Artykuł metodologiczny

Mapowanie metaboliczne: ilościowa cytochemia enzymatyczna i histochemia w celu określenia aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56843

⸱

26 maja 2018

 ,  ,  , 
1Cancer Center Amsterdam, Department of Medical Biology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który może być użyty do mikroskopowego obrazowania i ilościowego określania aktywności dehydrogenaz w komórkach i tkankach oraz jej kinetyki, funkcji i lokalizacji subkomórkowej.

Streszczenie

Zmieniony metabolizm komórkowy jest cechą charakterystyczną wielu chorób, w tym raka, chorób układu krążenia i infekcji. Metaboliczne jednostki motoryczne komórek są enzymami, a ich aktywność jest silnie regulowana na wielu poziomach, w tym na poziomie transkrypcyjnym, stabilności mRNA, translacyjnym, potranslacyjnym i funkcjonalnym. Ta złożona regulacja oznacza, że konwencjonalne testy ilościowe lub obrazowe, takie jak ilościowe eksperymenty mRNA, Western Blot i immunohistochemia, dostarczają niekompletnych informacji na temat ostatecznej aktywności enzymów, ich funkcji i / lub lokalizacji subkomórkowej. Ilościowa cytochemia enzymatyczna i histochemia (tj. mapowanie metaboliczne) dostarczają szczegółowych informacji na temat aktywności enzymatycznej in situ i jej kinetyki, funkcji i lokalizacji subkomórkowej w sytuacji niemal zgodnej z naturą.

Opisujemy protokół do wykrywania aktywności dehydrogenaz, które są enzymami przeprowadzającymi reakcje redoks w celu redukcji kofaktorów, takich jak NAD(P)+ i FAD. Komórki i skrawki tkanek są inkubowane w pożywce, która jest specyficzna dla aktywności enzymatycznej jednej dehydrogenazy. Następnie dehydrogenaza, która jest przedmiotem badań, wykonuje swoją aktywność enzymatyczną w swoim miejscu subkomórkowym. W reakcji chemicznej z podłożem reakcyjnym ostatecznie generuje to niebieski formazan w miejscu aktywności dehydrogenazy. Absorbancja formazana jest zatem bezpośrednią miarą aktywności dehydrogenazy i może być określona ilościowo za pomocą monochromatycznej mikroskopii świetlnej i analizy obrazu. Ilościowy aspekt tego protokołu umożliwia naukowcom wyciąganie wniosków statystycznych z tych testów.

Oprócz badań obserwacyjnych, technika ta może być wykorzystana do badań hamowania określonych enzymów. W tym kontekście, badania korzystają z wiernych naturze zalet mapowania metabolicznego, dając wyniki in situ, które mogą być fizjologicznie bardziej istotne niż badania inhibicji enzymów in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, mapowanie metaboliczne jest nieodzowną techniką badania metabolizmu na poziomie komórkowym lub tkankowym. Technika ta jest łatwa do zastosowania, dostarcza dogłębnych, kompleksowych i zintegrowanych informacji metabolicznych oraz umożliwia szybką analizę ilościową.

Wprowadzenie

Podstawowym kamieniem węgielnym fizjologii komórkowej jest metabolizm. Metabolizm dostarcza komórkom energii potrzebnej do wszystkich procesów fizjologicznych, dostarcza elementów budulcowych do biosyntezy makromolekularnej i reguluje homeostazę komórkową w odniesieniu do produktów przemiany materii, toksycznych cząsteczek oraz demontażu i recyklingu niepotrzebnych lub dysfunkcyjnych składników komórkowych. Enzymy katalizują prawie wszystkie ważne komórkowe reakcje chemiczne i dlatego są jednostkami motorycznymi w fizjologii komórek. 1,2

Aktywność enzymów jest ściśle regulowana na wielu poziomach, dlatego też ilościowa histochemia enzymów i cytochemia (zwana również mapowaniem metabolicznym) jest preferowaną metodą badania aktywności enzymów in situ. Na poziomie transkrypcyjnym regulowana jest ekspresja genów do mRNA. Efekt regulacji transkrypcji można określić za pomocą ilościowych testów mRNA, takich jak mikromacierze lub bezpośrednie sekwencjonowanie RNA, lub jakościowych testów mRNA, takich jak hybrydyzacja in-situ, która dostarcza informacji na temat (sub)komórkowej lokalizacji cząsteczek mRNA. Pozwala to docenić względne różnice w aktywności transkrypcyjnej między komórkami. Jednak interpretacja i trafność tych testów mRNA w odniesieniu do aktywności metabolicznej jest skomplikowana, ponieważ regulacja zachodzi również na poziomie mRNA, gdzie sekwencja i stabilność cząsteczek mRNA są edytowane po transkrypcji z DNA. Ta edycja reguluje translację izoform białek i ilość translacji białek w rybosomach. Ponadto proces translacji białek jest kontrolowany i ostatecznie wpływa na ekspresję enzymów, a tym samym na aktywność. Połączone efekty wyżej wymienionych etapów regulacyjnych można ocenić za pomocą ilościowych testów ekspresji białek, takich jak Western Blotting lub mikromacierze lizatu białek z odwróconą fazą, lub jakościowych testów ekspresji białek, takich jak immunocytochemia i immunohistochemia, ale techniki te nie uwzględniają dalszych efektów regulacyjnych, takich jak potranslacyjna modyfikacja białek i funkcjonalna regulacja enzymów w ich zatłoczonym mikrośrodowisku. Co więcej, ekspresja enzymu może słabo korelować z jego aktywnością, tak więc pomiary aktywności oczyszczonego enzymu w homogenatach komórkowych lub tkankowych lub w rozcieńczonych roztworach są szeroko stosowane do badań aktywności enzymów. Jednak eksperymenty te nie są w stanie odtworzyć wpływu zatłoczonej cytoplazmy lub organelli na aktywność enzymu. Co więcej, wszystkie wyżej wymienione techniki określają albo ilość, albo lokalizację ekspresji mRNA lub enzymu, ale nie są w stanie dostarczyć wyczerpujących informacji na temat obu tych aspektów ekspresji enzymów, nie mówiąc już o integracji tych informacji z określeniami aktywności enzymu. 2,3,4

