Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56802

⸱

6 grudnia 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Streszczenie

U ludzi błędy segregacji chromosomów w oocytach są odpowiedzialne za większość poronień i wad wrodzonych. Co więcej, wraz z wiekiem ryzyko poczęcia płodu aneuploidalnego dramatycznie wzrasta, a zjawisko to jest znane jako efekt wieku matki. Jednym z warunków dokładnej segregacji chromosomów podczas podziałów mejotycznych jest utrzymanie spójności chromatyd siostrzanych podczas wydłużonego okresu profazy, którego doświadczają oocyty. Dowody cytologiczne zarówno u ludzi, jak i organizmów modelowych sugerują, że spójność mejolityczna pogarsza się podczas procesu starzenia. Ponadto błędy segregacji w ludzkich oocytach są najbardziej rozpowszechnione podczas mejozy I, co jest zgodne z przedwczesną utratą spójności ramienia. Wykorzystanie organizmów modelowych ma kluczowe znaczenie dla rozwikłania mechanizmów, które leżą u podstaw zależnej od wieku utraty spójności. Drosophila melanogaster oferuje kilka zalet w badaniu regulacji spójności mejotycznej w oocytach. Jednak do niedawna dostępne były tylko testy genetyczne do oznaczania utraty spójności ramienia w oocytach o różnych genotypach lub w różnych warunkach eksperymentalnych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół stosowania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do bezpośredniej wizualizacji defektów w kohezji ramienia w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie I i metafazie I. Generując sondę FISH, która hybrydyzuje z dystalnym ramieniem chromosomu X i zbierając konfokalne stosy Z, badacz może zwizualizować liczbę pojedynczych sygnałów FISH w trzech wymiarach i określić, czy siostrzane ramiona chromatydy są rozdzielone. Opisana procedura umożliwia ilościowe określenie wad kohezji ramienia w setkach oocytów Drosophila. W związku z tym metoda ta stanowi ważne narzędzie do badania mechanizmów, które przyczyniają się do utrzymania spójności, a także czynników, które prowadzą do jej zaniku w procesie starzenia.

Wprowadzenie

Właściwa segregacja chromosomów podczas mitozy i mejozy wymaga, aby spójność chromatydy siostrzanej była ustanowiona, utrzymywana i uwalniana w skoordynowany sposób1,2. Kohezja powstaje w fazie S i jest pośredniczona przez kompleks kohezyny, który tworzy fizyczne wiązania, które utrzymują razem chromatydy siostrzane. W mejozie kohezja dystalna do skrzyżowania pełni również funkcję utrzymywania razem rekombinowanych homologów, a to fizyczne powiązanie pomaga zapewnić prawidłową orientację biwalentnego wrzeciona metafazy I ( Rysunek 1) < sup class = "xref" > 3,< sup class = "xref" > 4,< sup class = "xref">5. Uwolnienie kohezji ramienia w anafazie I umożliwia segregację homologów na przeciwległe bieguny wrzeciona. Jeśli jednak spójność ramienia zostanie przedwcześnie utracona, rekombinowane homologi stracą swoje fizyczne połączenie i losowo się segregują, co może skutkować gametami aneuploidalnymi (Rysunek 1).

U ludzkich oocytów główną przyczyną poronień i wad wrodzonych są błędy w segregacji chromosomów, takie jak zespół Downa6, a ich częstość wzrasta wykładniczo wraz z wiekiem matki7. Kohezja chromatydy siostrzanej ustala się w oocytach płodu, a rekombinacja mejotyczna kończy się przed urodzeniem. Oocyty następnie zatrzymują się w połowie profazy I aż do owulacji, a podczas tego zatrzymania ciągła fizyczna asocjacja rekombinowanych homologów opiera się na kohezji chromatyd siostrzanych. Dlatego dokładna segregacja podczas mejozy i normalne wyniki ciąży wymagają, aby spójność pozostała nienaruszona przez okres do pięciu dekad.

Przedwczesna utrata spójności podczas długotrwałego zatrzymania mejotycznego ludzkich oocytów została zaproponowana jako przyczynienie się do efektu wieku matki i wiele linii dowodowych potwierdza tę hipotezę8,9. Jednak biorąc pod uwagę wyzwania związane z badaniem spójności mejotycznej w ludzkich oocytach, znaczna część naszego zrozumienia tego zjawiska opiera się na wykorzystaniu organizmów modelowych5,10,11,12,13,14,15.

oocyty Drosophila melanogaster oferują liczne korzyści w badaniu kohezji mejotycznej i segregacji chromosomów. Prosty test genetyczny pozwala odzyskać potomstwo z gamet aneuploidalnych i zmierzyć wierność segregacji chromosomu X na dużą skalę11,16,17. Co więcej, można również ustalić, czy błędy segregacji chromosomów powstają, ponieważ rekombinowane homologi nieprawidłowo segregują się podczas mejozy I, fenotypu, który jest zgodny z przedwczesną utratą spójności ramienia11,18,19. Bezpośrednia obserwacja stanu kohezji mejotycznej w oocytach Drosophila jest również możliwa za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Chociaż fluorescencyjne oligonukleotydy, które hybrydyzują się z powtarzalnymi sekwencjami satelitarnymi, są używane od ponad dekady do monitorowania spójności pericentromerowej w dojrzałych oocytach Drosophila4,20, analiza spójności ramienia była znacznie trudniejsza. Wizualizacja stanu kohezji ramion wymaga sondy, która obejmuje duży obszar sekwencji pojedynczej kopii i jest wystarczająco jasna, aby skutkować widocznymi sygnałami dla poszczególnych chromatyd siostrzanych, gdy kohezja ramienia jest nieobecna. Ponadto warunki wiązania oocytów i wielkość znakowanego DNA muszą ułatwiać penetrację21 do dużego dojrzałego oocytu Drosophila (o szerokości 200 μm i długości 500 μm). Ostatnio z powodzeniem wykorzystano sondę ramienia do wizualizacji chromatyd oocytów Drosophila podczas anafazy I, ale autorzy stwierdzili, że nie mogą wykryć sygnału w oocytach zatrzymanych w prometafazie lub metafazie I22. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania sond FISH ramienia chromosomu X i warunków przygotowania oocytów, które pozwoliły nam stwierdzić przedwczesną utratę kohezji chromatyd siostrzanych w oocytach prometafazy I i metafazy I. Techniki te, które umożliwiły nam zidentyfikowanie produktów genów, które są niezbędne do utrzymania spójności mejotycznej, pozwolą innym na przeprowadzenie testów na defekty kohezji chromatyd siostrzanych w dojrzałych oocytach Drosophila o różnych genotypach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania

  1. Przygotować roztwory do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Przygotuj wszystkie roztwory przy użyciu ultraczystej wody.
    1. Przygotuj 5x Zmodyfikowany bufor Robba: 275 mM octan potasu, 200 mM octan sodu, 500 mM sacharoza, 50 mM glukoza, 6 mM chlorek magnezu, 5 mM chlorek wapnia, 500 mM HEPES pH = 7,4. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 10 N NaOH. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby rozmrozić i rozcieńczyć do 1x, a następnie przechowywać 1x porcje w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przy użyciu 1,3 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą 10 N NaOH. Sterylizuj w autoklawie lub sterylizacji filtra.
  2. Przygotuj szkiełka nakrywkowe z poli-L-lizyny na dzień przed potrzebą.
    1. Odpipetować 70% etanolu zawierającego 1% kwasu solnego na powierzchnię szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 mm x 18 mm #1.5 i inkubować przez 5 minut. Użyć aspiracji próżniowej, aby usunąć płyn. Powtórz z sterylną ultraczystą wodą. Przykryj powierzchnię szkiełka nakrywkowego 0,1 mg/ml poli-L-lizyny i inkubuj przez 10 minut.
    2. Odessać, aby usunąć płyn i schnąć na powietrzu przez 10 minut. Przechowywać szkiełka nakrywkowe poli-L-lizyną do góry w plastikowym pojemniku z ciasno przylegającą pokrywką, aby uniknąć kurzu.
  3. Przygotuj wyciągnięte pipety Pasteura, aby usunąć płynne roztwory bez usuwania oocytów. Nad płomieniem palnika Bunsena podgrzej środek długiej szklanej pipety Pasteura, delikatnie pociągając za każdy koniec, aż szklanka stopi się i rozpadnie.

2. Generacja sondy ramienia dla FISH

UWAGA: Wszystkie etapy wirówki są wykonywane przy ~16 000 - 21 000 x g (maksymalna prędkość w większości mikrowirówek stołowych). Krótkie wirówki wskazują na wirowanie przez 5 - 15 s. Wir oznacza wirowanie przez ~15 s z maksymalną prędkością, chyba że zaznaczono inaczej.

UWAGA: BAC dla sond arm można uzyskać z BAC PAC Resources. Dwie euchromatyczne sondy ramienia chromosomu X zostały z powodzeniem wykorzystane w tej metodzie. Jednoramienna sonda składała się z sześciu klonów BAC odpowiadających prążkom cytologicznym 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). Druga sonda ramienia składała się z sześciu klonów BAC odpowiadających prążkom cytologicznym 2F-3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BAC do innych regionów chromosomu Drosophila można przeglądać w: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Dwie sondy perycentryczne, które rozpoznają powtórzenie satelitarne chromosomu X o długości 359 pz, zostały z powodzeniem wykorzystane w tej metodzie. Sonda 22 nukleotydowa była szeroko stosowana i działa dobrze (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Sonda 28 nukleotydów została niedawno przetestowana i również działała dobrze (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. Oczyszczone oligonukleotydy 5' oczyszczone HPLC znakowane specyficznym fluoroforem zostały zamówione ze źródła komercyjnego (np. Integrated DNA Technologies).

