Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56810

⸱

30 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, 2Applied Medical, 3College of Veterinary Medicine, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Streszczenie

Medycyna regeneracyjna dostarcza nowatorskich alternatyw dla schorzeń, które stanowią wyzwanie dla tradycyjnych metod leczenia. Rozpowszechnienie i zachorowalność na tendinopatię u różnych gatunków, w połączeniu z ograniczonymi właściwościami leczniczymi tej tkanki, skłoniły do poszukiwania terapii komórkowych i przyspieszyły rozwój modeli eksperymentalnych w celu zbadania ich skuteczności. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z macierzy pępowinowej (UCM-MSC) są atrakcyjnymi kandydatami, ponieważ są liczne, łatwe do pobrania, omijają obawy etyczne i ryzyko powstania potworniaka, a jednocześnie bardziej przypominają prymitywne embrionalne komórki macierzyste niż dorosłe MSC pochodzące z tkanki. Duże zainteresowanie skupiło się na chitozanie jako strategii poprawy właściwości MSCs poprzez tworzenie sferoidów. W artykule szczegółowo opisano techniki izolowania UCM-MSC, przygotowania sferoid na błonie chitozanu oraz analizy wpływu tworzenia się sferoidów na ekspresję markerów powierzchniowych. W związku z tym opisano stworzenie obustronnego modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów w celu implantacji in vivo sferoidów UCM-MSC utworzonych na błonie chitozanu. W badaniu nie zaobserwowano żadnych powikłań związanych z zachorowalnością, skutkami narastania stresu lub zakażeniem tkanek. Całkowity wynik funkcjonalny operowanych szczurów po 7 dniach był niższy niż u normalnych szczurów, ale powrócił do normy w ciągu 28 dni po operacji. Wyniki histologiczne gojenia tkanek potwierdziły obecność skrzepu w leczonych defektach ocenianych po 7 dniach, brak reakcji ciała obcego i postępujące gojenie po 28 dniach. Ten obustronny model ubytku ścięgna rzepki kontroluje zmienność międzyosobniczą poprzez stworzenie wewnętrznej kontroli u każdego szczura, był związany z akceptowalną chorobowością i pozwolił na wykrycie różnic między nieleczonymi ścięgnami a leczeniem.

Wprowadzenie

Uraz ścięgna jest jedną z najczęstszych przyczyn znacznego bólu i zaniku mięśni u różnych gatunków1. W medycynie weterynaryjnej urazy ścięgien i więzadeł są szczególnie interesujące u koni, ponieważ 82% wszystkich urazów u koni wyścigowych dotyczy układu mięśniowo-szkieletowego, a 46% z nich dotyczy ścięgien i więzadeł2,3. Tworzenie się tkanki bliznowatej wpływa na właściwości biomechaniczne wyleczonych ścięgien i wyjaśnia ostrożne rokowanie dotyczące powrotu do użytku sportowego po urazach ścięgien zginaczy; Ponowna kontuzja występuje w ciągu 2 lat u 67% koni leczonych zachowawczo4. Medycyna regeneracyjna dostarcza nowatorskich alternatyw dla schorzenia, które stanowi wyzwanie dla tradycyjnych metod leczenia. Terapia autologicznymi komórkami macierzystymi przyniosła zachęcające wyniki5,6 ale jest ograniczona przez zachorowalność związaną z pobraniem tkanek, opóźnione podawanie z powodu przetwarzania/przeprogramowania komórek oraz wpływ stanu zdrowia pacjenta (np. wieku) na właściwości komórek macierzystych7,8. Ograniczenia te stanowią uzasadnienie dla badań nad allogenicznymi komórkami macierzystymi jako gotową alternatywą. Komórki pochodzące z przydatków płodowych są atrakcyjnymi kandydatami, ponieważ omijają obawy etyczne i ryzyko powstania potworniaka związane z embrionalnymi komórkami macierzystymi. Wśród przydatków płodu macierz pępowiny (UCM), zwana również galaretką Whartona, jest obfita i łatwa do zebrania.

Niezależnie od źródła komórek, poprawa macierzystej jest niezbędna do stworzenia banku komórek dla allogenicznej medycyny regeneracyjnej. Z funkcjonalnego punktu widzenia, stem można zdefiniować jako potencjał do samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego9. Dowody na pochodzenie opierają się na testach proliferacji i różnicowania, wraz z ekspresją markerów genowych Oct4, Sox2 i Nanog9. Jedna ze strategii mających na celu zwiększenie macierzystej łodygi opiera się na wykorzystaniu biomateriałów, które służą jako wypełniacze pustych przestrzeni i nośniki, zwiększając proliferację i różnicowanie UCM-MSC. Takie podejście eliminuje obawy związane z manipulacją czynnikami transkrypcyjnymi w celu przeprogramowania dojrzałych komórek w indukowane komórki pluripotencjalne. Wśród biomateriałów uważanych za potencjalne nośniki komórek macierzystych, chitozan jest atrakcyjny ze względu na swoją biokompatybilność i degradowalność10. Ten naturalny aminopolisacharyd powstaje w wyniku alkalicznej deacetylacji chityny, drugiego najobficiej występującego naturalnego polisacharydu, otrzymywanego głównie jako produkt uboczny skorupiaków10. Wcześniej badaliśmy interakcje między MSCs a rusztowaniami chitozanowymi i obserwowaliśmy powstawanie sferoidów11,12,13,14,15,16. Informowaliśmy również o wyższości chondrogenezy chondrogenezy w matrycach chitozanu12,13,14,15,16,17,18. Niedawno dwa niezależne badania opisały powstawanie sferoid przez MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej i tkanki łożyska, hodowane na folii chitozanowej 19,20. To tworzenie sferoid nie tylko zwiększyło zdolność macierzystą, ale także poprawiło retencję komórek macierzystych po implantacji in vivo20.

