Eksperymentalny protokół wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach narażonych na pestycydy chloroorganiczne

Summary

Zrozumienie wpływu środowiskowych pestycydów chloroorganicznych (OCP) na funkcję mitochondriów w hepatocytach jest ważne dla zbadania mechanizmu OCP powodującego zaburzenia metaboliczne. W pracy przedstawiono szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby.

Abstract

Ten artykuł przedstawia szczegółowe metody wykrywania funkcji mitochondriów wątroby dla lepszego zrozumienia przyczyny zaburzeń metabolicznych spowodowanych przez środowiskowe pestycydy chloroorganiczne (OCP) w hepatocytach. Komórki HepG2 poddano działaniu β-heksachlorocykloheksanu (β-HCH) przez 24 godziny przy równoważnej dawce ekspozycji wewnętrznej w populacji ogólnej. Ultrastrukturę hepatocytów zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu wykazania uszkodzeń mitochondriów. Funkcję mitochondriów oceniano następnie na podstawie intensywności fluorescencji mitochondriów, poziomu adenozyno-5'-trifosforanu (ATP), wskaźnika zużycia tlenu (OCR) i potencjału błony mitochondrialnej (MMP) w komórkach HepG2 inkubowanych z β-HCH. Intensywność fluorescencji mitochondriów po wybarwieniu mitochondrialną zieloną sondą fluorescencyjną obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Do określenia poziomów ATP wykorzystano reakcję lucyferyna-lucyferazy. MMP wykryto za pomocą barwnika kationowego JC-1 i przeanalizowano w cytometrii przepływowej. OCR mierzono za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Podsumowując, protokoły te wykorzystano do wykrywania funkcji mitochondriów w hepatocytach w celu zbadania uszkodzeń mitochondriów.

Introduction

Wpływ pestycydów chloroorganicznych (OCP) na zdrowie, np. zakłócenia reprodukcyjne, toksyczność immunologiczna, zmiany metaboliczne były wcześniej badane^1,2,3. Metody wykrywania metabolizmu komórkowego i wykrywania dysfunkcji mitochondriów umożliwiły naukowcom zrozumienie roli funkcji mitochondriów (tj. poziomów mitochondriów STAT3, mleczanu, pirogronianu, stosunku mleczanu do pirogronianu, koenzymu Q10, mitochondrialnego wycieku protonów, bioenergetyki, biogenezy i dynamiki) w obszarach takich jak starzenie się, otyłość, cukrzyca, funkcjonowanie układu serc....

Protocol

Wszystkie eksperymenty i protokoły eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami oraz zatwierdzone przez lokalną Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.

1. Ultrastruktura mitochondriów według TEM

1. Pobieranie komórek HepG2
   1. Wysiewaj komórki HepG2 w szalkach o średnicy 100 mm. Przechowywać w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Trawić komórki z 0,25% EDTA w probówce 1,5 mLEP.
   3. Wirować przy 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Odrzucić supernatant.
   4. Zbierz 4-6 x 10⁵ komórek HepG2.

Results

Mitochondria komórek HepG2 narażonych na działanie β-HCH były znacznie uszkodzone. Rozproszone mitochondria były łagodnie lub wyraźnie rozszerzone, miały nieregularny kształt, a grzbiet mitochondrialny znikał ze stosunkowo nieprawidłową architekturą mitochondrialną (Ryc. 1).

Średnia intensywność zielonej fluorescencji mitochondrialnej, która reprezentuje mitochondria, zmniejszyła się w komórkach HepG2.......

Discussion

Kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu wykrywania ma zastosowanie różnorodnych metod eksperymentalnych, które zostały uwzględnione w badaniu od fenotypu do mechanizmu. W tym badaniu komórki HepG2 hodowano w DMEM z penicyliną i streptomycyną oraz 10% płodową surowicą bydlęcą. Gdy komórki osiągnęły 40-50% konfluencji, dodano β-HCH (0, 10, 100 ng / ml) i inkubowano przez 24 godziny. Po raz pierwszy użyliśmy TEM, który wykazał zmiany ultrastrukturalne w hepatocytach wywołane przez reprezentatywne OCP, β-HCH, wykazujące .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmisyjny mikroskop elektronowy	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Obrazowanie o wysokim kontraście, wysoka rozdzielczość, Obserwacja i obrazowanie przy niskich dawkach, Obserwacja w niskiej temperaturze, Znakomita wydajność analityczna, Automatyzacja dla wygody i wydajności
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green to mitochondrialna zielona sonda fluorescencyjna, która może być używana do barwienia fluorescencyjnego specyficznego dla mitochondriów żywych komórek.
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Zeiss	700B	Konstrukcja jest kompaktowa, stabilna, ścieżka światła jest najkrótsza, wysoka precyzja światła, kreatywna technologia i wyrafinowana technologia skanowania razem, aby uzyskać doskonały trójwymiarowy obraz próbki.
Ulepszony zestaw do oznaczania ATP	Beyotime	S0027	Ulepszony zestaw do oznaczania ATP może być używany do wykrywania poziomów ATP (adenozyno-5'-trifosforanu) w popularnych roztworach, komórkach lub tkankach. Komórki i próbki tkanek można podzielić, aby zakończyć przygotowanie próbki, czułość wykrywania do 0,1 nmol / l, chemiluminescencję można utrzymać przez 30 minut.
Luminometr	Berthold	Centro LB 960	Luminometr jest detektorem chemiluminescencji, sama próbka testowa może być lekka, nie musi być stymulowana. Luminometr to przyrząd, który wykrywa chemiluminescencję.
Zestaw do oznaczania białek BCA	Beyotime	P0012	Zestaw do oznaczania białek BCA jest jedną z najczęściej stosowanych metod wykrywania stężeń białek.
Czytnik wielomodowy	TECAN	InfiniteM200	Czytnik wielomodowy może być używany do wykrywania zgody białek.