  1. Przygotuj DNA klona BAC zgodnie z instrukcjami zestawu, jak określono w Tabeli Materiałów. Zawiesić osad DNA otrzymany ze 100 ml kultury w 200 μl TE; końcowe stężenie DNA powinno mieścić się w przedziale 5 - 40 ng/μl w zależności od klonu BAC.
  2. Przeprowadzić amplifikację DNA dla każdego BAC przy użyciu zestawu do amplifikacji, jak określono w tabeli materiałów i w poniższym protokole. Przetwarzaj DNA BAC dla każdego klonu indywidualnie. Stosować enzymy i dostarczone z zestawem w krokach od 2.2.1 do 2.2.3.
    1. Losowa fragmentacja DNA BAC: Dla każdego BAC należy użyć TE do przygotowania 10 μl roztworu DNA o stężeniu 1 ng/μl w probówce PCR o pojemności 200 μl. Dodaj 1 μl 10-krotnego buforu fragmentacyjnego. Umieścić probówkę w maszynie do PCR w temperaturze 95 °C dokładnie na 4 minuty. Natychmiast schłodzić próbkę w lodowatej wodzie i krótko odwirować. Inkubacja jest wrażliwa na czas, a wszelkie odchylenia mogą zmienić wyniki.
    2. Przygotowanie biblioteki
      UWAGA: Ta metoda wykorzystuje losowe startery do generowania biblioteki fragmentów, które można amplifikować.
      1. Do probówki zawierającej DNA dodać następujące elementy: 2 μl 1x buforu do przygotowania biblioteki, 1 μl roztworu stabilizującego bibliotekę. Dokładnie wymieszać przez wirowanie, krótko odwirować i umieścić probówkę w maszynie do PCR w temperaturze 95 °C na 2 minuty. Natychmiast schłodzić próbkę w lodowatej wodzie i krótko odwirować.
      2. Dodać 1 μl enzymu do przygotowania biblioteki do probówki PCR, wymieszać i krótko odwirować. Umieścić probówkę PCR w maszynie do PCR i inkubować w następujący sposób: 16 °C przez 20 min, 24 °C przez 20 min, 37 °C przez 20 min, 75 °C przez 5 min, następnie trzymać w temperaturze 4 °C.
      3. Wyjąć próbki z maszyny do PCR i krótko odwirować. Próbki mogą być natychmiast amplifikowane lub przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do trzech dni.
    3. Amplifikacja biblioteki DNA BAC
      1. Dodać następujące odczynniki do całej 15 μl reakcji losowych fragmentów: 7,5 μL 10x Amplification Master Mix, 47,5 μl wody wolnej od nukleaz, 5 μl polimerazy DNA WGA. Dokładnie wymieszać przez wirowanie i krótko odwirować.
      2. Umieścić probówkę PCR w maszynie do PCR i inkubować w następujący sposób: początkowa denaturacja 95 °C przez 3 minuty, 14 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 15 s, następnie wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie utrzymanie w temperaturze 4 °C.
      3. Po zakończeniu cyklu oznacz stężenie DNA. Stężenie DNA powinno wynosić co najmniej 800 ng/μl. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do roztrawienia. Opcjonalnie oceń rozmiar fragmentu DNA, przeprowadzając 400 ng DNA na 2% żelu agarozowym. Fragmenty powinny mieć rozmiar od 200 pz do 3 kb (Rysunek 2).
  3. Trawienie enzymatyczne restrykcyjne amplifikowanego DNA
    1. Umieść 20 μg amplifikowanego DNA z poprzedniej sekcji w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 jednostek Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 jednostek BfuCl, 0,5 μL 100x BSA, 5 μL 10x bufor trawienia enzymów restrykcyjnych i dostosować objętość do 50 μL, dodając odpowiednią ilość ultraczystegoH2O.
    2. Inkubować trawienie przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na pokrywie. Etanol wytrąca strawione DNA. Dodać do roztworu: 1 μl glikogenu, 1/10 objętości octanu sodu 3M, 2,5 objętości 100% etanolu klasy cząsteczkowej. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę lub przez noc.
    3. Wirować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć osad DNA 1 objętością 70% etanolu o temperaturze pokojowej i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i pozostawić osad DNA do wyschnięcia na powietrzu lub delikatnie wyschnąć stałym strumieniem powietrza.
    4. Zawiesić osad DNA w sterylnym ultraczystymH2Oo objętości 36 μl i użyć 1 μl DNA do oznaczenia stężenia DNA, które powinno wynosić około 285 ng/μL. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.
    5. Opcjonalnie oceń wielkość fragmentu DNA, prowadząc 400 ng DNA na 2% żelu agarozowym. Większość fragmentów powinna mieć temperaturę od 100 do 200 pz, przy słabszym sygnale do 500 pz (Rysunek 2).
  4. 3' reakcja ogonowa
    1. Denaturacja strawionego DNA w temperaturze 100 °C przez 1 minutę w bloku grzewczym. Natychmiast schłodzić w lodowatej wodzie. Do 35 μl DNA dodaj: 50 μl 400 mM kakodylanu sodu, 1 μl 10 mM DTT i dobrze odwiruj. Dodać 4 μL 25 mM CoCl2, 2,5 μL 2 mM 5-(3-aminoallil)-dUTP z zestawu do znakowania ARES zgodnie z tabelą materiałów, 5 μL 1mM dTTP, 18 μL buforu 5x TdT i 1 μL końcowej deoksynukleotydylotransferazy (TdT) 400 U/μL. Odwirować i krótko odwirować.
      UWAGA: CoCl2 jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.
    2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze, aby zapobiec kondensacji. Dodać 1 μl 250 mM EDTA, aby zatrzymać reakcję i krótko zwirować, aby wymieszać. Etanol wytrąca ogoniaste DNA, jak opisano powyżej (kroki 2.3.2 - 2.3.4). Zawiesić wysuszoną osadkę DNA w 10 μl sterylnego ultraczystegoH2O. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie ono gotowe do kontynuowania.
  5. Przeprowadź koniugację barwnika fluorescencyjnego przy użyciu zestawu do znakowania DNA, jak określono w Tabeli Materiałów.
    UWAGA: Po dodaniu barwnika próbki należy przechowywać w ciemności.
    1. Denaturacja ogoniastego DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut w bloku grzewczym. Natychmiast schłodzić DNA w lodowatej wodzie i krótko odwirować. Przygotować bufor do znakowania zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu i dodać 6 μl do każdej próbki DNA. Ponownie zawiesić każdą tubkę barwnika w 4 μl DMSO z zestawu. Wirować i krótko odwirować.
    2. Użyj jednej tubki barwnika do każdej reakcji etykietowania. Dodaj roztwór barwnika do DNA, wiruj i krótko odwiruj. Reakcję znakowania inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności. Dodać 3 μl hydroksyloaminy 3M, aby zatrzymać reakcję, a następnie 77 μl wolnego od nukleazH2Oz zestawu. Wirować i krótko odwirować.
  6. Usunąć niesprzężony barwnik za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, jak określono w tabeli materiałów. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wyeluować DNA z kolumny dwa razy, za każdym razem używając 40 μl buforu elucyjnego.
  7. Etanol wytrąca znakowane DNA, jak opisano wcześniej (kroki 2.3.2 - 2.3.4). Zawiesić wysuszony osad DNA w 10 μl buforu elucyjnego.
  8. Przygotuj mieszaninę sondy
    1. W przypadku znakowanego DNA należy oznaczyć stężenie barwnika fluorochromowego w pmol/μl. Stężenie fluoroforu może wynosić od 30 do 100 pmol/μl, w zależności od BAC. Stężenie DNA może wynosić od 300 do 800 ng/μL.
      UWAGA: Ustawienie mikromacierzy działa dobrze na spektrofotometrze mikroobjętościowym, takim jak określony w tabeli materiałów. W oknie mikromacierzy wybierz DNA-50 i określ fluorochrom.
    2. Utwórz mieszankę główną, łącząc równomolowe ilości (pmol fluor) każdej z sond BAC. Wirować 30 s przed połączeniem. Aby uniknąć cykli zamrażania/rozmrażania, należy przygotować porcje mieszanki wzorcowej, nałożyć folię parafinową na probówki, aby zapobiec parowaniu, i przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Dobrze sprawdza się mastermix zawierający 250 pmol każdej z 6 pojedynczych sond BAC w łącznej objętości 30 - 50 μL. Podwielokrotność zawierająca 25 pmol (fluoru) dla każdego BAC będzie wystarczająca dla dwóch 40 μl reakcji hybrydyzacji, przy końcowym stężeniu sondy 0,31 pmol fluor/μL dla każdego BAC.

