-AuNP. (A) Wykres żywotności komórek (metabolizm MTS) dla komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej szczura po 16 h koinkubacji z fluorescencyjnymi PEG-AuNP. (B) Konfokalne obrazy przekroju utrwalonych komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej szczura, barwionych DAPI na jądra (niebieski) oraz przeciwciałem przeciwko siarczanowi heparanu, składnikowi glikokaliksu (zielony). Górny obraz przedstawia zdrowy glikokaliks, a dolny zdegradowaną warstwę glikokaliksu; w próbce ze zdegradowanym glikokaliksem widoczna jest znacznie silniejsza czerwona fluorescencja nanocząstek. Pasek skali wynosi 10 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Technika ta jest skuteczną metodą syntezy konfigurowalnych, ultramałych AuNP pokrytych PEG. Ważną częścią tej procedury jest początkowe tworzenie się nanocząstek złota pokrytych THPC, co można potwierdzić zmianą koloru z żółtego na brązowy, która nastąpi po dodaniu HAuCl4 do zawartości kolby okrągłodennej (krok 2.3 protokołu). Brak zmiany koloru oznacza, że nie powstały żadne nanocząstki i że początkowe kroki należy sprawdzić i powtórzyć przed kontynuowaniem. W przypadku, gdy kolor zmieni się na inny niż brązowy, taki jak czerwony lub szary, powstałe cząstki prawdopodobnie nie będą znajdować się w okolicach docelowych 2,5 nm i należy również wykonać nową partię.

Po utworzeniu złotego rdzenia, wymiana THPC na PEG i procedury oczyszczania obejmują kilka kluczowych kroków do pomyślnego zakończenia protokołu. Mieszanie przez noc pozwala na zakończenie reakcji wymiany. Nieudane oczyszczanie może wystąpić, jeśli woda do dializy nie zostanie zmieniona z zalecaną częstotliwością. Agregacja i wytrącanie się cząstek może również wystąpić, jeśli cząstki są pozostawione w dializie na dłużej niż 72 godziny. Inne potencjalne problemy można zaobserwować podczas liofilizacji. Jeśli ultramały roztwór AuNP pokryty PEG nie został całkowicie zamrożony lub jeśli liofilizator nie został prawidłowo ustawiony, próbki mogą zostać utracone. Zapoznaj się z instrukcją obsługi liofilizatora, ponieważ niektóre urządzenia mogą wymagać różnych przygotowań próbki.

Łatwość syntezy i biokompatybilność powstałych cząstek stanowią zalety stosowania tych PEG-AuNP. Ponadto te nanocząstki mają tę zaletę, że mogą wchodzić w interakcje ze strukturami komórkowymi w nanoskali, czego dowodem jest zdolność do identyfikacji zdegradowanego glikokaliksu przez wychwyt tych nanocząstek. Zaleta ta może być wykorzystana do opracowania nowych terapii miażdżycy i środków zapobiegawczych. Poza tym, co tutaj prezentujemy, kolejną zaletą tego protokołu jest to, że pozwala on na szerokie dostosowanie cząstek, a także zwiększoną stabilność i możliwości przechowywania poprzez dołączenie PEG zawierającego tiol do nanocząstek złota4. Drugi koniec łańcucha PEG może zawierać dowolną grupę funkcyjną, a niezliczona ilość cząsteczek może być sprzężona z tymi grupami. W tym protokole przyłączone są wszystkie trzy popularne grupy funkcyjne (metylowa, karboksylowa i aminowa). Stosunek PEG jest wybierany tak, aby w pierwszej kolejności nadać priorytet wykrywaniu fluorescencyjnemu, a następnie możliwości włączenia wtórnego ugrupowania celującego przy użyciu grupy kwasów karboksylowych. Proporcje tych grup można dostosować w zależności od zastosowania, a także dostosować długości i kształty polimerów.

Aby zmierzyć wychwyt cząstek, skoniugowaliśmy sondę fluorescencyjną z jedną z grup funkcyjnych. Należy zauważyć, że każda koniugacja wykraczająca poza to, co opisaliśmy, spowoduje zmianę właściwości powierzchni nanocząstki. Każda iteracja nanocząstek w odniesieniu do dodatkowych składników i reakcji koniugacji powinna być testowana pod kątem pożądanych właściwości.

