Ten protokół opisuje ulepszoną technikę obfitego gromadzenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) bez zanieczyszczenia krwią. Dzięki lepszemu pobieraniu i czystości próbek można wykonać więcej analiz przy użyciu płynu mózgowo-rdzeniowego, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób wpływających na mózg i rdzeń kręgowy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ulepszona metoda pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od znieczulonych myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) jest cennym płynem ustrojowym do analizy w badaniach neurobiologicznych. Jest to jeden z płynów mających najbliższy kontakt z ośrodkowym układem nerwowym, a zatem może być używany do analizy chorobowego stanu mózgu lub rdzenia kręgowego bez bezpośredniego dostępu do tych tkanek. Jednak u myszy jest trudny do uzyskania z cisterna magna ze względu na jego bliskość do naczyń krwionośnych, które często zanieczyszczają próbki. Obszar pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego u myszy jest również trudny do wypreparowania i często uzyskuje się tylko małe próbki (maksymalnie 5-7 μl lub mniej). Protokół ten szczegółowo opisuje technikę, która ulepsza obecne metody pobierania, aby zminimalizować zanieczyszczenie krwią i umożliwić obfite pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego (średnio można pobrać 10-15 μl). Technika ta może być stosowana z innymi metodami preparacji do pobierania tkanek od myszy, ponieważ nie wpływa na żadne tkanki podczas ekstrakcji płynu mózgowo-rdzeniowego. W ten sposób mózg i rdzeń kręgowy nie są dotknięte tą techniką i pozostają nienaruszone. Dzięki lepszemu pobieraniu i czystości próbek płynu mózgowo-rdzeniowego, można zastosować więcej analiz tego płynu, aby jeszcze bardziej wspomóc badania neurobiologiczne i lepiej zrozumieć choroby wpływające na mózg i rdzeń kręgowy.
Wprowadzenie
Płyn mózgowo-rdzeniowy jest cennym płynem ustrojowym do analizy w badaniach neurobiologicznych. Płyn mózgowo-rdzeniowy jest wytwarzany głównie z osocza krwi, zawiera niewiele komórek (brak czerwonych krwinek i tylko kilka białych krwinek) i jest prawie pozbawiony białka. Jest to jeden z płynów mających bliski kontakt z ośrodkowym układem nerwowym (OUN) i może przepuszczać wiele elektrolitów z mózgu i rdzenia kręgowego do układu obwodowego. U ludzi próbki płynu mózgowo-rdzeniowego można pobierać, aby pomóc w diagnozowaniu choroby lub do celów badawczych w badaniach klinicznych, ponieważ nakłucie lędźwiowe (lub nakłucie lędźwiowe) jest niewielką, inwazyjną procedurą: płyn płynu mózgowo-rdzeniowego może odzwierciedlać zmiany w OUN bez konieczności bezpośredniego dostępu do tych tkanek. Tak więc w ostatnich latach, do celów badawczych w klinice, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego zostały uzyskane od pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera i inne demencje1,2,3. Istnieje wiele testów biomarkerów, które zostały opracowane przy użyciu próbek płynu mózgowo-rdzeniowego, aby potencjalnie pomóc w diagnozowaniu chorób w klinice2,3. Toczy się jednak wiele dyskusji na temat wiarygodności tych testów w celu uzyskania spójnych, czułych wyników w celu specyficznego diagnozowania choroby4,5. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba opracowania lepszych testów i celów, które można znaleźć w płynie mózgowo-rdzeniowym, aby pomóc w stworzeniu standardowej techniki diagnozowania chorób neurodegeneracyjnych z większą czułością i swoistością. Ze względu na potencjalne znaczenie próbek ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego w chorobie, interesujące jest również pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego od gryzoni w badaniach neurobiologicznych.
Myszy są ważnymi zwierzętami w badaniach biologicznych i medycznych i pozwalają na testowanie potencjalnych związków terapeutycznych oraz badania potwierdzające słuszność koncepcji przed próbami klinicznymi na ludziach. Jednak u myszy trudno jest uzyskać próbki płynu mózgowo-rdzeniowego ze względu na jego bliskość do mózgu u małego zwierzęcia, ponieważ zwykłą metodą pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego u myszy jest uzyskanie go przez cisterna magna, otwór między móżdżkiem a grzbietową powierzchnią rdzenia przedłużonego. Powoduje to trudności w pobieraniu próbek płynu mózgowo-rdzeniowego, ponieważ obszar ten jest trudny do wypreparowania i znajduje się w bliskiej odległości od naczyń krwionośnych, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia krwinkami. Ze względu na te trudności większość badaczy może uzyskać tylko niewielką ilość płynu mózgowo-rdzeniowego do analizy (zwykle podawaną jako 5-7 μl), a zanieczyszczenie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego przez komórki krwi jest głównym problemem podczas analiz6,7,8,9. Zanieczyszczenie krwi może zaciemniać wyniki i nie odzwierciedlać w pełni stanu OUN. Co więcej, ograniczona liczba pobranych próbek może mieć wpływ na badania, ponieważ zwykła ilość pobrana od myszy wystarcza tylko na jeden pomiar (w duplikacie lub trzykrotnie) przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA). W związku z tym próbki płynu mózgowo-rdzeniowego są zwykle łączone od wielu myszy, aby mieć wystarczającą ilość próbki do przeprowadzenia wielu testów. Opracowanie protokołu obfitego, nieskażonego zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy jest bardzo pożądane i będzie korzystne w poprawie badań neurobiologicznych z wykorzystaniem gryzoni.