Rozpowszechnienie i chorobowość tendinopatii u różnych gatunków skłoniły do opracowania eksperymentalnych modeli do badania patofizjologii tendinopatii i testowania nowych terapii, takich jak zastrzyki z komórek macierzystych. U koni zapalenie ścięgien wywołane kolagenazą jest powszechnym modelem wykazującym skuteczność przy użyciu MSCs w naprawie ścięgien21. Znaczenie tego podejścia jest ograniczone, ponieważ zastrzyki powodują ostre zmiany zapalne, podczas gdy tendinopatie kliniczne zwykle wynikają z przewlekłego przeciążenia22,23. Ponadto, chemiczna indukcja choroby ścięgien indukuje reakcję gojenia i nie replikuje upośledzonego procesu gojenia obecnego w przypadkach klinicznych22,23. Wycięcie odcinka ścięgna zginacza powierzchownego palca zostało opisane jako chirurgiczny model zapalenia ścięgien u koni24. Niedawno zastosowano podejście minimalnie inwazyjne w celu ograniczenia urazowego uszkodzenia centralnego rdzenia powierzchownego ścięgna zginacza cyfrowego 25. Modele chirurgiczne nie symulują mechanizmu zmęczenia, który może prowadzić do naturalnej choroby ścięgien i zwykle nie są odtwarzalne w zakresie tworzonych uszkodzeń25. Niezależnie od modelu, zachorowalność i koszty związane z modelami chorób ścięgien koni są dodatkowymi ograniczeniami, które uzasadniają zainteresowanie modelami gryzoni jako pierwszym krokiem do oceny in vivo nowych terapii.

Jedną z głównych zalet modeli eksperymentalnych na gryzoniach jest koszt i możliwość kontrolowania zmienności międzyosobniczej. Gryzonie można standaryzować pod względem różnych czynników fizjologicznych ze względu na ich szybkie tempo wzrostu i stosunkowo krótką żywotność, co ogranicza źródła zmienności, a tym samym zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do wykrycia różnic. Strategie wywoływania chorób ścięgien u gryzoni opierały się na indukcji chemicznej, ale także na chirurgicznym tworzeniu częściowych wad ścięgien21. Modele chirurgiczne mogą symulować naturalne tendinopatie lepiej niż modele chemiczne, ale mogą prowadzić do większej zachorowalności i katastrofalnej niewydolności uszkodzonego ścięgna. Pod tym względem szczury wydają się lepszymi kandydatami na te modele niż myszy, ponieważ ich rozmiar pozwala na tworzenie większych defektów, ułatwiając w ten sposób ocenę gojenia się tkanek. Szczury Sprague-Dawley zostały wykorzystane w eksperymentalnych badaniach tendinopatii w czterech głównych grupach ścięgien: stożek rotatorów, zginacz, ścięgno Achillesa i ścięgna rzepki26. Wśród nich szczególnie atrakcyjne są modele obejmujące ścięgno rzepki ze względu na większy rozmiar tego ścięgna i łatwość dostępu do niego27. Ścięgno rzepki przyczepia mięsień czworogłowy uda do guzowatości piszczelowej. W tym mechanizmie prostownika rzepka jest kością trzeszczkową, która kieruje działaniem mięśnia czworogłowego uda i wyznacza proksymalny zakres ścięgna rzepki. Obecność kotwic kostnych w bliższym i dalszym zasięgu ścięgna rzepki ułatwia badania biomechaniczne. Modele obejmujące ścięgno rzepki zazwyczaj opierają się na jednostronnych wadach chirurgicznych, z nienaruszonym ścięgnem przeciwległym służącym jako kontrola28,29. Najczęstszy model ubytku ścięgna rzepki polega na wycięciu środkowej części (1 mm szerokości) ścięgna rzepki od dystalnego wierzchołka rzepki do przyczepu guzowatości piszczelowej, podczas gdy przeciwległe ścięgno rzepki pozostawia się nienaruszone. Miary wyników obejmowały histologię, nieniszczące badania biomechaniczne lub testy biomechaniczne do awarii, obrazowanie ultrasonograficzne, obrazowanie fluorescencyjne ex vivo, obserwację ogólną i testy funkcjonalne28,30,31. Modele jednostronne nie pozwalają na porównanie proponowanego leczenia z zachowawczym leczeniem podobnego urazu u tego samego zwierzęcia. Podobnie, porównanie między kilkoma zabiegami wymaga oddzielnych zwierząt. Model dwustronny wyeliminowałby różnice między osobnikami i zmniejszyłby liczbę zwierząt wymaganych do badania32. Jednak obustronne urazy mogą zwiększać zachorowalność, a obustronna kulawizna może utrudniać ocenę leczenia. Kilka badań pokrótce donosi o zastosowaniu obustronnych wad ścięgna rzepki u szczurów, ale koncentrują się na efektach leczenia, a nie na leczeniu okołooperacyjnym i zachorowalności modelu33,34.

