Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56842

⸱

21 maja 2018

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

Lipoproteiny są ważnymi składnikami otoczki komórek bakteryjnych i silnymi aktywatorami wrodzonej odpowiedzi immunologicznej ssaków. Pomimo ich znaczenia zarówno dla fizjologii komórki, jak i immunologii, wiele pozostaje do odkrycia na temat nowych form lipoprotein, sposobu ich syntezy oraz wpływu różnych form na odporność gospodarza. Aby umożliwić dokładne badania nad lipoproteinami, protokół ten opisuje metodę wzbogacania lipoprotein bakteryjnych i otrzymywania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do oznaczania strukturalnego za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą i czasem jonizacji lotu (MALDI-TOF MS). Rozszerzając uznaną metodę partycjonowania faz Triton X-114 w celu ekstrakcji i wzbogacania lipoprotein z błony komórkowej bakterii, protokół zawiera dodatkowe kroki w celu usunięcia zanieczyszczeń niezwiązanych z lipoproteinami, zwiększając wydajność i czystość lipoprotein. Ponieważ lipoproteiny są powszechnie stosowane w testach receptorów Toll-podobnych (TLR), bardzo ważne jest, aby najpierw scharakteryzować strukturę N-końcową za pomocą MALDI-TOF MS. W niniejszej pracy przedstawiono metodę izolacji skoncentrowanych peptydów hydrofobowych wzbogaconych w N-końcowe lipopeptydy nadające się do bezpośredniej analizy przez MALDI-TOF MS/MS. Lipoproteiny, które zostały oddzielone za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), są przenoszone do membrany nitrocelulozowej, Trawione in situ trypsyną, sekwencyjnie przemywane w celu usunięcia polarnych peptydów tryptycznych, a na koniec eluowane chloroformem-metanolem. W połączeniu ze stwardnieniem rozsianym bardziej polarnych peptydów trypsynizowanych z roztworów do płukania, metoda ta zapewnia możliwość zarówno identyfikacji lipoproteiny, jak i scharakteryzowania jej N-końca w jednym eksperymencie. Celowe tworzenie adduktów sodu może być również wykorzystane jako narzędzie do promowania bardziej strukturalnie pouczających widm fragmentacji. Ostatecznie wzbogacenie lipoprotein i określenie ich N-końcowych struktur pozwoli na szersze badania nad tą wszechobecną klasą białek bakteryjnych.

Wprowadzenie

Lipoproteiny bakteryjne charakteryzują się konserwatywną N-końcową cysteiną modyfikowaną lipidowo, która zakotwicza domenę białka globularnego na powierzchni błony komórkowej. Są one powszechnie rozmieszczone w bakteriach, stanowiąc od 2 do 5% wszystkich genów komórkowych w typowym genomie1. Lipoproteiny odgrywają kluczową rolę w wielu różnych procesach komórkowych, w tym w pobieraniu składników odżywczych, transdukcji sygnału, składaniu kompleksów białkowych oraz w utrzymaniu integralności strukturalnej otoczki komórkowej2. W bakteriach chorobotwórczych lipoproteiny służą jako czynniki wirulencji3,4. Podczas infekcji rozpoznanie N-końcowych lipopeptydów przez receptor Toll-podobny (TLR) 2 wywołuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną w celu usunięcia atakujących patogenów. W zależności od N-końcowego stanu acylacji, lipoproteiny są na ogół rozpoznawane przez alternatywne kompleksy heterodimeryczne TLR2. TLR2-TLR1 rozpoznaje N-acylowane lipopeptydy, podczas gdy TLR2-TLR6 wiąże wolne zakończenia lipopeptydowe α-aminowe. Po związaniu szlaki sygnałowe zbiegają się, aby indukować wydzielanie cytokin prozapalnych3,4.

