Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

25 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Udało nam się wygenerować dwa testy γ sekretazy specyficzne dla substratu. Oba przedstawione tutaj testy komórkowe mają na celu ilościowe określenie aktywności enzymatycznej γ-sekretazy poprzez wyniki reporterów lucyferazy świetlika.

Streszczenie

Opracowaliśmy parę testów genów reporterowych opartych na komórkach, aby ilościowo mierzyć rozszczepienie γ sekretazy różnych substratów. W tym manuskrypcie opisano procedury, które mogą być stosowane do monitorowania rozszczepienia APP-C99 lub Notch za pośrednictwem γ-sekretazy, przy użyciu systemu reporterowego lucyferazy świetlika napędzanego przez promotor Gal4. Testy te zostały ustalone przez stabilną kotransfekcję komórek HEK293 z genem reporterowym lucyferazy napędzanym przez Gal4 i albo znakowanym Gal4 / VP16 C-końcowym fragmentem APP (APP-C99; CG) lub Notch-ΔE oznaczone Gal4/VP16 (NΔE; Ogniwa NG). Korzystając z tych testów reporterowych równolegle, wykazaliśmy, że inhibitor ErbB2, CL-387,785, może preferencyjnie hamować rozszczepienie γ-sekretazy APP-C99 w komórkach CG, ale nie NΔE w komórkach NG. Zróżnicowane odpowiedzi wykazywane przez komórki CG i NG po potraktowaniu CL-387,785 reprezentują preferowaną cechę modulatorów γ-sekretazy, a odpowiedzi te są w wyraźnym kontraście do pan-inhibicji γ-sekretazy indukowanej przez DAPT. Nasze badania dostarczają bezpośrednich dowodów na to, że aktywność γ-sekretazy w stosunku do różnych substratów może być różnicowana w kontekście komórkowym. Te nowe testy mogą być zatem użytecznymi narzędziami w odkrywaniu leków na lepsze terapie choroby Alzheimera.

Wprowadzenie

Oligomeryczne formy β amyloidu (Aβ) są uważane za główną przyczynę neurodegeneracji w mózgach pacjentów cierpiących na chorobę Alzheimera (AD)1. Peptydy Aβ są wytwarzane w wyniku stopniowego rozszczepienia białka prekursorowego amyloidu (APP), najpierw przez β-sekretazę, a następnie przez γ-sekretazę2. W ciągu ostatniej dekady podejścia terapeutyczne do leczenia AD koncentrowały się na zapobieganiu produkcji Aβ3. Większość badań koncentrowała się na zwiększeniu aktywności α-sekretazy, co może wykluczyć rozszczepienie APP przez γ-sekretazę, a tym samym zmniejszyć produkcję Aβ, lub na hamowaniu aktywności β-i/lub γ-sekretazy4. Niestety, nieselektywne hamowanie β- lub γ-sekretaz powoduje nieuniknione skutki uboczne, które wynikają z zakłóceń w funkcjonowaniu innych fizjologicznych substratów β- i γ-sekretazy5,6. Jeśli chodzi o inhibitory γ-sekretazy, ostatnie badania wykazały odkrycie szeregu chemicznych i genetycznych modulatorów, które mogą regulować produkcję Aβ, wywierając jednocześnie znikomy wpływ na podstawowe przetwarzanie za pośrednictwem γ sekretazy w Notch7,8,9,10,11,12, jednak skuteczne terapie nie zostały jeszcze opracowane. W związku z tym uzasadnione są dalsze systematyczne badania przesiewowe w celu odkrycia nowych modyfikatorów genetycznych i chemicznych, które mogą selektywnie modulować przetwarzanie APP za pośrednictwem γ-sekretazy.

