Method Article

Stworzenie strukturalnie realistycznego modelu geometrycznego kardiomiocytów metodą elementów skończonych w celu zbadania roli architektury komórkowej w biologii układów kardiomiocytów

DOI:

10.3791/56817

⸱

April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia nowatorską metodę tworzenia przestrzennie szczegółowego modelu elementów skończonych wewnątrzkomórkowej architektury kardiomiocytów na podstawie obrazów z mikroskopii elektronowej i mikroskopii konfokalnej. Moc tego szczegółowego przestrzennie modelu została zademonstrowana na podstawie studiów przypadków z zakresu sygnalizacji wapniowej i bioenergetyki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się technologii obrazowania trójwymiarowego (3D), takich jak tomografia elektronowa, skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem szeregowym i mikroskopia konfokalna, społeczność naukowa ma bezprecedensowy dostęp do dużych zbiorów danych o rozdzielczości submikrometrowej, które charakteryzują przebudowę architektoniczną, która towarzyszy zmianom w funkcjonowaniu kardiomiocytów w zdrowiu i chorobie. Jednak te zestawy danych były niedostatecznie wykorzystywane do badania roli przebudowy architektury komórkowej w funkcji kardiomiocytów. Celem tego protokołu jest nakreślenie, w jaki sposób stworzyć dokładny model elementów skończonych kardiomiocytu przy użyciu obrazów z mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości i mikroskopii konfokalnej. Szczegółowy i dokładny model architektury komórkowej ma znaczny potencjał, aby dostarczyć nowych informacji na temat biologii kardiomiocytów, więcej niż mogą zebrać same eksperymenty. Siła tej metody polega na jej zdolności do obliczeniowego łączenia informacji z dwóch różnych modalności obrazowania ultrastruktury kardiomiocytów w celu opracowania jednego ujednoliconego i szczegółowego modelu kardiomiocytu. Protokół ten określa kroki mające na celu integrację obrazów tomografii elektronowej i mikroskopii konfokalnej dorosłych kardiomiocytów szczurów rasy Wistar (nazwa określonej rasy szczura albinosa) w celu opracowania półsarkomerowego modelu elementów skończonych kardiomiocytów. Procedura generuje model 3D elementów skończonych, który zawiera dokładny, wysokiej rozdzielczości obraz (rzędu ~35 nm) rozmieszczenia mitochondriów, miofibryli i klastrów receptorów ryanodyny, które uwalniają wapń niezbędny do skurczu kardiomiocytów z sarkoplazmatycznej sieci siatkowatej (SR) do przedziału miofibrylowego i cytozolowego. Model wygenerowany tutaj jako ilustracja nie zawiera szczegółów architektury kanalików poprzecznych ani sarkoplazmatycznej sieci siatkowatej, a zatem jest minimalnym modelem kardiomiocytów. Niemniej jednak model ten może być już stosowany w badaniach symulacyjnych nad rolą struktury komórki w sygnalizacji wapniowej i bioenergetyce mitochondriów, co zostało zilustrowane i omówione za pomocą dwóch studiów przypadku, które przedstawiono zgodnie ze szczegółowym protokołem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprzężenie pobudzenia-skurczu (ECC) w sercu odnosi się do ważnego i skomplikowanego sprzężenia między elektrycznym wzbudzeniem błony kardiomiocytów a późniejszym mechanicznym skurczem komórki podczas każdego uderzenia serca. Modele matematyczne odegrały kluczową rolę w rozwoju ilościowego zrozumienia powiązanych ze sobą procesów biochemicznych, które regulują potencjał czynnościowy1, cytozolowa sygnalizacja wapniowa2, bioenergetics3, a następnie generowanie siły skurczowej. Takie modele z powodzeniem przewidziały również zmiany w biciu serca, gdy jeden lub kilka z tych procesów biochemicznych ulega zmianom4,5. Coraz częściej uznaje się, że wysoce zorganizowana ultrastruktura kardiomiocytów odgrywa kluczową rolę w prawidłowej funkcji skurczowej komórki i całego serca. Rzeczywiście, zmiany w morfologii i organizacji składników ultrastruktury serca zachodzą równolegle ze zmianami biochemicznymi w stanach chorobowych, takich jak hipertrofia6, niewydolność serca7 i kardiomiopatia cukrzycowa8. Nadal w dużej mierze nie wiadomo, czy te zmiany strukturalne są niewielkimi, adaptacyjnymi czy patologicznymi reakcjami na zmieniające się warunki biochemiczne9. Z natury ścisłe sprzężenie między formą a funkcją w biologii oznacza, że same badania eksperymentalne nie mogą dostarczyć głębszych spostrzeżeń niż korelacje między przebudową strukturalną a funkcją kardiomiocytów. Nowa generacja modeli matematycznych, które mogą obejmować strukturalny montaż komponentów subkomórkowych, wraz z dobrze zbadanymi procesami biochemicznymi, jest niezbędna do opracowania kompleksowego, ilościowego zrozumienia związku między strukturą, biochemią i siłą skurczu w kardiomiocytach. Protokół ten opisuje metody, które można wykorzystać do generowania strukturalnie dokładnych modeli elementów skończonych kardiomiocytów, które można wykorzystać do takich badań.