Długoterminowym celem tego badania jest opracowanie strategii poprawy zdolności macierzystej i przeżywalności in vivo UCM-MSC przeznaczonych do przeszczepu allogenicznego. Aby osiągnąć ten cel, niedawno informowaliśmy o poprawie macierzystej UCM-MSCs poprzez tworzenie sferoid na folii chitozanu i inkubację w środowisku niedotlenionym35. Te właściwości in vitro były związane z poprawą właściwości biomechanicznych ubytków ścięgna rzepki leczonych kondycjonowanymi UCM-MSC. Opierając się na tych wynikach, model obustronnego ubytku ścięgna rzepki u szczura wydaje się odpowiedni do testowania potencjalnych metod leczenia urazów ścięgien36. Celem opisywanego tutaj badania jest dostarczenie szczegółowych protokołów izolacji i charakterystyki UCM-MSC, przygotowania biologicznego systemu dostarczania komórek macierzystych, tworzenia i leczenia obustronnych ubytków ścięgna rzepki oraz rekonwalescencji pooperacyjnej i oceny gojenia się tkanek w obrębie ubytków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Zachodniego Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu.

1. Izolacja i ekspansja MSCs z macierzy pępowiny koni

  1. Pozyskać łożysko od dorosłej klaczy (ciężarnej) po zaobserwowanym źrebięciu i aseptycznie odizolować pępowinę od łożyska. Przechowywać pępowinę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 1% penicyliną-streptomycyną (P/S) w temperaturze 4 °C podczas transferu do czasu przetworzenia.
  2. Umyj pępowinę dwukrotnie PBS o temperaturze pokojowej z 1% P/S w probówce o pojemności 50 ml. Pokrój pępowinę na fragmenty o długości 2 cali na płytce 150 mm i umyj w temperaturze pokojowej PBS z 1% P/S w probówce o pojemności 50 ml dwa lub trzy razy, aż większość krwi zostanie wypłukana.
  3. Przetnij pępowinę wzdłuż, aby odsłonić naczynia. Usuń naczynia, w tym 2 tętnice, żyłę i łodygę omocznikową z pępowiny za pomocą kleszczy i nożyczek. Zbierz macierz pępowinową (galaretka Whartona), która jest galaretowatą matrycą otaczającą naczynia, na płytkę o średnicy 150 mm, zeskrobując skalpelem, i zmiel galaretkę na drobne kawałki.
  4. Umieść galaretkę Whartona z 2-3 fragmentów pępowiny (około 12-15 g) w 50-mililitrowej probówce z 15 ml 0,1% (w/v) roztworu kolagenazy typu IA w PBS. Inkubować w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 3-4 godziny, aż do rozpuszczenia.
  5. Odwirować strawioną tkankę w stężeniu 300 x g przez 15 minut i odessać supernatant. Zawiesić strawioną tkankę w 15 ml PBS o temperaturze pokojowej z 1% P/S, wymieszać pipetując, odwirować przy 150 x g przez 5 minut i odessać supernatant (przemywać). Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
  6. Zawiesić umyte komórki w 15 ml PBS o temperaturze pokojowej z 1% P/S, wymieszać pipetując, przecedzić za pomocą sitka do komórek o wielkości 100 μm, odwirować przy 150 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  7. Przygotować pożywkę hodowlaną (CM), mieszając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle's Medium o niskiej zawartości glukozy z surowicą płodową bydlęcą (FBS) i 1% P/S. Wysterylizuj pożywkę przez filtrację.
  8. Ponownie zawiesić odcedzone komórki w 10 ml CM wstępnie ogrzanego do 37 °C, wymieszać pipetując, przenieść do kolby do hodowli tkankowej o średnicy 25cm2 i inkubować w 5% CO2 przy wilgotności 90% i temperaturze 37,0 °C. Zmieniaj CM co 3 dni, aż kultura osiągnie 70–80% zbieżności, kiedy kultura będzie pasażowana.
  9. Aby przejść przez kulturę, należy odessać CM z kolby, przemyć dwukrotnie 5 ml PBS o temperaturze pokojowej i odłączyć 3 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  10. Zneutralizować trypsynę/EDTA za pomocą 6 ml CM wstępnie podgrzanego do 37,0 °C, wymieszać pipetując, przenieść do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 150 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić oderwane komórki w 1 ml CM, wymieszać pipetując. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Ponownie wysiać do kolby do hodowli tkankowej o średnicy 25cm2 w ilości 5 000 komórek/cm2 i inkubować w 5% CO2 przy wilgotności 90% i temperaturze 37,0 °C.