3. Sekcja i utrwalenie oocytów

  1. Zbierz 30 dorosłych dziewiczych samic o odpowiednim genotypie. Aby wzbogacić oocyty w późnym stadium, trzymaj samice bez samców w fiolce z pokarmem dla much i suchymi drożdżami przez 3 - 5 dni przed sekcją25. Dzień przed sekcją przenieś samice bez gazu do świeżej fiolki z drożdżami.
  2. Wykonaj sekcję.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3, aby zapoznać się z potrzebnymi narzędziami. Roztwory usuwa się za pomocą ciągniętej pipety Pasteura, chyba że zaznaczono inaczej. Podczas przenoszenia jajników należy zawsze używać końcówki pipety pokrytej 10% roztworem BSA.
    1. W płytkim naczyniu preparacyjnym zawierającym zmodyfikowany bufor Robba użyj kleszczy, aby usunąć jajniki od pojedynczej samicy. Użyj kleszczyków lub igły wolframowej, aby delikatnie rozchylić każdy jajnik, pozwalając roztworowi zetknąć się z wewnętrznymi jajnikami. Przenieś parę rozłożonych jajników do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml zmodyfikowanego buforu Robba.
    2. Powtórz krok 3.2.1, aby zgromadzić jajniki od 20 do 25 samic w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Zakończ sekcje 20 - 25 samic w ciągu 10 minut.
  3. Wykonaj fiksację w następujący sposób.
    1. Za pomocą wyciągniętej pipety Pasteura usuń płyn z probówki do mikrofuge, użyj P1000, aby szybko dodać 500 μl roztworu utrwalającego o temperaturze 37 °C do jajników, a następnie natychmiast dodaj 500 μl heptanu o temperaturze pokojowej do jajników.
    2. Wstrząśnij probówką do mikrofuge, aby wymieszać i umieścić na nutatorze na 3 minuty. Wyjmij probówkę do mikrofuge z nutatora i umieść w stojaku na probówki na 1 minutę, aby oocyty osiadły na dnie. Całkowity czas utrwalania wynosi 4 min.
      ostrożność: Roztwór fix i heptan są toksyczne, należy nosić odpowiednią ochronę.
    3. Usunąć roztwór utrwalający i przepłukać jajniki 3 razy w 500 μl PBS zawierającego 0,5% BSA i 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Powtórz dla pozostałych genotypów.

4. Usuwanie kosmówek i błon witelinowych

UWAGA: Zobacz Rysunek 3, aby zapoznać się z potrzebnymi narzędziami.

