Artykuł metodologiczny

Odkrycie epitopu diagnostycznego specyficznego dla wirusa Zika

DOI:

10.3791/56784

⸱

12 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences and Craniofacial Development, New York University College of Dentistry, 2Rheonix, Inc., 3Department of Medicine, New York University Langone School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy technikę wykrywania peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Protokół ten można łatwo dostosować do innych pojawiających się chorób zakaźnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikromacierze peptydowe o dużej gęstości pozwalają na badanie przesiewowe ponad sześciu tysięcy peptydów na jednym standardowym szkiełku mikroskopowym. Metoda ta może być stosowana do odkrywania leków, identyfikacji celów terapeutycznych i opracowywania diagnostyki. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania specyficznych peptydów diagnostycznych wirusa Zika (ZIKV) przy użyciu mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości. Ludzka próbka surowicy zwalidowana pod kątem zakażenia ZIKV była inkubowana z mikromacierzą peptydową o dużej gęstości zawierającą całe białko ZIKV przetłumaczone na 3,423 unikalnych 15 liniowych reszt aminokwasowych (aa) z zakładką reszt 14-aa wydrukowanymi w dwóch egzemplarzach. Barwiąc różnymi przeciwciałami drugorzędowymi w tej samej macierzy, wykryliśmy peptydy, które wiążą się z przeciwciałami immunoglobuliny M (IgM) i immunoglobuliny G (IgG) obecnymi w surowicy. Peptydy te zostały wybrane do dalszych eksperymentów walidacyjnych. W tym protokole opisujemy strategię zastosowaną do projektowania, przetwarzania i analizowania mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagnoza wirusa Zika (ZIKV) na podstawie objawów klinicznych jest trudna, ponieważ wirus ten dzieli wektory, rozmieszczenie geograficzne i objawy z infekcją wirusem denga i Chikungunya1. Biorąc pod uwagę ryzyko niekorzystnych wyników ciąży u kobiet zakażonych ZIKV w czasie ciąży, ważne jest, aby rozróżnić te 3 wirusy. Chociaż obecne molekularne testy diagnostyczne są specyficzne, są one przydatne tylko we krwi lub ślinie w stosunkowo krótkim okresie ostrej infekcji2,3. Testy serologiczne są niezbędne do diagnozy poza tym początkowym okresem infekcji4.

Opracowanie testu serologicznego specyficznego dla ZIKV jest wyzwaniem z dwóch powodów: po pierwsze, antygeny Zika, na które reaguje ludzki układ odpornościowy, nie są obecnie znane; a po drugie, konserwatywne sekwencje aminokwasów flawiwirusów indukują reaktywność krzyżową przeciwciał. Naszym celem było odkrycie unikalnych peptydów specyficznych dla ZIKV do wykorzystania w diagnostyce. Opracowano różne podejścia do badań przesiewowych bibliotek peptydów obejmujących całe białka, w tym fagi, bakterie i powierzchnię drożdży5,6,7,8,9,10. Nasza strategia polegała na użyciu mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości, która umożliwia szybkie i niedrogie, wysokoprzepustowe badania serologiczne 11,12, a następnie zidentyfikowane peptydy mogą być wykorzystane do ulepszenia obecnych testów serologicznych do wykrywania zakażenia ZIKV.

Ten protokół umożliwia wykrywanie peptydów diagnostycznych specyficznych dla wirusa Zika za pomocą mikromacierzy peptydowej o dużej gęstości (Rysunek 1). Mikromacierz peptydowa o dużej gęstości została wyprodukowana przy użyciu technologii laserowego druku peptydowego. Cała sekwencja białka ZIKV składająca się z 3 423 reszt aminokwasowych opartych na szczepie Polinezji Francuskiej (GenBank: KJ776791.2), została wydrukowana na standardowym szkiełku podstawowym w blokach 15 reszt liniowych z nałożeniem 14 reszt aminokwasowych w dwóch egzemplarzach, co daje łącznie 6 846 plamek peptydowych. Oprócz peptydów z całą sekwencją białka Zika, mikromacierz wykorzystuje peptydy hemaglutyniny (HA) grypy do kontroli wewnętrznej.

Pozytywna próbka surowicy Zika uzyskana z Wadsworth Center (Albany, NY) została użyta do identyfikacji specyficznych peptydów reaktywnych immunoglobuliną M (IgM) i immunoglobuliną G (IgG). Po inkubacji z próbką przez noc, mikromacierz wybarwiono drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem (anty-ludzka IgM lub anty-ludzka IgG) i przeanalizowano na skanerze mikromacierzy. Kwantyfikacja intensywności plamki i adnotacja peptydów została przeprowadzona za pomocą specjalnego oprogramowania dostarczonego przez tę samą firmę, która wyprodukowała mikromacierz

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te dane są częścią trwającego badania naukowego prowadzonego w New York University College of Dentistry i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Próbki kliniczne użyte w tym badaniu były próbkami pozbawionymi elementów pozwalających na identyfikację, używanymi wcześniej do diagnozy i za zgodą Wadsworth Center of New York State Department of Health, Albany, NY.

