Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Summary

Zrozumienie wpływu środowiskowych pestycydów chloroorganicznych (OCP) na funkcję mitochondriów w hepatocytach jest ważne dla zbadania mechanizmu OCP powodującego zaburzenia metaboliczne. W pracy przedstawiono szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby.

Abstract

Ten artykuł przedstawia szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby dla lepszego zrozumienia przyczyny zaburzeń metabolicznych spowodowanych przez środowiskowe pestycydy chloroorganiczne (OCP) w hepatocytach. Komórki HepG2 poddano działaniu β-heksachlorocykloheksanu (β-HCH) przez 24 godziny przy równoważnej dawce ekspozycji wewnętrznej w populacji ogólnej. Ultrastrukturę hepatocytów zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu wykazania uszkodzeń mitochondriów. Funkcję mitochondriów oceniano następnie na podstawie intensywności fluorescencji mitochondriów, poziomu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP), wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i potencjału błony mitochondrialnej (MMP) w komórkach HepG2 inkubowanych z β-HCH. Intensywność fluorescencji mitochondriów po wybarwieniu mitochondrialną zieloną sondą fluorescencyjną obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Do określenia poziomów ATP wykorzystano reakcję lucyferyna-lucyferazy. MMP wykryto za pomocą barwnika kationowego JC-1 i przeanalizowano w cytometrii przepływowej. OCR mierzono za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Podsumowując, protokoły te wykorzystano do wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach w celu zbadania uszkodzeń mitochondriów.

Introduction

Wpływ pestycydów chloroorganicznych (OCP) na zdrowie, np. zakłócenia reprodukcyjne, toksyczność immunologiczna, zmiany metaboliczne były wcześniej badane^1,2,3. Metody wykrywania metabolizmu komórkowego i wykrywania dysfunkcji mitochondriów umożliwiły naukowcom zrozumienie roli funkcji mitochondriów (tj. poziomów mitochondriów STAT3, mleczanu, pirogronianu, stosunku mleczanu do pirogronianu, koenzymu Q10, mitochondrialnego wycieku protonów, bioenergetyki, biogenezy i dynamiki) w obszarach takich jak starzenie się, otyłość, cukrzyca, funkcjonowanie układu sercowo-naczyniowego, rak i toksyczność bezpieczeństwa^4,5,6,7. W artykule opisano metody oceny dysfunkcji mitochondriów wywołanej przez OCP.