Mapowanie metaboliczne pozwala na docenienie wszystkich wyżej wymienionych zmiennych, które determinują aktywność enzymu. Co więcej, mapowanie metaboliczne jest formą obrazowania żywych komórek lub tkanek z komórkami i tkankami, które są utrzymywane w stanie nienaruszonym podczas analizy, w celu wygenerowania niemal wiernej naturze sytuacji w celu wygenerowania danych o aktywności enzymów. Tworzy obrazy, które ułatwiają zarówno szczegółową ocenę lokalizacji aktywności enzymu, jak i solidną ocenę ilościową aktywności enzymu w komórce lub przedziale tkankowym. 3,4 Opisane tutaj protokoły metabolicznego mapowania aktywności dehydrogenaz są oparte na podręczniku laboratoryjnym wszystkich dostępnych metod histochemicznych enzymów,5 na zasadach ilościowej histochemii enzymów,6 oraz na analizie obrazu ilościowego mapowania metabolicznego. 4

Dehydrogenazy to enzymy, które przeprowadzają reakcje redoks w celu zredukowania kanonicznych kofaktorów, takich jak NAD+, NADP+ i FAD do odpowiednio NADH, NADPH i FADH2. Nienaruszone komórki lub skrawki tkanek kriostatu, które nie są chemicznie utrwalone, inkubuje się w pożywce reakcyjnej, która zawiera, między innymi, substrat i kofaktory specyficznej dehydrogenazy i soli tetrazolowej. Następnie ta dehydrogenaza wykonuje swoją aktywność katalityczną i redukuje, na przykład, NADP+ do NADPH. Za pomocą nośnika elektronów, 2 cząsteczki NADPH ostatecznie redukują 1 rozpuszczalną w wodzie, półbezbarwną cząsteczkę soli tetrazolowej do 1 nierozpuszczalnej w wodzie niebieskiej cząsteczki formazanu, która natychmiast wytrąca się w miejscu dehydrogenazy. W związku z tym absorbancja wytrąconego formazanu jest bezpośrednią miarą lokalnej aktywności dehydrogenazy i może być obserwowana za pomocą mikroskopii świetlnej lub określana ilościowo za pomocą monochromatycznej mikroskopii świetlnej i analizy obrazu. Ilościowy aspekt tego protokołu umożliwia naukowcom wyciąganie wniosków statystycznych z tych testów. Ponadto ta kwantyfikacja ułatwia określenie parametrów enzymów kinetycznych in situ, takich jak maksymalna aktywność enzymu (Vmax) i powinowactwo substratu do enzymu (Km). 3,4,5,6

Podczas planowania eksperymentu mapowania metabolicznego, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że na eksperyment zaleca się maksymalnie pięćdziesiąt szkiełek z przylegającymi preparatami komórkowymi lub skrawkami tkanki, aby zminimalizować opóźnienia czasowe podczas inkubacji w celu uzyskania spójnych wyników. Możliwe jest przetwarzanie większej liczby preparatów i/lub kompozycji podłoża, gdy te etapy protokołu są przeprowadzane wspólnie przez więcej niż jednego eksperymentatora. Co więcej, istnieje pewna zmienność między eksperymentami. W związku z tym identyczne doświadczenia należy powtórzyć co najmniej 3 razy z cytospinami z każdego preparatu komórkowego lub skrawkami z każdej próbki tkanki, a do każdego doświadczenia powinny być włączone odpowiednie kontrole. Zawsze należy przygotować kontrolną pożywkę inkubacyjną przy braku substratu, ale w obecności kofaktorów w celu kontroli barwienia niespecyficzną aktywnością enzymatyczną. Najbardziej reprezentatywne wyniki uzyskuje się w doświadczeniach, w których różne stężenia substratu/kofaktora są stosowane do skrawków tkanek lub preparatów komórkowych z tej samej próbki, tak aby eksperymentator mógł przeprowadzić analizy kinetyki enzymów przy użyciu krzywych dawka-aktywność.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Oceny Medyczno-Etycznej Akademickiego Centrum Medycznego dotyczącymi wykorzystania materiału ludzkiego.

1. Przygotowanie komórek lub skrawków tkanek

  1. Komórek
    1. Trypsynizować komórki z szalek hodowlanych za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C na 10-milimetrowej szalce Petriego i umieścić komórki w zawiesinie o temperaturze 37 °C 50 000-200 000 komórek/ml, w zależności od wielkości komórek.
    2. Umieścić 200 μl zawiesiny komórek na szkiełkach mikroskopowych za pomocą lejków cytospinowych w cytowirówce przy 20 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Suszyć cytospiny na powietrzu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Nie wpływa to na aktywność dehydrogenazy. 5
  2. Skrawki tkanek
    1. Pobieraj tkanki od pacjentów lub zwierząt zgodnie z zezwoleniami etycznymi. 10mm3 tkanki wystarcza do przeprowadzenia wielu eksperymentów.
    2. Umieść kawałki tkanki w małych wentylowanych plastikowych fiolkach o pojemności 2 ml i zamroź fiolki zawierające kawałek tkanki w ciekłym azocie.
    3. Przechowywać fiolki zawierające fragmenty tkanek w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
    4. Użyj żelowego medium zwanego optymalną temperaturą cięcia (OCT), aby zamontować próbkę tkanki na uchwycie, który szybko zamarza do -20 °C do -25 °C, tak aby woda nie mogła tworzyć kryształów.
    5. Do cięcia należy użyć kriostatu i najpierw przyciąć blok do żądanego poziomu (najlepiej połowy szerokości szkiełka mikroskopowego, np. 5 mm x 5 mm).
    6. Podczas krojenia użyj szczotek i płytki zapobiegającej zwijaniu się sekcji, aby zapobiec zwijaniu się sekcji do góry.
    7. Pokrój próbki tkanek na odcinki o grubości 6-10 μm z powolną, ale stałą prędkością (1 s na sekcję). Gdy sekcja jest prawidłowo przycięta, pozostaje płasko na nożu mikrotomowym pod płytą zabezpieczającą.
    8. Zebrać 1-3 skrawki na mikroskopijnych szkiełkach podstawowych i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Liczba przygotowanych skrawków zależy od wielkości próbki tkanki i pożądanej grubości skrawków.