W tym protokole, szczegółowo opisana jest technika obfitego (średnio 10-15 μL) pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od znieczulonych myszy, która ulepsza obecnie znaną metodę zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krwią10. Solidny protokół pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego pomoże w opracowaniu testów biomarkerów opartych na płynie mózgowo-rdzeniowym, które mogą być wykorzystane do pomocy w diagnozowaniu choroby, a także do usprawnienia badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw chorób wpływających na OUN.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komisji etycznych Society for Neuroscience (USA) oraz Uniwersytetu Fudan (Szanghaj, Chiny). Niniejsza procedura dotyczy operacji w warunkach nieprzeżywalnych.
1. Konfiguracja aparatury do pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego
- Wytocz kapilarę szklaną (średnica wewnętrzna 0,75 mm, średnica zewnętrzna 1,0 mm) za pomocą urządzenia do wytaczania mikropipet (jak pokazano u Liu et al.10; zaostrzona kapilara przedstawiona jest na Rysunku 1).
- Umieść zaostrzoną kapilarę szklaną w uchwycie kapilarnym stabilnie zamocowanym na mikromanipulatorze (Rysunek 1A).
- Odłam końcówkę zaostrzonej kapilary za pomocą pęsety prostej pod mikroskopem stereoskopowym w taki sposób, aby średnica wewnętrzna odłamanej końcówki wynosiła około 10-20 µm (Rysunek 1C).
- Do drugiego końca uchwytu kapilarnego podłącz cienką rurkę oraz strzykawkę, a rurkę i strzykawkę połącz za pomocą zaworu trójdrożnego.
- Przełącz zawór trójdrożny w pozycji otwartej i naciśnij tłok strzykawki, aby przepchnąć powietrze ze strzykawki przez rurkę do kapilary szklanej w celu usunięcia zanieczyszczeń i wytworzenia nadciśnienia w rurce kapilarnej.
- Powtórz tę czynność kilka razy, odłączając i ponownie podłączając strzykawkę do zaworu trójdrożnego, nabierając do strzykawki ~ 100-200 µL przed ostatnim ponownym podłączeniem strzykawki do zaworu trójdrożnego (Rysunek 1B).
- Przesuń mikromanipulator z kapilarą szklaną na bok, aby zapobiec jej uszkodzeniu podczas sekcji myszy.
Rysunek 1. Układ składający się z mikroskopu, mikromanipulatora i kapilary. (A) Układ z mikroskopem i mikromanipulatorem z przymocowaną kapilarą, a także powiększony obraz (B) podłączonej strzykawki i zaworu trójdrożnego służącego do otwierania (pokazane tutaj) lub zamykania rurki oraz (C) nienaruszonej (prawo) i złamanej (lewo) końcówki kapilary gotowej do pobierania CSF. Po złamaniu końcówka kapilary powinna mieć średnicę wewnętrzną 0.75 mm i średnicę zewnętrzną 1.0 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Sekcja myszy
- Zanurzyć mysz w narkozie.
UWAGA: W tym protokole zastosowano myszy C57BL/6 oraz myszy transgeniczne z białkiem prekursorowym amyloidu/preseniliną 1 (APP/PS1) (model mysi choroby Alzheimera), które zanurzono w narkozie za pomocą 4% wodnego roztworu chloranu (w dH20) w dawce 10 µL/g masy ciała myszy, podanego w formie wstrzyknięcia doszpikowego. - Po pełnym znieczuleniu upewnić się, że mysz jest odpowiednio zanurzona w narkozie. W celu potwierdzenia odpowiedniej głębokości znieczulenia wykonuje się próbę odruchowego wycofania palca stopy, polegającą na lekkim wyproście kończyn tylnych, uciśnięciu palców i obserwacji reakcji wycofania. Sprawdzić wszystkie cztery kończyny; brak reakcji oznacza, że mysz jest prawidłowo znieczulona. Za pomocą nożyczek sekcyjnych wyciąć i przyciąć sierść na potylicy myszy, od miejsca nad oczami, między uszami, aż do dołu szyi (Rysunek 2A). Alternatywnie do usuwania sierści można użyć trymera lub kremu depilacyjnego.