Wcześniej sądzono, że lipoproteiny bakterii Gram-dodatnich były diacylowane, a te z bakterii Gram-ujemnych były triacylowane, różniąc się brakiem lub obecnością kwasu tłuszczowego związanego z amidem na konserwatywnej N-końcowej reszcie cysteiny. Założenie to zostało poparte brakiem ortologów sekwencji w genomach Gram-dodatnich do Lnt, Gram-ujemnej N-acylowej transferazy, która tworzy triacylowane lipoproteiny5. Jednak ostatnie badania wykazały triacylację lipoprotein w Gram-dodatnich firmicutes, które nie mają lnt, a także trzy nowe N-końcowe struktury lipoproteinowe, zwane formami peptydylu, lizo i N-acetylu6,7,8. Odkrycia te rodzą pytania o możliwe, jeszcze nieodkryte formy lipoprotein, a także fundamentalne pytania o to, jak powstają te nowe lipoproteiny i jaki fizjologiczny cel lub korzyść dają różne formy. Co więcej, wyraźnie pokazują one obecną niezdolność genomiki do przewidywania struktury lipoprotein. Rzeczywiście, niedawno zidentyfikowaliśmy nową klasę lipoprotein N-acyl transferazy, zwaną Lit, od Enterococcus faecalis i Bacillus cereus, która tworzy lipoproteiny w formie lizo9. Wskazuje to na potrzebę eksperymentalnej weryfikacji struktury lipoprotein, co może być trudne ze względu na ich wyjątkowo hydrofobowy charakter i ograniczone dostępne metody charakteryzowania ich struktury molekularnej.

Aby ułatwić badania nad indukcją lipoprotein w odpowiedzi immunologicznej gospodarza, jak również N-końcowym określeniem strukturalnym, dostosowaliśmy kilka wcześniej opisanych protokołów w celu oczyszczenia lipoprotein bakteryjnych i przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do analizy przez MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiny są wzbogacane przy użyciu uznanej metody podziału faz Triton X-114 (zwanej dalej środkiem powierzchniowo czynnym lub TX-114), z optymalizacją w celu usunięcia zanieczyszczających nie-lipoprotein i zwiększenia wydajności lipoprotein. Te lipoproteiny nadają się do bezpośredniego stosowania w testach TLR lub do dalszego oczyszczania przez SDS-PAGE. W przypadku MALDI-TOF MS przeniesienie lipoprotein do błony nitrocelulozowej stanowi rusztowanie do wydajnego trawienia trypsyny in situ, płukania, a następnie elucji z powierzchni błony, w wyniku czego powstają wysoce oczyszczone N-końcowe lipopeptydy. Wykazano, że nitroceluloza ułatwia obsługę próbek i poprawia pokrycie sekwencji wysoce hydrofobowych peptydów z integralnych białek błonowych13,14, a także lipoproteiny9,10. Dodatkową zaletą metody jest frakcjonowanie peptydów w oparciu o polarność, dzięki czemu pośrednie roztwory płuczące mogą być analizowane w celu identyfikacji białek o wysokim poziomie pewności jednocześnie z N-końcowym oznaczaniem strukturalnym w jednym eksperymencie. Protokół ten w unikalny sposób charakteryzuje się celowym tworzeniem adduktów sodu w celu promowania fragmentacji jonów macierzystych w kierunku jonów dehydroalanylowych podczas MS / MS, pomagając w strukturalnym przypisaniu stanu N-acylacji. N-koniec jest zarówno najbardziej zmienną, jak i kluczową cechą związaną z rozpoznawaniem lipoprotein TLR. Podsumowując, protokół ten pozwolił na intensywne i powtarzalne badania lipoprotein, a poszczególne etapy oczyszczania i oznaczania strukturalnego za pomocą MALDI-TOF MS można łatwo dostosować w zależności od ogólnego celu eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost i liza komórek