  1. Oddziel oocyty w późnym stadium rozwoju
    1. Dodaj 1 ml PBSBTx do płytkiego naczynia preparacyjnego. Użyj P200 z końcówką pokrytą BSA, aby przenieść nieruchome jajniki (w ~150 μl) do płytkiego naczynia. Pipetuj jajniki w górę i w dół za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA, aby usunąć dojrzałe oocyty ze mniej dojrzałych oocytów.
    2. Gdy oocyty w późnym stadium są wystarczająco oddzielone, przenieś całą tkankę do probówki do mikrofuge o pojemności 500 μl. Nadmiar płynu usunąć za pomocą ciągniętej pipety Pasteura, pozostawiając w probówce około 150 - 200 μL. Powtórzyć sekcję 4.1 dla pozostałych genotypów.
  2. Przygotuj się do walcowania
    1. Wstępnie zwilż naczynie z głęboką studnią z 200 μl PBSBTx. Przykryj i odstaw na bok. Zdobądź 3 szkiełka z matowego szkła i odłóż zjeżdżalnię #3 na bok. Delikatnie pocieraj o siebie obszary matowego szkła szkiełek #1 i #2. Opłucz je w wodzie dejonizowanej, aby usunąć wszelkie odłamki szkła i osusz jednorazową chusteczką.
    2. Pokryj oszronione obszary szkiełek #1 i #2 PBSBTx, dodając 50 μl PBSBTx do jednego szkiełka i pocierając ten obszar drugim szkiełkiem. Usuń płyn jednorazową chusteczką.
    3. Umieść szkiełka pod mikroskopem preparacyjnym w konfiguracji pokazanej na Rysunek 4A. Utrzymuj oszronione obszary slajdów #1 i #2 w kontakcie, ze slajdem #3 podtrzymującym slajd #2.
  3. Zwijaj oocyty; upewnij się, że kierunek toczenia jest zawsze w linii prostej, a nigdy w ruchu okrężnym.
    1. Wstępnie zwilż końcówkę pipety P200 w PBSBTx i rozproszyj oocyty w probówce do mikrofuge, pipetując w górę iw dół. Przenieś 50 μl płynu zawierającego oocyty na środek matowej szklanej części szkiełka #1. Podnieś zjeżdżalnię #2, aby to zrobić.
    2. Powoli opuść suwak #2, aż napięcie powierzchniowe cieczy utworzy uszczelnienie między dwoma obszarami z matowego szkła. Powinno być wystarczająco dużo płynu, aby pokryć oszroniony obszar, ale żaden nie powinien wyciekać. Jeśli płyn jest przepełniony, użyj wyciągniętej pipety Pasteura, aby usunąć nadmiar płynu.
    3. Przytrzymaj dolną prowadnicę (#1) na miejscu jedną ręką, a drugą ręką przesuń górną prowadnicę (#2) do przodu iz powrotem w kierunku poziomym, utrzymując suwak #2 poziomo i podparty na slajdzie #3. Wykonuj pod mikroskopem, aby łatwo zobrazować ruchy i postępy oocytów.
      UWAGA: Ten ruch wygeneruje tarcie i spowoduje, że oocyty "przetoczą się" i stracą kosturę. Należy stosować minimalny nacisk, a ruchy powinny być krótkie i szybkie.
    4. Po wykonaniu kilku ruchów w kierunku poziomym nieznacznie zmień kąt ruchu (Rysunek 4B). W wielu krokach stopniowo zwiększaj ten kąt do 90°, aż ruch górnego suwaka będzie prostopadły do kierunku początkowego (Rysunek 4B). Należy pamiętać, że puste kosmówki będą widoczne w płynie, a oocyty pozbawione kosmówki będą wydawać się dłuższe i cieńsze.
    5. Powtórz kroki 4.3.3 - 4.3.4 około 7 - 10 razy, aż roztwór stanie się lekko mętny. Przestań się toczyć, gdy wydaje się, że większość oocytów (75 - 85%) utraciła błony żółciowe.
      UWAGA: Charakterystyczny spiczasty koniec jest często widoczny na oocytach pozbawionych błon witelinowych. Błony witelinowe są trudniejsze do usunięcia niż kosmówka. Podczas walcowania można wywierać lekki nacisk na górny suwak (slajd #2) w celu usunięcia membran witelinowych. Próba usunięcia błon witelinowych ze wszystkich oocytów często kończy się zniszczeniem innych oocytów.
    6. Delikatnie podnieś górny slajd (#2), przeciągając jeden z jego rogów do środka oszronionego obszaru dolnego zjeżdżalni (#1) tak, aby zwinięte oocyty gromadziły się w środku oszronionego obszaru. Przepłukać oocyty z obu szkiełek za pomocą PBSBTx do naczynia głębinowego zawierającego PBSBTx.
    7. Wyczyść szkiełka #1 i #2 ultraczystą wodą, osusz jednorazową chusteczką i zresetuj. Powtarzać kroki 4.3.1 - 4.3.6, aż wszystkie oocyty o tym samym genotypie zostaną zrolowane. Zwykle wymaga to 3-4 rund walcowania na genotyp.
  4. Usuń zanieczyszczenia po walcowaniu
    1. Dodaj 1 ml PBSBTx do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zakręć płynem, aby pokryć boki tuby.
    2. Za pomocą końcówki do pipety P1000 pokrytej PBSBTx przenieś zwinięte oocyty z naczynia głębinowego do stożkowej probówki zawierającej 1 ml PBSBTx. Dodać dodatkowe 2 ml PBSBTx do stożkowej probówki zawierającej oocyty.
    3. Pozwól oocytom zacząć osiadać na dnie, a następnie usuń górne 2 ml roztworu zawierającego zanieczyszczenia (kosmówki, żółciówki itp.) za pomocą P1000 i wyrzuć. W razie potrzeby przytrzymaj stożkową rurkę na ciemnym tle, aby zobaczyć nieprzezroczyste oocyty, gdy toną.
    4. Dodać dodatkowe 2 ml PBSBTx do oocytów i powtórzyć krok 4.4.3. Powtórzyć czynności 4.4.3. w sumie 3 rundy usuwania gruzu.
    5. Używając końcówki pipety P1000 z powłoką PBSBTx, przenieś oocyty z powrotem do oryginalnej probówki mikrofuge o pojemności 500 μl. 20 - 25 samic powinno dać około 50 μl zwiniętych dojrzałych oocytów.
  5. Powtórzyć sekcję 4 dla pozostałych genotypów, używając świeżych, oszronionych szkiełek, czystego naczynia z głęboką studzienką i nowej stożkowej rurki dla każdego genotypu.
  6. Jeśli konieczne jest przechowywanie, przenieś oocyty do 1x PBS z 0,1% TritionX-100 i przechowuj przez noc w temperaturze 4 °C. Nie zaleca się długotrwałego przechowywania, ponieważ sieciowanie formaldehydu może zostać odwrócone przez detergenty niejonowe.

5. RYBA

UWAGA: Wszystkie prania są wykonywane na nutatorze w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Oocyty, które zostały zwinięte, potrzebują więcej czasu, aby osiąść na dnie probówki do mikrofuge, szczególnie w roztworach zawierających formamid. Ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość podczas zmiany roztworów, aby oocyty nie zostały utracone w tym procesie. Może to wymagać odczekania 5 - 15 minut, aby oocyty osiadły po płukaniu i myciu. Należy również pamiętać, że oocyty w formamidzie są mniej nieprzezroczyste.

