Artykuł metodologiczny

Analiza wiązania cząstek DNA-magnetycznych za pomocą dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła

DOI:

10.3791/56815

⸱

9 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje syntezę cząstek magnetycznych i ocenę ich właściwości wiązania DNA za pomocą dynamicznego i elektroforetycznego rozpraszania światła. Metoda ta koncentruje się na monitorowaniu zmian wielkości cząstek, ich polidyspersyjności i potencjału zeta powierzchni cząstek, które odgrywają główną rolę w wiązaniu materiałów takich jak DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja DNA za pomocą cząstek magnetycznych to dziedzina o dużym znaczeniu w badaniach biotechnologii i biologii molekularnej. Protokół ten opisuje ocenę wiązania cząstek DNA-magnetycznych poprzez dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) i elektroforetyczne rozpraszanie światła (ELS). Analiza przeprowadzona przez DLS dostarcza cennych informacji na temat właściwości fizykochemicznych cząstek, w tym wielkości cząstek, polidyspersyjności i potencjału zeta. Ten ostatni opisuje ładunek powierzchniowy cząstki, który odgrywa główną rolę w elektrostatycznym wiązaniu materiałów, takich jak DNA. W tym miejscu w analizie porównawczej wykorzystano trzy modyfikacje chemiczne nanocząstek i mikrocząstek oraz ich wpływ na wiązanie i elucję DNA. Badane są modyfikacje chemiczne przez rozgałęzioną polietyleninaminę, ortokrzemian tetraetylu i (3-aminopropylo)trietoksysilan. Ponieważ DNA wykazuje ładunek ujemny, oczekuje się, że potencjał zeta powierzchni cząstki zmniejszy się po związaniu DNA. Tworzenie się skupisk powinno również wpływać na wielkość cząstek. W celu zbadania skuteczności tych cząstek w izolacji i elucji DNA, cząstki miesza się z DNA w środowisku o niskim pH (~ 6), wysokiej sile jonowej i odwodnieniu. Cząstki są myte na magnesie, a następnie DNA jest eluowane przez bufor Tris-HCl (pH = 8). Liczba kopii DNA jest szacowana za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Potencjał zeta, wielkość cząstek, polidyspersyjność i ilościowe dane PCR są oceniane i porównywane. DLS to wnikliwa i wspomagająca metoda analizy, która dodaje nową perspektywę do procesu badań przesiewowych cząstek w celu izolacji DNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja DNA jest jednym z najważniejszych etapów biologii molekularnej. Rozwój metod ekstrakcji kwasów nukleinowych ma ogromny wpływ na rozwijające się dziedziny genomiki, metagenomiki, epigenetyki i transkryptomiki. Istnieje szeroki zakres zastosowań biotechnologicznych do izolacji DNA, w tym zastosowania medyczne (narzędzia kryminalistyczne/diagnostyczne i biomarkery prognostycznych) oraz środowiskowe (bioróżnorodność metagenomiczna, rozpowszechnienie patogenów i nadzór). Rośnie zapotrzebowanie na oczyszczanie i izolowanie DNA z różnych materiałów i w różnych skalach, takich jak krew, mocz, gleba, drewno i inne rodzaje próbek. 1,2,3,4

Nano- i mikrocząsteczki nadają się do izolacji DNA ze względu na ich dużą powierzchnię, a zwłaszcza gdy mogą być unieruchomione przez pole magnetyczne. Właściwości fizykochemiczne cząstek, takie jak rozmiar lub ładunek, mogą w znacznym stopniu wpływać na ich zdolność do wiązania docelowych biomolekuł. 5 Aby jeszcze bardziej wzmocnić wiązanie biomolekuł i ustabilizować cząstki, można zastosować różne modyfikacje chemiczne (powłoki powierzchniowe). Wiele różnych strategii wiązania jest klasyfikowanych według oddziaływań kowalencyjnych i niekowalencyjnych. 6 Rozmiar cząstek bezpośrednio wpływa na ich właściwości magnetyzacyjne, podczas gdy skład cząstek może być dostosowany poprzez dodanie metalu, stopu lub innych materiałów, które mogą wpływać na jego gęstość, porowatość i powierzchnię. 7 Nie ma wiarygodnego sposobu na zmierzenie ładunku powierzchniowego małych cząstek. Zamiast tego można zmierzyć potencjał elektryczny w płaszczyźnie poślizgu (w pewnej odległości od powierzchni nanocząstek). 8 Ta wartość nazywana jest potencjałem zeta i jest to potężne narzędzie, które jest zwykle używane do oceny stabilności nano- i mikrocząstek za pomocą DLS. 9 Ponieważ jego wartość jest wysoce zależna nie tylko od pH i siły jonowej środowiska dyspersyjnego, ale także od charakterystyki powierzchni cząstek, może również udowodnić zmiany na tej powierzchni spowodowane oddziaływaniem między cząstkami a cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. 10