Ostatnia dekada przyniosła znaczące postępy w mikroskopii elektronowej 3D10, confocal11, oraz mikroskopii superrozdzielczej12, które dostarczają bezprecedensowych, wysokorozdzielczych wglądów w nano- i mikroskalowe składanie subkomórkowych składników kardiomiocytu. Ostatnio te zestawy danych zostały wykorzystane do generowania modeli obliczeniowych ultrastruktury kardiomiocytów13,14,15,16. Modele te wykorzystują dobrze znaną metodę symulacji inżynierskiej, zwaną metodą elementów skończonych17, do tworzenia siatek obliczeniowych elementów skończonych, na których można symulować procesy biochemiczne i skurcze kardiomiocytów. Modele te są jednak ograniczone rozdzielczością i szczegółowością, jaką może zapewnić metoda mikroskopowa w zestawie danych obrazu. Na przykład mikroskopia elektronowa może generować szczegóły struktury komórki na poziomie nanometrów, ale trudno jest zidentyfikować konkretne białka na obrazie, które byłyby niezbędne do stworzenia modelu. Z drugiej strony, mikroskopia optyczna o wysokiej rozdzielczości może zapewnić obrazy o wysokim kontraście w rozdzielczościach rzędu 50 nm tylko kilku wybranych składników molekularnych komórki. Tylko poprzez integrację uzupełniających informacji z tych metod obrazowania można realistycznie zbadać wrażliwość funkcji na zmiany w strukturze. Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa nadal nie jest rutynową procedurą i nadal miałaby ograniczenie, polegające na tym, że tylko ograniczona liczba składników może być barwiona w widoku immunofluorescencyjnym i korelowana z obrazem mikroskopii elektronowej.

Ten protokół prezentuje nowatorskie podejście18, które wykorzystuje metody statystyczne19 do analizy i obliczeniowego łączenia informacji z mikroskopii świetlnej na temat przestrzennego rozkładu kanałów jonowych z informacjami z mikroskopii elektronowej na temat innych elementów ultrastruktury serca, takich jak miofibryle i mitochondria. W ten sposób powstaje model elementów skończonych, który może być używany z biofizycznymi modelami procesów biochemicznych do badania roli organizacji subkomórkowej kardiomiocytów w procesach biochemicznych regulujących skurcz kardiomiocytów. Na przykład, protokół ten może być wykorzystany do tworzenia modeli ze zdrowych i indukowanych streptozotocyną cukrzycowych miocytów serca w celu zbadania wpływu przebudowy strukturalnej na funkcję komórek serca, która jest obserwowana w modelach zwierzęcych z cukrzycą8. Dodatkową zaletą wynikającą ze statystycznego charakteru prezentowanej metody jest również zilustrowany w protokole: metoda może generować wiele instancji geometrii elementów skończonych, które ściśle naśladują obserwowane eksperymentalnie zmiany w strukturze komórki.

Jako przegląd, kroki protokołu obejmują: (i) przygotowanie tkanki serca do mikroskopii elektronowej w celu generowania obrazów 3D o wystarczającej rozdzielczości i kontraście; (ii) rekonstrukcja i segmentacja stosów obrazów 3D na podstawie danych z mikroskopii elektronowej przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji i analizy obrazu mikroskopii elektronowej 3D o nazwie IMOD20; (iii) użycie iso2mesh21 w celu wygenerowania siatki elementów skończonych przy użyciu danych segmentowanych jako danych wejściowych; (iv) wykorzystanie nowatorskiego algorytmu i kodów do odwzorowania rozkładu kanałów jonowych na siatce elementów skończonych.

Założenie podejścia do każdego kroku jest przedstawione w protokole, a reprezentatywne wyniki są przedstawione na załączonych rysunkach. Przedstawiono przegląd określający, w jaki sposób wygenerowane modele przestrzenne mogą być wykorzystane do badania dynamiki przestrzennej wapnia podczas ECC, a także bioenergetyki mitochondrialnej. Omówiono niektóre z obecnych ograniczeń protokołu, a także nowe osiągnięcia, które są w toku, aby je przezwyciężyć i jeszcze bardziej pogłębić ilościowe zrozumienie roli struktury komórki w biologii układów sercowych. Omówiono również, w jaki sposób można uogólnić te metody w celu tworzenia modeli elementów skończonych innych typów komórek.

Użytkownicy tego protokołu mogą pominąć krok 1 i część rekonstrukcji kroku 2, jeśli mają dostęp do istniejącego wcześniej stosu obrazów z mikroskopii elektronowej. Użytkownicy, którzy zamierzają pozyskać swoje dane we współpracy z bardziej doświadczonymi mikroskopistami elektronowymi, mogą chcieć omówić i porównać procedury utrwalania i barwienia w kroku 1 z ekspertem w celu określenia optymalnego protokołu akwizycji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Auckland oraz Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego, gdzie pierwotnie opracowano protokół tkankowy.