2. Enzymatyczne histo/cytochemia dla rozpuszczalnych dehydrogenaz

  1. Przygotowanie buforu reakcyjnego.
    1. Przygotować 100 ml buforu fosforanowego o odpowiednim pH (patrz Tabela 1; każdy enzym ma optymalne pH, przy którym jego aktywność jest najwyższa). Na przykład mieszać roztwory 0,1 M KH2PO4 (kwaśny) i 0,1 M NA2HPO4 (zasadowy), aż do uzyskania buforu o odpowiednim pH.
    2. Odważyć 18 g alkoholu poliwinylowego (PVA) do buforu fosforanowego pod wyciągiem, ponieważ PVA jest pylisty i toksyczny.
      1. Rozpuścić 18% w/v PVA w buforze fosforanowym w temperaturze 100 °C, ogrzewając bufor au bain marie (umieścić szklaną butelkę we wrzącej wodzie) i mieszając aż do całkowitego rozpuszczenia PVA. Roztwór będzie wtedy przezroczysty, z małymi pęcherzykami powietrza, które są spowodowane mieszaniem. Zazwyczaj potrzeba ~15 minut, aby PVA się rozpuścił.
        UWAGA: 18% w/v PVA w buforze fosforanowym jest lepki i można go przenieść do 15 ml probówek z buforem reakcyjnym za pomocą szerokiej pipety. Krótkotrwałe przechowywanie 18% w/v PVA w buforze fosforanowym powinno nastąpić w temperaturze ≥40 °C, a długotrwałe przechowywanie (do 2 tygodni) w temperaturze ≥ 60 °C. Do przygotowania cytospiny zwykle wymagane jest 250 μl 18% w/v PVA w buforze fosforanowym, podczas gdy do wycinka tkanki wymagane jest 500 μl.
    3. Przygotować roztwór soli tetrazolowej (nitroBT). Na każdy 1 ml pożywki inkubacyjnej wymagane jest 40 μl roztworu nitroBT, składającego się z 5 mg nitroBT (żółtego proszku) rozpuszczonego w mieszaninie 20 μl dimetyloformamidu (DMF) i 20 μl etanolu, który będzie jasnożółtym przezroczystym roztworem.
      UWAGA: Ponieważ stabilność nitroBT jest najniższa ze wszystkich niezbędnych odczynników, zaleca się przygotowanie roztworu podstawowego nitroBT na końcu i najpierw rozpuszczenie nitroBT w pożywce reakcyjnej.
      1. Rozpuść nitroBT w DMF i etanolu, podgrzewając go w szklanej fiolce przez krótki okres czasu (~10 s) za pomocą palnika Bunsena. Podczas podgrzewania należy wstrząsnąć fiolką i nie pozostawiać fiolki zbyt długo w płomieniu, aby zapobiec parowaniu.
      2. Przygotuj 10% dodatkowego roztworu nitroBT, aby umożliwić odparowanie DMF i etanolu podczas procesu rozpuszczania.
    4. Osłoń nośniki elektronów, metosiarczan fenazyny (PMS) lub (1-metoksy)-metosiarczan fenazyny (mPMS) oraz pożywki inkubacyjne zawierające m (PMS) przed bezpośrednim światłem, owijając folię aluminiową wokół szklanej fiolki do przechowywania.
    5. Przygotować roztwory odczynników zgodnie z tabelą 1, rozpuszczając je w destylowanymH2O. Niektóre odczynniki szybko się psują, dlatego przygotuj je jak najkrócej przed eksperymentem. Roztwory odczynników należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    6. Przygotować pożywkę do inkubacji, jak pokazano w tabeli 1 i homogenizować roztwór po każdym etapie, delikatnie mieszając. Unikać wytwarzania pęcherzyków powietrza w pożywce inkubacyjnej poprzez ciągłe mieszanie i utrzymywanie szpatułki pod powierzchnią pożywki inkubacyjnej podczas mieszania.
  2. Nakładanie pożywki inkubacyjnej na skrawki tkanek
    1. Wstępnie ogrzane szkiełka mikroskopowe z cytospinami lub skrawkami tkanek przymocowanymi w temperaturze 37 °C w komorze inkubacyjnej immunohistochemicznej na 15 minut. Zanurzyć dno komory inkubacyjnej immunohistochemii w ciepłej wodzie, aby utrzymać stałą temperaturę w inkubatorze.
    2. Ostrożnie odciąć lub odciąć pipety Pasteura na przejściu od wąskiej do szerokiej części. Zwykłe pipety Pasteura są zbyt wąskie, aby zassać lepką pożywkę inkubacyjną, dlatego ten krok jest potrzebny, aby pipety Pasteura były wystarczająco szerokie, aby można było zaaspirować pożywkę inkubacyjną.
    3. Nanieść 250-500 μl odpowiedniej pożywki inkubacyjnej na każdy preparat komórkowy lub wycinek tkanki na szkiełkach mikroskopowych za pomocą szerokiej części pipety Pasteura.
    4. Użyj końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić pożywkę inkubacyjną. Należy zignorować małe pęcherzyki powietrza w pożywce inkubacyjnej, ponieważ będą one unosić się na powierzchni i nie będą zakłócać reakcji enzymatycznej w preparacji komórek lub sekcji tkanki na szkiełku mikroskopowym.
    5. Preparaty komórkowe lub skrawki tkanek należy inkubować na szkiełkach mikroskopowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C (np. inkubatorze do hodowli tkankowych) przez określony czas, w zależności od kinetyki enzymu i jego ekspresji w określonym preparacie komórkowym lub tkance (tabela 1). Pokrywę komory inkubacyjnej immunohistochemii należy trzymać zamkniętą, aby utrzymać wilgotne środowisko i zapobiec wysychaniu buforu reakcyjnego.
  3. Mycie szkiełek mikroskopowych
    1. Stuknąć nadmiar pożywki inkubacyjnej na chusteczkę.
    2. Mechanicznie wypłukać pożywkę inkubacyjną ze szkiełek mikroskopowych w buforze fosforanowym o temperaturze 60 °C, pH 5,3, przesuwając szkiełka mikroskopowe w górę i w dół w buforze. To zatrzymuje reakcję enzymatyczną.
    3. Umyć szkiełka mikroskopowe, trzymając je w buforze fosforanowym o temperaturze 60 °C, pH 5,3 przez 20 minut.
    4. Szkiełka mikroskopowe należy umyć mechanicznie w wodzie z kranu o temperaturze 60 °C.
    5. Umyj szkiełka mikroskopowe, trzymając je w wodzie z kranu o temperaturze 60 °C przez 20 minut.
    6. Poczekaj, aż woda i szkiełka ostygną, powoli mieszając wodę z kranu o temperaturze pokojowej z wodą z kranu o temperaturze 60 °C w ciągu 1 minuty.
    7. Ostatni etap mycia mechanicznego należy wykonać w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej.
  4. Umieść barwione cytospiny lub skrawki tkanek na szkiełkach mikroskopowych
    1. Podgrzej podgrzewacz do szkiełek w temperaturze 50-60 °C.
    2. Ostrożnie osusz tylną stronę szkiełek mikroskopowych za pomocą ręcznika papierowego i umieść je na podgrzewaczu do szkiełek, aby wysuszyć górną stronę szkiełka mikroskopowego.
    3. Gdy szkiełka wyschną, należy zamknąć preparaty komórkowe lub skrawki tkanek na szkiełkach mikroskopowych za pomocą podłoża do mocowania galaretki glicerolowej i szkiełek nakrywkowych.
    4. Preparaty komórkowe lub skrawki tkanek należy przechowywać w ciemności w lodówce w temperaturze 4 °C lub natychmiast przystąpić do akwizycji obrazu.

