Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W przeciwieństwie do dorosłych jajników Drosophila, jajniki poczwarki są stosunkowo trudne do zbadania ze względu na ich mały rozmiar, przezroczystość i zamknięcie w opakowaniu poczwarki. Wyzwanie związane z preparacją jajników poczwarki polega również na ich fizycznym umiejscowieniu w poczwarce: jajniki są otoczone komórkami tłuszczowymi wewnątrz brzucha poczwarki, a te komórki tłuszczowe muszą zostać usunięte, aby umożliwić prawidłowe barwienie przeciwciał. Aby przezwyciężyć te wyzwania, protokół ten wykorzystuje niestandardowe pipety Pasteura do ekstrakcji komórek tłuszczowych ciała z brzucha poczwarki. Ponadto podczas procesu barwienia zamiast probówki mikrowirówkowej stosuje się komorowe szkło nakrywkowe, aby poprawić widoczność poczwarek. Jednak pomimo tych i innych zalet narzędzi stosowanych w tym protokole, pomyślne wykonanie tych technik może nadal wymagać kilku dni praktyki ze względu na mały rozmiar jajników poczwarki. Techniki opisane w tym protokole mogą być stosowane w eksperymentach z biegiem czasu, w których jajniki są analizowane na różnych etapach rozwoju poczwarki.
Wprowadzenie
Badania nad komórkami macierzystymi z wykorzystaniem jajników Drosophila znacznie się rozszerzyły od czasu pierwszej dokumentacji niszy komórek macierzystych1,2,3,4. Po opracowaniu narzędzi genetycznych do śledzenia linii, sekcje jajników Drosophila są powszechnie stosowane do badania linii komórek macierzystych i szlaków sygnałowych, które regulują utrzymanie, proliferację i los komórek macierzystych w niszy komórek macierzystych. Wiedza na temat tych szlaków sygnałowych może dostarczyć informacji na temat potencjalnych przyczyn nowotworów, które wywodzą się z nieprawidłowej aktywności komórek macierzystych5,6,7. Niedawno wykazano również, że somatyczne komórki macierzyste w jajniku Drosophila, znane jako pęcherzykowe komórki macierzyste (FSC), bardzo przypominają jelitowe komórki macierzyste ssaków w wielu aspektach ich organizacji8. Z tego powodu jajniki Drosophila są bardzo użytecznym systemem modelowym do badania zachowania komórek macierzystych.
Podczas gdy larwalne i dorosłe jajniki dostarczają wskazówek odpowiednio do wczesnego rozwoju komórek macierzystych i końcowej organizacji komórek macierzystych w niszy, jajnik poczwarki jest strukturą pośrednią, w której linia zarodkowa i komórki somatyczne reorganizują się i ustalają swoją tożsamość9,10. Chociaż w kilku badaniach analizowano aspekty rozwoju tkanek w jajniku poczwarki10,11,12,13, pozostają pytania dotyczące różnicowania i organizacji przestrzennej typów komórek jajnika podczas rozwoju poczwarki. W szczególności w tym okresie następuje specyfikacja FSC. Protokół ten przedstawia metodę preparowania i barwienia jajników poczwarki w pożądanych punktach czasowych - technikę, która może być wykorzystana w eksperymentach z biegiem czasu, które szczegółowo analizują rozwój jajnika poczwarki od larwy do stadium dorosłego.
Aby uwzględnić mały rozmiar, przezroczystość i niedostępność jajnika poczwarki w obrębie odwłoka poczwarki, protokół ten wykorzystuje narzędzia, takie jak specjalnie wykonana pipeta Pasteura z cienką końcówką do usuwania tkanki tłuszczowej z brzucha, która utrudnia dostęp przeciwciał do jajników. Przezroczyste, komorowe szkło nakrywkowe używane podczas barwienia przeciwciałami zapewnia lepszą widoczność poczwarek i łagodniejszą platformę do kołysania jajników na "Nutatorze". W oparciu o protokół sekcji jajników larwalnych autorstwa Maimona i Gilboa14, w początkowych etapach procedury barwienia zastosowano stosunkowo wysokie stężenie Triton X-100, aby zmaksymalizować przepuszczalność błony komórkowej i dostęp przeciwciał do komórek jajnika.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Składanie jaj
- Połącz około dziesięciu samców i piętnastu samic dorosłych much Drosophila o pożądanym genotypie w fiolce z normalnym, bogatym pokarmem dla much uzupełnionym drożdżami. Aby uniknąć przepełnienia fiolki, pozwól krytym samicom składać jaja nie dłużej niż 2–4 h14.
