Method Article

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

DOI:

10.3791/56814

⸱

March 21st, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Capital Normal University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estry kwasu ftalowego (PAE) są jedną z głównych grup trwałych zanieczyszczeń organicznych. Wykrywanie PAE w zależności od grupy jest wysoce pożądane ze względu na szybki wzrost kongenerów. Aptamery DNA są coraz częściej stosowane jako elementy rozpoznające na platformach biosensorów, ale rzadko zgłasza się wybór aptamerów w kierunku wysoce hydrofobowych celów małocząsteczkowych, takich jak PAE. W pracy opisano metodę opartą na koralikach, zaprojektowaną w celu selekcji aptamerów DNA specyficznych dla grupy do PAE. Funkcjonalizowany grupą aminową ftalan dibutylu (DBP-NH2) jako cel kotwicy został zsyntetyzowany i unieruchomiony na kulkach agarozy aktywowanych epoksydowo, co umożliwiło wyświetlenie grupy estrów ftalowych na powierzchni matrycy immobilizacyjnej, a tym samym wybór spoiw specyficznych dla grupy. Określiliśmy stałe dysocjacji kandydatów na aptamery za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimeryzacji sprzężonej z separacją magnetyczną. Względne powinowactwo i selektywność aptamerów do innych PAE określono za pomocą testów konkurencyjnych, w których kandydaci na aptamery zostali wstępnie związani z kulkami magnetycznymi dołączonymi do DBP-NH2 i uwolnieni do supernatantu po inkubacji z badanymi PAE lub innymi potencjalnymi substancjami zakłócającymi. Test konkurencyjny został zastosowany, ponieważ zapewnił łatwe porównanie powinowactwa między PAE, które nie miały grup funkcyjnych do immobilizacji powierzchniowej. Na koniec zademonstrowaliśmy wytwarzanie elektrochemicznego czujnika aptasensora i wykorzystaliśmy go do ultraczułego i selektywnego wykrywania ftalanu bis(2-etyloheksylu). Protokół ten dostarcza informacji na temat odkrywania aptamerów innych małych cząsteczek hydrofobowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z szybkim rozwojem gospodarczym, przyspieszeniem industrializacji i budownictwem miejskim, zanieczyszczenie środowiska jest większe niż kiedykolwiek. Typowe zanieczyszczenia środowiska obejmują jony metali ciężkich, toksyny, antybiotyki, pestycydy, substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego i trwałe zanieczyszczenia organiczne (TZO). Oprócz jonów metali i toksyn, inne zanieczyszczenia to małe cząsteczki, które dość często składają się z różnych kongenerów. Na przykład najbardziej toksyczne TZO obejmują polichlorowane bifenyle (PCB), wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polibromowane etery bifenylowe (PBDE), polichlorowane dibenzo-p-dioksyny (PCDD), polichlorowane dibenzo-f-dioksyny (PCDF) i estry kwasu ftalowego (PAE)1,2, które składają się z wielu kongenerów. Wykrywanie małych cząsteczek odbywa się głównie za pomocą technik opartych na chromatografii/spektrometrii mas ze względu na ich różnorodność zastosowań3,4,5,6. Do wykrywania na miejscu opracowano ostatnio metody oparte na przeciwciałach7,8,9. Ponieważ jednak metody te są wysoce specyficzne dla określonego kongeneru, należy przeprowadzić wiele testów. Poważniejsze jest to, że nowe kongenery rosną tak szybko, że ich przeciwciała nie mogą zostać wytworzone na czas. W związku z tym opracowanie specyficznych dla danej grupy bioczujników do monitorowania całkowitych poziomów wszystkich kongenerów w jednym teście może stanowić nieoceniony wskaźnik do oceny stanu zanieczyszczenia środowiska.

Ostatnio, aptamery kwasów nukleinowych są szeroko stosowane jako elementy rozpoznające w różnych platformach biosensorycznych ze względu na ich zdolność do rozpoznawania szerokiej gamy celów, od jonów i małych molekuł po białka i komórki10,11,12. Aptamery są identyfikowane za pomocą metody in vitro zwanej systematyczną ewolucją ligandów przez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)13,14. SELEX rozpoczyna się od losowej syntetycznej biblioteki oligonukleotydów jednoniciowych, która zawiera około 1014-10 15 sekwencji. Wielkość losowej biblioteki zapewnia różnorodność struktur kandydujących na RNA lub DNA. Typowy proces SELEX składa się z wielu rund wzbogacania, aż biblioteka zostanie wzbogacona o sekwencje o wysokim powinowactwie i swoistości do celu. Końcowa wzbogacona pula jest następnie sekwencjonowana, a stałe dysocjacji (Kd) i selektywność wobec potencjalnych substancji zakłócających są określane za pomocą różnych technik, takich jak wiązanie filtra, chromatografia powinowactwa, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) itp. 15