3. Akwizycja obrazu

  1. Rejestruj obrazy za pomocą naukowej monochromatycznej kamery CCD o wystarczającym zakresie dynamiki (co najmniej 8-bitowym, ale najlepiej 10-bitowym lub 12-bitowym), stałym wzmocnieniu i liniowej charakterystyce.
  2. Wybierz odpowiedni obiektyw (20X-63X dla cytospinów i 10-63X dla odcinków tkanek).
  3. Zmniejsz odblaski, zwężając przysłonę pola widzenia tak, aby była nieco większa niż pole widzenia.
  4. Użyj światła monochromatycznego, stosując filtr wnioskowania pasmowoprzepustowego o szerokości 10 nm w pobliżu izobestycznej długości fali osadu formazanu7 w połączeniu z filtrem blokującym podczerwień (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Maksymalna absorbancja izobestyczna nitroBT wynosi 585 nm.
  5. Zoptymalizuj oświetlenie, aby upewnić się, że używany jest cały zakres poziomu szarości kamery (tj. ustaw poziom oświetlenia tak, aby osiągnąć maksymalne oświetlenie bez nadmiernego naświetlania podczas nagrywania pustego szkiełka mikroskopowego).
  6. Skalibruj zmierzone poziomy szarości do znanych wartości absorbancji (lub gęstości optycznej [OD]). W tym celu należy wykonać obrazy w skali szarości co najmniej 10 różnych kroków szkiełka kalibracyjnego lub tabletki krokowej ze znanymi wartościami średnicy zewnętrznej (patrz krok 4.1.1), które są dostępne na rynku (patrz tabela materiałów) lub zmierzyć za pomocą densytofotometru specjalnie wykonaną tabletkę z klinem skali szarości i wykorzystać wyniki do kalibracji zmierzonych wartości szarości do znanych wartości absorbancji.
  7. Zrób zdjęcia mikrofotografii interesujących komórek lub odcinków tkanki.