  1. Hoduj bakterie w 15 ml bulionu sojowego tryptycznego (TSB) lub podobnym pożywce bogatej do późnej fazy wykładniczej (OD600 1,0 - 1,5). Zebrać komórki przez odwirowanie, przemyć raz solą fizjologiczną/EDTA (TBSE) i kontynuować zgodnie z protokołem lub zamrozić do użycia.
    UWAGA: TBSE: 20 mM tris-chlorowodorek (HCl), pH 8,0, 130 mM chlorek sodu (NaCl) i 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)). Na ekspresję i modyfikację lipoprotein mogą mieć wpływ warunki wzrostu (np. kwasowość, zasolenie, pożywka wzrostowa) oraz faza wzrostu15. Wzrost komórek można skalować według potrzeb, ale do pojedynczego przygotowania lipoprotein zaleca się 15 ml komórek, ponieważ nadmiar biomasy może zmniejszyć wydajność lipoprotein. Jeden preparat o pojemności 15 ml zazwyczaj daje wystarczającą ilość próbki do optymalnego obciążenia ~2-4 pasów na standardowy mini żel SDS-PAGE.
  2. Zawieś komórki w 800 μl TBSE z 1 mM fluorkiem fenylometylosulfonylu (PMSF) i 0,5 mg / ml lizozymu. Przenieść roztwór do probówki mikrowirówkowej z gwintem 2,0 ml z nakrętką i pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Niektóre gatunki nie są podatne na lizę przez lizozym. Należy zastąpić go odpowiednim enzymem litycznym, aby wspomóc lizę.
  3. Dodaj ~800 μl 0,1 mm kulek cyrkonu/krzemionki do probówki i rozbij komórki, wytrząsając z maksymalną prędkością (7,000 obr./min) na homogenizatorze przez 5 cykli po 30 s każdy, z 2-minutowym odpoczynkiem na lodzie między każdym cyklem.
  4. Odwirować próbkę o masie 3000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (do osadzania kulek i nieuszkodzonych komórek). Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml i przechowywać na lodzie.
  5. Dodaj 200 μl TBSE do pozostałego osadu i wróć do homogenizatora na dodatkowy cykl. Odwirować (jak wyżej) i połączyć supernatant z poprzednim supernatantem (powinna mieć ~800-1000 μL całkowitej objętości).

2. Wzbogacanie lipoprotein przez podział faz TX-114

  1. Uzupełnij supernatant środkiem powierzchniowo czynnym TX-114 do końcowego stężenia 2% (vol/vol), dodając równą objętość 4% (vol/vol) środka powierzchniowo czynnego w lodowatym TBSE i inkubuj na lodzie przez 1 h, mieszając przez inwersję co ~15 min.
    UWAGA: Po schłodzeniu supernatant i środek powierzchniowo czynny będą się mieszać.
  2. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut w celu wywołania separacji faz. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrzymać separację dwufazową.
  3. Delikatnie odpipetować górną fazę wodną i wyrzucić. Dodaj lodowato zimne TBSE do dolnej fazy środka powierzchniowo czynnego, aby napełnić probówkę do jej pierwotnej objętości i odwrócić do mieszania. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
  4. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut w celu wywołania separacji faz, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Powtórz kroki 2.3-2.4 jeszcze raz, aby uzyskać w sumie 3 separacje. Usuń górną fazę wodną i wyrzuć.
  6. Usunąć osad wytrąconych białek, które powstały w trakcie ekstrakcji (widoczny na dnie probówki), dodając 1 objętość lodowatego TBSE do fazy środka powierzchniowo czynnego. Wirować w temperaturze 4 °C przy 16 000 x g przez 2 minuty w celu granulowania nierozpuszczalnego białka.
    UWAGA: Próbka powinna pozostać jednofazowa. Jeśli nastąpi separacja faz, ponownie schłodzić próbkę i ponownie odwirować. Osad składa się na ogół z zanieczyszczeń innych niż lipoproteiny, ale może być zachowany do dalszej analizy.
  7. Natychmiast przenieść supernatant do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml zawierającej 1250 μl 100% acetonu. Dokładnie pipetować w górę i w dół, aby umyć próbkę z końcówki, ponieważ będzie lepka. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia białka.
  8. Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać lipoproteiny, zwracając uwagę na orientację probówki. Lipoproteiny utworzą cienką, białą warstwę wzdłuż zewnętrznej ścianki rurki.
  9. Umyj pellet dwukrotnie 100% acetonem. Zdekantować aceton i pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu.
  10. Dodać 20-40 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 lub standardowego buforu do próbek Laemmli SDS-PAGE16 i dokładnie zawiesić, pipetując w górę iw dół do ściany z wytrąconymi lipoproteinami. Zeskrob bok probówki końcówką pipety, aby usunąć lipoproteiny.
    UWAGA: Lipoproteiny nie rozpuszczają się w buforze Tris, ale raczej tworzą zawiesinę.
    1. Przechowuj lipoproteiny w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. SDS-PAGE, Elektroblotting i barwienie za pomocą Pąsa S