1. Instalowanie szkiełka mikromacierzowego peptydowego o wysokiej gęstości ZIKV w określonej tacy inkubacyjnej

  1. Szkiełko należy chwytać za krawędzie w rękawicach bezpudrowych. Wymiary szkiełka to 75,4 mm na 25,0 mm i 1 mm grubości. Umieść szkiełko w tacce inkubacyjnej powierzchnią mikromacierzy skierowaną do góry.
  2. Umieść błyszczącą stronę uszczelki skierowaną w dół na zadrukowaną powierzchnię mikromatrycy. Aby zapewnić dobrą pozycję, załóż na siebie otwory na uszczelki i płyty podstawy.
  3. Umieść górną część tacki na uszczelce, aby utworzyć komorę mikromacierzy.
  4. Zamocuj suwak w tacy, dokręcając równo skrzydełkowe jedna po drugiej ręcznie w naprzemienny sposób, zaczynając od lewego górnego rogu, a następnie od prawego dolnego rogu. Umieść pokrywę tacki inkubacyjnej.

2. Wykrywanie interakcji w tle: barwienie mikromacierzy przeciwciałami drugorzędowymi

UWAGA: Użyj pipety, aby umieścić roztwory (standardowe i blokujące, rozcieńczone przeciwciała wtórne) w rogu komory mikromatrycy.

  1. Inkubować mikromacierz ze standardowym buforem (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7,4, przefiltrowana filtrem 0,45 μm) (całkowita objętość 2,000 μl/mikromacierz) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.
  2. Usunąć bufor wzorcowy, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy. Wypełnij puste uchwyty na szkiełka pustymi szkiełkami, aby zapobiec pęknięciu szkiełka do mikromacierzy.
  3. Zablokuj mikromacierz buforem blokującym (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz) na 60 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy 140 obr./min.
  4. Usunąć bufor blokujący, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.
  5. Inkubować mikromacierz z przeciwciałem drugorzędowym, anty-ludzkim IgM sprzężonym z fluorochromem, rozcieńczonym w stosunku 1: 5 000 (całkowita objętość 2 000 μl / mikromacierz) w buforze barwiącym (10% bufor blokujący w buforze standardowym) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej przy 140 obr./min.
  6. Usunąć przeciwciało wtórne, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.
  7. Przemyj mikromacierz 3 razy, 1 minutę na mycie standardowym buforem (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz przy RT na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Po każdym myciu należy wyjąć bufor wzorcowy, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.
  8. Zanurz szkiełko 2x w świeżo przygotowanym buforze do zanurzania (1 mM Tris, pH 7,4), (całkowita objętość 200 ml).
  9. Ostrożnie osuszyć mikromacierz przez około 1 minutę, bardzo ostrożnie odsysając nadmiar płynu od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka. Przeanalizuj szkiełko w czytniku skanera mikromacierzowego.

3. Ekspozycja mikromacierzy na surowicę gospodarza

UWAGA: Wykonaj ten krok w warunkach bezpieczeństwa laboratoryjnego, poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) ze względu na potencjalnie zakaźny charakter próbek surowicy. Praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC).

  1. Dezaktywować próbkę surowicy w temperaturze 56 °C przez 30 minut i odwirować w temperaturze 16 000 rcf przez 5 minut w temperaturze 4 °C13.
    UWAGA: Za pomocą pipety nanieść roztwory (barwnik, bufor standardowy i rozcieńczoną surowicę) w rogu komory mikromacierzy.
  2. Rozcieńczyć próbkę surowicy w buforze barwiącym, zaczynając od rozcieńczenia 1:1 000 (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz). Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Inkubować mikromacierz z buforem barwiącym (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz) przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.
  4. Usunąć bufor barwiący, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.
  5. Inkubować mikromacierz z rozcieńczoną próbką surowicy przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.
  6. Usunąć rozcieńczoną próbkę surowicy, zasysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.
  7. Przemyj mikromacierz 3 razy, 1 minutę na mycie standardowym buforem (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz przy RT na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Po każdym myciu należy wyjąć bufor wzorcowy, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.

4. Barwienie przeciwciałami drugorzędowymi i znakowanymi przeciwciałami kontrolnymi

UWAGA: Użyj pipety, aby umieścić roztwory (standardowe, rozcieńczone przeciwciała wtórne i znakowane) w rogu komory mikromacierzy.

  1. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze barwiącym.
    UWAGA: Użyć przeciwciała sprzężonego z fluorochromem anty-ludzkiego IgM lub przeciwciała sprzężonego z fluorochromem anty-ludzkiej IgG w rozcieńczeniu 1:5,000 (całkowita objętość 2,000 μl / mikromacierz) w buforze barwiącym.
  2. Zmieszać przeciwciało ze znakiem kontrolnym (monoklonalny anty-HA sprzężony z fluorochromem) w rozcieńczeniu 1:1 000 (całkowita objętość 2 000 μl/mikromacierz) w buforze barwiącym z przeciwciałem drugorzędowym uprzednio rozcieńczonym w buforze barwiącym.
  3. Inkubować z mikromacierzą przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min.
  4. Usunąć mieszaninę rozcieńczonych przeciwciał drugorzędowych i znakowanych, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.
  5. Przemyć 3x standardowym buforem (całkowita objętość 2 000 μL/mikromacierz). Każde mycie trwa 1 minutę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min. Po każdym myciu należy wyjąć bufor wzorcowy, odsysając pipetą z rogu komory mikromacierzy.