2. Przygotowanie sferoid z UCM-MSC hodowanych na foliach chitozanowych

  1. Aby przygotować 100 ml 1% (w/v) roztworu chitozanu, dodaj 1 g chitozanu do 99 ml wody destylowanej (dH2O) i dobrze wymieszaj z mieszadłem magnetycznym.
  2. Dodać 670 μl lodowatego kwasu octowego i kontynuować mieszanie, aż chitozan się rozpuści i stanie się lepki. Trwa to zwykle 3–4 godziny.
  3. Dodać 500 μl roztworu chitozanu do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i zawirować płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór chitozanu i pokryć całą dolną powierzchnię.
  4. Płytkę pokrytą roztworem chitozanu suszyć pod komorą z przepływem laminarnym bez pokrywy przez noc przez 24 godziny. Po wyschnięciu zostanie uformowana cienka folia i przyklejona do płyty.
  5. Zneutralizować film chitozanowy, dodając 1 ml 0,5 N roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) do każdego dołka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Odessać NaOH z każdej studzienki i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 1 ml dH2O. Umyj każdą studzienkę 1 ml 70% etanolu (EtOH) raz.
  6. Aby wysterylizować film chitozanowy, dodaj 1 ml 70% EtOH do każdej studzienki i inkubuj przez noc w komorze laminarnej. Odessać pozostały EtOH z każdej studzienki w następnym dniu. Umyj każdą studzienkę trzykrotnie 1 ml sterylnego PBS. Sterylizuj folię chitozanową światłem ultrafioletowym w komorze laminarnej przez noc bez pokrywy.
  7. Aby utworzyć sferoidy UCM-MSC, należy wysiać ekspandowane i pasażowane komórki do każdej studzienki w ilości 5 000 komórek/cm2 i inkubować w 5% CO2 przy wilgotności 90% i temperaturze 37,0 °C.
    UWAGA: Komórki mogą być inkubowane w warunkach niedotlenienia lub normoksji, w zależności od zainteresowania badacza.

3. Ekspresja markerów powierzchniowych analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
    1. Płyta standardowa
      1. Usuń pożywkę z każdej studzienki i umyj dwukrotnie PBS o temperaturze pokojowej.
      2. Odłącz komórki z 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek do każdego dołka 12-dołkowej płytki na 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Po inkubacji dodać 1 ml buforu barwiącego (PBS zawierający 0,5% BSA) do każdej studzienki i wymieszać pipetując w celu odłączenia komórek.
      4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 150 x g przez 5 minut.
    2. Płytka chitozanowa
      1. Zebrać wszystkie sferoidy, odsysając podłoże za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl. Przenieś zebrane podłoże do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Po zebraniu pożywki dobrze umyć, dodając 1 ml PBS i przenieść umyty PBS do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      2. Odwirować sferoidy o masie 150 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      3. Dodać 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek (np. akutazy) i inkubować przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać pipetując za pomocą końcówki o pojemności 1 ml, aż sferoidy rozdzielą się i przestaną być widoczne.
      4. Dodać 1 ml buforu barwiącego do zawiesiny jednokomórkowej i odwirować przy 150 x g przez 5 minut.
  2. Komórki myjące
    1. Usunąć supernatant z probówki stożkowej i ponownie zawiesić komórki w 3 ml zimnego buforu barwiącego. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu od tego kroku.
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut (mycie).
    3. Umyć dwukrotnie.
  3. Barwienie komórek
    1. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
    2. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 50 μl buforu blokującego (PBS zawierający 10% surowicy końskiej) i inkubować przez 30 minut na lodzie.
    3. Dodać 10 μl przeciwciał sprzężonych z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (CD44, CD90, CD105, CD34, główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) klasy II lub kontrolę izotypu dla każdego przeciwciała) i 40 μl buforu barwiącego, a następnie inkubować chroniony przed światłem przez 1 godzinę na lodzie.
    4. Dodać 3 ml zimnego buforu barwiącego i wymieszać, odwirować przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant (przemywać).
    5. Powtórz pranie dwa razy.
    6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml buforu barwiącego
    7. Dodać 5 μl 7-AAD (barwnik żywotności) i inkubować przez 30 minut na lodzie
    8. Analizuj barwione próbki komórek za pomocą cytometru przepływowego. Wyklucz zanieczyszczenia na podstawie ich mniejszych SSC i FSC i zidentyfikuj żywotne komórki z niższym wychwytem 7-AAD. Wykreśl FL1 i FL2 odpowiednio na osiach y i x. Użyj kontrolki izotypu, aby utworzyć bramkę powyżej linii ukośnej. Zmierz procent dodatnio zabarwionych komórek w obszarze. Policz co najmniej 20 000 zdarzeń na próbkę (rysunek uzupełniający 1).
    9. Zmierz procent komórek wybarwionych przeciwciałami poprzez bramkowanie żywotnych komórek i autofluorescencję oraz odejmij procent komórek wybarwionych kontrolą izotypu.