Z drugiej strony, struktura DNA w warunkach odwodnienia (forma A-DNA) wykazuje zwarte konformacje, które ułatwiają jego wytrącanie (agregację) w porównaniu do powszechnie występującej formy B-DNA. Elektrostatyka (wiązanie jonowe i H) są głównymi siłami kontrolującymi wiązanie DNA z innymi materiałami ze względu na ich sterycznie dostępne zasady fosforanowe i azotowe (zwłaszcza guaninę). 7,10

W tej pracy analizowane są trzy reprezentatywne modyfikacje chemiczne magnetycznych nanocząstek i mikrocząstek (Rysunek 1A). Opisano metodę syntezy i modyfikacji chemicznej nanocząstek i mikrocząstek. Roztwór wiążący, który jest zgodny z teoretycznymi zasadami wytrącania DNA (pH, siła jonowa i odwodnienie), służy do oceny wiązania i elucji DNA. Ilościowy PCR służy do oceny skuteczności elucji DNA z reprezentatywnych nanocząstek i mikrocząstek (Rysunek 1B). Wielkość cząstek, wskaźnik polidyspersyjności i potencjał zeta są ważnymi parametrami, które są wykorzystywane do wizualizacji zmian fizykochemicznych zachodzących na powierzchni cząstek (Rysunek 1C). Ważne jest, aby położyć nacisk na charakterystykę chemiczną powierzchni cząstek magnetycznych. Chociaż krok ten wykraczał poza zakres tego protokołu, do zbadania skuteczności modyfikacji chemicznych można zastosować kilka nowoczesnych technik. 11,12,13,14 Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) może być wykorzystana do oceny widma podczerwieni powierzchni cząstki i porównania go z widmem wolnych modyfikatorów chemicznych. Rentgenowska spektroskopia fotoelektronów (XPS) to kolejna technika, którą można wykorzystać do identyfikacji składu pierwiastkowego powierzchni materiału. Inne metody elektrochemiczne, mikroskopowe i spektroskopowe mogą być wykorzystane do rzucenia światła na jakość syntezy cząstek. Praca ta podkreśla nową perspektywę analizy interakcji DNA-cząstki magnetyczne za pomocą DLS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza nanocząstek magnetycznych