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotować roztwory podstawowe 0,15 M i 0,3 M kakodylanu sodu o pH 7,4 zgodnie z tabelą 1.
  2. Przygotować utrwalacz aldehydu glutarowego (2% paraformaldehydu (PFA) + 2,5% aldehydu glutarowego + 0,2% kwasu garbnikowego w 0,15 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4) przy użyciu składników wymienionych w Tabeli 1.
    1. Rozpuścić 2 g proszku PFA w 20 ml wody destylowanej o temperaturze 60 °C na płycie grzejnej, ciągle mieszając.
    2. Dodawać 1 M roztwór NaOH, aż roztwór będzie klarowny.
    3. Poczekaj, aż temperatura roztworu spadnie poniżej 40 °C, a następnie dodaj 10 ml aldehydu glutarowego i 20 ml 0,3 M kakodylanu sodu.
    4. Dodać 0,2 g kwasu garbnikowego i rozpuść go w roztworze.
    5. Dodać 50 ml 0,15 M kakodylanu sodu.
    6. Przechowywać trzy lub cztery fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 ml z utrwalaczem w lodówce w temperaturze 4 °C lub na lodzie, jeśli są używane tego samego dnia.
  3. Przygotować roztwór Tyrode'a z 20 mM monoksymu 2,3-butanodionu (BDM), zgodnie z przepisem w tabeli 1.
  4. Zbuduj aparat Langendorffa w dygestorium.
    1. Zamocuj dwie plastikowe probówki strzykawkowe o pojemności 100 ml do dwóch różnych stojaków retortowych, na wysokości około 70 cm od podstawy stojaka.
    2. Połącz plastikowe rurki strzykawki i rurkę łączącą za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej 3 mm i trójdrożnego kranu, jak pokazano na Rysunek 1.
    3. Zamontuj kaniulę o średnicy zewnętrznej 3 mm do dolnej części rurki łączącej, gdzie serce zostanie przywiązane w celu utrwalenia perfuzji.
  5. Napełnić probówki strzykawki roztworem Tyrode'a i roztworami utrwalającymi w temperaturze 37 °C.
    1. Usunąć pęcherzyki powietrza z rurki, przepuszczając przez nie roztwory strzykawki.