  1. Oddziel lipoproteiny za pomocą SDS-PAGE przy użyciu standardowych metod16.
    UWAGA: Odpowiednia zawartość procentowa akrylamidu w żelu będzie się różnić w zależności od jego przeznaczenia i wielkości lipoprotein. W tym przypadku lipoproteiny E. faecalis oddzielono od 10% żelu tris-glicynowego, podczas gdy 16,5% żelu tris-trycyny użyto dla mniejszej lipoproteiny E. coli Lpp17.
  2. Przenieś lipoproteiny do membrany transferowej nitrocelulozy za pomocą standardowej procedury elektroblottingu.
    UWAGA: Transfer półsuchy przy użyciu bufora Bjerrum Schafer-Nielsen plus 0,1% SDS przeprowadzono przy napięciu 25 V, 1,3 mA przez 15 min18. Alternatywnie można zastosować membranę z polifluorku winylidenu (PVDF), jednak ponieważ jest ona bardziej hydrofobowa niż nitroceluloza, może zmniejszać wydajną wymywanie hydrofobowych lipopeptydów z membrany na późniejszych etapach.
  3. Przenieść membranę nitrocelulozową do pojemnika i zalać roztworem Pąsek (0,2% (m/v) Pąsek S w 5% kwasie octowym). Kołysz delikatnie przez 5 minut lub do momentu, gdy pojawią się czerwono-różowe paski.
  4. Odlej roztwór Pąsa S i ostrożnie spłucz membranę nitrocelulozową dH2O, aby usunąć nadmiar plam.
    UWAGA: Opaski poplamione Ponceau szybko się odplamiają. Jeśli pasma znikną, powtórz proces barwienia.
  5. Za pomocą czystej żyletki wytnij żądaną prążek i przenieś do probówki mikrowirówkowej. Przemyć trzykrotnie 1 ml dH2O, aby całkowicie usunąć plamy z opaski.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Wycięty fragment należy przechowywać pod przykryciem wodą w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  6. Przenieś fragment na czystą powierzchnię i za pomocą czystej żyletki pokrój pasek nitrocelulozy w kostkę na małe kawałki o wymiarach około 1 mm x 1 mm. Zbierz kawałki do probówki wirówkowej o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka
    7. .
  7. Umyj kawałki dwukrotnie 0,5 ml świeżo przygotowanego 50 mM wodorowęglanu amonu (NH4HCO3) o pH 7,8 w wodzie klasy HPLC o wysokiej wydajności do chromatografii cieczowej.

4. Trawienie tryptyczne, ekstrakcja lipopeptydu z membrany nitrocelulozowej, osadzanie na tarczy MALDI i akwizycja danych