Ze względu na bardzo słabą rozpuszczalność w wodzie i brak grup funkcyjnych do unieruchomienia powierzchni, wybór aptamerów POP jest teoretycznie trudny. Znaczące postępy poczynione w ramach projektu SELEX przyspieszyły odkrycie aptamerów. Nie zgłoszono jednak jeszcze wyboru aptamerów specyficznych dla danej grupy dla TZO. Do tej pory zidentyfikowano tylko aptamery DNA wiążące PCB o wysokiej swoistości dla określonego kongeneru16. PAE są stosowane głównie w materiałach z polichlorku winylu, zmieniając polichlorek winylu z twardego tworzywa sztucznego w elastyczne tworzywo sztuczne, działając w ten sposób jako plastyfikator. Niektóre PAE zostały zidentyfikowane jako substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego, mogą powodować poważne uszkodzenia czynności wątroby i nerek, zmniejszać ruchliwość męskich plemników i mogą powodować nieprawidłową morfologię plemników i raka jąder17. Nie zgłoszono ani swoistych dla związku, ani dla grupy aptamerów wiążących PAE.

Celem tej pracy jest dostarczenie reprezentatywnego protokołu wyboru aptamerów DNA specyficznych dla grupy do wysoce hydrofobowych małych cząsteczek, takich jak PAE, reprezentatywna grupa POP. Demonstrujemy również zastosowanie wybranego aptameru do wykrywania zanieczyszczeń środowiska. Protokół ten zawiera wskazówki i spostrzeżenia dotyczące odkrywania aptamerów innych hydrofobowych małych cząsteczek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i synteza bibliotek i podkładów

  1. Zaprojektuj początkową bibliotekę i podstawki.
    Biblioteka (pula0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCACAC-3'
    Starter do przodu (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforylowany podkład odwrotny (PO4-RP): 5'-PO 4-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Zsyntetyzuj pulę0, FP i PO4-RP przy użyciu standardowej chemii fosforoamidytu18,19,20, i oczyść wszystkie DNA za pomocą standardowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)21.
  3. Rozpuść pulę0, FP i PO4-RP w wodzie wolnej od nukleaz o temperaturze 100 μM, podwielokrotnie, i przechowuj je w temperaturze -20 lub -80 °C przez okres do jednego roku.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przechowywanie puli0, FP i PO4-RP w podwielokrotnościach 10-20 μl, aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia krzyżowego.

2. Zsyntetyzuj cel kotwicy i jego unieruchomienie na kulce agarozowej aktywowanej żywicą epoksydową

  1. Zsyntetyzuj ftalan dibutylu funkcjonalizowany grupą aminową (DBP-NH2) jako cel kotwicy.
    UWAGA: Szczegóły eksperymentalne dotyczące syntezy i charakterystyki DBP-NH2 zostały opisane w literaturze22.
  2. Przygotować roztwory podstawowe zakotwiczenia w podłożu odpowiednim do docelowej rozpuszczalności. Do tego badania należy przygotować 100 mM DBP-NH2 roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać roztwór w temperaturze 4 lub -20 °C przez okres do jednego roku.
  3. Unieruchomić DBP-NH2 na kulkach agarozowych aktywowanych żywicą epoksydową zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem producenta.
    1. Odważyć 0,1 g liofilizowanego proszku z kulek agarozy aktywowanych żywicą epoksydową i zawiesić w wodzie destylowanej. Myć podłoże przez 1 godzinę przy użyciu 20 ml wody destylowanej dodanej w kilku porcjach. Przemyć podłoże 0,2 M Na2CO3 (pH 12).
      UWAGA: Podłoże pęcznieje natychmiast po dodaniu do niego wody.
    2. Rozpuścić DBP-NH2 (46,7 mg, 0,15 mmol) w 500 μl buforze sprzęgającym (0,2 M Na2CO3 bufor
      3. ).
    3. Zmieszać roztwór sprzęgający zawierający ligand z podłożem. Używaj wytrząsarki o prędkości 5 obr./min przez 48 godzin w temperaturze pokojowej.
    4. Powtórzyć mycie produktu trzy razy, kolejno przy użyciu 0,1 M buforu octanowego (0,5 M NaCl, pH 4,5) i 0,2 M buforu węglanowego (0,5 M NaCl, pH 12) w każdym cyklu prania. Umyj i zawieś produkt w wodzie, aby uzyskać końcową objętość 500 μL.
    5. Przed użyciem produkt przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Potwierdź powodzenie unieruchomienia celu za pomocą analizy elementarnej.