4. Model obustronnego uszkodzenia ścięgna rzepki u szczura

  1. Wybierz szczury Sprague-Dawley (dorosły samiec w wieku 4–5 miesięcy, masa ciała 350–375 g). Zwróć uwagę na stosunkowo duży rozmiar szczurów użytych w tym modelu.
  2. Znieczulić i nałożyć sztuczny lubrykant do oczu szczura z 8% sewofluranem w 2 l/min 100% tlenu dostarczanego przez maskę, aż do ustąpienia odruchu szczypania w komorze indukcyjnej.
  3. Należy podać domięśniowe wstrzyknięcie meloksykamu (1 mg/kg) jako środek przeciwbólowy zapobiegawczy.
  4. Umieść szczura między dwiema butelkami z wodą o pojemności 0,5 l wypełnionymi ciepłą wodą i przykrytymi szmatką, aby utrzymać temperaturę i pozycję ciała, jednocześnie zapobiegając urazom skóry. Przyklej każdy koniec do stołu. Aby zmniejszyć ryzyko hipotermii, przykryj ciało folią bąbelkową (Rysunek 1).
  5. Utrzymuj znieczulenie z ciągłym przepływem 5% sewofluranu w 1 l 100% mieszaniny tlenu przez stożek nosowy, ze zwierzęciem w pozycji grzbietowej na poduszce grzewczej wodnej.
  6. Aby uniknąć urazów skóry, nie przycinaj miejsc operowanych. Zamiast tego nałóż krem do depilacji na obie kolana. Użyj depresora do języka, aby usunąć krem i włosy.
  7. Wyszoruj miejsce operowane peelingiem z diglukonianu chlorheksydyny i spłucz 70% etanolem 3 razy.
  8. Naciąć skórę sterylnym ostrzem skalpela #15 w kierunku proksymalnym do dystalnego, po stronie czaszkowo-przyśrodkowej kolana. Rozpocznij nacięcie około 1 cm proksymalnie do poziomu rzepki i przedłuż je około 5 mm dystalnie do guzka piszczelowego.
  9. Odbij skórę, aby odsłonić ścięgno rzepki, uwalniając leżącą pod spodem tkankę podskórną za pomocą ostrza skalpela #15.
  10. Za pomocą ostrza skalpela #15 wytnij środkową trzecią część każdego ścięgna rzepki (1 mm) od dystalnej części rzepki do guzowatości piszczelowej.
    1. Dopasuj drut Kirschnera o średnicy 0,99 mm do ścięgna jako szablon, aby ujednolicić rozmiar wady w każdej kończynie (Rysunek 2).
    2. Wykonaj 2 nacięcia o pełnej grubości z każdej strony drutu Kirschnera za pomocą ostrza skalpela #15, aby odizolować środkową część ścięgna (Rysunek 3). Wytnij środkową część proksymalnie i dystalnie za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki (Ryc. 4).
    3. Przed zamknięciem powięzi kolana należy wprowadzić skrzep (zawiesinę komórek mieszanych i ACP) dla odpowiednich grup poddanych działaniu substancji, jak opisano w ppkt 5.5. Zamknij powięź wzorem krzyżowym i skórę wzorem śródskórnym za pomocą szwów poliglaktynowych 910 5-0 (Ryc. 5).
  11. Powtórz procedurę na przeciwległym kolanie.
    UWAGA: Jedna wada jest losowo przypisywana do leczenia (komórki macierzyste kondycjonowane chitozanem lub hodowane na standardowych płytkach). Wada kontralateralna pozostaje pusta, aby służyć jako kontrola wewnętrzna.
  12. Po zabiegu chirurgicznym należy podawać 4 tabletki enrofloksacyny (2 mg/tabletkę, doustnie, raz na dobę) i tabletkę meloksykamu (2 mg/tabletkę, doustnie, raz na dobę) przez 7 dni. Dawki te zostały zalecone przez lekarza weterynarii zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone w protokole IACUC.

5. Dostawa MSCs w obrębie wady ścięgna rzepki

  1. Znieczulenie zdrowego szczura, który nie jest używany do tworzenia ubytków ścięgna rzepki, należy znieczulić 8% sewofluranem w 2 l/min 100 % tlenu dostarczanym przez maskę, aż do ustąpienia odruchu szczypania w komorze indukcyjnej.
  2. Pobrać 5 ml krwi przez nakłucie serca od znieczulonego szczura Sprague-Dawley (dorosły samiec w wieku 4-5 miesięcy, masa ciała 350-375 g) w strzykawce o pojemności 5 ml z igłą 20 G zawierającą 1 ml kwasu cytrynianu i dekstrozy (5: 1 v / v).
  3. Poddaj szczura eutanazji po punkcji serca i pobraniu krwi, poprzez dosercowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (100 mg / kg), w tym samym znieczuleniu.
  4. Odwirować próbkę o masie 350 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant i przechowywać podwielokrotności (po 120 μl każdy) w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  5. Bezpośrednio przed implantacją in vivo rozmrozić powyższą podwielokrotność i zmieszać 20 μl z 0,5 x 106 MSCs (z 1,9 lub 3.1.2.1) odłączonymi od standardowych płytek za pomocą trypsyny/EDTA lub zebrać z płytek chitozanu przez płukanie (PBS/pożywką).
  6. Dodać 6 μl 10% chlorku wapnia (CaCl2) do pozostałych 100 μl rozmrożonego osocza w studzience z 96-dołkową płytką, aby aktywować osocze i wywołać tworzenie się skrzepu (aktywowane kondycjonowane osocze: ACP).
  7. Wymieszaj zawiesinę komórkową (20 μl) i ACP (100 μl), aby utworzyć skrzep (Rysunek 6). Umieść skrzep w ubytku ścięgna rzepki utworzonego przed zamknięciem powięzi kolana (patrz krok 4.10.3).

6. Wynik funkcjonalny

  1. Monitoruj szczury dwa razy dziennie pod kątem oznak bólu, w oparciu o skalę grymasu szczura (RGS)37,38 i obrzęk w miejscach implantacji.
    UWAGA: Opracowano system punktacji (0-6) do oceny funkcji ambulatoryjnych w oparciu o 3 czynności, w tym stanie kończyn tylnych z podpartymi kończynami przednimi (0-3), stanie kończyn tylnych bez pomocy (0-2) oraz zdolność do wspinania się po 17-centymetrowej ścianie klatki z tworzywa sztucznego (0-1) (Tabela 1).
  2. Oceń szczury pod kątem dwóch czynności stania na tylnych kończynach rano i wieczorem w każdym punkcie czasowym, aby obliczyć średni wynik.
  3. Oceń szczury pod kątem zdolności do skutecznego wspinania się po 17-centymetrowej plastikowej ścianie klatki, przy czym obie tylne kończyny sięgają szczytu.