2. Pozyskiwanie danych z mikroskopii elektronowej ultrastruktury kardiomiocytów

  1. Przygotuj zwierzę do wycięcia i chemicznego unieruchomienia serca.
    UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje etapy przetwarzania tkanki serca dorosłego samca szczura Wistar (nazwa określonej rasy szczura albinosa). Protokół może wymagać modyfikacji, gdy tkanka serca pochodzi od innych gatunków.
    1. Znieczulić zwierzę, traktując szczura (200-250 g masy ciała) 0,5 ml heparyny o stężeniu 250 U/ml we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Odczekaj 10 minut, a następnie potraktuj szczura wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu (210 mg/kg masy ciała).
    2. Potwierdź odpowiedni stopień znieczulenia, testując odruch szczypania palca u nogi.
    3. Poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
    4. Zbierz serce, stosując procedury preparacyjne podobne do wcześniej opublikowanych artykułów JoVE22,23, a następnie umieść je w lodowatej soli fizjologicznej.
    5. Odizoluj aortę wstępującą i kaniulować. Upewnij się, że końcówka kaniuli znajduje się tuż nad zastawką półksiężycowatą, gdzie rozgałęziają się tętnice wieńcowe. Zawiąż mocno nić wokół wznoszącej się aorty.
    6. Podłącz kaniulę do grawitacyjnie sterowanego aparatu Langendorffa, działającego na wysokości ~70 cm nad podstawą systemu (Rysunek 1).
    7. Przekręć kran w systemie Langendorffa, aby perfuzjować serce roztworem Tyrode'a, w tym 20 mM BDM (inhibitorem miozyny) przez 2-3 minuty.
    8. Przekręcić kurek, aby rozpocząć perfuzję z utrwalaczem 2% paraformaldehydu, 2,5% aldehydu glutarowego i 0,2% kwasu garbnikowego w 0,15 M kakodylanu sodu w temperaturze 37 °C przez 10 min. Jeśli się powiedzie, serce zmieni kolor na bladobrązowy i stanie się sztywne i gumowate.
    9. Za pomocą żyletki wypreparuj bloki tkanek z lewej (bocznej) wolnej ściany komory i uzyskaj bloki tkanek o wielkości około 1 mm3.
    10. Próbki należy przechowywać we wstępnie schłodzonych fiolkach scyntylacyjnych o pojemności 20 ml tego samego utrwalacza na lodzie przez 2 godziny. Przechowywać jak najwięcej próbek w fiolkach i upewnić się, że próbki są zanurzone w roztworze.
      UWAGA: Ważne jest, aby próbki były zimne do czasu zakończenia poniższego etapu 100% odwodnienia.
  2. Dalsze utrwalanie i barwienie próbek do mikroskopii elektronowej.
    1. Wlać 100 ml 0,15 M buforu kakodylanu sodu do szklanej zlewki i ostudzić na lodzie.
    2. Przygotować równe objętości 4% tetratlenku osmu i 0,3 M kakodylanu sodu, a następnie dodać 0,08 g żelazocyjanku potasu w celu uzyskania roztworu barwienia metali ciężkich zawierającego 2% żelazocyjanku potasu w 2% tetratlenku osmu i 0,15 M kakodylanu sodu. Ostudzić roztwór na lodzie.
    3. Odpipetować utrwalacz i zastąpić go wystarczającą ilością zimnego buforu kakodylanu sodu o wielkości 0,15 M, aby zanurzyć próbki w fiolkach. Umieść fiolki na lodzie na 5 minut.
    4. Powtórzyć krok 2.2.3 jeszcze cztery razy z 0,15 M kakodylanem sodu, aby usunąć nadmiar utrwalacza.
      UWAGA: Nie używaj szklanych pipet, ponieważ małe odłamki mogą dostać się do próbki i mogą uszkodzić noże diamentowe podczas cięcia bloków tkankowych. Ważne jest, aby wstępnie schłodzić wszystkie roztwory na lodzie przed dodaniem ich do próbki. Ważne jest również, aby próbka pozostawała pokryta roztworem przez cały czas (bardzo krótkie okresy częściowego pokrycia trwające nie dłużej niż kilka sekund mogą być krótko tolerowane podczas wymiany roztworu). Podczas mycia lub wymiany roztworów należy szybko dodać nowy roztwór po usunięciu poprzedniego roztworu. Przechowywać fiolki scyntylacyjne na lodzie między myciami. Należy pamiętać, że ten krok nie jest wrażliwy na czas, w razie potrzeby bloki tkanek można myć nieco dłużej.
    5. Zastąp bufor kakodylanu sodu lodowatym roztworem plamy z metali ciężkich i przechowuj go na lodzie przez noc. Upewnić się, że żelazocyjanek jest dobrze wymieszany, potrząsając fiolką ręcznie; Roztwór powinien zmienić kolor na.
      UWAGA: Podczas wykonywania tego kroku należy pracować w dygestorium, ponieważ osm jest toksyczny.
    6. Rozcieńczyć 4% wodny roztwór podstawowy octanu uranylu (UA) (Tabela 1) do 2%, używając równych objętości roztworu podstawowego UA i podwójnie destylowanej wody i schłodzić na lodzie.
    7. Zastąp barwnik z metali ciężkich chłodzonym lodem buforem kakodylanu sodu o stężeniu 0,15 M i pozwól próbce inkubować się przez 5 minut na lodzie.
    8. Powtórz krok 2.2.7 jeszcze cztery razy na lodzie, aby spłukać nadmiar roztworu plam z metali ciężkich.
    9. Przepłukać próbki cztery razy, zachowując 2-minutowy odstęp między nimi w oczyszczonej wodzie (wystarczy podwójnie destylowana).
    10. Zastąp oczyszczoną wodę lodowatym 2% UA i pozwól próbce inkubować się przez 60-120 minut na lodzie.
    11. Schłodzić pięć 20 ml fiolek scyntylacyjnych etanolu (wystarczających do zanurzenia próbek) na lodzie, który zostanie użyty na etapie odwadniania. Sześć fiolek ma rosnący procent etanolu w wodzie destylowanej: 20%, 50%, 70%, 90% i 100%.
    12. Wlać czysty aceton do kolejnej 20 ml fiolki scyntylacyjnej i ostudzić na lodzie razem z fiolkami etanolu.
    13. Próbki należy czterokrotnie przepłukać w oczyszczonej wodzie z 2-minutowymi okresami oczekiwania na lodzie w celu zmycia nadmiaru UA.
  3. Odwodnić próbki w etanolu.
    1. Odwodnić w zimnym etanolu seryjnie, kolejno zastępując roztwór w fiolce z próbką w następujący sposób, na lodzie: 20% etanolu przez 10 minut, 50% etanolu przez 10 minut, 70% etanolu przez 10 minut, 90% etanolu przez 10 minut, a następnie dwukrotnie w 100% etanolu przez 10 minut.
    2. Przenieś próbkę do temperatury pokojowej, zastępując końcowy 100% etanol schłodzonym czystym acetonem i umieść fiolkę z próbką na stole laboratoryjnym o temperaturze pokojowej na 10 minut.
    3. Wykonaj jeszcze jedno 10-minutowe płukanie w czystym acetonie w temperaturze pokojowej, aby usunąć kondensację, która jest widoczna w fiolkach. Podczas inkubacji uzupełnić roztwory acetonu/żywicy.
    4. Zastąp czysty aceton w fiolkach czystym acetonem i żywicą epoksydową w proporcjach 50:50 (w proporcjach dla składników żywicy epoksydowej zgodnie z zaleceniami producenta). Użyj wszystkich składników z tej samej partii. Fiolki z próbkami wypełnionymi żywicą należy pozostawić na noc na wirniku.
  4. Zanurz próbki w żywicy.
    1. Zastąp żywicę w proporcji 50:50 żywicą 75% (25% acetonu) i inkubuj przez 3 godziny, a następnie kontynuuj inkubację/infiltrację w 100% żywicy przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Zastąp 100% żywicę świeżą 100% żywicą i pozostaw fiolki z próbkami na noc w celu głębszego wniknięcia żywicy do próbek tkanek.
    3. Wyjmij próbki z fiolek i umieść je w pojemnikach, które są przystosowane do pieczenia w piekarniku i mają płaską podstawę; do tego celu można na przykład użyć kubków do pieczenia z folii aluminiowej lub srebrnej.
    4. Delikatnie wylać (aby uniknąć przemieszczenia próbek) świeżą żywicę na próbki (zatapiając w ten sposób próbki w żywicy) i polimeryzować żywicę i próbki w piecu w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.
  5. Zmień orientację bloków żywicy na komórki obrazu w przekroju.
    1. Uzyskać skrawki testowe o grubości 1 μm z bloków żywicy za pomocą ultramikrotomu ze szklanym nożem, aby ocenić orientację komórki24.
    2. Barwić grube skrawki testowe przez 20 sekund 1% błękitu toluenowego i 1% boraksu.
    3. Zbadaj orientację komórek mięśniowych pod mikroskopem jasnego pola.
    4. Opierając się na orientacji wywnioskowanej z obrazów poplamionych odcinków testu, ponownie zorientuj bloki żywicy w orientacji wzdłużnej lub ukośnej (podobnie jak w przypadku bloków żywicy Rysunek 2A), aby upewnić się, że komórki są wystawione na działanie szklanego noża, tak aby zostały przecięte w przekroju poprzecznym (podobnie jak w Rysunek 2B).
  6. Obrazowanie skrawków tkanek za pomocą tomografii elektronowej.
    1. Za pomocą noża diamentowego uzyskaj półcienkie skrawki (~300 nm) przeorientowanych bloków tkanek i przenieś je na siatki miedziane25.
    2. Grube odcinki zabarwić 2% UA i Sato lead25.
    3. Nałóż koloidalne cząstki złota po obu stronach sekcji25.
    4. Uzyskaj zestawy jedno- lub dwuosiowych serii wyświetlanych obrazów z pochyleniem od -70 ° do +70 ° 25.
  7. Użyj IMOD20, aby zrekonstruować stos obrazów 3D (serię obrazów 2D, które dostarczają informacji 3D pojedynczego przekroju tomografii elektronowej) komórki. Ten zrekonstruowany stos zostanie podzielony na segmenty w następnym kroku.