- Przenieść dorosłe osobniki z fiolki do nowej fiolki, stukając otworem fiolki o inną fiolkę z pokarmem dla much. Pozwól jajom rozwinąć się w larwy w temperaturze pokojowej przez 3-4 dni.
2. Wybór larw samic
- Za pomocą wilgotnej, cienkiej szczoteczki z miękkim włosiem, wykonaj ruch toczenia szczoteczką wzdłuż ścianki fiolki, aby przenieść wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki do szklanki dobrze wypełnionej po brzegi solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Zmyj resztki jedzenia z larw, przenosząc je do innej studzienki wypełnionej 1x PBS.
- Oddziel larwy męskie i żeńskie za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj larwy samca za pomocą pary dużych, okrągłych i półprzezroczystych jąder osadzonych w tłustym ciele po bocznej stronie ciała, około dwóch trzecich w dół od jego przedniego końca15. Larwy samic są średnio większe, mniej przezroczyste niż samce i mają znacznie mniejsze gonady, które są trudniejsze do wykrycia.
- Wybierz larwy męskie, aby zebrać larwy żeńskie. Zbierz co najmniej dziesięć samic ze studni. Umieść larwy samic w osobnej studzience wypełnionej 1x PBS.
- Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy samic do nowej fiolki ze świeżym pokarmem dla much uzupełnionym drożdżami.
- Umieść fiolkę z samicami larw w ciemnym miejscu, aby ułatwić przepoczwarzenie16. Przez cały dzień monitoruj larwy pod kątem przepoczwarzenia. Gdy każda larwa unieruchamia się i rozwija w poczwarkę, zakreśl poczwarkę względem fiolki i zapisz przybliżony czas, w którym po raz pierwszy formuje się w poczwarkę. Zidentyfikuj poczwarki na podstawie wystających przednich przetchlinków i czasu powstania poczwarki17. Pozwól poczwarkom rozwinąć się do pożądanego punktu czasowego (mierzonego w godzinach po utworzeniu poczwarki, APF).
UWAGA: Każde zwierzę, które przechodzi formowanie się poczwarki w odstępie około 10 godzin, może być uważane za poczwarkę. Faza poczwarki rozpoczyna się około 12 godzin po utworzeniu poczwarki po wewnętrznym linieniu.
3. Przygotowanie poczwarek do barwienia przeciwciał
- Uformuj cienką szklaną pipetę, która będzie używana w późniejszych krokach w celu oczyszczenia tłuszczu poczwarki.
- Rozpuść szklaną końcówkę pipety Pasteura nad palnikiem Bunsena. Gdy szkło się topi, użyj kleszczyków, aby odciągnąć końcówkę poziomo od reszty pipety, aby utworzyć cieńszą końcówkę.
- Po schłodzeniu odłamać niewielką część końcówki pipety, aby utworzyć zgrabny okrągły otwór. Podłącz żarówkę do drugiego końca pipety.
- Naładować pipetę 1x PBS.
- Aby zebrać poczwarki, które są przyklejone do ścianki fiolki, nałóż niewielką kroplę wody wzdłuż strefy kontaktu między poczwarką a fiolką. Odczekaj 1-2 minuty, aby klej białkowy się rozpuścił, a następnie delikatnie podnieś poczwarkę ze ściany wilgotną, delikatną szczotką. Przenieś poczwarkę do szklanki wypełnionej 1x PBS. Poświęć jedną studnię na poczwarkę, aby uniknąć przepełnienia studni.
- Chwytając tylny koniec poczwarki jedną parą kleszczy, ostrożnie rozerwij przednią część poczwarki inną parą, aż głowa poczwarki będzie widoczna.
- Chwyć szczypcami najbardziej wysunięty do przodu czubek głowy poczwarki i delikatnie wyciągnij poczwarkę z etui poczwarki.