7. Ogólny wygląd i histopatologia ścięgna rzepki

  1. Szczury należy poddać eutanazji po 7 dniach (w celu oceny stanu zapalnego) lub 28 dniach (w celu oceny gojenia się tkanek) przez dosercowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (100 mg / kg) w znieczuleniu z 8% sewofluranem i 2 litrami 100% tlenu podawanego przez maskę.
  2. Zbierz jednostki guzowatości rzepki, ścięgna i kości piszczelowej za pomocą skalpela i nożyczek po eutanazji. Usuń tkanki miękkie i więzadła wokół kolana, z wyjątkiem ścięgna rzepki.
  3. Zbadaj każdą próbkę pod kątem ogólnego wyglądu i pogrubienia ścięgna (Rysunek 7).
  4. Zorientuj próbkę, umieszczając węzeł chirurgiczny z 5,0 polidioksanonu na bliższej i bocznej stronie ścięgna. Każdą próbkę umieścić w 10% obojętnym roztworze formaliny z buforem i uzyskać przekroje poprzeczne (5 μm) od środkowej części każdego ścięgna.
  5. Wybarwić skrawki za pomocą hematoksyliny i eozyny oraz barwienia trichromowego Massona zgodnie ze standardowymi protokołami.
  6. Zbadaj sekcję, aby wykryć obecność krwiaka w obrębie wady, a także zmian patologicznych, takich jak stan zapalny.
  7. Oceń wynik histologiczny skrawków przy użyciu wcześniej opublikowanego systemu punktacji, opartego na stopniu kolagenu, stopniu angiogenezy i tworzeniu chrząstki (Tabela 2)39.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu wyniki przedstawiono jako średnia ± SD (odchylenie standardowe). Komórki wyizolowano z pępowin 6 klaczy, a odsetek wyizolowanych linii komórkowych wykazujących każdy marker powierzchniowy w warunkach standardowych lub kondycjonowania chitozanem porównano za pomocą testu Friedmana, jako nieparametrycznej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami. Do stworzenia modelu defektu ścięgna wykorzystano 8 szczurów do oceny 7 dni po operacji oraz 12 szczurów do oceny po 28 dni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki koni zostały wybrane do tego projektu, ponieważ ostatecznie zamierzamy przetestować potencjalne podejścia w leczeniu naturalnych tendinopatii u koni. Rzeczywiście, urazy ścięgien u koni są atrakcyjne jako naturalne modele tendinopatii u człowieka ze względu na biologiczne podobieństwo między powierzchownym zginaczem palców konia a ścięgnem Achillesa u ludzi41. Markery powierzchniowe komórek CD44, CD90, CD105, CD34 i MHC II zostały wybrane do immunofenotypowania komórek, zgodnie z kryteriam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Su, PhD, za jej statystyczną analizę danych. Autorzy dziękują również dr McClure, DVM, PhD DACLAM, za jej porady dotyczące znieczulenia i protokołów leczenia bólu stosowanych w badaniu. Projekt ten był wspierany przez granty z Biura Wiceprezydenta ds. Badań Zachodniego Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu (12678v) oraz funduszy USDA Section 1433 (2090).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBS 10xHycloneSH30258.01Materiały eksploatacyjne
Kolagenaza typu IAWorthingtonLS004197Materiały eksploatacyjne
DMEM o niskiej zawartości glukozySH30021. FSKonsumpcyjny
hyklonpłodowej surowicy bydlęcejSH30910.03Materiał eksploatacyjny
Penicylina / Streptomycyna 100xHyclonSV30010Topliwy
Trypsyna 0,25%HyklonuSH30042.01Materiał eksploatacyjny
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Topliwy
niebieski hyklontrypanowySV30084.01Materiał eksploatacyjny
DimetylosulfotlenekSigmaD2650Materiał eksploatacyjny
ChitozanSigmaC3646Materiał eksploatacyjny
Wodorotlenek soduSigmaS8045Materiał eksploatacyjny
Hyklonalbuminy surowicy bydlęcejSH30574.01Materiał eksploatacyjny
Rurka polistyrenowa z okrągłym dnemCorning149591AMateriał eksploatacyjny
Mysz anty-koń CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FMateriały eksploatacyjne
Mysz anty-szczura CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTMateriał eksploatacyjny
Mysz przeciw koniom MHC-II (FITC)AbDSerotecMCA1085FKonsumpcyjna
mysz IgG1 (FITC) - Kontrola izotypuAbD serotecMCA928FMateriałowy
monoklonalny mysz [SN6] do CD105 (FITC)abcamab11415Zużywalna
mysz IgG1 (FITC) - Kontrola izotypuabcamab91356Konsumpcyjna
mysz anty-ludzka CD34 (FITC)BDBDB560942Eksploatacyjna
mysz IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Materiał eksploatacyjny
7-AADBDBDB559925Materiał eksploatacyjny
BD Cytometr przepływowy Accuri C6BDSprzęt
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Materiał eksploatacyjny
Kwas-cytrynian-dekstrozaSigmaC3821Materiał
Chlorek wapniaSigmaC5670Materiał eksploatacyjny
SewofluranJD Medical60307-320-25eksploatacyjne
SzczuryCharlesRiver Kod szczepu: 400Zwierzę doświadczalne
Zestaw chirurgiczny dla szczurówAparat Harvard728942Sprzęt
Ostrze chirurgiczne #15MEDLINEMDS15115Materiał eksploatacyjny
Baptril firmy Rat MD (2 mg / tabletkę),
Rimadyl (2 mg / tabletka)		Bio ServF06801Materiał eksploatacyjny
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GMateriał eksploatacyjny
Eosin alchol shandonThermo naukowy6766007Materiały eksploatacyjne
Harris HematoxylinThermo naukowe143907Materiały eksploatacyjne
eksploatacyjny Materiały