4. Analiza obrazu

  1. Przed analizą obrazu należy skalibrować oprogramowanie ImageJ do pomiarów absorbancji.
    1. Zmierzyć absorbancję (OD) mikrofotografii z co najmniej 10 obszarów kalibracyjnych o znanych parametrach absorbancji na szkiełku kalibracyjnym lub tabletce schodkowej o znanych wartościach OD. W ImageJ użyj menu Analizuj → Zmierz lub skrótu Ctrl+M, aby zmierzyć wybrany obszar.
    2. Rozpocznij procedurę kalibracji absorbancji, przechodząc do części Analiza → kalibracji. Wybierz funkcję "Rodbard (obraz NIH)". W lewej kolumnie okna, które zostanie otwarte, znajdują się już wyniki pomiarów poziomu szarości z każdego kroku szkiełka kalibracyjnego/tabletki krokowej wykonanej w ppkt 4.1.1. Jeśli nie, skopiuj je z ekranu wyników ImageJ. W prawej kolumnie wprowadź każdą odpowiednią znaną wartość absorbancji wydrukowaną na certyfikacie otrzymanym wraz ze skalibrowaną tabletką krokową. Zaznacz pola "Kalibracja globalna" i "Pokaż wykres" i naciśnij "OK".
    3. W celu kontroli jakości upewnij się, że R2 funkcji Rodbard wynosi >0,99. Jeśli wynosi <0,99, sprawdź, czy szkiełka kalibracyjne zostały prawidłowo sfotografowane i zmierzone oraz czy znane parametry absorbancji zostały wprowadzone prawidłowo.
    4. ImageJ jest teraz kalibrowany do momentu zamknięcia programu (stąd "kalibracja globalna"). W przypadku pomiarów absorbancji, skalibrowana sesja ImageJ zawsze przelicza obserwowane średnie absorbancji na wartości od 0 do 1, gdzie 0 i 1 to asymptoty odpowiednio zerowej i pełnej absorbancji.
  2. W przypadku cytospinów wybierz >100 pojedynczych komórek w sposób losowy. W przypadku przekrojów tkanek wybierz jedno lub więcej pól zainteresowania o stałej długości i szerokości we wszystkich sekcjach.
    1. Wyświetlaj raster na mikrofotografiach, aby pomóc w bezstronnym wyborze komórek. W ImageJ wyświetl siatkę na obrazie za pomocą menu Wtyczki → Analizuj → siatkę.
    2. W ImageJ użyj narzędzia Eliptyczny, aby zaznaczyć pojedyncze komórki, a użyj narzędzia Prostokąt, aby zaznaczyć obszary tkanki.
  3. Zmierz absorbancję i powierzchnię wybranych komórek lub obszarów tkanki. Gęstość optyczna i pole są nazywane odpowiednio "Średnią" i "Obszarem" w arkuszu kalkulacyjnym wyników ImageJ.
    UWAGA: Całkowita absorbancja komórki lub regionu tkanki (jeśli wybrano kilka obszarów tkanki o różnych rozmiarach) jest równa sumie wszystkich oddzielonych absorbancji pikseli. Jeśli komórka jest obrazowana przez 1000 pikseli, to całkowita absorbancja jest wyrażona przez sumę 1000 absorbancji, a średnia absorbancja jest wyrażona przez całkowitą absorbancję/1000. Ta procedura pozwala również uniknąć błędu dystrybucji.
  4. Określić średnią całkowitą absorbancję >30 komórek lub regionów tkanek z szkiełka kontrolnego (szkiełek kontrolnych), które zawierają próbkę, która została wystawiona na działanie kontrolnej pożywki inkubacyjnej przy braku substratu, ale w obecności kofaktorów. Ta absorbancja kontrolna służy do kontroli niespecyficznego barwienia aktywnością enzymatyczną i artefaktów absorbancji indukowanych przez zastosowane szkiełka mikroskopowe, podłoże montażowe, szkiełko nakrywkowe lub mikroskop.
  5. Odjąć średnią absorbancję kontrolną od wszystkich pomiarów absorbancji całkowitej próbek, które poddano działaniu pożywki inkubacyjnej o tym samym stężeniu kofaktora (ale różnych stężeniach substratu i/lub inhibitora). Daje to skorygowaną całkowitą absorbancję komórki lub obszaru tkanki.
  6. Porównaj statystycznie średnie skorygowane absorbancje całkowite za pomocą testu Studenta T-test lub jednoczynnikowego testu ANOVA, w zależności od projektu eksperymentalnego.
  7. Absorbancję formazanu można przekształcić w aktywność enzymatyczną (substrat przekształcony w μmol na ml na min) przy użyciu prawa Lamberta-Beera: c=A/(є×d), gdzie c jest stężeniem formazanu w podłożu reakcyjnym, A jest zmierzoną absorbancją w ImageJ po kalibracji; є jest współczynnikiem ekstynkcji formazanu (16.000 przy 585 nm)8 a d to odległość przechodząca światło, która jest równa średniej grubości komórki lub nominalnej grubości cięcia przekroju (6-10 μm w tym protokole).
    UWAGA: Po wysuszeniu grubość przekroju tkanki zmniejsza się o ~50% w stosunku do nominalnej grubości cięcia przekroju, ale nie jest to odzwierciedlone w powyższych obliczeniach, ponieważ nominalna grubość cięcia przekroju jest biologicznie najbardziej istotna. Średnią grubość komórek i wymiary kuli preparatów komórkowych przylegających do szkiełek mikroskopowych można określić za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii szerokokątnej, dla których protokoły można znaleźć w innym miejscu. 9,10

Wyniki

Przedstawiono kilka protokołów przygotowania pożywki inkubacyjnej w celu zbadania aktywności konkretnej dehydrogenazy. W przypadku każdej dehydrogenazy należy rozpuścić wymienione odczynniki w roztworze PVA, utrzymując temperaturę co najmniej 37 °COdczynniki należy rozpuszczać w kolejności wymienionej w tabeli, t. j. nitroBT jest zawsze rozpuszczany jako pierwszy, a (m)PMS jako ostatni. Każde 5 mg nitroBT rozpuszcza się w 40 µL wymieszaj (20 µL etanol + 20 µL dimetyloformamid). Wszystkie objętości podano w przeliczeniu na 1 ml 18% roztworu PVA, którym można zabarwić ok. 2 przekroje tkanek lub ok. 4 preparaty komórkowe na szkiełkach przedmiotowych. NitroBT, NAD+, NADP+roztwory ADP i substratów należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. NaN3, MgCl22 or roztwory (m)PMS można przechowywać w 4 °C przez jeden miesiąc. 18% PVA rozpuszczony w buforze fosforanowym można przechowywać w 60 °C przez 2 tygodnie. Wartość pH 18% roztworu PVA można ustawić, stosując różne składy 0,1 M fosforanu potasu jednowodnego (KH2PO4) oraz 0,1 M wodorofosforanu sodu (NA2HPO4) bufory. Przedstawione okresy inkubacji stanowią dobre punkty wyjścia, jednak optymalny czas inkubacji zależy od gatunku, rodzaju tkanki oraz stopnia jej utrwalenia. Generalnie preparaty komórkowe powinny być inkubowane dłużej niż skrawki tkanek, aby uzyskać podobny poziom produkcji formazanu.