UWAGA: Podczas tego procesu może część ciała tłuszczowego. - Oddziel i odrzuć przednią połowę poczwarki od tylnej połowy, aż pozostanie tylko worek brzuszny.
- Wyciągnij komórki tłuszczowe z worka brzusznego.
- Chwyć worek brzuszny o dno studzienki kleszczami w jednej ręce, trzymając cienką szklaną pipetę wypełnioną 1x PBS w drugiej ręce.
- Skieruj cienką końcówkę pipety w stronę otworu worka i powoli pipetuj 1x PBS do jamy brzusznej, aby zmyć komórki tłuszczowe otaczające jajniki poczwarki.
UWAGA: Jajniki to para małych, półprzezroczystych, prążkowanych i podłużnych struktur, które powinny pozostać wewnątrz worka brzusznego. - Zmyj komórki tłuszczowe ciała, aż zniknie co najmniej dwie trzecie ciała tłuszczowego lub dopóki jajniki nie będą widoczne w pobliżu otworu worka brzusznego. Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok powoli, aby przypadkowo nie wypłukać jajników z jamy brzusznej.
- Zbadaj studnię, aby sprawdzić, czy jajniki podczas płukania komórek tłuszczowych ciała. Jeśli jajniki nie są widoczne w studni, powinny pozostać w jamie brzusznej. Jeśli jajniki wyszły, umieść nową poczwarkę w studzience i powtórz ten krok.
- Przenieś brzuch do przezroczystej komory ze szkła nakrywkowego wypełnionej buforem utrwalającym (1x PBS, 4% paraformaldehydu) i umieść pokrywkę na wierzchu. Aby upewnić się, że wystarczająca liczba jajników wytrzyma proces barwienia i montażu, należy wyciąć więcej jajników niż to konieczne.
Uwaga: Bufor utrwalający zawiera paraformaldehyd, który jest toksyczny. Należy nosić odpowiednie środki ochrony, takie jak rękawice, okulary ochronne itp.
4. Immunohistochemia
- Podczas całego procesu barwienia użyj kleszczyków, aby delikatnie docisnąć pływające jajniki do dna szkła nakrywkowego, aby upewnić się, że jajniki są całkowicie zanurzone w roztworze przeciwciał.
- Umieść paski taśmy dwustronnej na płaskiej powierzchni nutatora, a następnie umieść komorę nakrywkową na powierzchni klejącej.
- Jajniki należy inkubować w buforze utrwalającym z kroku 3.7 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Przepłukać jajniki trzy razy w 1x PBS 1% Triton X-100 odpowiednio przez 5, 10 i 45 minut (łącznie 1 godzinę), aby umożliwić dokładną przepuszczalność.
- Zablokuj jajniki w 10% normalnej surowicy koziej w 1x PBS z 0,5% Triton X-100 przez 30 min.
- Inkubować jajniki przez noc w 600 μl wybranego przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczonego do odpowiedniego stężenia w 1x PBS z 0,5% Triton X-100 w temperaturze 4 °C.
- Przepłukać jajniki trzy razy przez 5 minut w 1x PBS z 0,5% Triton X-100.
- Inkubować jajniki przez 2 godziny w 600 μl wybranego przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego do odpowiedniego stężenia w 1x PBS z 0,5% Triton X-100 w temperaturze pokojowej.
- Przepłukać jajniki dwa razy przez 5 minut w 1x PBS 0,5% Triton X-100 i raz przez 5 minut w 1x PBS.
5. Preparowanie i montowanie jajników poczwarki
- Umieść małą kroplę 1x PBS na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą kleszczy przenieś worek brzuszny z komory na szklankę wypełnioną 1x PBS. Poświęć jedną studnię na poczwarkę, aby uniknąć przepełnienia studni.
- Rozerwij worek brzuszny i resztki tłuszczu za pomocą kleszczy.
UWAGA: Jajniki, które są parą małych, półprzezroczystych, prążkowanych i podłużnych struktur, powinny być widoczne wewnątrz studzienki. Jajniki są często ściśle otoczone przez ciało tłuszczowe, dlatego ważne jest, aby upewnić się, że całe ciało tłuszczowe jest dokładnie rozdarte. - Przenieś jajniki ze studzienki do kropli 1x PBS na szkiełku mikroskopowym, chwytając środek jajników między końcówkami kleszczy. Bardzo ważne jest, aby trzymać mocno jajniki bez ściskania, aby ich nie zgubić ani nie zniszczyć podczas transferu. Dodaj kilka kropli 1x PBS do szkiełka, gdy roztwór wyschnie z czasem.