3. Segmentuj miofibryle i regiony mitochondriów z zestawu danych obrazów EM 3D

  1. Uruchom program IMOD "3dmod".
  2. W graficznym interfejsie użytkownika 3dmod wprowadź adres pliku ".rec" lub ".mrc", który zawiera zrekonstruowany w 3D zestaw danych obrazu komórki (wygenerowany w kroku 2.7) w polu wprowadzania oznaczonym "Image file(s):", a następnie naciśnij "OK".
  3. W menu "Plik" wybierz Nowy model, a następnie zapisz plik o odpowiedniej nazwie, korzystając z pozycji menu "Zapisz model jako"... w sekcji "Plik".
    UWAGA: Obiekt w IMOD może zawierać zbiór segmentowanych komponentów, które składają się na "obiekt". Domyślnie nowy model zawiera nowy obiekt o identyfikatorze "#1".
  4. W menu "Specjalne" wybierz "Narzędzia do rysowania". Spowoduje to otwarcie nowego paska narzędzi podobnego do tego pokazanego w Rysunek 3A.
    UWAGA: Istnieje kilka narzędzi, których można użyć do tworzenia konturów wokół różnych granic organelli. Więcej informacji na temat sposobów korzystania z tych narzędzi można znaleźć w dokumentacji IMOD20.
  5. Wybierz opcję "Rzeźbić" w menu "Narzędzia do rysowania" i przesuń mysz do okna obrazu; pojawi się okrągły kontur wyśrodkowany na wskaźniku myszy.
  6. Przytrzymując środkowy przycisk myszy nad mitochondrium (ciemniejsze obszary plików graficznych, zilustrowane zielonymi liniami konturowymi w Rysunek 3A), przeciągnij obwód konturu koła do kształtu jego granicy.
  7. Po zakończeniu konturowania granicy mitochondrium zwolnij środkowy przycisk i powtórz kroki 3.6 dla każdego mitochondrium w danych. Każdy kontur zostanie automatycznie rozpoznany przez IMOD jako nowy kontur w tym samym obiekcie.
  8. W punkcie menu "Opracuj | Obiekt "menu, wybierz "Nowy", aby utworzyć nowy obiekt. Spowoduje to automatyczne zwiększenie całkowitej liczby obiektów o jeden i przypisanie tego numeru do nowego obiektu.
  9. Powtórz kroki 3.6 i 3.7, aby podzielić kontury miofibryli na segmenty i je zapisać.
  10. Powtórz krok 3.8, a następnie krok 3.6, aby również podzielić granicę komórki na segmenty.
  11. Zapisz plik modelu w menu "Plik".
  12. Wykonaj następujące polecenia w oknie wiersza poleceń, aby przekonwertować każde zgrupowanie obiektów na maskę binarną, jak pokazano w Rysunek 4A-C.
    1. Wyodrębnij określony obiekt z modelu "imodextract object modelfile outputmodelfile", gdzie "object" to numer obiektu, który ma zostać wyodrębniony.
    2. Utwórz maskę dla tego obiektu: imodmop -mask 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Przekonwertuj plik na stos tif: mrc2tif -s maska wyjściowa.mrc outputmask.tif