Wystawiliśmy komórki HepG2 na działanie β-heksachlorocykloheksanu (β-HCH), jednego reprezentatywnego OCP, przez 24 godziny w dawce równoważnej wewnętrznej ekspozycji człowieka. Po pierwsze, TEM zastosowano do obserwacji ultrastruktury hepatocytów, takich jak jądra, mitochondria i retikulum endoplazmatyczne⁸. W porównaniu ze zwykłymi mikroskopami, TEM umożliwia badanie ultrastruktury 2D i 3D komórek i składników komórkowych (linii komórkowych lub tkanek), morfologii, składu chemicznego, a także funkcji materiałów naturalnych lub sztucznych, które odgrywają kluczową rolę we współczesnej nauce i technologii. Funkcję mitochondriów oceniano następnie na podstawie intensywności fluorescencji mitochondriów, poziomu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP), wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i potencjału błony mitochondrialnej (MMP) w komórkach HepG2 inkubowanych z β-HCH. Mito-tracker green to mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna, która może być używana do barwienia fluorescencyjnego specyficznego dla mitochondriów żywych komórek. Mitochondria w hepatocytach wybarwiono zielonym roztworem mito-tracker, a intensywność, liczbę i wzór fluorescencji mitochondriów obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej⁹. Mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna może być używana do barwienia żywych komórek. W porównaniu z rodaminą 123 lub JC-1, mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna nie zależy od potencjału błony mitochondrialnej do barwienia mitochondriów. Poziomy ATP oznaczono za pomocą zestawu lucyferaza-lucyferyna i znormalizowano przez stężenie białka. Zestaw do oznaczania ATP może być używany do wykrywania poziomów ATP w popularnych roztworach, komórkach lub tkankach. Ten zestaw jest oparty na lucyferazie świetlika katalizowanej przez fluoresceinę w celu wytworzenia fluorescencji, gdy ATP jest wymagane do dostarczenia energii. Gdy lucyferazy świetlika i fluoresceiny jest nadmiernie, w pewnym zakresie stężeń, wytwarzanie fluorescencji jest proporcjonalne do stężenia ATP. Ponadto zestaw ten został specjalnie zaprojektowany w celu optymalizacji chemiluminescencji ATP. ATP, jako najważniejsza cząsteczka energetyczna, odgrywa ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych lub patologicznych komórek. Zmiany poziomu ATP mogą odzwierciedlać defekty w funkcjonowaniu komórek, zwłaszcza w produkcji energii mitochondrialnej. Zwykle pod wpływem apoptozy, martwicy lub w stanie toksycznym, poziomy ATP w komórkach zmniejszyły się ¹⁰. Zestaw testowy MMP z JC-1 to zestaw, który wykorzystuje JC-1 jako sondę fluorescencyjną do szybkiego i czułego wykrywania komórek, tkanek lub oczyszczonych MMP. Może być stosowany do wczesnego wykrywania apoptozy. Barwnik kationowy JC-1 jest sondą fluorescencyjną służącą do wykrywania MMP, który może być analizowany w cytometrii przepływowej wskazywanej przez zmiany stosunku fluorescencji zielonej i czerwonej. Gdy MMP jest wysoki, JC-1 jest agregowany w macierzy mitochondriów, tworząc polimer (agregaty J), który wytwarza czerwoną fluorescencję. Gdy MMP jest niskie, JC-1 nie może się akumulować i tworzy monomer, który wytwarza zieloną fluorescencję¹¹. Tak więc stosunek czerwonej i zielonej fluorescencji może odzwierciedlać poziom MMP. OCR komórek jest kluczowym wskaźnikiem prawidłowego funkcjonowania komórek¹². Jest uważany za parametr do badania funkcji mitochondriów. Zestaw do testów wysiłkowych mito komórek zapewnia stabilną metodę analizy kluczowych parametrów funkcji mitochondriów. Zestaw zapewnia odczynniki do kontroli jakości i predykcji, a także standardową metodę wykonywania testu wysiłkowego mitochondriów komórkowych. Może być stosowany do wykrywania wszystkich typów komórek, w tym komórek pierwotnych, linii komórkowych, komórek zawieszonych, a także wysepek, nicieni, drożdży i izolowanych mitochondriów.

Pomiar OCR może dostarczyć cennych informacji na temat stanu fizjologicznego lub zmian w komórkach. Określono go za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w celu wykrycia linii podstawowej oddychania, wycieku protonów, maksymalnego oddychania, obrotu ATP i pojemności rezerwowej. Krótko mówiąc, po podstawowych pomiarach OCR, OCR wykryto po sekwencyjnym dodaniu do oligomycyny (ATP Coupler), FCCP (mitochondrialnego rozprzęgacza fosforylacji oksydacyjnej) i antymycyny A / rotenonu (inhibitora zużycia tlenu) na studzienkę.

Aby ułatwić opracowanie bardziej szczegółowego protokołu wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach in vitro, prezentujemy tutaj eksperymenty TEM, mikroskopii konfokalnej, luminometru, cytometrii przepływowej i analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego z przyszłym zastosowaniem w badaniu niekorzystnych skutków związanych z uszkodzeniem mitochondriów.

Protocol

Wszystkie eksperymenty i protokoły eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami oraz zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.

