Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Estry kwasu ftalowego (PAE) są jedną z głównych grup trwałych zanieczyszczeń organicznych. Wykrywanie PAE w zależności od grupy jest wysoce pożądane ze względu na szybki wzrost kongenerów. Aptamery DNA są coraz częściej stosowane jako elementy rozpoznające na platformach biosensorów, ale rzadko zgłasza się wybór aptamerów w kierunku wysoce hydrofobowych celów małocząsteczkowych, takich jak PAE. W pracy opisano metodę opartą na koralikach, zaprojektowaną w celu selekcji aptamerów DNA specyficznych dla grupy do PAE. Funkcjonalizowany grupą aminową ftalan dibutylu (DBP-NH2) jako cel kotwicy został zsyntetyzowany i unieruchomiony na kulkach agarozy aktywowanych epoksydowo, co umożliwiło wyświetlenie grupy estrów ftalowych na powierzchni matrycy immobilizacyjnej, a tym samym wybór spoiw specyficznych dla grupy. Określiliśmy stałe dysocjacji kandydatów na aptamery za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimeryzacji sprzężonej z separacją magnetyczną. Względne powinowactwo i selektywność aptamerów do innych PAE określono za pomocą testów konkurencyjnych, w których kandydaci na aptamery zostali wstępnie związani z kulkami magnetycznymi dołączonymi do DBP-NH2 i uwolnieni do supernatantu po inkubacji z badanymi PAE lub innymi potencjalnymi substancjami zakłócającymi. Test konkurencyjny został zastosowany, ponieważ zapewnił łatwe porównanie powinowactwa między PAE, które nie miały grup funkcyjnych do immobilizacji powierzchniowej. Na koniec zademonstrowaliśmy wytwarzanie elektrochemicznego czujnika aptasensora i wykorzystaliśmy go do ultraczułego i selektywnego wykrywania ftalanu bis(2-etyloheksylu). Protokół ten dostarcza informacji na temat odkrywania aptamerów innych małych cząsteczek hydrofobowych.
Wprowadzenie
Wraz z szybkim rozwojem gospodarczym, przyspieszeniem industrializacji i budownictwem miejskim, zanieczyszczenie środowiska jest większe niż kiedykolwiek. Typowe zanieczyszczenia środowiska obejmują jony metali ciężkich, toksyny, antybiotyki, pestycydy, substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego i trwałe zanieczyszczenia organiczne (TZO). Oprócz jonów metali i toksyn, inne zanieczyszczenia to małe cząsteczki, które dość często składają się z różnych kongenerów. Na przykład najbardziej toksyczne TZO obejmują polichlorowane bifenyle (PCB), wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polibromowane etery bifenylowe (PBDE), polichlorowane dibenzo-p-dio....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie i synteza bibliotek i podkładów
- Zaprojektuj początkową bibliotekę i podstawki.
Biblioteka (pula0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCACAC-3'
Starter do przodu (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
Fosforylowany podkład odwrotny (PO4-RP): 5'-PO 4-GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3' - Zsyntetyzuj pulę0, FP i PO4-RP przy użyciu standardowej chemii fosforoamidytu18,19,20, i oczyść wszystkie DNA za pomocą standardowej wysokosprawnej chromatografii cieczowej ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy funkcjonalizowany grupą aminową ftalan dibutylu (DBP-NH2) jako docelową kotwicę (Rysunek 1F). Następnie przeprowadziliśmy selekcję aptamerów DNA dla PAE, wykorzystując DBP-NH2 jako docelową kotwicę, zgodnie z klasyczną metodą opartą na immobilizacji celu (Rysunek 2). W każdej rundzie wykonywano pilotażową reakcję PCR z wykorzystaniem denaturującej elektroforezy w żelu po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jedną z wyjątkowych zalet aptamerów jest to, że są one identyfikowane za pomocą metody in vitro SELEX, podczas gdy przeciwciała są generowane w wyniku reakcji immunologicznych in vivo . W związku z tym aptamery mogą być wybierane z pożądaną swoistością docelową w dobrze zaprojektowanych warunkach eksperymentalnych, podczas gdy przeciwciała są ograniczone do warunków fizjologicznych.
Aby ułatwić oddzielenie sekwencji związanych od sekwencji swobodnych, ostatnio zgłoszono kilka.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (21675112), kluczowego projektu planu nauki i technologii Pekińskiej Komisji Edukacyjnej (KZ201710028027) oraz Yanjing Young Scholar Program of Capital Normal University.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| UV-2550 | Shimadzu, protokół japoński | sekcja 3.8.2 | |
| Termocykler DNA Engnine, PTC0200 | BIO-RAD | sekcja 3.5.1.2 i 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | sekcja 5.3.6 i 6.3 | |
| Science, Claix, Francja | sekcja 7.4,7.8 i 7.11 | ||
| Sepharoza aktywowana żywicą epoksydową 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | koraliki argarozowe, sekcja 2.3 i 3.3 |
| Dynabeads M-270 kulki magnetyczne z kwasem karboksylowym | Invitrogen, USA | 420420 | kulki magnetyczne, sekcja 5.2. i 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara, Dalian, Chiny | R028A | , sekcja 3.5.1.1 |
| Membrana uszczelniająca PARAFILM | Bemis, USA | PM-996 | sekcja 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | sekcja3.7.1.2.Bufor reakcyjny 10 × jest dostarczany wraz z egzonukleazą λ przez dostawcę. |
| Dr. GenTLE Nośnik opadów | Takara, Dalian, Chiny | 9094 | sekcja 3.6.2 i 3.8.1 |
| Zestaw do odzyskiwania DNA UNIQ-10 PAGE | Sangon Biotech (Szanghaj) B511135 | sekcja 4.2 | |
| SYBR Złoty barwnik żelowy kwasu nukleinowego | Invitrogen, USA | 1811838 | barwnik barwiący kwasem nucelowym, sekcja 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara, Dalian, Chiny | RR820A | mieszanina polimerazy łącząca polimerazę i dNTP, sekcja 5.3.5 |
| Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | sekcja 5.2.1 |
| Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | sekcja 5.2.2 |
| N-hydroksysukcynimid (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | sekcja 5.2.3 |
| merkaptoheksanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | sekcja 7.7 |
| Złota elektroda | Shanghai Chenhua | CHI101 | sekcja 7.4. - 7.11 |
| chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | sekcja 7.5 |
| O-(2-merkaptoetylo)-O'-metylo-hexa-(glikol etylenowy) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | sekcja 7.7 |
| ftalan dietyloheksylu (DEHP) | Narodowy Instytut Metrologii, Chiny | CAS: 117-81-7 | sekcja 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | monolaurynian sorbaitanu polioksyetylenowego(20) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | niejonowy środek powierzchniowo czynny |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM bufor fosforanowy zawierające 1 M NaCl, pH 7,4 |
Bibliografia
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