4. Utwórz siatkę elementów skończonych z segmentowanych komponentów

  1. Iso2mesh to ogólnodostępny program MATLAB do konwersji stosów obrazów TIFF na wolumetryczne czworościenne siatki elementów skończonych. Pobierz i dodaj iso2mesh do ścieżki MATLAB z iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Pobierz kody źródłowe i dane do symulacji klastrów RyR w siatce z witryny internetowej github https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
  3. Uruchom aplikację CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Rysunek 5).
  4. Załaduj różne maski składników organelli do MATLAB za pomocą trzech przycisków w lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika.
  5. Utwórz kolejny binarny stos obrazów, który wyznacza odstępy między miofibrylami a mitochondriami, jak pokazano na Rysunek 6A.
    1. Otwórz plik ImageJ.
    2. Korzystanie z punktu menu Plik | Otwórz okno dialogowe, załaduj do programu stosy tiff miofibryli i mitochondriów.
    3. Zainicjuj wtyczkę dodawania obrazu, wybierając "Proces | Kalkulator Plus".
    4. Wybierz stos obrazów miofibryli jako i1, stos obrazów mitochondriów jako i2 i wybierz operator "Dodaj". Kliknij "OK".
    5. Po pojawieniu się nowego stosu obrazów reprezentującego wynik 4.5.4 wybierz "Edytuj | Odwróć", aby utworzyć stos obrazów podobny do Rysunek 6A.
  6. Załaduj plik zawierający binarny stos obrazów przerw między miofibrylami a mitochondriami, naciskając przycisk "RyRGapsFile" w programie CardiacCellMeshGenerator.
  7. Naciśnij "Generuj siatkę" w graficznym interfejsie użytkownika. Spowoduje to uruchomienie polecenia iso2mesh v2m z opcją "cgalmesh", aby wygenerować siatkę czworościenną podobną do Rysunek 4E. Na końcu tego kroku zostaną wyświetlone trzy pliki: plik .ele, plik .face i plik .node, który będzie zawierał odpowiednio listę węzłów tworzących elementy, węzłów tworzących ściany i współrzędne węzłów.

5. Matematycznie odwzorowuj przestrzennie zmienną gęstość interesujących kanałów jonowych na siatkę elementów skończonych.