  1. Ekstrakcja i obróbka RNAZA
    1. Przepłukać oocyty 500 μl PBS zawierającego 1% Triton X-100 (PBSTx). Usunąć płyn i dodać 500 μl buforu ekstrakcyjnego (PBSTx zawierającego RNAzę). Inkubować na nutatorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Myjnie przed hybrydyzacją
    1. Przepłukać oocyty 3 razy 500 μl 2x Sól fizjologiczna z cytrynianem sodu zawierającym Tween 20 (SSCT). Podgrzej podwielokrotność (~500 μL/genotyp) 2x SSCT + 50% formamidu do 37 °C.
      Uwaga: formamid jest toksyczny, należy stosować odpowiednią ochronę.
    2. Przemyć oocyty 3 razy po 10 minut w 500 μL 2x SSCT. Myć oocyty przez 10 min w 500 μL 2x SSCT + 20% formamidu. Myj oocyty przez 10 minut w 500 μL 2x SSCT + 40% formamidu. Myć oocyty przez 10 minut w 500 μL 2x SSCT + 50% formamidu.
    3. Usunąć ciecz i dodać 500 μl 2x SSCT + 50% formamidu z etapu 5.2.1 do próbki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z rotacją.
      UWAGA: Dobrze sprawdza się do tego piec do hybrydyzacji wyposażony w rotator. Do zabezpieczenia rurek można użyć piankowej rurki "pływaka" z mikrofugi przymocowanej do rotatora.
  3. Denaturacja i hybrydyzacja
    1. Dla każdej probówki oocytów użyj 40 μl 1x buforu hybrydyzacyjnego zawierającego 2,5 ng/μL sondy centromerowej i 0,31 pmol fluor/μL każdej sondy BAC. Przygotować roztwór sondy w buforze hybrydyzacyjnym wystarczającym dla wszystkich genotypów. Wymieszaj sondę wirową 30 s przed dodaniem.
    2. Za pomocą końcówki do pipety P200 pokrytej BSA przenieś oocyty do probówki PCR o pojemności 200 μl. Utrzymuj próbki w temperaturze 37 °C i pozwól oocytom osiąść na dnie, a następnie użyj ciągniętej pipety Pasteura, aby usunąć jak najwięcej płynu.
    3. Dodać 40 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę (przygotowanego w sekcji 2) do oocytów. Umieścić probówkę PCR zawierającą oocyty w maszynie do PCR i inkubować w następujący sposób: 37 °C przez 5 minut, 92 °C przez 3 minuty, a następnie 37 °C przez noc. Po dodaniu sondy do oocytów trzymaj je w ciemności tak bardzo, jak to możliwe.
  4. Myjnie po hybrydyzacji
    1. Podgrzej 2x SSCT + 50% formamid do temperatury 37 °C i trzymaj go w inkubatorze do hybrydyzacji. Za pomocą końcówki do pipety P200 z powłoką BSA dodać 100 μL 2x SSCT + 50% formamidu o temperaturze 37 °C do probówki z oocytami i przenieść oocyty do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 500 μL.
    2. Dodać dodatkowe 400 μL 2x SSCT + 50% formamidu w temperaturze 37 °C do tej samej probówki i pozostawić oocyty w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
      UWAGA: Na tym etapie osiedlenie się często trwa dłużej. Nie jest niczym niezwykłym, że zajmuje to 15 minut lub dłużej. Brak cierpliwości będzie skutkował znaczną utratą komórek jajowych.
    3. Przemyć oocyty 3 razy po 20 minut w 500 μL 37 °C 2x SSCT + 50% formamidu w temperaturze 37 °C na przemian. Utrzymuj oocyty w temperaturze 37 °C, gdy się uspokajają.
    4. Płukać oocyty 3 razy po 10 minut w 500 μL 37 °C 2x SSCT + 50% formamidu w temperaturze 37 °C na przemian. Utrzymuj oocyty w temperaturze 37 °C, gdy się uspokajają.
    5. W temperaturze pokojowej płukać oocyty przez 10 min w 500 μL 2x SSCT + 40% formamidu na nutatorze. Myj oocyty przez 10 minut w 500 μL 2x SSCT + 20% formamidu. Myć oocyty przez 10 minut w 500 μL 2x SSCT.
  5. Bejca z DAPI
    UWAGA: DAPI jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.
    1. Myć oocyty przez 20 minut w 500 μl roztworu DAPI (1 μg/ml) w 2x SSCT na nutatorze. Przepłukać oocyty 3 razy w 500 μL 2x SSCT. Przemyj oocyty 2 razy po 10 minut w 500 μL 2x SSCT na nutatorze. Próbki można przechowywać do 4 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności, aż będą gotowe do zamontowania na szkiełkach nakrywkowych.
  6. Montaż
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3, aby zapoznać się z potrzebnymi narzędziami.
    1. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń płyn z probówki oocytów, dostosowując całkowitą objętość do około 150 μL. Za pomocą końcówki do pipety P200 z powłoką BSA, pipetuj w górę i w dół, aby rozproszyć oocyty w roztworze, a następnie przenieś 40 μl oocytów/roztworu do szkiełka nakrywkowego pokrytego poli-L-lizyną.
    2. Usuń część płynu z szkiełka nakrywkowego za pomocą ciągniętej pipety Pasteura, aż oocyty przykleją się do szkiełka nakrywkowego, ale nadal będą otoczone płynem. Za pomocą kleszczy przytrzymaj szkiełko nakrywkowe z jednej strony i użyj wolframowej igły, aby delikatnie rozdzielić grudki oocytów, przesuwając je, aby uzyskać pojedynczą warstwę nienakładających się na siebie oocytów.
    3. Usuń pozostałą część płynu wokół oocytów za pomocą wyciągniętej pipety Pasteura. Weź czyste szkiełko i użyj sprężonego gazu, aby zdmuchnąć kurz. Dodaj 22 μl podłoża montażowego (np. Prolong-GOLD) na środek szkiełka. Powoli opuścić szkiełko w kierunku szkiełka nakrywkowego, tak aby nośnik mocujący był skierowany w stronę próbki, aż nośnik dotknie próbki. Napięcie powierzchniowe spowoduje, że szkiełko nakrywkowe będzie przylegać do szkiełka.
    4. Umieść szkiełka w plastikowym pojemniku ze szczelnie przylegającą pokrywką, która zawiera warstwę świeżego środka osuszającego (np. dryrytu). Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 3-5 dni w ciemności przed obrazowaniem. Czas schnięcia może się różnić w zależności od wilgotności w pomieszczeniu.