3. SELEX

  1. Przygotować 500 ml buforu wiążącego PAE w ultraczystej wodzie lub wodzie bez nukleaz z 20 mM Tris·HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% monolaurynianu sorbaitanu polioksyetylenowego (20) i 0,03% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (pH 7,9). Przefiltrować bufor przez sterylny filtr nitrocelulozowy 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze wyższej niż 20 °C przez miesiące.
    UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie dobrego stanu dyspersji PAE w buforze wiążącym PAE. Do zwiększenia rozpuszczalności PAE w roztworze wodnym potrzebnych jest wiele rodzajów środków powierzchniowo czynnych. Jednak liczba środków powierzchniowo czynnych powinna być ograniczona do minimum, aby uniknąć tworzenia się miceli środków powierzchniowo czynnych, które otaczałyby cząsteczki PAE. Niejonowy, powierzchniowo czynny środek łatwo wytrąca się w temperaturach niższych niż 20 °C, dlatego bufor powinien być przechowywany w temperaturze wyższej niż 20 °C.
  2. Rozcieńczyć 10 μL 100 μM Pool0 (~ 1,0 nmol dla 1014-10 15 sekwencji) w 490 μL buforu wiążącego PAE. Podgrzewać basen0 porcji (5 × 100 μl) w cienkościennych probówkach wirówkowych w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 10 minut. Umieść probówki na lodzie na 5 minut, a następnie inkubuj probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej (~25 °C w tej pracy).
  3. Pierwsza runda selekcji: inkubacja pożywki z puli0 i DBP−NH2−pokrytej.
    1. Przepłukać 200 μl pożywki pokrytejDBP−NH 2− trzykrotnie 500 μl buforu wiążącego PAE. Zmieszać pożywkę pokrytą DBP−NH2−z pulą0 i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę pod łagodnym wstrząsaniem.
    2. Oddzielić podłoże pokryte DBP−NH2− związane aptamerami od niezwiązanych DNA przez ultrafiltrację przy użyciu rurki ultrafiltracyjnej z odcięciem molekularnym 100 kDa. Przepłukać pożywkę trzykrotnie 500 μl buforu wiążącego PAE i odwirować w temperaturze 9,168× g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Pierwsza runda selekcji: elucja aptamerów z pożywki pokrytej DBP−NH2−.
    1. Dodać 50 μl buforu wiążącego PAE do przemytego podłoża i podgrzewać mieszaninę w temperaturze 90 °C przez 9 minut pod wstrząsaniem.
    2. Zebrać supernatant zawierający eluowane DNA przez ultrafiltrację. Powtórz ten proces elucji trzy razy, aby odzyskać więcej związanych DNA.
  5. Pierwsza runda selekcji: PCR
    1. PCR na małą skalę
      1. Wykonaj PCR23 (4 × 20 μL porcji) przy użyciu ~15-30 cykli. Ustaw reakcję PCR24 w następujący sposób: 6,5 μl wody wolnej od RNaz, 1 μL po 10 μM każdego startera (FP, PO4-RP, 0,01 nmol każdy), 1,5 μl eluowanej puli z sekcji 3.4 (lub wody wolnej od RNaz jako kontroli ujemnej) i 10 μl wstępnie zmieszanej mieszaniny reakcyjnej zawierającej dNTP, polimerazę gorącego startu, oraz 2 × bufor reakcyjny PCR (20 mM tris·HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8,3).
      2. Uruchomić PCR za pomocą termocyklera z następującymi ustawieniami: 1 cykl 95 °C, 1 min; 30 cykli [95 °C, 30 s; 56 °C, 30 s; 72 °C, 30 s]; 1 cykl 72 °C, 2 min i utrzymać w temperaturze 4 °C. Gdy przyrząd pracuje 20 s stopni wysuwu na 15, 20, 25 i 30 cykli, naciśnij pauzy, otwórz pokrywę instrumentu i wyjmij jedną rurkę, a następnie ponownie naciśnij pauzy, aby wznowić PCR.
      3. Przygotowanie 12% denaturowanego żelu poliakryloamidowego (STRONA)25,26. Wymieszaj 4,8 g mocznika, 6 ml ultraczystej wody, 1 ml 10 × tris/kwas borowy/kwas etylenodiaminotetraoctowy (TBE), 3 ml 40% akrylamidu, 10 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 100 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS), w tej kolejności. Dobrze wymieszaj i odczekaj 1,5-2 godziny, aby żel całkowicie zastygł.
      4. Przeanalizuj wyniki optymalizacji cyklu: połącz 1 μl każdego produktu PCR z 5 μl buforu ładującego RNA (62,5% formamidu, 0,4 M formaldehydu, 1,25×3-(N-morfolino) bufor kwasu propansulfonowego, 0,02% cyjanolu ksylenu FF, 0,02% błękitu bromofenolowego) i 4 μl wody wolnej od RNaz; podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 10 min, i szybko schłodzić do 0 °C na lodzie; inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej; załadować do 5 oddzielnych studzienek 12% zdenaturowanej STRONY; uruchomić elektroforezę za pomocą pionowego systemu elektroforezy w buforze TBE o napięciu 1 × przy napięciu 170 V przez 45 minut.
      5. Po elektroforezie wybarwić żel 3 μl 1× barwnika żelowego z kwasem nukleinowym w 30 ml buforu 1 × TBE przez 10 minut i wykonać zdjęcie żelu.
    2. PCR na dużą skalę: wybierz odpowiednią liczbę cykli, aby wyprodukować pasmo o najwyższej intensywności przy odpowiednim znaczniku rozmiaru bez niepożądanych produktów ubocznych. Przeprowadzić PCR na dużą skalę (20 × 100 μl podwielokrotności), wykorzystując warunki i odpowiednią liczbę cykli określoną w sekcji 3.5.1.
      UWAGA: Ostateczna ilość biblioteki jednoniciowej, którą można uzyskać, jest proporcjonalna do całkowitej objętości PCR, a nie do stężenia matrycy. Zazwyczaj, aby uzyskać 1 nmol biblioteki, pula jednoniciowa potrzebuje 2 ml PCR. PCR jest bardzo czuły i łatwo zanieczyszczony zewnętrznym DNA. Należy podjąć kroki w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia, takie jak noszenie rękawiczek, używanie wysterylizowanych końcówek, nie plucie do probówek i nie otwieranie nakrętki probówki do PCR przed odwirowaniem.
  6. Pierwsza runda selekcji: oczyszczanie produktu PCR przez wytrącanie etanolu.
    1. Połącz dwie probówki mieszaniny PCR w jedną probówkę (200 μl każda). Powtórz to dla wszystkich probówek.
    2. Do każdej probówki dodać 15 μl roztworu octanu sodu (3 M, pH 5,2), 4 μl roztworu nośnika wytrącającego DNA/RNA i 2,5-krotność objętości wstępnie schłodzonego etanolu w temperaturze -20 °C. Wymieszaj je równomiernie.