γ-sekretaza jest znana z tego, że rozszczepia ponad 90 różnych białek zakotwiczonych w błonie. Wśród tych substratów znajduje się Notch, którego aktywność ma kluczowe znaczenie dla określania losu i różnicowania komórek podczas rozwoju13. Selektywne modulowanie przetwarzania APP katalizowanego γ-sekretazą przy braku wpływu na przetwarzanie Notch będzie miało zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania skutków ubocznych związanych z Notch inhibitorów γ-sekretazy, a ta selektywność jest uważana za główny czynnik, który będzie dyktował biologiczną skuteczność potencjalnych modulatorów γ-sekretazy w przewlekłym leczeniu AD. Stwierdzono wiele pochodnych arylosulfonamidu, takich jak GSI-953 (begacestat) i BMS-708163 (awagacestat), które wykazują silne i selektywne hamowanie γ-sekretazy14,15. Poprzednie badanie wykazało, że różnicowe hamowanie rozszczepienia γ-sekretazy APP i Notch można zaobserwować za pomocą ilościowego testu opartego na teście ELISA w połączeniu z walidacją in vivo przy użyciu danio pręgowanego16. Ponadto ustanowiono paradygmaty testów komórkowych w celu zbadania potencjalnej selektywności substratowej γ-sekretazy w stosunku do APP i Notch17,18. Korzystając z protokołów podobnych do opisanych w niniejszym dokumencie, niedawno odkryliśmy nową klasę (D)-leucynamidów, które silnie modulują rozszczepienie γ-sekretazy APP z selektywnością oszczędzającą Notch19. Łącznie ten zbiór badań dostarcza dowodu słuszności koncepcji potwierdzającego pogląd, że selektywność/dostępność substratu γ-sekretazy może podlegać modulacji chemicznej i weryfikacji eksperymentalnej. Jednak te platformy testowe często opierają się na odczytach o stosunkowo niskiej przepustowości i pracochłonnych podejściach, które mogą nie spełniać standardów przemysłowych dla programów odkrywania leków.

Niedawno przeprowadziliśmy testy genów reporterowych lucyferazy opartej na komórkach, które mogą ilościowo określić aktywność katalityczną γ-sekretazy w stosunku do dwóch różnych substratów, 99-aminokwasowego C-końcowego fragmentu APP (APP-C99) i peptydu Notch z delecją w domenie zewnątrzkomórkowej (NΔE). Zarówno APP-C99, jak i NΔE są szeroko stosowane jako bezpośrednie substraty γ-sekretazy w różnych testach. Aby wygenerować jednorodne i spójne testy genu reporterowego lucyferazy dla rozszczepienia γ-sekretazy APP-C99 lub NΔE, wygenerowaliśmy jedną stabilną linię komórkową (CG) pochodzącą z HEK, która konstytutywnie wyraża reporter lucyferazy świetlika napędzany promotorem Gal4 (Gal4-Luc) i białko fuzyjne APP-C99 znakowane Gal4 / VP16 (C99-GV). Ponadto wygenerowaliśmy kolejną stabilną linię komórkową (NG) pochodzącą z HEK, która konstytutywnie wyraża Gal4-Luc i znakowane Gal4/VP16 NΔE (NΔE-GV). Korzystając z tych nowatorskich, specyficznych dla substratu testów γ-sekretazy, zapewniamy teraz metodę ilościowego określania i rozróżniania aktywności katalitycznej γ-sekretazy w kierunku różnych substratów (APP-C99 w komórkach CG lub NΔE w komórkach NG). Co więcej, specyficzne dla substratu testy γ sekretazy zaprojektowano tak, aby sprzyjały platformom przesiewowym o wysokiej zawartości. Te nowo wygenerowane testy γ-sekretazy mogą utorować drogę do odkrycia nowych modulatorów γ-sekretazy, które mogą poprawić funkcje poznawcze poprzez hamowanie produkcji Aβ bez wywoływania niepożądanego hamowania Notch w leczeniu choroby Alzheimera nowej generacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pomiar sygnałów reporterowych lucyferazy, które odpowiadają rozszczepieniu γ-sekretazy APP-C99 lub NΔE

UWAGA: Szczegółowe opisy generacji komórek CG i NG można znaleźć w poprzednich publikacjach20,21.

  1. Wysiewać komórki NG lub CG (20 000 komórek/studzienkę) na 96-dołkowych mikropłytkach o końcowej objętości 200 μl/studzienkę w pożywce wzrostowej, która składa się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/ml blasticydyny, 250 μg/ml antybiotyku (np. zeocyny) i 200 μg/ml higromycyny B.
    1. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
    2. Przenieść mikropłytki do nawilżonego inkubatora CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Usuń 100 μl podłoża wzrostowego z każdej studzienki.
  3. Dodać 100 μl/basenik pożywki wzrostowej zawierającej 2 μg/ml tetracykliny z 0,2% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorofenacetylo-L-alanylo)]-S-fenyloglicyny t-butylestru (DAPT) lub innymi pokrewnymi inhibitorami ErbB1/ErbB2.
  4. Inkubować poddane działaniu CG lub NG komórki w mikropłytkach w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  5. Usunąć 150 μl/studzienkę z mikropłytek.
  6. Dodać 50 μl/dostór do oznaczania lucyferazy (patrz tabela materiałów).
  7. Przenieś mikropłytki do czytnika mikropłytek luminescencyjnych.
    1. Utrzymuj mikropłytki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając.
  8. Określ luminescencję emitowaną przez lucyferazy świetlika (FL) za pomocą wstępnie zdefiniowanego programu przechowywanego w czytniku mikropłytek luminescencyjnych.
    1. Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów).
    2. Z menu "Narzędzie" wybierz "Luminometria".
      1. W ustawieniach "Parametry" wybierz "Brak filtra" dla filtra emisji, zaznacz "Normalny" dla przysłony emisyjnej, wprowadź "1" dla czasu zliczania i kliknij "OK", aby ustawić odczyt luminescencji.
    3. W zakładce "Sterowanie instrumentem" przewiń listę aktywnych protokołów i wybierz wstępnie zapisany protokół do odczytu luminescencji.
    4. W zakładce "Wyświetlanie na żywo" zdefiniuj skalę z listy rozwijanej i wybierz "Logarytm" lub "Liniowy" jako Typ.
    5. W zakładce "Temperatura" wybierz opcję "Wyłącz" dla ogrzewania płytowego.
    6. Kliknij przycisk "Start", aby wykonać odczyt luminescencji.
    7. W razie potrzeby wyeksportuj wyniki do formatu arkusza kalkulacyjnego za pomocą "Eksploratora" wbudowanego w oprogramowanie sterujące
      8. .