6. Obrazowanie

  1. Po wyjęciu suchych szkiełek z pudełka ze środkiem osuszającym wyczyść je, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci. Zamknięte szkiełka mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C.
  2. Uzyskiwanie obrazów konfokalnych ze skanowaniem laserowym za pomocą obiektywu olejowego o dużej aperturze numerycznej 40x z 6-krotnym zoomem cyfrowym.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby oprogramowanie systemowe pozwoliło znaleźć i oznaczyć lokalizację X-Y chromosomów mejotycznych dla wielu oocytów podczas przeglądania ich za pomocą epifluorescencji. Ta funkcja oszczędza czas podczas sesji obrazowania. Szybkie wybielanie obiektywem 60X o dużej aperturze numerycznej sprawiło, że jego użycie nie było odpowiednie z wybranym systemem konfokalnym, ale może działać z innymi systemami.
  3. Przechwyć serię Z dla każdego oocytu, ustawiając górną i dolną część serii za pomocą sygnału DAPI.
    UWAGA: Wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera będą musiały zostać określone empirycznie przy użyciu podzbioru oocytów. Po znalezieniu odpowiednich parametrów należy dokonać tylko drobnych korekt.
    Jeśli wymagane są zmienione ustawienia akwizycji, użyj wcześniej zebranego stosu obrazów, aby oszacować niezbędne zmiany. Aby uniknąć wybielania, powstrzymaj się od wstępnego obrazowania sondy ramienia przed uchwyceniem serii Z. Przy wielkości kroku 0,25 μm, seria Z zwykle waha się od 25 do 30 kroków, w zależności od orientacji i umiejscowienia chromosomów. Mniejszy rozmiar kroku może poprawić zdolność do oceny, czy dwie plamki FISH są oddzielone w wymiarze osiowym, ale istnieje kompromis w postaci czasu potrzebnego na uchwycenie mniejszych kroków i utraty intensywności sygnału z powodu bielenia. Obiektyw 40-krotny z 6-krotnym zoomem cyfrowym i polem obrazu 1 024 x 512 generuje obrazy o rozmiarze piksela 0,05 μm.