  1. Synteza nanocząstek magnetycznych stabilizowanych cytrynianem (MNP)
    1. Dodać 20 mmol FeCl3 ∙ 6H2O (5,406 g) i 10 mmol FeCl2 ∙ 4H2O (1,988 g) w 20 ml odtlenionej podwójnie destylowanej wody (woda ddd). Otrzymany roztwór energicznie mieszać w zlewce w atmosferze N2 za pomocą mieszadła mechanicznego, aż do uzyskania przezroczystego roztworu.
    2. Pod wpływem szybkiego mieszania mechanicznego dodać 150 ml 1 M NH4OH, kropla po kropli za pomocą zakraplacza (w razie potrzeby należy odczekać 1 godzinę lub dłużej). Przenieść roztwór do zamykanego naczynia po dodaniu całego NH4OH. Zakręcić naczynie i podgrzewać roztwór w temperaturze 75 °C przez 30 min.
      UWAGA: NH4OH jest klasyfikowany jako i niebezpieczny dla środowiska.
      UWAGA: Przygotuj roztwór NH4OH z wysokiej jakości 28% NH4OH w wodzie przy użyciu wody odtlenionej.
    3. Zbierz osad za pomocą magnesu i umyj go 100 ml wody ddd. Powtórz 3 razy. Dodać 50 ml 0,5 M dwuwodnego cytrynianu trójsodu, aby się wytrącić. Przykręć naczynie.
      UWAGA: Użyć odtlenionego roztworu dwuwodnego cytrynianu trójsodu.
    4. Ponownie rozproszyć osad za pomocą sonikacji (35 kHz, amplituda 100%) i ogrzewać naczynie w temperaturze 80 °C przez 1 h.
      UWAGA: Potrzebny jest sonikator o wystarczającej mocy.
    5. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Zebrać osad za pomocą magnesu i usunąć supernatant. Ponownie rozproszyć czarne błoto w 50 ml wody ddd za pomocą sonikatora (35 kHz, amplituda 100%).
    6. Przenieś podwielokrotności (~25 ml) do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i dodaj 20 ml acetonu. Wirować przy 2400 x g przez 10 minut i usunąć supernatanty.
    7. Ponownie rozproszyć osad i dializować roztwór z wodą za pomocą urządzenia do dializy o niskiej masie cząsteczkowej (500 - 1 000 Da) o odpowiedniej objętości na 24 godziny
      UWAGA: Urządzenie do dializy należy przygotować zgodnie z wymaganiami producenta.
  2. Synteza nanocząstek magnetycznych modyfikowanych rozgałęzioną polietyleniną (MNPs_PEI)
    1. Dodać 2 ml otrzymanego roztworu MNP (~0,1 g/ml) do szklanej zlewki. Dodać 38 ml wody ddd i poddać zawiesinę działaniu sonikacji (35 kHz, amplituda 100%) (10 min).
    2. Pod wpływem szybkiego mieszania mechanicznego dodać 10 ml 10% rozgałęzionej polietylenininy (średnio 25 kDa). Mieszaj roztwór przez kolejne 3 godziny.
    3. Zebrać osad za pomocą magnesu i usunąć supernatant. Ponownie rozproszyć osad w 20 ml wody ddd. Powtórz 5 razy, a następnie wykonaj sonifikację końcowej zawiesiny (35 kHz, amplituda 100%).
  3. Synteza cząstek nanocząstek magnetycznych modyfikowanych krzemionką (MNPs_TEOS)
    1. Dodać 10 ml otrzymanego roztworu MNP (~0,1 g/ml) do szklanej zlewki. Dodać 60 ml wody i 130 ml etanolu. Roztworu sonikować i dodać 6 ml 28% NH4OH.
    2. Pod wpływem szybkiego mieszania mechanicznego dodać 1 ml ortokrzemianu tetraetylu. Mieszaj roztwór przez kolejne 12 godzin.
    3. Zbierz osad za pomocą magnesu i umyj go 50 ml etanolu (3 razy) i 50 ml wody (3 razy). Ponownie zdyspergować cząstki w 10 ml wody ddd i poddać sonifikację zawiesiny (35 kHz, amplituda 100%).
  4. Synteza nanocząstek magnetycznych modyfikowanych grupami aminowymi (MNPs_APTES)
    1. Dodać 5 ml otrzymanego roztworu MNPs_TEOS (~0,1 g/ml) do szklanej zlewki. Dodaj 45 ml wody i 50 ml etanolu. Roztwór sonikacyjny (35 kHz, amplituda 100%).
    2. Pod wpływem szybkiego mieszania mechanicznego dodać 0,5 ml (3-aminopropylo)trietoksysilanu. Mieszaj roztwór przez kolejne 3 godziny.
    3. Zbierz osad za pomocą magnesu i umyj go 50 ml etanolu (3 razy) i 50 ml wody (3 razy). Ponownie zdyspergować cząstki w 5 ml wody ddd i poddać sonikację zawiesiny (35 kHz, amplituda 100%).