      UWAGA: Nośnik wytrącania DNA / RNA jest szeroko stosowany w eksperymentach z wytrącaniem etanolu w celu znacznej poprawy procentu odzyskiwania DNA / RNA przy niskich stężeniach. Nie koliduje z dalszymi aplikacjami, takimi jak PCR i sekwencjonowanie.
    3. Odwirować mieszaninę o stężeniu 20,627 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odrzucić supernatant i pozostawić biały osad.
    4. Dodać 400 μl 70% roztworu etanolu z chłodzeniem wstępnym w temperaturze -20 °C do każdej probówki, aby zmyć osady. Odwirować mieszaninę w temperaturze 20,627 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ostrożnie odrzucić supernatant i pozostawić biały osad. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.
    5. Otworzyć pokrywę probówki, nakłuć membranę uszczelniającą, pozostawić etanol do ulatniania się w temperaturze 40 °C na bloku grzewczym, aż biały osad stanie się przezroczysty. Przechowywać osad w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Oczyszczony produkt PCR można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. Pierwsza runda selekcji: wytwarzanie jednoniciowego DNA (wytwarzanie wzbogaconej puli1) poprzez przeprowadzenie reakcji egzonukleazy λ w celu trawienia fosforylowanej nici odwrotnej.
    1. Reakcja egzonukleazy λ na małą skalę
      1. Dodać 100 μl wody wolnej od RNaz do jednej probówki zawierającej oczyszczony produkt PCR z sekcji 3.6. Odwiruj probówkę, aby całkowicie rozpuścić osad w probówce.
      2. Przygotować pięć probówek wirówkowych i dodać 5 μl powyższego roztworu, 11 μl wody wolnej od RNaz i 2 μl 10 × buforu reakcyjnego (670 mM glicyny-KOH, 25 mM MgCl 2,0,1% (v/v) Triton X-100 pH 9,4) do każdej probówki.
      3. Dodać 2 μl wody lub rozcieńczonego roztworu λ egzonukleazy zawierającego odpowiednio 2 U, 5 U, 8 U i 10 U λ egzonukleazy do tych probówek. Dobrze wymieszać roztwór, delikatnie pipetując. Bufor reakcyjny 10 × dostarczany jest wraz z egzonukleazą λ od dostawcy.
      4. Inkubować probówki przez 35 minut w temperaturze 37 °C, 15 minut w temperaturze 80 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      5. Przygotuj 12% natywną STRONĘ. Wymieszaj 6 ml ultraczystej wody, 1 ml 10 × TBE, 3 ml 40% akrylamidu, 10 μl TEMED i 100 μl 10% APS, w tej kolejności. Dobrze wymieszaj i odczekaj 60-90 minut, aby żel całkowicie zestalił się.
      6. Przeanalizuj wyniki reakcji, łącząc 5 μl każdej reakcji z 1 μl barwnika ładującego i 4 μl wody wolnej od RNaz i ładując te mieszaniny do 5 oddzielnych studzienek o natywnym 12% PAGE (150 V przez 45 min).
        UWAGA: Dwuniciową drabinę DNA o długości 20 pz można również załadować na żel, ale może to nie być konieczne, ponieważ wyraźne prążki produktu PCR i wygenerowana biblioteka jednoniciowa są widoczne na żelu.
        UWAGA: Reakcja egzonukleazy λ charakteryzuje się doskonałą selektywnością strukturalną. Dwuniciowy produkt PCR (nić antysensowna jest znakowana grupą fosforanową na końcu 5') może być całkowicie strawiony do jednoniciowej biblioteki w obecności egzonukleazy λ w dość szerokim zakresie stężeń (Rysunek 4). Minimalna ilość egzonukleazy λ, która może całkowicie wytworzyć jednoniciowe DNA w reakcji egzonukleazy λ na małą skalę, jest również stosowana w reakcji egzonukleazy λ na dużą skalę. Można również zastosować wyższe stężenie egzonukleazy λ, ponieważ egzonukleaza λ działa dobrze w szerokim zakresie stężeń, nie tracąc przy tym swojej selektywności strukturalnej i wydajności produktu. Reakcja egzonukleazy λ jest hamowana przez wysokie stężenie soli. Niepełne trawienie produktu PCR zwykle oznacza, że w produkcie PCR znajduje się zbyt dużo soli. Oczyszczanie produktów PCR przez wytrącanie etanolu (sekcja 3.6) jest zwykle zgodne z tym etapem, podczas gdy produkt PCR oczyszczony przez wytrącanie izopropanolu dość często zawiera zbyt dużo soli.
    2. Reakcja egzonukleazy λ na dużą skalę: Wybierz minimalną ilość egzonukleazy λ, która może całkowicie wytworzyć jednoniciowe DNA dla reakcji egzonukleazy λ na dużą skalę. Reakcja jest proporcjonalnie skalowana w górę zgodnie z tym warunkiem. Na przykład: jeśli 2 U jest minimalną wymaganą ilością egzonukleazy λ, zmieszaj 38 μl wody wolnej od Rnazy, 10 μl z 10 x buforem, 50 μl puli DNA1 i 2 μl 10 U/μL λ egzonukleazy.
  8. Pierwsza runda selekcji: oczyszczanie jednoniciowej puli1 przez wytrącanie etanolu.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami w kroku 3.6.
    2. Oznaczyć stężenie oczyszczonej puli1 przez absorpcję promieniowania UV przy długości fali 260 nm.
    3. Rozpuścić 90% oczyszczoną pulę1 w odpowiedniej objętości buforu wiążącego PAE. Jeśli nie ma wystarczającej ilości uzyskanego DNA do następnej rundy selekcji, powtórzyć sekcje 3.5-3.8.2.
      UWAGA: Objętość buforu wiążącego PAE zwykle waha się od 200 do 500 μL w zależności od ilości biblioteki i pożądanego końcowego stężenia biblioteki w następnej rundzie SELEX.
  9. Druga, trzecia, czwarta i piąta runda SELEX.
    1. Przeprowadź drugą, trzecią, czwartą i piątą rundę SELEX kolejno postępując zgodnie z tą samą procedurą opisaną powyżej (sekcja 3.2 - 3.8), z wyjątkiem tego, że biblioteka ~300 pmol została wprowadzona w celu zwiększenia rygorystyczności wyboru.
    2. Aby zminimalizować niespecyficzną absorpcję DNA na pożywce, inkubować basen z niezmodyfikowaną pożywką na wytrząsarce obrotowej przez 30 minut w trzeciej i czwartej rundzie selekcji przed inkubacją z pożywką pokrytąDBP−NH 2−.
      UWAGA: Proces SELEX zakończył się na piątej rundzie ze względu na poważne usieciowanie krzyżowe między DNA, które ujawniła duża ilość produktu o dużej masie cząsteczkowej, który nie migrował do żelu.

4. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

  1. Przygotować pulę4 z sekcji 3.9.2 do sekwencjonowania przez amplifikację PCR z kompatybilnymi starterami.
    1. Zaprojektuj i zsyntetyzuj indeksowany starter do przodu z 6 nt na końcu 5′, aby ułatwić analizę sekwencji.
      Indeksowany starter do przodu (sekwencjonowanie FP): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Ustaw reakcję 1,000 μLPCR w następujący sposób: 380 μl wody wolnej od RNaz, 50 μl każdego startera 10 μM (sekwencjonowanie FP, PO4-RP, 0,5 nmol każdy), 20 μl eluowanej puli z sekcji 3.9.2 i 500 μl wstępnie zmieszanej mieszaniny reakcyjnej zawierającej dNTP, polimerazę gorącego startu i 2 × bufor reakcyjny PCR. Podzielić mieszaninę na 10 probówek do PCR. Należy stosować te same warunki PCR, jak opisano w sekcji 3.5.1.2.
  2. Oczyść produkt PCR, aby spełniał wymagania zakładu sekwencjonowania. Na przykład użyj zestawu do odzyskiwania DNA PAGE-gel zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Wyślij oczyszczony produkt PCR (~2 μg) do zakładu sekwencjonowania zgodnie z warunkami wysyłki wymaganymi przez zakład sekwencjonowania. Na przykład, wyślij produkt PCR w probówce wirówkowej z nakrętkami dokładnie uszczelnionymi okładami z lodu do zakładu sekwencjonowania.
    UWAGA: Otrzymano wyniki, które uszeregowały sekwencje według numeru kopii każdej sekwencji, aby ocenić wzbogacenie zsekwencjonowanej puli. Górna sekwencja została nazwana DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCCCCATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Jego powinowactwo i selektywność mierzono za pomocą następującego protokołu (sekcja 5 i 6). Jego zastosowanie w elektrochemicznej biodetekcji zostało następnie zademonstrowane w sekcji 7.