Bibliografia

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - biomed 2011. Biomed Sci Instrum. 47, 112-117 (2011).
  3. Lake, S. P., Ansorge, H. L., Soslowsky, L. J. Animal models of tendinopathy. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1530-1541 (2008).
  4. Frank, C. B. Ligament structure, physiology and function. J Musculoskelet Neuronal Interact. 4 (2), 199-201 (2004).
  5. Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Vet J. 44 (1), 25-32 (2012).
  6. Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PLoS One. 8 (9), e75697(2013).
  7. Fossett, E., Khan, W. S., Longo, U. G., Smitham, P. J. Effect of age and gender on cell proliferation and cell surface characterization of synovial fat pad derived mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 30 (7), 1013-1018 (2012).
  8. Zaim, M., Karaman, S., Cetin, G., Isik, S. Donor age and long-term culture affect differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Ann Hematol. 91 (8), 1175-1186 (2012).
  9. Leychkis, Y., Munzer, S. R., Richardson, J. L. What is stemness? Stud Hist Philos Biol Biomed Sci. 40 (4), 312-320 (2009).
  10. VandeVord, P. J., et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J Biomed Mater Res. 59 (3), 585-590 (2002).
  11. Griffon, D. J., Abulencia, J. P., Ragetly, G. R., Fredericks, L. P., Chaieb, S. A comparative study of seeding techniques and three-dimensional matrices for mesenchymal cell attachment. J Tissue Eng Regen Med. 5 (3), 169-179 (2011).
  12. Schwartz, Z., Griffon, D. J., Fredericks, L. P., Lee, H. B., Weng, H. Y. Hyaluronic acid and chondrogenesis of murine bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan sponges. Am J Vet Res. 72 (1), 42-50 (2011).
  13. Ragetly, G., Griffon, D. J., Chung, Y. S. The effect of type II collagen coating of chitosan fibrous scaffolds on mesenchymal stem cell adhesion and chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (10), 3988-3997 (2010).
  14. Ragetly, G. R., Griffon, D. J., Lee, H. B., Chung, Y. S. Effect of collagen II coating on mesenchymal stem cell adhesion on chitosan and on reacetylated chitosan fibrous scaffolds. J Mater Sci Mater Med. 21 (8), 2479-2490 (2010).
  15. Ragetly, G. R., et al. Effect of chitosan scaffold microstructure on mesenchymal stem cell chondrogenesis. Acta Biomater. 6 (4), 1430-1436 (2010).
  16. Ragetly, G. R., Slavik, G. J., Cunningham, B. T., Schaeffer, D. J., Griffon, D. J. Cartilage tissue engineering on fibrous chitosan scaffolds produced by a replica molding technique. J Biomed Mater Res A. 93 (1), 46-55 (2010).
  17. Slavik, G. J., Ragetly, G., Ganesh, N., Griffon, D. J., Cunningham, B. T. A replica molding technique for producing fibrous chitosan scaffolds for cartilage engineering. Journal of Materials Chemistry. 17 (38), 4095-4101 (2007).
  18. Griffon, D. J., Sedighi, M. R., Schaeffer, D. V., Eurell, J. A., Johnson, A. L. Chitosan scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering. Acta Biomater. 2 (3), 313-320 (2006).
  19. Huang, G. S., Dai, L. G., Yen, B. L., Hsu, S. H. Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes. Biomaterials. 32 (29), 6929-6945 (2011).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Webster, R. A., Blaber, S. P., Herbert, B. R., Wilkins, M. R., Vesey, G. The role of mesenchymal stem cells in veterinary therapeutics - a review. N Z Vet J. 60 (5), 265-272 (2012).
  22. Khan, M. H., Li, Z., Wang, J. H. Repeated exposure of tendon to prostaglandin-E2 leads to localized tendon degeneration. Clin J Sport Med. 15 (1), 27-33 (2005).
  23. Sullo, A., Maffulli, N., Capasso, G., Testa, V. The effects of prolonged peritendinous administration of PGE1 to the rat Achilles tendon: a possible animal model of chronic Achilles tendinopathy. J Orthop Sci. 6 (4), 349-357 (2001).
  24. van Schie, H. T., et al. Monitoring of the repair process of surgically created lesions in equine superficial digital flexor tendons by use of computerized ultrasonography. Am J Vet Res. 70 (1), 37-48 (2009).
  25. Schramme, M., Kerekes, Z., Hunter, S., Labens, R. Mr imaging features of surgically induced core lesions in the equine superficial digital flexor tendon. Vet Radiol Ultrasound. 51 (3), 280-287 (2010).
  26. Hast, M. W., Zuskov, A., Soslowsky, L. J. The role of animal models in tendon research. Bone Joint Res. 3 (6), 193-202 (2014).
  27. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  28. Murrell, G. A., et al. Achilles tendon injuries: a comparison of surgical repair versus no repair in a rat model. Foot Ankle. 14 (7), 400-406 (1993).
  29. Ozer, H., et al. Effect of glucosamine chondroitine sulphate on repaired tenotomized rat Achilles tendons. Eklem Hastalik Cerrahisi. 22 (2), 100-106 (2011).
  30. Chan, B. P., Fu, S. C., Qin, L., Rolf, C., Chan, K. M. Pyridinoline in relation to ultimate stress of the patellar tendon during healing: an animal study. J Orthop Res. 16 (5), 597-603 (1998).