- Utrwalić głowę myszy za pomocą adaptera dla myszy (potylica skierowana do góry, nos skierowany w dół pod kątem ok. 45°, Rysunek 2A). Zamocować pręty uszne między uszami a oczami myszy i mocno dokręcić. Upewnić się, że głowa nie może się poruszać i jest stabilnie zamocowana w adapterze, delikatnie naciskając na głowę myszy.
- Przed wykonaniem cięcia chirurgicznego, a następnie regularnie w jego trakcie, ponownie sprawdzić odruch wycofania palca stopy, aby zapewnić chirurgiczną głębokość znieczulenia. Wizualnie monitorować wszelkie zmiany w częstości oddechów podczas procedury, co może wskazywać na zmiany w stopniu znieczulenia. W przypadku tej krótkiej operacji nieprzeżywalnej można zastosować czystą technikę nieaseptyczną. Za pomocą nożyczek i pęsety zakrzywionej przeciąć skórę i pierwszą warstwę mięśni, aż do odsłonięcia podstawy czaszki pokrytej jedynie cienką warstwą mięśni.
UWAGA: Przeciąć skórę myszy w poprzek karku, a następnie przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej czaszki między uszami a oczami myszy. Następnie skórę i tkanki można rozsunąć i odsunąć z obszaru nad cysterną wielką. - Obserwując preparat przez mikroskop sekcyjny, ostrożnie usunąć pęsetą ostatnie cienkie warstwy mięśni nad podstawą czaszki i przesunąć je na bok, poza obszar zainteresowania. W przypadku krwawienia użyć patyczków bawełnianych do usunięcia krwi i zahamowania krwawienia.
- Po odsłonięciu opony twardej nad cysterną wielką (o kształcie trójkątnym, zazwyczaj z 1-2 dużymi naczyniami krwionośnymi przebiegającymi przez ten obszar; optymalnym miejscem do wprowadzenia kapilary i pobrania CSF jest przestrzeń po obu stronach lub pomiędzy naczyniami krwionośnymi, Rysunek 2B), użyć wilgotnego patyczka bawełnianego do oczyszczenia błony, a następnie suchego patyczka bawełnianego do osuszenia obszaru.
Rycina 2. Mysz i układ do sekcji wraz z reprezentatywnymi obrazami wprowadzania kapilary w celu pobrania CSF. Układ myszy przygotowanej do ekstrakcji CSF z (A) ogoloną głową unieruchomioną zaciskiem do sekcji oraz (B) szczegółowym obrazem (powiększenie 10x) rozciętej opony twardej myszy pokrywającej cysternę wielką (przerywana strzałka wskazuje naczynie krwionośne przebiegające przez ten obszar, a ciągła strzałka wskazuje obszar optymalny do wprowadzenia kapilary). Szczegółowe obrazy (powiększenie 10x) przedstawiające (C) zaostrzoną końcówkę szklanej kapilary ustawioną przy oponie twardej cysterny wielkiej, (D) moment, w którym kapilara niemal przebija oponę twardą, napotykając pewien opór, oraz (E) końcówkę kapilary przebitą przez oponę twardą w celu pobrania CSF. CSF powinna być przejrzystym płynem zebranym w szklanej kapilarze (kropkowana strzałka). Wszystkie paski skali w prawym dolnym rogu każdego obrazu mikroskopowego oznaczają 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Pobieranie CSF od znieczuplonej myszy
- Ustaw kapilarę szklaną z tyłu głowy myszy tak, aby zaostrzony koniec znajdował się tuż za błoną pod kątem ~ 30-45° (Rysunek 2C).
- Wciśnij tłok strzykawki raz lub kilka razy, a następnie odciągnij go o ~ 100-200 µL (aby upewnić się, że w kapilarze szklanej nie ma zanieczyszczeń i panuje w niej podciśnienie).
- Za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę kapilary bliżej błony, aż zostanie odnotowany opór, dbając o to, by jej nie przebić (Rysunek 2D).
- Gdy pojawi się opór między końcówką kapilary a błoną, delikatnie wprowadź rurkę kapilarną przez błonę, uderzając w pokrętła mikromanipulatora. Używając mikroskopu, obserwuj moment przebicia cysterny wielkiej zaostrzonym końcem kapilary. Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) powinien zostać automatycznie zassany do rurki kapilarnej po przebiciu otworu (Rysunek 2E).
- Pozostaw kapilarę do powolnego zbierania CSF. Jeśli pobieranie CSF ustało, powoli odciągnij tłok strzykawki o niewielką ilość (~ 50 µL), aby wytworzyć w kapilarze większe podciśnienie i pobrać CSF.