2. Synteza mikrocząstek magnetycznych

  1. Synteza mikrocząstek magnetycznych stabilizowanych cytrynianem (MMP)
    1. Do zakręcanego naczynia dodać 25 ml 2 M KNO3, 12,5 ml 1 M KOH i 205,875 ml wody ddd. Dodać 6,675 ml 1 M FeSO4 podczas mieszania magnetycznego. Natychmiast przenieść naczynie do podgrzanej łaźni wodnej (90 °C) przez 2 godziny
      UWAGA: Przygotuj roztwory KNO3 i KOH w wodzie ddd.
    2. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej. Zbierz osad za pomocą magnesu i umyj go 50 ml wody ddd (5 razy). Dodać 50 ml 0,5 M dwuwodnego cytrynianu trójsodu, aby się wytrącić. Przykręć naczynie.
    3. Ponownie rozproszyć osad za pomocą sonikacji (35 kHz, amplituda 100%) i ogrzewać naczynie w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę. Zebrać osad za pomocą magnesu i przemyć go za pomocą 50 ml wody ddd (10 razy).
    4. Zmodyfikuj MMP za pomocą rozgałęzionej polietylenininy (MMPs_PEI), krzemionki (MMPs_TEOS) i grup aminowych (MMPs_APTES) podobnie jak w protokole MNPs. Więcej informacji można znaleźć odpowiednio w sekcjach 2.2, 2.3 i 2.4.
  2. Synteza mikrocząstek magnetycznych modyfikowanych rozgałęzioną polietyleniną (MMPs_PEI)
    1. Dodać 5 ml roztworu MMP (~0,1 g/ml) do szklanej zlewki. Dodać 38 ml wody ddd i sonikować roztwór (35 kHz, amplituda 100%, 10 min). Pod wpływem szybkiego mieszania mechanicznego dodać 10 ml 10% rozgałęzionej polietylenininy (średnio 25 kDa). Mieszaj roztwór przez kolejne 3 godziny.
    2. Zebrać osad za pomocą magnesu i usunąć supernatant. Ponownie rozproszyć osad w 20 ml podwójnie destylowanej wody. Powtórz 5 razy, a następnie poddaj sonikacji końcowego roztworu (35 kHz, amplituda 100%).
  3. Synteza mikrocząstek magnetycznych modyfikowanych krzemionką (MMPs_TEOS)
    1. Dodać 5 ml roztworu MMP (~0,1 g/ml) do szklanej zlewki. Dodać 60 ml wody i 130 ml etanolu. Zawiesinę sonikacyjną (35 kHz, amplituda 100%) i dodać 6 ml 28% NH4OH.
    2. Pod wpływem szybkiego mieszania mechanicznego dodać 1 ml ortokrzemianu tetraetylu. Mieszaj roztwór przez kolejne 12 godzin.
    3. Zbierz osad za pomocą magnesu i umyj go 50 ml etanolu (3 razy) i 50 ml wody (3 razy). Ponownie rozproszyć cząstki w 5 ml wody ddd i poddać sonifikację zawiesiny (35 kHz, amplituda 100%).
  4. Synteza mikrocząstek magnetycznych modyfikowanych grupami aminowymi (MMPs_APTES)
    1. Dodaj 3 ml roztworu MMPs_TEOS (~0,1 g/ml) do szklanej zlewki. Dodaj 45 ml wody i 50 ml etanolu. Sonikować zawiesinę (35 kHz, amplituda 100%).
    2. Pod szybkim mieszaniem mechanicznym dodać 0,5 ml (3-aminopropylo)trietoksysilanu. Mieszaj roztwór przez kolejne 3 godziny.
    3. Zbierz osad za pomocą magnesu i umyj go 50 ml etanolu (3 razy) i 50 ml wody (3 razy). Ponownie zdyspergować cząstki w 3 ml wody ddd i poddać sonifikację zawiesiny (35 kHz, amplituda 100%).