1. Ultrastruktura mitochondriów według TEM

1. Pobieranie komórek HepG2
   1. Wysiewaj komórki HepG2 w szalkach o średnicy 100 mm. Przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Trawić komórki z 0,25% EDTA w probówce 1,5 mLEP.
   3. Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant.
   4. Zbierz 4-6 x 10⁵ komórek HepG2.
2. Dodać 1 ml 5% aldehydu glutarowego (rozpuszczalnik: woda podwójnie destylowana) za pomocą pipet i inkubować w temperaturze 4°C przez 2 godziny.
3. Dodać i przemyć 4 zmiany po 1 ml buforu fosforanowego (zawierającego Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl i KCl, pH 7,4) każda, po 15 minut. Odessać bufor fosforanowy za pomocą pipet.
4. Dodać 200 μm 1% osmu (rozpuszczalnik: woda podwójnie destylowana) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny do czarnej próbki.
   ostrożność: Osm jest substancją wysoce toksyczną i lotną. Należy go ostrożnie obsługiwać w szafce na leki.
5. Dodać i przemyć 2 zmiany po 1 ml buforu fosforanowego, każda po 5 minut. Odessać bufor fosforanowy.
6. Barwienie w 2% roztworze octanu uranylu (rozpuszczalnik: podwójnie destylowana woda i kwas octowy) w probówce EP o pojemności 1,5 ml przez 2 godziny.
7. Odwodnić i zanurzyć w 50% acetonie, 70% acetonie, 90% acetonie (rozpuszczalnik: woda podwójnie destylowana), 2 przemiany acetonu bezwzględnego, po 15 minut każda.
8. Penetrować w 2 kroplach aceton (100%)/środek do zatapiania (1:1) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Środek do zatapiania Epon812, przepis jest następujący: A: Epon812, 62 ml i DDSA, 100 ml; B: Epon812, 100 ml i MNA 89 ml. A:B=2:8 (v:v, zimą), A:B=1:9 (v:v, latem). Osadzanie w foremkach do zatapiania (miękka plastikowa płyta z siatką w kratkę).
9. Inkubować sekwencyjnie w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, w temperaturze 45 °C przez 12 godzin, a następnie w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.
10. Przygotowanie i obserwacja ultracienkich przekrojów (największa powierzchnia nie może przekraczać 0,5 mm × 0,3 mm) za pomocą ultracienkiej maszyny do profili i TEM (2 μm i 500 nm).

2. Wykrywanie intensywności fluorescencji mitochondrialnej

1. Wysiewaj 2x 10⁴ komórek HepG2 na płytkach 6-dołkowych. Dodaj β-HCH na 24 godziny.
2. Dodaj bezwodny DMSO, aby sformułować końcowe stężenie 1 mM mitochondrialnej zielonej sondy fluorescencyjnej.
3. Dodać 1 ml mitochondrialnego roztworu zielonej sondy fluorescencyjnej (końcowe stężenie: 200 nM) do każdej studzienki 6-dołkowych płytek, inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
4. Przed rozpoczęciem obrazowania usunąć roztwór mitochondrialnej zielonej sondy fluorescencyjnej i dodać świeżo przygotowaną pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM) w temperaturze 37 °C.
5. Obserwuj zieloną fluorescencję mitochondriów pod mikroskopem fluorescencyjnym (10x). Maksymalna długość fali wzbudzenia w momencie wykrycia wynosi 490 nm, a maksymalna długość fali emisji wynosi 516 nm.

3. Oznaczanie komórkowych poziomów ATP

1. Nasiona komórek HepG2 w płytkach 6-dołkowych. Dodaj β-HCH na 24 godziny.
2. Dodaj 200 μl do lizy z zestawu do oznaczania ATP lucyferazy-lucyferyny do każdego dołka 6-dołkowych płytek. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant za pomocą pipet do nowych probówek.
3. Rozcieńczyć odczynnik do wykrywania ATP rozcieńczeniem ATP w stosunku 1: 5, jako bufor do wykrywania ATP.
4. Przygotować oznaczenie krzywej wzorcowej: rozcieńczyć 0,5 mM roztworu wzorcowego ATP do 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM za pomocą do lizy ATP.
5. Dodać 100 μl buforu detekcyjnego ATP do 96-dołkowej płytki na 5 minut w temperaturze pokojowej i dodać 100 μl supernatantu komórki, wykrytego za pomocą luminometru (detektor chemiluminescencji). Obliczyć stężenie ATP (nmol/l) za pomocą krzywej wzorcowej.
6. Wykrywanie stężenia białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA z czytnikiem wielomodowym.
   1. Przygotowanie oznaczenia krzywej wzorcowej: rozcieńczyć 5 mg/ml roztworu wzorcowego białka do 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 mg/ml wodą podwójnie destylowaną.
   2. Dodać 1 μl supernatantu komórki do płytki 96-dołkowej i dodać 19 μl podwójnie destylowanej wody.
   3. Dodaj 200 μl roztworów do wykrywania BCA do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Wykrywanie wartości OD (gęstości optycznej) przez czytnik wielomodowy o długości fali 562 nm. Obliczyć stężenie białka (mg/ml) za pomocą krzywej wzorcowej.
7. Skorygować zawartość ATP na mg stężenia białka (jednostka: stężenie ATP/stężenie białka, nmol/mg).