  1. Wygeneruj niezbędne dane wejściowe dla RyR-Simulator, naciskając przycisk oznaczony Generuj dane wejściowe RyR-Simulator w GUI.
    UWAGA: Przycisk uruchomi funkcję generateRyRsimulatorInputs.m, która wykorzystuje następujące informacje z kroku 4 do wygenerowania danych wejściowych:
    (1) outDir: lokalizacja plików wyjściowych, które są niezbędne do symulacji klastra RyR.
    (2) IMRES: rozdzielczość pikseli w trzech kierunkach stosu obrazów.
    (3) myofibril_file: plik zawierający binarny stos obrazów, taki jak ten pokazany w Rysunek 4B.
    (4) sarcolemma_file: plik zawierający binarny stos obrazów, taki jak pokazany w Rysunek 4A.
    (5) ryrgaps_file: plik zawierający binarny stos obrazów, taki jak ten pokazany na Rysunek 5A.
    1. Po wykonaniu tej funkcji sprawdź, czy następujące pliki zostały utworzone w katalogu określonym jako ścieżka outDir:
    • d_axial_micron.txt, który reprezentuje odległość osiową między położeniem dysku z a pozostałymi pikselami w stosie obrazów.
    • d_radial_micron.txt, który reprezentuje odległość euklidesową (z wyłączeniem składowej osiowej) od każdego piksela w zbiorze możliwych lokalizacji klastra RyR do pikseli na płaszczyźnie dysku z.
    • W_micron.txt, który reprezentuje listę współrzędnych przestrzennych wszystkich dostępnych pozycji, w których mogą występować klastry RyR.
    • Pozostałe 3 pliki w folderze zawierają przyrostek "_pixel" zamiast "_micron", co oznacza, że wartości w tych plikach zostały zapisane w postaci współrzędnych pikseli.
  2. Symuluj rozkłady klastrów RyR na binarnym stosie obrazów miofibryli.
    1. Naciśnij przycisk oznaczony "Otwórz symulator RyR w R", aby zainicjować program R.
    2. W R-gui wybierz "Plik | Otwórz" i znajdź plik "ustawienia. R" w pakiecie RyR-Simulator (RyR-Simulator/source/settings. R).
    3. Otwórz również plik ryr-simulator-parallel. R (znajduje się w RyR-Simulator/source/ryr-simulator-parallel. R). Środowiska takie jak Rstudio (https://www.rstudio.com) lub zwykły interfejs wiersza poleceń mogą być używane, np. za pomocą polecenia R64 w powłoce lub oknie poleceń.
    4. Zmień parametry w ustawieniach. R file zgodnie z poniższymi opisami:
      1. Ustaw Path2 na adres folderu, który zawiera pliki wymienione w 5.1.2 dla eksperymentalnie uzyskanego stosu obrazów konfokalnych klastrów RyR i miofibryli.
        UWAGA: Folder repozytorium github input-files/master-cell/ zawiera już pliki, które zostały wygenerowane dla wcześniej zebranego stosu obrazów.
      2. Ustaw Path4 na adres folderu, w którym są przechowywane pliki wygenerowane w kroku 5.1.2.
      3. Ustaw Path3 punkt na folder, w którym użytkownik chce zapisać symulowane lokalizacje klastra RyR.
      4. Ustaw N na liczbę klastrów RyR, które mają być symulowane w modelu (zwykle w zakresie od 200 do 300).
      5. Ustaw etol, ustawienie tolerancji, dla różnicy między eksperymentalnie zmierzonym rozkładem przestrzennym klastrów RyR a modelowym symulowanym rozkładem przestrzennym klastrów RyR.
      6. Ustaw numIter, aby ograniczyć liczbę prób, które symulator RyR powinien podjąć, aby znaleźć symulowany wzorzec klastra RyR, który spełnia wartość etol.
        UWAGA: Wartości dla etol i numIter zostały ustawione na typowe wartości w ustawieniach. Plik R.
      7. Ustaw numPatterns na liczbę różnych wzorców klastrów RyR, które użytkownik chce symulować (zazwyczaj jest to przydatna praktyka symulowania 99 wzorców w celu uzyskania pewności statystycznej).
      8. Ustaw numCores, aby umożliwić korzystanie z kilku wątków procesora CPU (rdzeni) w celu szybszego przetwarzania równoległego z językiem R w celu symulowania wzorców punktów.
    5. Sprawdź, czy następujące pakiety są instalowane przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika instalatora pakietów w języku R: snow, doSNOW, doparallel, foreach, iteratory i rgl.
    6. Uruchom symulator, wprowadzając następujące polecenie w oknie poleceń języka R: source('path to ryr-simulator-parallel. R',chdir=PRAWDA)
      UWAGA: Wynikiem programu RyR-Simulator jest lista plików .txt (zostanie wygenerowany plik numPatterns), które zawierają listy współrzędnych w N wierszach i 3 kolumnach, które reprezentują współrzędne x, y i z symulowanych klastrów RyR.
  3. Mapowanie punktów jako gęstości przestrzennych do modelu obliczeniowego za pomocą generatora CardiacCellMeshGenerator.
    1. Wybierając przycisk oznaczony "Wybierz plik punktów RyR", wybierz symulowany plik tekstowy dystrybucji klastra RyR spośród tych, które zostały wyprowadzone przez symulator RyR.
    2. Uruchom "RyR Density Mapper" w graficznym interfejsie użytkownika w MATLAB. Spowoduje to zmapowanie lokalizacji przestrzennych symulowanych klastrów RyR w pliku .txt w kroku 5.3.1 na siatkę elementów skończonych, która została wygenerowana w kroku 4.8 przy użyciu metody zwanej metodą estymatora intensywności jądra sferycznego26.
      UWAGA: Wynikiem tego kroku jest plik z rozszerzeniem .txt, który zawiera listę wartości gęstości liczbowej kanału jonowego na jednostkę objętości sferycznej w każdym z węzłów siatki obliczeniowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 do Rysunek 7 przedstawia reprezentatywne wyniki kilku kluczowych kroków w tym protokole: (i) wizualizacja i reorientacja bloków tkankowych dla przekrojowych widoków mikroskopii elektronowej; (ii) generowanie stosu obrazów z mikroskopii elektronowej 3D; (iii) segmentacja ultrastruktury subkomórkowej dla organelli będących przedmiotem zainteresowania; (iv) generowanie siatki elementów skończonych za pomocą ISO2Mesh; (v) s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół przedstawia kluczowe kroki w celu wygenerowania nowatorskiego modelu geometrycznego elementów skończonych ultrastruktury kardiomiocytów. Metoda ta umożliwia obliczeniową fuzję różnych modalności mikroskopowych (lub, w zasadzie, innych danych) w celu opracowania bardziej kompleksowego modelu obliczeniowego dynamiki kardiomiocytów, który zawiera szczegóły przestrzennej architektury komórek. Obecnie nie ma dostępnego innego protokołu do stworzenia takiego modelu kardiomiocytu.