3. Analiza wielkości cząstek magnetycznych za pomocą DLS

  1. Wielkość cząstek w wodzie
    1. Użyj instrumentu DLS, który stosuje kąt detektora rozpraszania wstecznego (173°) i długość fali wiązki 633 nm.
      UWAGA: Rozpraszanie wsteczne DLS jest odpowiednie dla skoncentrowanych próbek, w których można uniknąć wielokrotnego rozpraszania. Rozpraszanie boczne (kąt detektora 90°) i rozpraszanie do przodu (kąt detektora 15°) DLS są odpowiednie odpowiednio dla mniejszych cząstek i cząstek mieszanych.
    2. Przed pomiarem w wodzie należy poddać sonikację cząstek przez 3 min.
      UWAGA: Użyj rozcieńczonego roztworu cząstek. W tym celu należy wymieszać 9,6 μl cząstek z 96 μl wody.
    3. Ostrożnie odpipetować 50 μl roztworu cząstek do kuwet lateksowych z polistyrenu i unikać tworzenia się pęcherzyków.
      UWAGA: Do każdej próbki użyj jednorazowej kuwety (patrz tabela materiałów).
    4. Zwróć uwagę na przejrzystość kuwety i kierunek wiązki światła. Włożyć kuwetę do uchwytu na próbkę i zamknąć komorę.
    5. Do pomiaru należy użyć następujących parametrów: temperatura: 25 °C; współczynnik załamania światła fazy dyspersyjnej (żelazo): 2,344; współczynnik załamania światła środowiska dyspersyjnego (woda): 1,333
      UWAGA: Pomiar współczynnika załamania światła należy wykonać za pomocą refraktometru, aby uzyskać dokładniejsze wyniki, szczególnie w przypadku opracowywania materiałów nowatorskich lub hybrydowych.

4. Przygotowanie materiału DNA, cząstek magnetycznych i buforu wiążącego

  1. Zapas DNA
    1. Użyj 10 mM buforu Tris-HCL (pH = 8) do rozcieńczenia i przechowywania DNA. Należy użyć standardowej próbki DNA, którą można amplifikować za pomocą protokołu bezpośredniego PCR w laboratorium (patrz sekcja 5.2, aby zapoznać się z ustawieniami i warunkami reakcji). Aby amplifikować 498 par zasad (bp) genu xis z kontroli bakteriofaga λ, użyj następujących starterów. Starter do przodu: 5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3'; Podkład odwrotny: 5'-TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC-3'
    2. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA.
      UWAGA: Zestawy komercyjne wykorzystujące procedurę opartą na kolumnie krzemionkowej dają > 100 ng/μl oczyszczonego DNA.
    3. Zmierzyć stężenie DNA metodą spektrofotometryczną (absorbancja przy 260 nm). Rozcieńczyć zapas DNA 1011 kopii/μl zgodnie z powyższymi instrukcjami do roztworów roboczych 1010, 109, 108 i 107 kopii/μL.
      UWAGA: Liczbę kopii produktu PCR można obliczyć zgodnie z następującym równaniem, zakładając, że średnia masa cząsteczkowa wynosi 650 Da dla każdego bp:
      Kopie DNA/μL = (ilość w ng/μL * 6,022x1023 kopii/mol) / (498 pz * 650 g/mol pz * 1x109 ng/g)
  2. Cząstki magnetyczne
    1. Pozwól cząstkom osiadać bez magnesu i usuń supernatant. Mieszaj 1: 20 v/v stosunek cząstek magnetycznych z wodą ddd (cząstki: woda).
      UWAGA: Podejście objętościowe jest używane do opisu ilości cząstek magnetycznych, ponieważ równe masy MNP i MMP były trudne do porównania.
  3. Bufor powiązania
    1. W celu szybkiego przygotowania 0,75 M roztworu octanu sodu-HCL (pH = 6), należy zmieszać 1 ml 3 M octanu sodu z 3 ml 1 mM HCL.
      UWAGA: Wszystkie roztwory używane do wiązania mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że niska temperatura znacznie zwiększa wiązanie, szczególnie w przypadku roztworu etanolu. Dokładnie kontroluj temperaturę roztworów, aby uzyskać lepszą odtwarzalność i dokładność przesiewania.