Izocytrynian dehydrogenaza 1 i 2 (IDH1/2) typu dzikiego katalizują przekształcenie izocytrynianu w α-ketoglutaran (αKG) z jednoczesną redukcją NADP+ do NADPH odpowiednio w cytoplazmie i mitochondriach. Enzymy te wzbudziły ostatnio zainteresowanie, ponieważ mutacje IDH1/2 występują w różnych typach nowotworów u ludzi, w tym w pierwotnym raku mózgu (glejak wielopostaciowy) i raku jelita grubego, co daje wyjątkową możliwość zademonstrowania możliwości mapowania metabolicznego. Mutacje IDH1 znoszą aktywność enzymu IDH1 typu dzikiego, a także indukują aktywność neoenzymatyczną, która prowadzi do produkcji i następującej po niej akumulacji onkometabolitu D-2-hydroksyglutaranu (D-2HG),11 co jest szczegółowo omówione w innym miejscu.12 Eksperymenty z mapowania metabolicznego wykazały, że aktywność IDH1/2 zależna od NADP+ była znacznie niższa w komórkach raka jelita grubego z wprowadzona heterozygotyczną mutacją IDH1 niż w komórkach raka jelita grubego typu dzikiego IDH1 (Rycina 1A). Różnicę tę określono ilościowo poprzez analizę obrazu monochromatycznych mikrofotografii świetlnych (Rycina 1B).12

Kolejny przykład ilustrujący eksperymenty z mapowaniem metabolicznym przedstawiono na Rysunku 2, który jest obrazem skrawka mózgu myszy pobranego z kriostatu, do którego wstrzyknięto ludzkie komórki glejaka wielopostaciowego. IDH1/2 jest najważniejszym dostawcą NADPH w ludzkim mózgu, a jego aktywność jest zwiększona w glejaku wielopostaciowym z dzikim typem IDH1/2, podczas gdy zdolność produkcji NADPH przez IDH1/2 w mózgach gryzoni jest znacznie niższa.11 Rysunek 2A pokazuje różnicę między wysoką aktywnością IDH1/2 zależną od NADP+ w ludzkich komórkach glejaka wielopostaciowego a niską aktywnością IDH1/2 zależną od NADP+ w zdrowym mózgu myszy. Aktywność IDH1/2 jest określona jako produkcja µmol NADPH na mL tkanki na minutę na Rysunku 2B.

Reakcja enzymatyczna IDH1/2 jest stosunkowo prosta, natomiast dehydrogenaza mleczanowa (LDH) stanowi bardziej złożony kompleks enzymatyczny. LDH katalizuje odwracalną przemianę mleczanu w pirogronian z jednoczesną redukcją NAD+ do NADH lub odwrotnie. Dostępność mleczanu i pirogronianu oraz skład kompleksu enzymatycznego LDH determinują, czy mleczan jest przede wszystkim przekształcany w pirogronian (co jest katalizowane przez LDH-B i prowadzi do powstania NADH), czy też pirogronian jest przede wszystkim przekształcany w mleczan (co jest katalizowane przez LDH-A i zużywa NADH).13 Eksperymenty z mapowania metabolicznego pozwalają na wizualizację aktywności reakcji LDH-B, lecz są „ślepe” na aktywność reakcji LDH-A, ponieważ nie dochodzi w niej do produkcji NADH, a w konsekwencji nitroBT nie zostaje zredukowane do formazanu. Rysunek 3 przedstawia zależną od NAD+ aktywność LDH (t.j. przekształcanie mleczanu w pirogronian) w przekrojach ludzkiego mózgu wobec braku substratu (Rysunek 3A), w obecności wysokiego stężenia mleczanu (Rysunek 3B), w obecności 6 mM mleczanu (Rysunek 3C) oraz w obecności niskiego stężenia mleczanu i wyższego stężenia pirogronianu (Rysunek 3D). Wyniki tych eksperymentów ilustrują, że mapowanie metaboliczne w sposób adekwatny oddaje fakt, iż zależna od NAD+ aktywność LDH w przekrojach tkanek zależy od dostępności mleczanu i pirogronianu w środowisku reakcyjnym.

Zdjęcia mikroskopowe i wykres absorbancji pokazują efekty mutanta IDH1 przy różnych poziomach izocytrynianu.

Rysunek 1. Aktywność IDH1/2 zależna od NADP+ w ludzkich komórkach raka jelita grubego. (A) Reprezentatywne monochromatyczne mikrofotografie komórek ludzkiego raka jelita grubego HCT116 po barwieniu na aktywność IDH1/2 zależną od NADP+ w obecności 1-10 mM izocytrynianu i 0,8 mM NADP+. Paski skali = 50 µm. (B) Ilościowe oznaczenie absorbancji niebieskiego formazanu powstałego z nitroBT w wyniku aktywności IDH1/2 zależnej od NADP+ na jedną komórkę, przeprowadzone z wykorzystaniem światła monochromatycznego w (A) oraz analizy obrazu. Skróty: IDH1WT/WT, dehydrogenaza izocytrynianowa 1 typu dzikiego; IDH1WT/MUT, dehydrogenaza izocytrynianowa 1 zmutowana. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Histologia glejaka wielopostaciowego, oznaczanie ilości NADPH; obraz przekroju i wykres słupkowy porównujący dane od myszy i ludzi.