5. Kd Oznaczanie wybranych kandydatów na aptamery za pomocą ilościowego PCR opartego na kulkach magnetycznych (qPCR)

  1. Zsyntetyzuj DBP-1-qPCR i startery przy użyciu standardowej chemii fosforoamidytu i oczyść go za pomocą standardu HPLC.
    Kandydat na aptamer (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTCTGTCCCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Starter do qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Starter odwrotny do qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    UWAGA: Regiony starterowe badanej sekwencji różnią się od tych z puli0 użytej w sekcji 3. Celem zmiany regionów startera jest przetestowanie powinowactwa samej sekwencji rdzenia, z wyłączeniem regionów starterowych.
  2. Unieruchomić DBP-NH2 na kulkach magnetycznych pokrytych kwasem karboksylowym zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Przemyć dwukrotnie kulki magnetyczne pokryte kwasem karboksylowym 25 mM kwasem 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES) (pH 5,0), używając równej objętości kulek magnetycznych (100 μl) odpipetowanych z fiolki, przez 10 minut z dobrym wymieszaniem (koniec po końcu lub podobnie).
    2. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 50 mg/ml roztworu chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) z zimnym 25 mM MES (pH 5,0).
    3. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 50 mg/ml roztworu N-hydroksysukcynimidu (NHS) z zimnym roztworem MES o stężeniu 25 mM (pH 5,0).
    4. Wymieszać 100 μl roztworu EDC i 100 μl roztworu NHS z przemytymi kulkami i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z powolnym obracaniem pochylenia.
    5. Umieścić probówkę na magnesie na 4 minuty po inkubacji, wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć kulki 100 μl zimnego 25 mM MES (pH 5,0).
    6. Inkubować 6 μl 100 mM DBP-NH2 roztworu podstawowego i 25 mM MES (pH 5,0, 290 μl) z aktywowanymi kulkami na obrotach przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej lub 2 godziny w temperaturze 4 °C, z powolnym obracaniem przy 5 obr./min.
    7. Umieść probówkę na magnesie na 4 minuty po inkubacji i wyrzuć supernatant. Umyj powlekane kulki 4 razy i ponownie zawiesić je 200 μl buforu wiążącego PAE i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Zebrać krzywą miareczkowania, aby oznaczyć Kd.
    1. Przygotować serię roztworów DBP-1 (500 μl) o różnych stężeniach w buforze wiążącym PAE od 1 pM do 300 nM.
    2. Dodać 10 μl kulek magnetycznych pokrytych DBP-NH2, jak opisano w sekcji 5.2.7, do każdego roztworu DBP-1. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na zmianę.
    3. Umieść probówki na magnesie na 4 minuty i usuń supernatant. Umyj kulki 4 razy za pomocą 200 μl buforu wiążącego PAE.
    4. Dodać 60 μl buforu wiążącego PAE do każdej probówki. Inkubować probówki w temperaturze 95 °C przez 15 minut. Zebrać supernatant zawierający eluowany DBP-1 przez separację magnetyczną. Powtórz ten proces elucji, aby odzyskać więcej związanego DBP-1.
    5. Rozcieńczyć roztwór elucji 100-krotnie i pobrać 3 μl do qPCR w czasie rzeczywistym. Ustaw reakcję qPCR w następujący sposób: 3 μl wody wolnej od RNaz, 2 μL po 10 μM każdego startera (FP, PO4-RP, 0,01 nmol każdy), 3 μl eluowanego i rozcieńczonego DBP-1 i 10 μl wstępnie zmieszanej mieszaniny reakcyjnej zawierającej dNTP, polimerazę i 2x bufor reakcyjny PCR.
    6. Oznaczyć liczbę DBP-1 w każdej próbce, przeprowadzając qPCR przy użyciu termocyklera z następującymi ustawieniami: 1 cykl 95 °C, 30 s; 30 cykli [95 °C, 30 s; 45 °C, 30 s; 72 °C, 30 s]; 1 cykl 72 °C, 30 s i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    7. Wykreślić krzywą miareczkowania i wyznaczyć Kd przez nieliniowe dopasowanie krzywej, przyjmując współczynnik wiązania 1:127.