4. Ocena potencjału błony mitochondrialnej (MMP) za pomocą JC-1

1. Zbierz komórki HepG2 wysiane na płytkach 6-dołkowych. Trawić komórki z 0,25% EDTA w probówce EP o pojemności 1,5 ml, wirować przy 1000 x g przez 3 minuty, odrzucić supernatant i zebrać komórki.
2. Dodaj 50 μl JC-1 (200X) do 8 ml wody destylowanej do wiru i wymieszaj. Dodaj 2 ml buforu barwiącego JC-1 (5X) jako roztwór do wykrywania JC-1.
3. Inkubować komórki mieszaniną 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowych i 0,5 ml roztworu do wykrywania JC-1 przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
4. Wirować przy 600 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
5. Przepłukać w 2 zmianach 1 ml buforu barwiącego JC-1 (1X), odwirować przy 600 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. I wyrzuć supernatant.
6. Zawieś komórki w 0,5 ml buforu barwiącego JC-1 (1X), przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia zielonej i czerwonej fluorescencji. Po wykryciu polimeru JC-1 należy ustawić światło wzbudzenia na 490 nm, a światło emisyjne na 530 nm. Po wykryciu polimeru JC-1 ustaw światło wzbudzenia na 525 nm, a światło emisyjne na 590 nm.

5. Pomiary wskaźników zużycia tlenu (OCR)

1. Nasiona komórek HepG2 w mikropłytkach 96-dołkowych w hodowli komórkowej o gęstości 4500 komórek/100 μl na dołek. Upewnij się, że komórki są pokryte każdym studziennem po 24 godzinach.
2. Dodać odpowiednią objętość przygotowanych odczynników do odpowiedniego portu iniekcyjnego, zgodnie z wcześniejszą literaturą¹³. Port A: 25 μL 1 μM oligomycyny (sprzęgacz ATP); Port B: 25 μL 0,75 μM FCCP (elektroniczne sterowanie przepustnicą, akcelerator ETC); Port C: 25 μL 0,5 μM antymycyny A / rotenonu (inhibitor mitochondriów A i inhibitor mitochondriów B).
3. Przechowuj wkład w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez CO₂ do czasu, gdy będzie gotowy do użycia.
4. Dokonaj wymiany pożywki w płytce komórkowej poprzez usunięcie bieżącego medium z każdej studzienki i dodanie do nowego DMEM. Ostateczna objętość dla każdej studzienki wynosi 180 μl.
5. Przechowywać płytkę komórkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO₂ przez 1 godzinę przed badaniem.
6. Nagrywaj OCR automatycznie za pomocą oprogramowania.
   1. Otwórz oprogramowanie OCR.
   2. Wybierz Cell Mito Stress Test Kit z menu rozwijanego Aplikacje.
   3. Kliknij przycisk Uruchom aplikację.
   4. Kliknij przycisk Uruchom test warunków skrajnych. Pojawi się ekran Cell Stress Test Setup (Konfiguracja testu obciążenia ogniwa).
   5. Wykonaj następujące czynności:
      1. Wprowadź liczbę komórek rozsiewanych na studzienkę w polu Umieszczanie komórek #
      .
      2. Wprowadź średnią wartość OCR w polu Średni podstawowy OCR.
      3. Wprowadź końcowe stężenie robocze dla każdego odczynnika i wstrzyknij odczynniki.
         UWAGA: Średnia podstawowa wartość OCR dla komórki powinna zostać wykryta przed uruchomieniem testu optymalizacyjnego podczas optymalizacji pod kątem stężenia wysiewu komórek.
      4. Kliknij przycisk Dalej. Pojawi się ekran informacji o grupie.
      5. Przypisz grupę do nieprzypisanych studni poprzez wybór koloru i nadanie nazwy, a następnie kliknięcie na odpowiednie studnie.
         UWAGA: Różne grupy są definiowane jako różne zabiegi przed przeprowadzeniem testu stresu Cell Mito. Wszystkie studzienki z mikropłytkami otrzymają te same zastrzyki odczynnika po przeprowadzeniu testu warunków skrajnych.
      6. Kliknij przycisk Dalej. Pojawi się ekran Stress Test Injection Layout (Układ wtrysku testu warunków skrajnych).
      7. Kliknij przycisk Start. Test warunków skrajnych jest teraz uruchamiany w analizatorze. Po zakończeniu biegu postępuj zgodnie z punktami s w oprogramowaniu, wyjmij i wyrzuć wkład i płytkę ogniwa.