Rysunek 2. Aktywność IDH1/2 zależna od NADP+ w próbkach glejaka wielopostaciowego człowieka. (A) Reprezentatywna mikrofotografia przekroju mózgu myszy zawierającego zdrowy mózg myszy (h) oraz ksenoprzeszczep guza glejaka wielopostaciowego człowieka (t) po barwieniu na aktywność IDH1/2 zależną od NADP+ w obecności 0,8 mM NADP+ i 2 mM izocytrynianu. Pasek skali = 200 µm (B) Ilościowe oznaczenie aktywności enzymatycznej obszarów mózgu myszy (h) i ksenoprzeszczepu glejaka wielopostaciowego człowieka (t) przedstawionych na (A) z zastosowaniem prawa Lamberta-Beera. Słupki błędu reprezentują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki barwienia histologicznego; obrazy mikroskopowe przedstawiające próbki tkanek, analiza eksperymentu.

Rycina 3. Aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH) zależnej od NAD+ w próbkach ludzkiego mózgu. Reprezentatywne mikrofotografie seryjnych przekrojów próbek ludzkiego mózgu po barwieniu na aktywność LDH zależnej od NAD+ (A) w warunkach kontrolnych (wobec 3 mM NAD+, bez substratu i pirogronianu) (B) w obecności 150 mM mleczanu, bez pirogronianu (C) w obecności 6 mM mleczanu, bez pirogronianu oraz (D) w obecności 6 mM mleczanu i 18 mM pirogronianu, który jest konkurencyjnym inhibitorem produktowym reakcji przemiany mleczanu w pirogronian. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Enzym:G6PDHLDHSDHMDHIDH1IDH2IDH36PGDGDH
18% PVA w 100 mM buforze fosforanowym1 ml; pH = 7,41 mL; pH = 7,41 mL; pH = 8,01 ml; pH = 7,41 ml; pH = 7,41 ml; pH = 7,41 mL; pH = 7,41 ml; pH = 8,01 ml; pH = 8,0
5 mM NitroBT5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL mieszaj5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL wymieszać5 mg/40 µL wymieszać
5 mM NaN₃3 10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL
5 mM MgCl22 10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL
3 mM NAD+10 µL10 µL10 µL
0,8 mM NADP10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL
2 mM ADP10 µL
podłoże10 mM glukozo-6-fosforanu150 mM mleczanu50 mM bursztynianu100 mM kwasu jabłkowego2 mM izocytrynianu 2 mM izocytrynianu2 mM izocytrynianu10 mM 6-fosfo-galaktonianu10 mM kwasu glutaminowego
0,32 mM mPMS 10 µL10 µL10 µL10 µL10 µL
0,2 mM PMS 10 µL10 µL10 µL10 µL
Czas inkubacji5 min30 min60 min60 min30 min30 min30 min10 min30 min

Tabela 1. Schematyczny przegląd protokołu mapowania metabolicznego dla dehydrogenaz. Skróty: ADP, difosforan adenozyny; (m)PMS (metoksy)-5-metylofenazynium metylosiarczan; nitroBT, chlorek nitro błękitu tetrazoliowego; G6PDH, dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu; LDH, dehydrogenaza mleczanowa; SDH, dehydrogenaza bursztynianowa; MDH, dehydrogenaza jabłczanowa; IDH, dehydrogenaza izocytrynianowa; 6PGD, dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa; GDH, dehydrogenaza glutaminianowa.

Dyskusja

Badania nad metabolizmem komórkowym przeżywają obecnie renesans, ponieważ naukowcy zdają sobie sprawę, że efekty metaboliczne mają kluczowe znaczenie dla patogenezy i leczenia wielu chorób. 1 Ponadto badania metaboliczne są wspomagane przez rosnącą dostępność technik, które zapewniają tej dziedzinie badań więcej narzędzi niż kiedykolwiek, w tym spektrometrię mas, znakowanie radioizotopowe i spektrometrię magnetycznego rezonansu jądrowego. Mapowanie metaboliczne nie jest w żadnym wypadku nową techniką, ale jej zdolność do dostarczania zintegrowanych informacji na temat aktywności enzymów w sytuacji niemal zgodnej z naturą sprawia, że technika ta jest bardziej istotna niż kiedykolwiek. cyfra arabska

Kofaktory NAD+ i NADP+ znajdują się we wszystkich żywych komórkach, co wskazuje, że dehydrogenazy powstały bardzo wcześnie podczas ewolucji i odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym. Obecnie zachodzą 523 reakcje katalizowane enzymami, które są klasyfikowane jako dehydrogenazy i występują u wszystkich gatunków. 16 Teoretycznie aktywność wszystkich różnych reakcji dehydrogenazy może być oddzielnie badana poprzez dostosowanie opisanego tutaj protokołu mapowania metabolicznego. Każda reakcja enzymatyczna jest wyjątkowa ze względu na substrat i kofaktory, które są potrzebne do jej działania. W związku z tym aktywność każdej reakcji enzymatycznej można określić za pomocą eksperymentu mapowania metabolicznego z odpowiednim substratem i kofaktorami w pożywce reakcyjnej. Jednak niektóre izoformy enzymów różnią się lokalizacją subkomórkową, np. jedna izoforma katalizuje reakcję w cytoplazmie, podczas gdy inna izoforma funkcjonuje w mitochondriach. Godnym uwagi przykładem są IDH1 i IDH2, z których pierwsze jest cytoplazmatyczne, a drugie mitochondrialne i są to dwa różne białka kodowane przez dwa różne geny. 11 Metylosiarczan 1-metoksy-5-metylofenazyny (metoksy-PMS) i metylosiarczan 5-metylofenazyny (PMS) mogą być używane jako nośniki elektronów w tych eksperymentach. Ten pierwszy nie przechodzi przez błony mitochondrialne, drugi tak. W związku z tym badania nad enzymami mitochondrialnymi (np. IDH2) powinny wykorzystywać PMS, podczas gdy badania nad enzymami cytozolowymi (np. IDH1) powinny wykorzystywać mPMS.