7. Analiza obrazu i punktacja pod kątem wad spójności

  1. Zdekonwolucjonizuj serię Z, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu dla każdego oocytu19.
    UWAGA: Pakiet oprogramowania, taki jak ten określony w tabeli materiałów, umożliwia dekonwolucję za pomocą integracyjnej renowacji, a także kadrowania i poprawiania kontrastu obrazów. Co ważne, niezbędny jest pakiet oprogramowania, który umożliwia przeglądanie obrazów i ocenę defektów spójności w trzech wymiarach.
  2. Dla każdego oocytu należy sporządzić tabelę z liczbą ognisk ramienia i centromerów, które kolokalizują się z sygnałem DAPI. Utrata spójności powoduje powstanie trzech lub czterech odrębnych i oddzielnych sygnałów dla określonej sondy. Nierzadko obserwuje się dwa ogniska, które są połączone cienką nitką. Według najbardziej rygorystycznych kryteriów, ogniska te nie byłyby uważane za "oddzielone".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia obrazy uzyskane za pomocą sondy ramienia, która hybrydyzuje z regionem cytologicznym 6E-7B chromosomu X. Sonda ta generuje sygnał, który kolokalizuje z sygnałem DAPI, jest łatwo odróżnialny od tła i był z powodzeniem stosowany do ilościowego określania defektów kohezji ramion w różnych genotypach19. Ilościowa ocena defektów kohezji została ograniczona do stadiów prometafazy I i metafazy I; z analizy wyklu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie sond FISH do oceny stanu spójności ramienia w oocytach Drosophila prometafazy I i metafazy I jest znaczącym postępem w dziedzinie mejozy Drosophila. Historycznie rzecz biorąc, badacze Drosophila byli ograniczeni do testów genetycznych, aby wywnioskować przedwczesną utratę spójności ramienia w dojrzałych oocytach 11,18,19. Teraz, dzięki przedstawionym tutaj metodom, stan spójności ramienia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez GM59354 grantu NIH przyznanego Sharon E. Bickel. Dziękujemy Huy Q. Nguyenowi za pomoc w opracowaniu protokołu generowania fluorescencyjnych sond ramienia, Ann Lavanway za pomoc w mikroskopii konfokalnej oraz J. Emiliano Reedowi za pomoc techniczną. Dziękujemy również wielu kolegom ze społeczności Drosophila za pomocne dyskusje i rady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kits
Midi Zestaw przygotowawczyQiagen12143Prep BAC klon DNA
GenomePlex Kompletny zestaw do amplifikacji całego genomu (WGA) SigmaWGA2Amplify BAC klon DNA
ARES Alexa Fluor 647 Zestaw do znakowania DNAInvitrogenA21676Etykieta BAC klon DNA
Zestaw do oczyszczania DNA PCRQiagen28104Usuń niesprzężony barwnik po oznakowaniu DNA klonu BAC
strong>NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Chemicals & Roztwory
Uwaga: Wszystkie roztwory są przygotowywane przy użyciu sterylnej ultraczystej wody i powinny być sterylizowane w autoklawie lub filtrze.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1600-100Przygotuj 10% bulionu
Zamroź podwielokrotności
Chlorek wapniaFisher ScientificC75-500
DAPI (4', 6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)InvitrogenD1306Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę. Przygotuj 100µ g/ml zapasu w 100% etanolu, przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C. Przygotować 1 &mikro; g/ml roztworu w 2X SSCT przed użyciem.
Siarczan dekstranuSigmaD-8906
DrieriteDrierite Company23001
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen15508-013Przygotuj 10 mM zapasu
dTTP (10 &mikro; mol, 100 i mikro; l)Boehringer Mannheim1277049Przygotuj 1 mM zapasu
EDTA (disodowy kwas etylenodiaminotetraoctowy) FisherScientificS311-500Przygotuj 250 mM zapasu
100% etanolu (klasa molekularna, 200 dowodów)Decon Laboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Kwas etylenobis(oksyetylenonitro)tetraoctowy)SigmaE-3889
16% formaldehydTed Pella, Inc.18505< Silny>Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę
FormamidInvitrogenAM9342Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę
GlukozaFisher ScientificD16-1
GlikogenRoche901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
HeptanFisher ScientificH350-4Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę.
Kwas solnyMilliporeHX0603-4Toksyczny: < / silny> nosić odpowiednią ochronę.
HydroksyloaminaSigma438227Przygotuj 3 M zapas
4,9 M Chlorek magnezuSigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
Poli-L-lizyna (0,1 mg / ml)SigmaP8920-100
Octan potasuFisher ScientificBP364-500
Octan soduFisher ScientificS209-500Przygotuj 3M zapas
Kakodylan soduPolysciences, Inc.1131Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę. Przygotuj 400mM zapasu
cytrynianu soduFisher ScientificBP327-1
Chlorek soduFisher ScientificS271-3Chlorek sodu
SacharozaFisher ScientificS5-500
10% Tween 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solutions
Uwaga: Wszystkie roztwory są przygotowywane przy użyciu sterylnej ultraczystej wody i powinny być sterylizowane w autoklawie lub przez sterylizację filtra.
Bufor10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0
20X SSC (Soline Sodium Citrate)3 M NaCl, 300 mM Cytrynian sodu
2X roztwór Silny>Toksyczny: nosić odpowiednią ochronę. 200 mM kakodylan sodu, 200 mM sacharozy, 80 mM octan sodu, 20 mM EGTA
1.1X Buforhybrydyzacyjny3,3X SSC, 55% formamid, 11% siarczan dekstranu
Fix roztwórToksyczny: nosić odpowiednią ochronę. 4% formaldehyd, 1X roztwór wiążący kakodylan
PBSBTx1X PBS, 0,5% BSA, 0,1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
Bufor ekstrakcyjny (PBSTx + Rnaza)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 & Mikro; g / mL RNaza
2X SSCT2X SSC, 0,1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamid< silny>Toksyczny: < / silny> nosić odpowiednią ochronę. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 20% formamid
2X SSCT + 40% formamidToksyczny: < / silny> nosić odpowiednią ochronę. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 40% formamid
2X SSCT + 50% formamidToksyczny: nosić odpowiednią ochronę. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 50% formamid
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
HaeIIINew England BiolabsR0108S
MseINew England BiolabsR0525S
MspINew England BiolabsR0106S
RsaINew England BiolabsR0167S
BfuCINew England BiolabsR0636S
100X BSANew England BiolabsW zestawie enzymy NEB
10X bufor NEB #2New England BiolabsBufor trawienia enzymów restrykcyjnych. W zestawie z enzymami NEB
Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (TdT) 400 U/&mikro; lRoche / Sigma 3333566001
Roche/ SigmaW zestawie z enzymem TdT
Chlorek kobaltuRoche / Sigma< strong>Toxic: < / strong>nosić odpowiednią ochronę. W zestawie enzym TdT
RNaza A (10 mg / ml)Thermo-ScientificEN0531
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cytology Tools itp.
KleszczeDumont#5 INOX, Biologia
9" Jednorazowe szklane pipety PasteuraFisher13-678-20CAutoklaw do sterylizacji
NaczynieWykonane na zamówienie
Naczynie do głębokiej studni (3 dołki)Pyrex7223-34
Szkiełka mikroskopowe Fisherfinest PremiumFisher Scientific22-038-104Służy do przykrywania naczyń ze studni głębinowych
Szkiełka z matowego szkła, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
Szkiełka podstawowe, 3 x 1 cal, grubość 1 mmThermo-Scientific3051
Szkiełka nakrywkowe, 10 x 10 mm, nr 1.5Thermo-Scientific3405
Igła wolframowadomowej roboty
Prolong GOLD Nośnikimontażowe Sondy molekularneP36930
Sprężone powietrze w puszceRóżne
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
PCRRóżne
Nanodrop 2000, spektrofotometrTermo-naukowyspektrofotometr mikroobjętościowy
VortexerVarious
Mikrofuge stołowy w temperaturze pokojowejRóżne
Mikrofuge stołowe w 4 & stopniach; CRóżne
bloki grzewczeRóżne
Piec do hybrydyzacji lub inkubator z rotatoremRóżne
nutatoryRóżne
konfegalne skanowanie laserowe A1RSiNikon40X olej Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Nazwa< / silny>Firma< / silny>Numer katalogowyKomentarze
Materiały eksploatacyjne itp.
50 mL probówki stożkoweRóżne
probówki stożkowe 15 mlRóżne
probówki do mikrofuge 1,5 mlRóżne
500 i mikro; l rurki do mikrofugeRóżne
200 i mikro; l Probówki PCRRóżne
Plastikowy pojemnik ze szczelnie dopasowaną pokrywkąRóżneDo przechowywania Drierite
KimwipesRóżnechusteczki jednorazowe
ParafilmRóżnefolie parafinowe
< silny>Nazwa< / silny>Firma< / silny>Numer katalogowyKomentarze
Inne
HPLC oczyszczone oligonukleotydy znakowane 5'Zintegrowane technologie DNA Sondyznakowane Cy3, które rozpoznają powtórzenie satelitarne 359 pz chromosomu X
Oprogramowanie do analizy obrazu 3D VolocityPerkinElmerwersja 6.3
< TE kakodylan 2X Bufor TdT preparacyjne z płytkiego szkła

Bibliografia

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710(2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sonda FISHkohezja ramion meiotycznychprometafaza Imikroskopia konfokalnatoczenie oocytówsegregacja chromosomów
Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.