  1. Zawiesić kawałki nitrocelulozy w 20 μl roztworu trypsyny o stężeniu 20 μg/ml w 50 mM NH4HCO3, pH 7,8 w wodzie klasy HPLC. Wirować, aby wymieszać, a następnie krótko obrócić, aby upewnić się, że wszystkie kawałki są całkowicie pokryte roztworem trypsyny. Przykryć pokrywę probówki folią parafinową, aby zapobiec parowaniu, i inkubować trawienie przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Wirować próbkę w temperaturze 16 000 x g przez 30 s i usunąć ciecz za pomocą pipetowania.
    UWAGA: Powoduje to usunięcie trypsynizowanych peptydów hydrofilowych, które można później zbadać za pomocą MALDI-TOF MS w celu identyfikacji białek.
  3. Dodać 50 μl 0,5% kwasu trifluorooctowego (TFA) do wody klasy HPLC. Wirować, aby wymieszać, a następnie krótko obrócić próbkę, aby upewnić się, że wszystkie kawałki są pokryte roztworem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć płyn za pomocą pipetowania.
    ostrożność: TFA jest szkodliwy w przypadku wdychania. Obchodzić się z nimi ostrożnie i używać w dygestoriach chemicznych. Unikać kontaktu ze skórą.
  4. Powtórz krok 4.3 z 50 μl 10% acetonitrylu w wodzie klasy HPLC.
    ostrożność: Acetonitryl jest szkodliwy w przypadku wdychania. Obchodzić się z nimi ostrożnie i używać w dygestoriach chemicznych. Unikać kontaktu ze skórą.
  5. Powtórz krok 4.3 z 50 μl 20% acetonitrylu w wodzie klasy HPLC.
    UWAGA: Usuwa to wszelkie umiarkowanie hydrofobowe peptydy luźno związane z nitrocelulozą.
  6. Aby wymyć ściśle związane lipopeptydy, dodać 15 μl świeżo przygotowanej matrycy 10 mg/ml kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) rozpuszczonej w chloroform-metanolu (2:1, v/v) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z przerywanym wirowaniem.
    1. Alternatywnie dodać 15 μl chloroformu-metanolu w celu wymycia lipopeptydów i wymieszać z matrycą w późniejszym czasie. Inne matryce, takie jak kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB), powinny być badane jako alternatywa dla CHCA, jeśli uzyskuje się niezadowalające wyniki dla określonego składu lipopeptydu.
      ostrożność: Zarówno chloroform, jak i metanol są szkodliwe w przypadku wdychania. Obchodzić się z nimi ostrożnie i używać w dygestoriach chemicznych. Unikać kontaktu ze skórą.
    2. Opcjonalnie: Aby pobudzić tworzenie adduktów sodu, należy uzupełnić roztwór CHCA w chloroformie-metanolu wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (NaHCO3) do końcowego stężenia 1 mM.
  7. Krótko odwiruj próbkę. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś płyn do nowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zawartości wiązania białek. To rozwiązanie będzie zawierało większość N-końcowych lipopeptydów.
    UWAGA: Nitroceluloza może częściowo lub całkowicie rozpuścić się w roztworze chloroformu i metanolu. Nie wpłynie to negatywnie na wyniki SM i może być stosowane jako alternatywna metoda zwiększania powrotu lipopeptydu. Membrana PVDF nie rozpuści się w ten sam sposób.
  8. Umieścić 1 μl eluowanych lipopeptydów z CHCA na tarczy MALDI z polerowanej stali.
    UWAGA: Chloroform-metanol szybko odparowuje, pozostawiając skrystalizowane CHCA i lipopeptydy. Opcjonalnie w tym samym miejscu można umieścić drugą porcję o pojemności 1 μl w celu zwiększenia stężenia próbki. Chloroform-metanol może się znacznie rozprzestrzeniać po osadzeniu na tarczy, dlatego należy zachować ostrożność, aby uniknąć mieszania się próbki z podłożem. Zaleca się zdeponowanie i sfotografowanie wielu miejsc każdej próbki.
  9. Natychmiast przejdź do spektrometrii mas. Skanuj wszystkie obszary plamki w poszukiwaniu sygnału lipopeptydu, zwłaszcza jeśli plamka zawiera dwie warstwy próbki, ponieważ druga warstwa może wypchnąć lipopeptydy na zewnętrzną krawędź plamki.