6. Test względnego powinowactwa i swoistości za pomocą testów konkurencyjnych

  1. Dodać 10 μl kulek magnetycznych pokrytych DBP-NH2 do roztworu DBP-1 (500 μL, 1 μM). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na zmianę. Umieść probówki na magnesie na 4 minuty i usuń supernatant. Przemyć kulki 4 razy przy użyciu 200 μl buforu wiążącego PAE i ponownie zawiesić je w 10 μl buforu wiążącego PAE.
  2. Dodać 10 μl pożywki pokrytej DBP-NH2 związanej DBP-1 do 110 μL każdej badanej próbki 10 μM (DBP-NH2, DBP, DEHP, ftalan butylobenzylu (BBP), jony metali ciężkich itp.) Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zebrać supernatant przez separację magnetyczną.
  3. Rozcieńczyć supernatant 100-krotnie i pobrać 3 μl do ilościowego oznaczania qPCR. Ustaw reakcję qPCR w następujący sposób: 3 μl wody wolnej od RNaz, 2 μL po 10 μM każdego startera (FP, PO4-RP, 0,01 nmol każdy), 3 μl eluowanego i rozcieńczonego DBP-1 oraz 10 μl wstępnie zmieszanej mieszaniny reakcyjnej zawierającej dNTP, polimerazę i 2 x bufor reakcyjny PCR.
  4. Oznaczyć liczbę DBP-1 w każdej próbce, przeprowadzając qPCR przy użyciu termocyklera z następującymi ustawieniami: 1 cykl 95 °C, 30 s; 30 cykli [95 °C, 30 s; 45 °C, 30 s; 72 °C, 30 s]; 1 cykl 72 °C, 30 s i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  5. Obliczyć względne powinowactwo, dzieląc liczbę DBP-1 uwolnionych z kulek w obecności próbki przez liczbę DBP-1 uwolnionych z kulek w buforze wiążącym PAE: Powinowactwo względne = Npróbki/N buforu.

7. Produkcja i pomiary elektrochemiczne biosensorów elektrochemicznych DEHP

  1. Zsyntetyzuj tiolowaną sekwencję rdzenia (HS-DBP-1) i sondę sygnalizacyjną (DBP-1-C-Fc) przy użyciu standardowej chemii fosforoamidytu i oczyść ją za pomocą standardu HPLC.
    HS-DBP-1: 5'- HS-(CH2)6-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3'
    DBP-1-C-FC: 5'-GATGTGACGGAAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    UWAGA: Racjonalna konstrukcja sond czujników została opisana w naszych poprzednich pbulications18,22.
  2. Rozpuść HS-DBP-1 i DBP-1-C-Fc w wodzie wolnej od nukleaz o temperaturze 100 μM, podwielokrotności, i przechowuj je w temperaturze -20 lub -80 °C przez okres do jednego roku.
  3. Ostrożnie wypoleruj złotą elektrodę do lustrzanej powierzchni proszkiem 1, 0,3 i 0,05 μm Al2O3 na mikrościereczce przez 5 minut i poddaj ją sonikacji w ultraczystej wodzie przez 5 minut, aby usunąć resztki Al2O3. Następnie wyczyść elektrodę przez polerowanie elektrochemiczne z 35 kolejnymi skanami cyklicznej woltamperometrii (CV) od 0,4 do +1,2 V (w porównaniu z Hg-Hg2SO4) w 0,5 M H2SO4 przy 100 mV/s.
  4. Przygotować mieszaninę 0,5 μM HS-DBP-1 i 0,5 μM DBP-1-C-Fc w 100 μl 10 mM buforze fosforanowym zawierającym 1 M NaCl, pH 7,4 (PBS). Podgrzewać mieszaninę w cienkościennej probówce wirówkowej w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 10 minut i powoli schładzać mieszaninę do temperatury pokojowej.
  5. Dodać 1 μl chlorowodorku tris-(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP, 10 mM, roztwór podstawowy) do mieszaniny. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Zanurz czystą złotą elektrodę w powyższym roztworze na 12 godzin lub na noc w temperaturze pokojowej.
  7. Przepłukać elektrodę PBS i zanurzyć elektrodę w 1 mM [S(CH 2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-EG 6-OMe) w PBS na 1 godzinę. Dokładnie przepłukać elektrodę za pomocą buforu wiążącego PAE i zanurzyć elektrodę w buforze wiążącym PAE.
  8. Wykonaj skanowanie woltamperometrii fali prostokątnej w tle (SWV) w bezdocelowym buforze wiązania PAE.
    1. Wyczyść cały sprzęt eksperymentalny: ogniwa elektrolityczne, złotą elektrodę roboczą, platynową przeciwelektrodę i nasyconą kalomelową elektrodę referencyjną (SCE).
    2. Aktywuj zainstalowane oprogramowanie; ustaw parametry eksperymentalne dla pomiarów SWV.
      UWAGA: W doświadczeniach SWV zastosowano następujące parametry eksperymentalne: zakres potencjału: od -0,2 do 0,7 V; amplituda modulacji: 25 mV; szerokość impulsu: 5 ms; szybkość skanowania: 50 mV/s; potencjał krokowy: 1 mV.
    3. Podłącz złotą elektrodę roboczą, platynową przeciwelektrodę i SCE do potencjostatu i umieść te trzy elektrody w ogniwie elektrolitycznym zawierającym bufor wiążący PAE.
    4. Uruchom SWV measurement.
      UWAGA: Po rozpoczęciu pomiaru SWV na ekranie komputera zostanie wyświetlona krzywa SWV. Skanowanie jest powtarzane do momentu, gdy skany będą stałe i nie zaobserwuje się dalszych zmian wysokości lub kształtu piku.
  9. Zanurzyć elektrodę roboczą w buforze wiążącym PAE zawierającym określone stężenie DEHP (np. 10 pM) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Dokładnie przepłukać elektrodę za pomocą buforu wiążącego PAE i zanurzyć elektrodę w buforze wiążącym PAE wraz z przeciwelektrodą i SCE. Zebrać krzywą SWV w takich samych warunkach, jak opisano w sekcji 7.8.
  10. Powtórzyć krok 7.9, z tym wyjątkiem, że stężenie DEHP (np. 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM) było kolejno zwiększane. Wykreślić krzywą miareczkowania.
  11. Badania swoistości: Powtórzyć kroki 7.3–7.9, z tym wyjątkiem, że bufor wiążący PAE zawierający DEHP zastępuje się buforem wiążącym PAE zawierającym potencjalną substancję zakłócającą o pożądanym stężeniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy funkcjonalizowany grupą aminową ftalan dibutylu (DBP-NH2) jako główny cel (Rysunek 1F). Następnie przeprowadziliśmy selekcję aptamerów DNA PAE przy użyciu DBP-NH2 jako celu kotwiczącego i zgodnie z klasyczną metodą opartą na unieruchomieniu celu (Figura 2). W każdej rundzie przeprowadzono pilotażowy PCR przy użyciu zdenaturowanej PAGE w celu optymalizacji liczby cyklu PCR (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z wyjątkowych zalet aptamerów jest to, że są one identyfikowane za pomocą metody in vitro SELEX, podczas gdy przeciwciała są generowane w wyniku reakcji immunologicznych in vivo . W związku z tym aptamery mogą być wybierane z pożądaną swoistością docelową w dobrze zaprojektowanych warunkach eksperymentalnych, podczas gdy przeciwciała są ograniczone do warunków fizjologicznych.