- Po wypreparowaniu wszystkich jajników i przeniesieniu ich na szkiełko mikroskopowe, odpipetować 40 μl podłoża mocującego na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm i delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na jajnikach. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowe wykonanie tej procedury powinno skutkować wyraźnym barwieniem przeciwciałami, które ujawnia strukturę i organizację komórkową jajnika poczwarki Drosophila. Immunohistochemia opisana w niniejszym protokole może być wykorzystana do identyfikacji typów komórek powszechnie barwionych w jajnikach larwalnych i dorosłych. Komórki łodygi poczwarki pochodzące z komórek roju18 (zaznaczone Fascicliną III na biało) przedstawiono na Rysu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najbardziej krytycznym i najtrudniejszym etapem tego protokołu jest przygotowanie jajników poczwarki przed utrwaleniem. Aby upewnić się, że jajniki, małe i zakopane przez komórki tłuszczowe wewnątrz odwłoka poczwarki, są wystarczająco wybarwione przeciwciałami, ważne jest, aby nie tylko rozerwać duży otwór w worku brzusznym za pomocą kleszczy, ale także usunąć komórki tłuszczowe ciała, które blokują jajniki z przeciwciał. Skuteczne wykonanie tego kroku wymaga zastosowania subtelnego nacisku na gruszkę pipety Pasteura pod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez National Institutes of Health (RO1 GM079351 do D.K.). Dziękujemy Dorothei Godt za jej pomocne porady dotyczące sekcji jajników poczwarki w oparciu o jej oryginalny protokół. Dziękujemy również Amy Reilein za jej pomoc i komentarze do manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Kleszcze, biologia | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Mikroskop preparacyjny | Nikon | SMZ-10A | |
| analityczne | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Oprogramowanie analityczne | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Szklane płytki punktowe depresyjne | Pyrex | 7220-85 | |
| Pibuła Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Żarówka do pipet Pasteura | Różni dostawcy | ||
| Palnik Bunsena | Różni dostawcy | ||
| Szkiełka mikroskopowe matowe Fisherfinest Premium | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm szklane szkiełka nakrywkowe Nr 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Taśma dwustronna | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Drobny pędzel #0, #3-#5 | Różni dostawcy | ||
| Gilson Pipetman Zestaw startowy | Thomas Scientific | F167300 | Zawiera p20, p200, p1000 pipety |
| 16% Paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15710 | Rozcieńczony do 4% paraformaldehydu w 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Rozcieńczony do 1x PBS |
| Normalna surowica kozia | ImmunoResearch | 5000121 | Rozcieńczyć do 10% normalnej surowicy koziej w PBST o stężeniu |
| 0,5% TritonPrzeciwciała pierwszorzędowe (w protokole: 7G10 anty-Fasciclin III rozcieńczony 1:250, króliczy antyfosfohiston H3 rozcieńczony 1:1000) | Różni dostawcy (w protokole: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Rozcieńczyć w PBST z 0,5% stężeniem Tritona | |
| Przeciwciała drugorzędowe (w protokole: Alexa-546, surowica anty-królików sprzężona z FITC) | Różni dostawcy (w protokole: Sondy molekularne, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Rozcieńczyć w PBST z 0,5% stężeniem Triton | |
| Fiolki na muchy | Denville Scientific | V9406 | |
| Waciki, do szerokich fiolek | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Drożdże, Piekarze Suszone Aktywne | MP Biomedicals | 101400 | |
| Pokarm dla much | Wyprodukowano w laboratorium | Mieszanina wody, drożdży piwnych, mąki kukurydzianej, melasy, agaru, EtOH, penicyliny, 4-hydrobenzoesanu metylu i kwasu propionowego | |
| Samce i samice much Drosophila (genotyp stosowany w protokole: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Magazynowe Bloomington Drosophila |
Bibliografia
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537(2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52(2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