Results

Mitochondria komórek HepG2 narażonych na działanie β-HCH były znacznie uszkodzone. Rozproszone mitochondria były łagodnie lub wyraźnie rozszerzone, miały nieregularny kształt, a grzbiet mitochondrialny znikał ze stosunkowo nieprawidłową architekturą mitochondrialną (Ryc. 1).

Średnia intensywność zielonej fluorescencji mitochondrialnej, która reprezentuje mitochondria, zmniejszyła się w komórkach HepG2...

Discussion

Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu wykrywania ma zastosowanie różnorodnych metod eksperymentalnych, które zostały uwzględnione w badaniu od fenotypu do mechanizmu. W tym badaniu komórki HepG2 hodowano w DMEM z penicyliną i streptomycyną oraz 10% płodową surowicą bydlęcą. Gdy komórki osiągnęły 40-50% konfluencji, dodano β-HCH (0, 10, 100 ng / ml) i inkubowano przez 24 godziny. Po raz pierwszy użyliśmy TEM, który wykazał zmiany ultrastrukturalne w hepatocytach wywołane przez reprezentatywne OCP, β-HCH, wykazujące ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmisyjny mikroskop elektronowy	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Obrazowanie o wysokim kontraście, wysoka rozdzielczość, Obserwacja i obrazowanie przy niskich dawkach, Obserwacja w niskiej temperaturze, Znakomita wydajność analityczna, Automatyzacja dla wygody i wydajności
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green to mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna, która może być używana do barwienia fluorescencyjnego specyficznego dla mitochondriów żywych komórek.
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Zeiss	700B	Konstrukcja jest kompaktowa, stabilna, ścieżka światła jest najkrótsza, wysoka precyzja światła, kreatywna technologia i wyrafinowana technologia skanowania razem, aby uzyskać doskonały trójwymiarowy obraz próbki.
Ulepszony zestaw do oznaczania ATP	Beyotime	S0027	Ulepszony zestaw do oznaczania ATP może być używany do wykrywania poziomów ATP (adenozyno-5'-trifosforanu) w popularnych roztworach, komórkach lub tkankach. Komórki i próbki tkanek można podzielić, aby zakończyć przygotowanie próbki, czułość wykrywania do 0,1 nmol / l, chemiluminescencję można utrzymać przez 30 minut.
Luminometr	Berthold	Centro LB 960	Luminometr jest detektorem chemiluminescencji, sama próbka testowa może być lekka, nie musi być stymulowana. Luminometr to przyrząd, który wykrywa chemiluminescencję.
Zestaw do oznaczania białek BCA	Beyotime	P0012	Zestaw do oznaczania białek BCA jest jedną z najczęściej stosowanych metod wykrywania stężeń białek.
Czytnik wielomodowy	TECAN	InfiniteM200	Czytnik wielomodowy może być używany do wykrywania zgody białek.