5. Testowanie skuteczności izolacji DNA za pomocą ilościowego PCR

  1. Izolacja DNA za pomocą zmodyfikowanych MMP lub MNP
    1. Użyj płytki 96-dołkowej i magnesu dostosowanego do płytki 96-dołkowej do eksperymentów o małej objętości.
    2. Użyj następującej mieszaniny roztworu wiążącego: 8 μl modyfikowanych MMP lub MNP, 10 μl octanu sodu-HCl (0,75 M, pH = 6), 60 μl 85% etanolu, 10 μL DNA (1010 kopii roztworu).
    3. Dobrze wymieszać pipetując i umieścić płytkę na magnesie na 3 minuty. Gdy płytka znajduje się na magnesie, usuń roztwór i dodaj 100 μl 85% etanolu do mycia.
    4. Usuń etanol.
      UWAGA: Pozostaw etanol do wyschnięcia na kilka sekund, ale nie pozwól, aby cząstki przeschły lub pokazały pęknięcia. Jeśli cząstki nadmiernie wyschną, trudno będzie je rozpuścić w roztworze elucyjnym.
    5. Zdjąć płytkę z magnesu i dodać 40 μl roztworu elucyjnego. Dobrze wymieszać przez pipetowanie. Umieść płytkę z powrotem na magnesie i zbierz wymyte DNA (~37 μL). Przechowywać eluent w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.
  2. Ilościowy PCR
    1. Użyj starterów, które zostały użyte do przygotowania podstawowego DNA w kroku 4.1.1, aby określić ilościowo kopie genu xis, zgodnie z protokołem Haddada i wsp. 10
    2. Przygotować roztwór mieszanki wzorcowej zgodnie z ilością próbek do badania, a następnie rozprowadzić mieszaninę do probówek PCR lub 96-dołkowej płytki z białym tłem.
    3. Na pełną objętość mieszaniny 20 μl PCR należy użyć następujących ilości: 10 μl mieszaniny polimerazy / barwnika interkalacyjnego (patrz tabela materiałów), 2 μl próbki DNA, 2 μl startera do przodu (10 μM), 2 μl startera odwrotnego (10 μM)
    4. Ustaw termocykler zgodnie z następującym programem: 95 °C przez 120 s, 40 cykli (95 °C przez 15 s, 64 °C przez 15 s, 68 °C przez 45 s), 68 °C przez 5 s.
    5. Używając trzech egzemplarzy dla wzorców i próbek, oblicz próg cyklu i skonstruuj krzywą standardową, aby oszacować liczbę kopii DNA pobranych w każdej próbce. Użyty tutaj instrument wykonuje to automatycznie.
    6. Tutaj liczbę kopii DNA szacuje się dla całkowitej objętości elucji (~40 μL). Procent pobranego DNA odpowiadający oryginalnej ilości dodanej do roztworu wiążącego (łącznie 1011 kopii) może różnić się poza przedział od 0 do 100.