    UWAGA: Zalecana początkowa intensywność lasera wynosi 25%, chociaż może być konieczne zwiększenie intensywności w celu uzyskania sygnału i zsumowania wielu widm (20 lub więcej skanów) w celu uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu. W tym przypadku widma zostały uzyskane za pomocą instrumentu MALDI-TOF-TOF (patrz Tabela Materiałów) przy użyciu fabrycznie skonfigurowanej metody instrumentu do detekcji jonów dodatnich reflektora w zakresie 700-3500 m/z. Przyrząd został skalibrowany mieszaniną albuminy tryptycznej surowicy bydlęcej (BSA) peptydów tryptycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat protokołu przedstawiono w Rycina 1frakcja wzbogacona w lipoproteiny wyekstrahowana z Enterococcus faecalis ATCC 1943 w TX-14 przedstawiono w Rycina 2Dla porównania przedstawiono również układ prążków frakcji białek wytrąconych. Analiza MALDI-MS potwierdziła, że białka z tej frakcji to przede wszystkim wysokoobecne białka zanieczyszczające inne niż lipoproteiny (Tabela 1). Widma masowe w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje dwa odrębne etapy charakterystyki lipoprotein: wzbogacanie przez partycjonowanie faz TX-114 i oznaczanie strukturalne przez MALDI-TOF MS. Podczas ekstrakcji TX-114 dodatkowe wirowanie usuwa zanieczyszczające białka, które wytrącają się podczas tego procesu, a następnie wytrącanie acetonu w celu uzyskania wysoko wzbogaconych lipoprotein. Ograniczając skalę każdego preparatu do komórek o wielkości 15 ml, kilka próbek można łatwo przetwarzać równolegle i w razie potrzeby łączyć na końcu protokołu....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania w laboratorium Meredith były wspierane przez fundusze startowe dostarczone przez Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Dziękujemy dr Tatianie Laremore za fachowe doradztwo techniczne i dostęp do sprzętu w Penn State Proteomics and Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, gdzie przeprowadzono analizy spektrometrii mas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
0,01 mm Koraliki cyrkonowe/krzemionkoweProdukty BioSpec110791012
Kwas octowyEMDAX0073-9
AcetonEMDAX0116-6
AcetonitrylEMDAX0142-6
Wodorowęglan amonuFluka Analytical09830
BioTrace NT NitrocelulozaPALL Nauki Przyrodnicze66485
Wzorzec trawienia albuminy surowicy bydlęcej (BSA)ProteaPS-204-1
ChloroformAcros Organics423550025
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Fisher ScientificBP118
Klasa HPLC WodaEMDWX0008-1
LysozymeFisher ScientificBP535-1
MetanolSigma-Aldrich34860
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Amresco0754
Proteaza trypsyny Pierce'aThermo Scientific90057
Ponceau SAcros Organics161470100
Białko LoBind Tubka 0,5 mlEppendorf022431064
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich792519
Chlorek soduMacron Fine Chemicals7581-06
Kwas trifluorooctowy (TFA)Sigma-Aldrich299537
Chlorowodorek trisu (HCl)Fisher ScientificBP152
Triton X-114Sigma-Aldrich93422
Bulion sojowy tryptyczny (TSB)BD211822
&kwas alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy (MS Grade)Sigma-AldrichC8982
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
MagNALyserRoche
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad
MALDI-TOF celownikBruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOFBruker DaltonicsWyposażony w laser Nd:YAG smartbeam-II o potrojonej częstotliwości 355 nm

Bibliografia

  1. Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
  2. Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
  3. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
  4. Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
  5. Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
  6. Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
  7. Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
  8. Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
  9. Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
  10. Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
  11. Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
  12. Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
  13. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
  14. Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
  15. Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
  18. Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , Spring Protocols. 321-334 (2002).
  19. Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , Springer Protocols. 1117-1129 (2009).
  20. Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
  21. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , Springer Protocols. 571-607 (2005).
  22. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  23. Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wzbogacanie lipoproteinrozdział fazowy Triton X-114spektrometria mas MALDI-TOFanaliza SDS-PAGEtrawienie trypsynątworzenie adduktów sodowychmembrana nitrocelulozowaelucja chloroformowo-metanolowa
Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.