5. Skanowanie mikromacierzy

  1. Zanurz szkiełko 2x w świeżo przygotowanym buforze do zanurzania (1 mM Tris, pH 7,4) (całkowita objętość 200 ml).
  2. Ostrożnie wysuszyć mikromacierz, około 1 minuty, bardzo ostrożnie zasysając od góry do dołu szkiełka, nie dotykając powierzchni szkiełka.
  3. Zeskanuj mikromacierz zgodnie z instrukcjami skanera. Umieść szkiełko na skanerze zadrukowaną powierzchnią skierowaną do góry.
  4. Utwórz nowy projekt i wybierz obszar skanowania. Ustaw parametry skanera jako: Rozdzielczość: 21 μm, Intensywność dla kanałów 700 i 800 nm: 7.0, Jakość skanowania: średnia i Przesunięcie: 0.8.
  5. Uzyskaj i zapisz zeskanowany obraz RAW jako 16-bitowy format pliku TIFF w skali szarości.

6. Analiza mikromacierzy przy użyciu specjalnego oprogramowania

  1. Otwórz obraz RAW (obraz TIFF). Otwórz plik siatki tablicy.
  2. Wyrównaj siatkę tablicy do skanowanego obrazu za pomocą strzałek myszy lub klawiatury komputera.
  3. Wybierz "Quantify Selection" w określonym oprogramowaniu, które tworzy plik odczytu zawierający intensywność sygnału dla każdego punktu, wartość tła i odpowiednią sekwencję peptydów.
    UWAGA: Ten plik wyjściowy można również zaimportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu dodatkowej analizy i tworzenia wykresów.

7. Pamięć masowa mikromacierzy

  1. Przechowywać mikromacierz szczelnie zgrzaną w ciemności w temperaturze 4 °C w atmosferze beztlenowego azotu lub argonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki uzyskane przy użyciu opisanego protokołu są pokazane w Rysunek 2 i Rysunek 3. Nie zaobserwowano interakcji tła podczas wstępnego barwienia mikromacierzy drugorzędowymi anty-ludzkimi IgM (dane nie pokazane). Barwienie anty-ludzkim koniugatem IgM spowodowało powstanie kilku obszarów powyżej intensywności zielonej fluorescencji tła, co wskazuje na wiązanie tych peptydów z IgM w próbce surowicy gospodarza (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowaliśmy protokół wykorzystujący mikromacierz peptydową o dużej gęstości zawierającą całą sekwencję białka wirusa Zika (szczep Polinezji Francuskiej). Mikromacierz została wyprodukowana poprzez wydrukowanie 3 423 różnych, nakładających się na siebie peptydów liniowych. Każdy peptyd składał się z 15 aminokwasów i różnił się tylko jedną resztą od najbliższego sąsiada w sekwencji (tj. 14 reszt nakładało się na siebie). Chociaż można drukować krótsze nakładki, mapowanie epitopów jest bardziej precyzyjne w p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne wsparcie jest dostarczane przez dotację na uzupełnienie administracyjne SBIR (Small Business Innovation Research) od NIDCRR44 DE024456. Grant NIDCR HIV, który wyewoluował z grantu NIDCR U01 DE017855 na opracowanie potwierdzającej diagnostyki przyłóżkowej dla HIV. Serdecznie dziękujemy Silke Weisenburger (PEPperPRINT Heidelberg, Niemcy) za jej pomoc techniczną i życzliwe wsparcie. Dziękujemy również NYU Langone Medical Center za system obrazowania LI-COR Odyssey.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Niestandardowy mikarak peptydowy: nasza mikromacierz zawiera całą sekwencję białka wirusa Zika
Taca inkubacyjna PEPperCHIP 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
Zestaw do barwienia PEPperCHIP (680 nm) (anty-HA, etykietowanie DyLight)PEPperPRINTPPC.037.002
Analizator PepSLidePEPperPRINTPSA.004.00114-dniowa bezpłatna licencja dla systemu Windows
Bufor blokującyRocklandMB-070
anty-ludzki IgM (łańcuch mu) DyLight 800Rockland609-145-007
anty-ludzki IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
System obrazowania LI-COR OdysseyLI-COR
Wytrząsarka orbitalnaCyfrowa wytrząsarka do mikromiareczkowania IKA MTS 2/4
Adobe Illustrator Adobe Deltagraph Redrocks

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748(2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
  15. Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikromacierze peptydowepeptydy diagnostycznedetekcja IgMdetekcja IgGmacierz o wysokiej g sto cianaliza surowicywi zanie przeciwciaskanowanie mikromacierzy

Powiązane artykuły