K...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Royal Society of New Zealand Marsden Fast Start Grant 11-UOA-184, grant badawczy Human Frontiers Science Program RGP0027/2013 oraz Australian Research Council Discovery Project Grant DP170101358.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiały
Chlorek soduSigma-Aldrich746398
Chlorek wapniaSigma-AldrichC8106
Chlorek magnezuSigma-AldrichM2393
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
ChlorekpotasuSigma-AldrichP5405
DekstrozaSigma-AldrichD9434
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045
ProbenecydSigma-AldrichP8761
2,3-butanodion monoksymowySigma-AldrichB0753
25% aldehyd glutarowy klasy EM (butelka 500 ml)Merck354400-500ML
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Kwas garbnikowySigma-Aldrich403040-500G100g EM klasy EM
Kakodylan soduSigma-AldrichC0250
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP4593
Tetratlenek osmuSigma-Aldrich75632-10ML4% w wodzie, butelka 5 ml (lub butelka 10 ml również dostępne)
Octan uranyluEM Sciences2240025g butelka
Żelazocyjanek potasuMerck Millipore104973
Błękit toluenowySigma-AldrichT3260
BoraksSigma-AldrichS9640określany również jako boran sodu
Etanol Sigma-Aldrich792780Rozcieńczony do różnych procentów za pomocą czysta woda
AcetonEM SciencesRT10017
Zestaw żywicEM Sciences14040ACM Durcupan działa dobrze
Kwas solnySigma-AldrichH98921Normalny roztwór
Sprzęt
UltramikrotomLeicaEM UC7
Transmisja elektronu mikroskopThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
Stojak retortowyProscitechT752
RurkaBioStrategy75831-346do aparatu perfuzyjnego Langendorff, średnica 3 mm jest zalecana, ale nie jest niezbędna
KrankiSDRQP13813do rurek langendorff; produkt jest tylko przykładem, użytkownik może wybrać dowolny
zaciski stojaka do retortyProscitechT715
Plastikowe strzykawkiSDRQPC1108do roztworów na aparacie langendorff
Jedwabny szew kaniulacyjny, 7-0TeleFlex15B051000do wiązania serca na aparacie Langedorffa
KaniulaWykonane ze stalowej igły o średnicy zewnętrznej 3 mm
Gumowa mata na szalki PetriegoProscitechH068do stosowania jako deska do krojenia podczas preparacji na sercu
ŻyletkiProscitechL056do cięcia stałosercowego na małe bloki do obróbki elektromagnetycznej
Butelki szklaneBioStrategy89000-236do przechowywania roztworów podczas utrwalania tkanek i przetwarzania dla
zlewekBioStrategy213-0477do tymczasowego przechowywania roztworów i podczas perfuzji
Fiolki scyntylacyjneBioStrategy548-2170do próbek tkanek podczas przetwarzania EM
Zestaw do rozwarstwianiaProscitechT161do sekcji zwierząt
Filtry strzykawkoweProscitechWS3-02225Sdo oczyszczania octanu uranylu
Aluminiowedo pieczenia Z dowolnego sklepu z produktami do pieczenia
Nóżdiamentowy DupontBioStrategy102680-780Wersja pod kątem 35 stopni zapewnia najlepsze przekroje.
Złoto koloidalneBBI RoztworyEM. GC1515 nm siatki koloidalne ze złota
EMProscitechGCU150można testować różne rozmiary: na przykład GCU150h, GCU200h
Pipety do usuwania tworzyw sztucznychProscitechLCH20najlepiej używać plastikowych materiałów jednorazowego użytku, szczególnie podczas pracy z żywicą
Oprogramowanie
SerialEMAkwizycja tomografiina Uniwersytecie w Boulder
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversity of Boulderwyrównanie i segmentacja obrazu
iso2meshdostępne na http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji lub podobnym oprogramowaniu do przetwarzania obrazówImageJFiji to tylko obraz Jdostępny pod adresem https://fiji.sc do manipulacji obrazem binarnym stosy
kodów/danych RyR-SimulatorCellSMBdostępna pod adresem https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorGrupajest dostarczana z RyR-Simulator w folderze "wersja gui"
Oprogramowanie R-statisticsR-projectPobierz z https://www.r-project.org
spatstatR-projectzainstalować za pomocą programu
R rglInstalacja projektu Rza pomocą programu R
dorównoległyInstalacja projektu R-instalacjaza pomocą programu R
foreachprojektu Rzapomocą programu
R doSNOWprojektu
iteratorówR Instalacja projektu Rpomocą programu R
EM / srebrne kubki Grupa CellSMB Instalacja Instalacja R za pomocą programu za

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417(2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908(2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Finite Element ModelCardiomyocyte ArchitectureElectron TomographyConfocal MicroscopyCellular ArchitectureCalcium SignalingMitochondrial BioenergeticsRyR Cluster SimulationImage SegmentationMesh Generation

Related Articles