Metoda ta wytwarza ultramałe nanocząstki złota, których celem jest przezwyciężenie właściwości obronnych śródbłonkowej zewnątrzkomórkowej glikokaliksu, która utrudnia wychwyt nanocząstek o konwencjonalnych rozmiarach. Jednak mały rozmiar sprawia trudności zarówno w aspekcie obrazowania, jak i ładowania leku. Cząstki te są znacznie mniejsze niż typowy zakres wielkości nanocząstek, w wyniku czego powierzchnia dostępna dla przyłączeń terapeutycznych i ugrupowań docelowych jest znacznie zmniejszona. Może to prowadzić do trudności w odbieraniu pojedynczych sygnałów w zastosowaniach obrazowych, chociaż skupiska cząstek można nadal łatwo zidentyfikować, jak pokazano na obrazach konfokalnych. Zmniejszona powierzchnia do przyłączania docelowych ligandów i środków terapeutycznych może wymagać podania większej ilości cząstek, aby osiągnąć wymagania dotyczące dawki docelowej. Jednak mniejsze cząstki będą bardziej wydajne w dostarczaniu, jeśli weźmie się pod uwagę glikokaliks.

Te nowatorskie ultramałe cząstki są zdolne do dostarczania do trudno dostępnych obszarów w nanoskali w organizmie przy minimalnym zakłóceniu mikrośrodowiska. Dodanie PEG pozwala na zwiększenie biokompatybilności i oferuje grupy funkcyjne do dużego dostosowania cząstek do różnych zastosowań. Mniejszy rozmiar w porównaniu z typowymi nanocząstkami ma pewne wady, ale jeśli zostanie opracowana strategicznie, ultramała cząstka jest obiecującym podejściem do akomodacji trudnego do penetracji, skomplikowanego i delikatnego glikokaliksu w celowaniu naczyniowym i dostarczaniu leków.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Wydział Inżynierii Chemicznej Uniwersytetu Północno-Wschodniego, fundusze start-up oraz grant na badania pilotażowe poziomu 1 od Biura Rektora Uniwersytetu Północno-Wschodniego, HL125499 NIH K01 oraz grant NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Autorzy chcieliby również podziękować Thomasowi J. Websterowi i jego laboratorium za pomoc, a także Centrum Nauki i Technologii Nanomedycyny oraz Wydziałowi Nauk Farmaceutycznych Uniwersytetu Północno-Wschodniego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma Aldrich795429
Gold (III) Trójwodny chlorek (HAuCl4,3H2O)Sigma Aldrich520918
Wodorowęglan soduSigma AldrichS5761
Tetrakis (hydroksymetylo)chlorek fosfeniumSigma Aldrich404861
Monofunkcyjny mPEG-tiolLayson Bio Inc.MPEG-SH-2000-1gMw: 2,000 Da
hetero bi-funkcjonalne anime-PEG-tiolLayson Bio Inc.NH2-PEG-SH-3400-1gMW: 3,400 Da
Karboksymetylo-PEG-tiolLayson Bio Inc.CM-PEG-SH-2000-1gMw: 2,000 Da
Celulozowa membrana dializowa (12-14 kDa)Sigma AldrichD9777
Zerostat instrument antystatycznySigma AldrichZ108812
Alexa Fluor 647 (AF647) ester sukcynimidylowy kwasu karboksylowegoFisherA20006Fluorofor
Fisherbrand Jakościowe koła z gładkiej bibuły filtracyjnej - klasa P5Thermo Fisher Scientific09-801-B
Transmisyjna mikroskopia elektronowaJEOL USAJEOL JEM-1000TEM
Dynamiczne rozpraszanie światłaBrookhaven Instruments Corporation Brookhaven90 Plus Analizator wielkości cząstek
Fluorometr DLS HoribaScientificJobin Yvon Fluromax 4Fluorometr
CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek (MTS)PromegaG3582MTS
Urządzenia molekularneSpectraMax M4Czytnik płytek
10E4 epitop HS mysie przeciwciało monoklonalne IgM (przeciwciało pierwszorzędowe)Amsbio370255Przeciwciało pierwszorzędowe
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało IgG (przeciwciało drugorzędowe)Thermo Fisher ScientificR37120Przeciwciało drugorzędowe
Pożywka montażowa VECTASHIELD z DAPIVector LaboratoriesH-1000
mikroskopem konfokalnymCarl Zeiss Meditex AGMikroskopia Zeiss LSM 700Confocol
Czytnik płytek Z DAPI

Bibliografia

  1. Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
  2. Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
  3. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  4. Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
  5. Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
  6. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
  7. Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
  8. Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
  9. Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
  10. Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
  11. Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
  12. Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nanocz steczki z otapow oka polimerowaoczyszczanie metod dializyproces liofilizacjiznakowanie fluorescencyjnedynamiczne rozpraszanie wiat amikroskopia konfokalnatransmisyjna mikroskopia elektronowa
Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.