  31. Ni, M., et al. Tendon-derived stem cells (TDSCs) promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. J Orthop Res. 30 (4), 613-619 (2012).
  32. Orth, P., Zurakowski, D., Alini, M., Cucchiarini, M., Madry, H. Reduction of sample size requirements by bilateral versus unilateral research designs in animal models for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 19 (11), 885-891 (2013).
  33. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J Cell Physiol. 215 (3), 837-845 (2008).
  34. Xu, W., et al. Human iPSC-derived neural crest stem cells promote tendon repair in a rat patellar tendon window defect model. Tissue Eng Part A. 19 (21-22), 2439-2451 (2013).
  35. Taguchi, T., et al. Influence of hypoxia on the stemness of umbilical cord matrix-derived mesenchymal stem cells cultured on chitosan films. J Biomed Mat Res B: Appl Biomat. , (2017).
  36. Griffon, D. J., et al. Effects of Hypoxia and Chitosan on Equine Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 2987140(2016).
  37. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. Eur J Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  38. Sotocinal, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: a partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  39. Rosenbaum, A. J., et al. Histologic stages of healing correlate with restoration of tensile strength in a model of experimental tendon repair. HSS J. 6 (2), 164-170 (2010).
  40. Vidal, M. A., Walker, N. J., Napoli, E., Borjesson, D. L. Evaluation of senescence in mesenchymal stem cells isolated from equine bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord tissue. Stem cells and development. 21 (2), 273-283 (2011).
  41. Patterson-Kane, J., Becker, D., Rich, T. The pathogenesis of tendon microdamage in athletes: the horse as a natural model for basic cellular research. J Compar Pathol. 147 (2), 227-247 (2012).
  42. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  43. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  44. Zhang, K., Yan, S., Li, G., Cui, L., Yin, J. In-situ birth of MSCs multicellular spheroids in poly(L-glutamic acid)/chitosan scaffold for hyaline-like cartilage regeneration. Biomaterials. 71, 24-34 (2015).
  45. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 72 (2), 237-249 (2015).
  46. Butler, D. L., et al. The use of mesenchymal stem cells in collagen-based scaffolds for tissue-engineered repair of tendons. Nat Protoc. 5 (5), 849-863 (2010).
  47. Brennan, M. P., Sinusas, A. J., Horvath, T. L., Collins, J. G., Harding, M. J. Correlation between body weight changes and postoperative pain in rats treated with meloxicam or buprenorphine. Lab Anim (NY). 38 (3), 87-93 (2009).
  48. Ramon-Cueto, A., Cordero, M. I., Santos-Benito, F. F., Avila, J. Functional recovery of paraplegic rats and motor axon regeneration in their spinal cords by olfactory ensheathing glia. Neuron. 25 (2), 425-435 (2000).
  49. Arculus, S. L. Use of meloxicam as an analgesic in canine orthopaedic surgery. Vet Rec. 155 (24), 784(2004).
  50. Bervar, M. Video analysis of standing--an alternative footprint analysis to assess functional loss following injury to the rat sciatic nerve. J Neurosci Methods. 102 (2), 109-116 (2000).
  51. Perry, S. M., Getz, C. L., Soslowsky, L. J. Alterations in function after rotator cuff tears in an animal model. J Shoulder Elbow Surg. 18 (2), 296-304 (2009).
  52. Stoll, C., et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials. 32 (21), 4806-4815 (2011).
  53. Hankemeier, S., et al. Bone marrow stromal cells in a liquid fibrin matrix improve the healing process of patellar tendon window defects. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1019-1030 (2009).
  54. Silver, I. A., et al. A clinical and experimental study of tendon injury, healing and treatment in the horse. Equine Vet J Suppl. (1), 1-43 (1983).
  55. Enwemeka, C. S. Inflammation, cellularity, and fibrillogenesis in regenerating tendon: implications for tendon rehabilitation. Phys Ther. 69 (10), 816-825 (1989).
  56. Goldin, B., Block, W. D., Pearson, J. R. Wound healing of tendon--I. Physical, mechanical and metabolic changes. J Biomech. 13 (3), 241-256 (1980).
  57. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch Orthop Trauma Surg. 129 (11), 1577-1582 (2009).
  58. Oshiro, W., Lou, J., Xing, X., Tu, Y., Manske, P. R. Flexor tendon healing in the rat: a histologic and gene expression study. J Hand Surg Am. 28 (5), 814-823 (2003).
  59. Visser, L. C., Arnoczky, S. P., Caballero, O., Gardner, K. L. Evaluation of the use of an autologous platelet-rich fibrin membrane to enhance tendon healing in dogs. Am J Vet Res. 72 (5), 699-705 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Terapia kom rkami macierzystymimodel szczuraMSC z p powinyb ona z chitozanutworzenie sferoid wizolacja kom rekprocedura chirurgicznaanaliza histologicznapowr t funkcji
Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.