6. Analiza wiązania cząstek DNA-magnetycznych za pomocą DLS

  1. Wiązanie DNA
    1. W przypadku eksperymentów o dużej objętości (w probówce o pojemności 1,5 ml) należy użyć następującej mieszaniny roztworu wiążącego: 96 μl modyfikowanych MMP lub MNP, 120 μl octanu sodu-HCl (0,75 M, pH = 6), 720 μl 85% etanolu, 120 μl DNA (1010 kopii roztworu) lub 120 μl buforu Tris-HCL (10 mM, pH = 8) do kontroli.
  2. Analiza potencjału Zeta
    1. Przygotować dwa roztwory wiążące, jeden z DNA, a drugi z buforem Tris-HCL do kontroli, zgodnie z instrukcjami w kroku 6.1.1. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ostrożnie odpipetować 800 μl mieszaniny wiążącej do jednorazowego pojemnika.
      UWAGA: Użyj jednorazowej kuwety do pomiaru powierzchniowego potencjału zeta (patrz tabela materiałów).
  3. Do pomiaru na przyrządzie DLS należy użyć następujących parametrów: model Smoluchowskiego o F(ka) 1,5, temperatura: 25 °C, współczynnik załamania światła fazy dyspersyjnej (żelazo): 2,344, współczynnik załamania światła środowiska dyspersyjnego (woda): 1,333,
    UWAGA: Szybkość oddziaływania DNA-cząstka magnetyczna ma bezpośredni wpływ na pomiar kontrprób. Pojedynczy pomiar za pomocą przyrządu trwa 60-70 s. W tym przypadku instrument został poinstruowany, aby wykonać 10 pomiarów z 1-minutowymi odstępami czasu. Dla uproszczenia wyniki zostaną pokazane w czasie = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 i 18 minut od pierwszego odczytu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego tutaj protokołu do chemicznej syntezy i modyfikacji cząstek magnetycznych, zsyntetyzowano sześć cząstek magnetycznych i przeanalizowano je pod kątem wiązania DNA. Podsumowanie analizy przedstawiono w tabeli 1. Porównując wielkość cząstek w wodzie i w roztworze wiążącym, jasne jest, że wszystkie cząstki zagregowane w roztworze wiążącym są od 2 do 22 razy. Niektóre cząstki dalej agregowały się w więcej fałd w obecności DNA; jednak nie było to bezpośr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole zakwestionowano teoretyczne zasady, które wyjaśniają wiązanie DNA z cząstkami magnetycznymi poprzez potencjał zeta. Protokół opisuje syntezę i modyfikację nanocząstek magnetycznych i mikrocząstek. Opisano również sposób przygotowania roztworu kontrolnego i wiążącego DNA. Przedstawiono tutaj dwie strategie badań przesiewowych interakcji DNA-cząstki: ilościowe podejścia PCR i DLS. DLS podaje trzy wskaźniki zmian fizykochemicznych w cząstkach: wielkość cząstek, wskaźnik polidyspersyjności i potencjał zeta. Z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe ze strony Czeskiej Fundacji Naukowej (projekt GA CR 17-12816S) i CEITEC 2020 (LQ1601) jest bardzo doceniane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek żelaza(III) sześciowodnySigma-Aldrich207926Synteza cząstek magnetycznych
Czterowodny chlorek żelaza(II)Sigma-Aldrich380024Synteza cząstek magnetycznych
Siarczan żelaza(II) siedmiowodnySigma-AldrichF8263Synteza cząstek magnetycznych
AcetonPenta10060-11000Synteza cząstek magnetycznych
Cytrynian sodu dwuwodnySigma-AldrichW302600Synteza cząstek magnetycznych
Ortokrzemian tetraetyluSigma-Aldrich131903Synteza cząstek magnetycznych
(3-aminopropylo)trietoksysilanSigma-Aldrich440140Synteza cząstek magnetycznych
Polietyleninamina, rozgałęziona, średnia Mw ~25 000408727 Sigma-AldrichaSynteza cząstek magnetycznych
Roztwór wodorotlenku amonuSigma-Aldrich221228-M Synteza cząstek magnetycznych
EtanolPenta71250-11000Magnetyczna synteza cząstek
Azotan potasuSigma-AldrichP6083Magnetyczna synteza cząstek
Wodorotlenek potasuSigma-Aldrich1.05012Synteza cząstek magnetycznych
ow-molekularna membrana odcięta (Mw=1 kDa)Spectrum labsG235063Synteza
cząstek magnetycznychMieszadło górnewiteg Labortechnik GmbHDH. WOS01035Synteza cząstek magnetycznych
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998Synteza cząstek magnetycznych
SonicatorBandelin795Synteza cząstek magnetycznych
Kuweta UV MARKI microSigma-AldrichBR759200-100EAKuweta do pomiaru rozmiaru
Nasadka MARKI do kuwety UV microSigma-AldrichBR759240-100EANasadki kuwetowe do pomiaru rozmiaru
Składana kapilarna komórka ZetaMalvernDTS1070Kuweta do pomiaru potencjału zeta
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600Urządzenie do pomiaru wielkości i potencjału zeta
Infinite 200 PRO
Przyrząd NanoQuant		Tecan396 227 V1.0, 04-2010pomiaru stężenia DNA
SYBR Zielony ilościowy zestaw RT-PCRSigma-AldrichQR0100Zestaw do PCR
Mastercycler pro S instrumentEppendorf6325 000.013Zestaw termocyklera
MinEluteZestaw do oczyszczania DNAQiagen28004
Octan soduWiązanie DNASigma-AldrichS7670
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamic Light ScatteringZeta Potential AnalysisParticle Size MeasurementPolydispersity IndexDNA Isolation ProtocolMagnetic Particle SeparationQuantitative PCR AnalysisNanoparticle Surface Modification

Powiązane artykuły