Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dobrze wiadomo, że przestrzenna i czasowa regulacja genów jest integralną częścią prawidłowego zarządzania ekspresją genów. W związku z tym nieocenione jest zrozumienie, gdzie i kiedy zachodzi transkrypcja w przestrzeni jądrowej oraz wizualizacja związku między episomami zainfekowanymi w jądrze tej samej komórki. W tym przypadku połączono zarówno immunofluorescencję (IFA), jak i RNA-FISH w celu identyfikacji aktywnie transkrybujących episomy herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV). Poprzez barwienie antygenu jądrowego związanego z opóźnieniem KSHV (LANA) możliwe jest zlokalizowanie episomów wirusa w jądrze. Ponadto, projektując sondy RNA-FISH celujące w region intronu genu wirusowego, który ulega ekspresji tylko podczas produktywnej infekcji, można zlokalizować powstające transkrypty RNA. Korzystając z tej kombinacji sond molekularnych, możliwe jest zwizualizowanie montażu dużych fabryk transkrypcji wirusa i analiza przestrzennej regulacji ekspresji genów wirusa podczas reaktywacji KSHV. Włączając barwienie przeciwciałami anty-RNA polimerazy II, można również zwizualizować związek między agregacją polimerazy RNA II (RNAPII) a transkrypcją KSHV podczas reaktywacji.
Wprowadzenie
Staje się coraz bardziej jasne, że czasoprzestrzenna organizacja jądra odgrywa ważną rolę w modulowaniu precyzyjnie dostrojonej ekspresji genów u eukariontów. Większość genów specyficznych tkankowo jest rozmieszczona na wielu chromosomach i musi być regulowana synchronicznie, aby reagować na określone bodźce w skoordynowany sposób1. Komórki konstruują aktywne koncentratory chromatyny (ACH) jako sposób na połączenie genów i ich składników cis-regulatorowych w określoną przestrzeń jądrową1.
Różne badania wykazały również, że chociaż jądro wydaje się bardzo gęste i lepkie, biologicznie aktywne cz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Linie komórkowe używane w tej procedurze zawierają zakaźne wirusy, bądź ostrożny i postępuj tylko w obiekcie poziomu 2 lub wyższego.
1. Przygotowanie i utrzymanie komórek
- Hodowla komórek TREx-K-RTA BCBL-1 (lub innych linii komórkowych PEL zakażonych KSHV) w pożywce RPMI1640 uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem glutaminy penicyliny streptomycyny.
- Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ), upewniając się, że stale rosną i dzielisz komórki w stosunku 1:4 co 2-4 dni.
- Codziennie monitoruj hodowle komórkowe za pomocą mikroskopu świetlnego, aby potwi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeprowadzono nieco skrócony protokół, w którym zastosowano komórki BCBL-1 i barwiono jedynie RNA LANA oraz K-Rta (Rycina 1). Eksperyment ten pozwala zbadać rozmieszczenie aktywnie transkrybowanych episomów wirusowych oraz heterogeniczność odpowiedzi na bodźce reaktywacji KSHV w populacji komórek. W komórce wskazanej strzałką na Rycynie 1 wyraźna fluorescencja K-Rta w obszarach ściśle odpowiadających rozmieszczeniu episomów wiru.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieją pewne aspekty protokołu, które można zmienić, aby dostosować się do nietypowych okoliczności. Wybór utrwalających i przepuszczalnych może być również zmieniony. W przypadku utrwalających skuteczny jest również paraformaldehyd, a do przepuszczalności można użyć etanolu.
Zaleca się gaszenie formaldehydu glicyną PBS, ponieważ zapobiega to wyłączaniu przeciwciał przez formaldehyd przy braku albuminy surowicy bydlęcej (BSA), ale jeśli szkiełka nakrywkowe zostaną wystarczająco dokładnie um.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy artykułu nie mają powiązań finansowych ani konkurujących ze sobą konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant National Institutes of Health (R01-DE025985) oraz przez American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Prace te były również wspierane przez granty z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (2015-67015-23268 i 2014-67015-21787) oraz grant New Research Initiative z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco firmy Life Technologies | 61870-036 | Musi być podgrzany do 37 & stopni; C |
| Surowica bydlęca płodu | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamina (100x) | Gibco firmy Life Technologies | 10378-016 | |
| Tymidyna | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco" s Roztwór buforowany fosforanem | Gibco firmy Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Maślan sodu | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Roztwór formaldehydu | Sigma Aldrich | 252549 | , toksyczne, zagrażające zdrowiu |
| pirowęglan dietylu | Sigma Aldrich | D-5758 | Toksyczność ostra |
| Glicyna | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Aceton | Sigma Aldrich | 179124 | Łatwopalny, toksyczny |
| metanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Łatwopalne, toksyczne, zagrażające zdrowiu |
| Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko KSHV/HHV-8 ORF73 | Zaawansowane technologie biologiczne | 13-210-100 | |
| Klon przeciwciała anty-RNA polimerazy II CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Kwas rybonukleinowy, transfer z piekarza" s drożdże (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Bufor soli fizjologicznej cytrynianu sodu 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | ||
| Formamid | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% roztwór | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4',6-diamindino-2-fenyloindol, dichlorowodorek) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| odczynnik przeciw blaknięciu slowFade Gold | Life Technologies | S36936 | |
| Mikro szkło osłonowe 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| obrazowania 3D | VoloCITY | ||
| Mikroskop | |||
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost/Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Bibliografia
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