UWAGA: Alternatywnie, kapilarę można delikatnie i powoli wycofać z mózgu za pomocą precyzyjnych pokręteł mikromanipulatora, aby umożliwić ponowny napływ CSF do kapilary. Zebranie całkowitej ilości ~ 10-15 µL CSF (~ 3-4 cm w kapilarze) trwa ~ 10-30 min, a sporadycznie można zebrać 20 µL lub więcej. Chociaż nie jest to absolutnie konieczne, zaleca się stosowanie podgrzewacza podczas pobierania CSF. Pobieranie CSF przeprowadzano w temperaturze pokojowej (~ 23 °C). - Po zebraniu pożądanej ilości CSF zamknij przewód, przestawiając zawór trójdrożny w pozycję zamkniętą (aby zatrzymać pobieranie CSF).
- Wyjmij strzykawkę połączoną z przewodem, a następnie otwórz i zamknij przewód (aby wyrównać ciśnienie w kapilarze, przewodzie i obszarze na zewnątrz kapilary). Ponownie podłącz strzykawkę do zaworu trójdrożnego, ale nie wciskaj tłoka.
- Delikatnie usuń kapilarę szklaną z myszy za pomocą mikromanipulatora.
- Umieść probówkę do zbierania (mikroprobówki 1,5 mL z 1 µL 20x inhibitora proteaz) pod zaostrzonym końcem kapilary szklanej.
- Otwórz przewód i delikatnie wciśnij tłok strzykawki: CSF powinien wypłynąć z kapilary do probówki zbiorczej.
- Po pobraniu szybko odwiruj CSF (krótkie wirowanie przez 5 s z maksymalną prędkością w miniwirówce), aby zmieszać próbkę z inhibitorem proteaz znajdującym się na dnie probówki.
UWAGA: Próbki CSF można podzielić na aلیکwoty, a następnie przechowywać do dalszych analiz w temperaturze -80 °C. Pozostałą część myszy można poddać sekcji w celu pobrania innych tkanek, takich jak mózg i rdzeń kręgowy. Na tym etapie mysz wciąż żyje, zatem w razie potrzeby można również pobrać krew.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując procedurę opisaną tutaj (Rysunek 1 i Rysunek 2), płyn mózgowo-rdzeniowy pobrany bezpośrednio do kapilary powinien być klarowny (Rysunek 2E), a nie różowy lub czerwony. Jeśli pobrany do kapilary płyn ma różowy lub czerwony odcień, oznacza to zanieczyszczenie krwią.
Jako przykład zastosowania próbek CSF pobranych tą metodą, poziomy b...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten szczegółowo opisuje technikę, która ulepsza obecne metody10 pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krwią i umożliwienia obfitego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (średnio można uzyskać ~ 10-15 μL) od myszy. Podczas przerywania końcówki kapilarnej, końcówka naczynia włosowatego nie powinna być zbyt mała (ponieważ wtedy płyn mózgowo-rdzeniowy będzie usuwany bardzo powoli) lub zbyt duża (nie będzie wystarczająco drobna, aby zebrać płyn mózgowo-r...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81650110527, 81371400) oraz Narodowy Kluczowy Program Badań Podstawowych Chin (2013CB530900).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hydrat chloralu (stosowany jako środek znieczulający) | Sinopharm Chemicals Reagen Co., Ltd. | 30037517 | Numer CAS 302-17-0. |
| Nożyczki preparacyjne | 66 technologia wizyjna | 54002 | |
| Kleszcze zakrzywione do preparowania | 66 technologia wizyjna | 53072 | |
| Kleszcze proste do preparowania | 66 technologia wizyjna | 53070 | |
| Adapter myszy (z nausznikami) | Wyprodukowany we własnym zakresie. | Nie dotyczy | Podobny sprzęt dostępny w World Precision Instruments. |
| Mikroskop preparacyjny | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Mikromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Podstawa magnetyczna do mikromanipulatora | Kanetec | MB-K | |
| szklane | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter | Instruments Model P-1000 | |
| Strzykawki (1ml) | Tansoole | 02024692 | Na 1ml. |
| Mikroprobówki (1,5 ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Inhibitor proteazy Zestaw koktajlowy III | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ 42 Zestaw ELISA | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (rurki teflonowe) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Otrzymywany z zestawu do mikroiniekcji i przymocowany do uchwytu kapilarnego i strzykawki. |
| Mini wirówka | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Patyczki kosmetyczne Otrzymywane | z dowolnego sklepu gospodarstwa domowego/apteki. | N/a |
Bibliografia
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. , (2016).
- You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2(2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowegoekstrakcja płynu mózgowo-rdzeniowego u myszydostęp do cysterny wielkiejtechnika mikromanipulatorowaredukcja zanieczyszczenia krwiąoczyszczanie próbek płynu mózgowo-rdzeniowegododawanie inhibitorów proteazużycie stereotypuwidok pod mikroskopem sekcyjnymprzygotowanie końcówki kapilary