Aby ułatwić oddzielenie sekwencji związanych od sekwencji swobodnych, ostatnio zgłoszono kilka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (21675112), kluczowego projektu planu nauki i technologii Pekińskiej Komisji Edukacyjnej (KZ201710028027) oraz Yanjing Young Scholar Program of Capital Normal University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UV-2550Shimadzu, protokół japońskisekcja 3.8.2
Termocykler DNA Engnine, PTC0200BIO-RADsekcja 3.5.1.2 i 3.5.2
C1000 TouchBIO-RADsekcja 5.3.6 i 6.3
Science, Claix, Francjasekcja 7.4,7.8 i 7.11
Sepharoza aktywowana żywicą epoksydową 6BGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)10220020koraliki argarozowe, sekcja 2.3 i 3.3
Dynabeads M-270 kulki magnetyczne z kwasem karboksylowymInvitrogen, USA420420kulki magnetyczne, sekcja 5.2. i 5.3
Premix Taq Hot Start VersionTakara, Dalian, ChinyR028A, sekcja 3.5.1.1
Membrana uszczelniająca PARAFILMBemis, USAPM-996sekcja 3.6.5
Lambda ExonucleaseInvitrogen, USAEN0561sekcja3.7.1.2.Bufor reakcyjny 10 × jest dostarczany wraz z egzonukleazą λ przez dostawcę.
Dr. GenTLE
Nośnik opadów		Takara, Dalian, Chiny9094sekcja 3.6.2 i 3.8.1
Zestaw do odzyskiwania DNA UNIQ-10 PAGESangon Biotech (Szanghaj) B511135sekcja 4.2
SYBR Złoty barwnik żelowy kwasu nukleinowegoInvitrogen, USA1811838barwnik barwiący kwasem nucelowym, sekcja 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq IITakara, Dalian, ChinyRR820Amieszanina polimerazy łącząca polimerazę i dNTP, sekcja 5.3.5
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2sekcja 5.2.1
Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)Invitrogen, USACAS: 25952-53-8sekcja 5.2.2
N-hydroksysukcynimid (NHS)Sigma-Aldrich6066-82-6sekcja 5.2.3
merkaptoheksanol (MCH)Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9sekcja 7.7
Złota elektrodaShanghai ChenhuaCHI101sekcja 7.4. - 7.11
chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9sekcja 7.5
O-(2-merkaptoetylo)-O'-metylo-hexa-(glikol etylenowy)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9sekcja 7.7
ftalan dietyloheksylu (DEHP)Narodowy Instytut Metrologii, ChinyCAS: 117-81-7sekcja 7.11
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5monolaurynian sorbaitanu polioksyetylenowego(20)
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1niejonowy środek powierzchniowo czynny
PBSSigma-AldrichP536810 mM bufor fosforanowy zawierające 1 M NaCl, pH 7,4
, Potencjostat wielokanałowy VMP3 Bio-Logic Polimeraza

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485(2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phthalic Acid EsterDNA Aptamer SelectionElectrochemical AptasensorGroup Specific BindingCompetitive AssayLambda ExonucleaseQuantitative PCRGold Electrode ModificationBis 2 Ethylhexyl PhthalateHydrophobic Small Molecules

Related Articles