2. Kwantyfikacja aktywności γ-sekretazy

  1. Zdefiniuj sygnał luminescencyjny emitowany przez komórki CG lub NG traktowane 0,1% DMSO w pożywce wzrostowej zawierającej 1 μg / ml samej tetracykliny jako 100% względną aktywność γ-sekretazy.
    1. Oszacuj luminescencję tła z komórek CG lub NG, traktując komórki pożywką wzrostową, która nie zawiera tetracykliny.
  2. Normalizuj sygnały lucyferazy z komórek CG lub NG, które są hodowane z pożywką wzrostową zawierającą 1 μg / ml tetracykliny i 1 μM CL-387,785 lub 1 μM DAPT z sygnałem lucyferazy emitowanym przez komórki CG lub NG traktowane DMSO (100% względna aktywność γ-sekretazy, jak określono w 2.1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hamowanie ErbB2 przez CL-387,785 może różnicowo promować przetwarzanie APP-C99 przez γ-sekretazę bez wpływu na rozszczepianie Notch
Aby opracować test komórkowy umożliwiający ilościowy pomiar proteolitycznego rozszczepiania konkretnego substratu γ-sekretazy, wygenerowaliśmy linię komórkową CG pochodzącą z HEK293 poprzez stabilną kotransfekcję indukowanego tetracykliną APP-C99 z tagiem Gal4/VP16 na końcu C oraz genu reporterowego luc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obiecujące wyniki badania fazy 1b immunoterapii aducanumabem w chorobie Alzheimera zdecydowanie ustaliły kluczową rolę Aβ w patogenezie AD22 i sugerują, że podejścia anty-Aβ są nadal realną strategią rozwoju leków przeciw AD. W tym miejscu opisujemy testy komórkowe do ilościowego określania proteolizy APP-C99 i NΔE katalizowanej γ-sekretazą przy użyciu systemów reporterowych lucyferazy świetlika. APP-C99 i NΔE to dwa najlepiej zbadane substraty γ-sekretazy i razem reprezentują zarówno patogenną, j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Głównej Placówce Instytutu Biologii Komórkowej i Organizmów, Academia Sinica, za wsparcie techniczne. Badanie to było wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 103-2320-B-001-016-MY3 do Y.-F. L.), Program for Translational Innovation of Biopharmaceutical Development – Technology Supporting Platform Axis Scheme (NP7 do Y.-F.L.) oraz Academia Sinica (do Y.-F.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czytnik płytek luminescencyjnych VictorLightPerkinElmer2030-0010
Klasa II, Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego typu 2Thermo Scientific1300 Series A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Thermo Fisher12100046główny składnik pożywki wzrostowej
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidynaThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Higromycyna BGibco10687010
HemocytomerSigma-AldrichAldricha
Nunc156545
tetracyklinaSigmaT7660
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
Odczynnik do oznaczania lucyferazy Steady-GloPromegaE2510
Nawilżony inkubator CO2RevcoUltima II
Linia komórkowa T-REx293InvitrogenR71007
Wallac 1420 wersja oprogramowania 3.0Oprogramowanie sterujące instrumentem PerkinElmerczytnika mikropłytek luminescencyjnych
BR717805 96-dołkowa mikropłytka

Bibliografia

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza aktywno ci sekretazyPomiar rozszczepiania APPAnaliza rozszczepiania NotchSystem reporterowy lucyferazyHodowla kom rek HEK293Leczenie zwi zkiem CL 387 785Badanie inhibicji DAPTAnaliza selektywno ci substratowejBadania nad chorob AlzheimeraPlatforma poszukiwania lek w

Powiązane artykuły