Podobnie jak w przypadku wielu technik, istnieją różne warianty tego protokołu, takie jak stosowanie różnych rodzajów soli tetrazoliowych, wykluczanie dodawania PMS i azydku sodu, stosowanie wodnego podłoża montażowego oraz różne czasy inkubacji i płukania, które mogą działać równie dobrze. Zastosowanie mapowania metabolicznego za pomocą soli tetrazolowych nie ogranicza się do dehydrogenaz. Z niewielkimi modyfikacjami protokołu, może on być również wykorzystywany do oceny aktywności enzymów, które działają bezpośrednio przed dehydrogenazą w szlaku metabolicznym. Wcześniej opisaliśmy tę zasadę dla enzymu glutaminazy, który działa bezpośrednio przed dehydrogenazą glutaminianu w szlaku glutaminolizy. 18 Teoretycznie tę samą zasadę można zastosować do innych enzymów, które działają bezpośrednio za lub przed dehydrogenazą, np. tojadazy, która leży bezpośrednio przed IDH2 i IDH3 w cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA). Inną prostą zmianą stężeń opisanych w tabeli 1 jest sporządzenie fiolek z pożywką inkubacyjną o różnych stężeniach substratu, kofaktora i/lub inhibitora. Pozwala to na generowanie krzywych dawka-aktywność w funkcji substratu, kofaktora i/lub stężenia inhibicji.

Technicznie rzecz biorąc, eksperymenty z mapowaniem metabolicznym nie ułatwiają bezstronnych obserwacji aktywności enzymów in situ, ponieważ naukowcy muszą wybrać stężenie substratu i kofaktora, które mogą nie odzwierciedlać poziomów substratu i kofaktora obecnych in situ. Ponadto zastosowanie lepkiego 18% PVA w pożywce reakcyjnej służy utrzymaniu makrocząsteczek w stanie nienaruszonym, na miejscu i w konformacji, ale uniemożliwia skuteczną dyfuzję odczynników o niskiej masie cząsteczkowej przez podłoże reakcyjne. 3,5 W związku z tym określone aktywności enzymatyczne w opisanych tutaj doświadczeniach, w których wykorzystuje się suprafizjologiczne stężenia substratów, nie odzwierciedlają sytuacji in vivo przy danym stężeniu substratu, ale są odpowiednie do porównań wewnątrzdoświadczalnych. Zatem wynikiem eksperymentów mapowania metabolicznego jest zdolność produkcyjna (maksymalna aktywność) reakcji enzymatycznej w kontekście poziomów substratu i kofaktora, które są obecne in situ. Ponadto zastosowanie różnych stężeń substratu i/lub kofaktorów oraz wielu próbek pozwala na bezstronne porównanie maksymalnej zdolności produkcyjnej (Vmax) i powinowactwa (Km) enzymu do substratu/kofaktora w preparatach komórkowych, tkankach lub regionach tkankowych. Parametry te są wynikiem sumy ekspresji białek enzymatycznych, modyfikacji potranslacyjnych oraz wpływu zatłoczonego mikrośrodowiska na aktywność enzymów. Dlatego mapowanie metaboliczne jest nadal lepszym odzwierciedleniem aktywności enzymu niż eksperymenty, które określają ekspresję białka lub aktywność oczyszczonego enzymu in vitro.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

R.J.M. jest wspierany przez stypendium doktoranckie AMC. Badania te były wspierane przez Holenderskie Towarzystwo Onkologiczne (grant KWF UVA 2014-6839). Autorzy dziękują dr A. Jonkerowi za pomoc w napisaniu protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól sodowa adenozyno-5′-difosforanuSigma-AldrichA2754
Sól sodowa 6-fosforanu D-glukozySigma-AldrichG7879
Wodorofosforan disodowy (NA2HPO4)Merck Millipore106559
bursztynian di-soduSigma-AldrichW327700
Hydrat soli trisodowej kwasu DL-izuelowegoSigma-AldrichI1252 
Kwas D-jabłkowySigma-Aldrich2300
Żelatyna glicerolowaSigma-AldrichGG1
Kwas L-glutaminowySigma-AldrichG1251
6-fosfo-D-galaktonian lituSigma-Aldrich55962
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
metoksy-fenazynosiarczanServa28966.01
Dinukleotyd nikotynamidoadeninowySigma-AldrichN0505 
Fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowegoSigma-AldrichNADP-RO
Nitrotetrazolium Niebieski chlorekSigma-AldrichN6876
Metosiarczan fenazynyServa32030.01
Alkohol poliwinylowy, w pełni hydrolizowanySigma-AldrichP1763
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Merck Millipore104873
Azydek soduSigma-AldrichS2002
L-mleczan soduSigma-AldrichL7022
Filtr pasmowoprzepustowyOptyka Edmundhttps://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/
Szaryklin schodkowyStouffer Industrieshttp://www.stouffer.net/TransPage.htm

Bibliografia

  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Van Noorden, C. J. Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry. J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).
  3. Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. Pathobiology of Human Disease. , Elsevier. 3760-3774 (2014).
  4. Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images. Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).
  5. Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , Oxford University Press, Royal Microscopical Society. (1992).
  6. Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G. Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. , Churchill Livingstone. 355-432 (1991).
  7. Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells. Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).
  8. Butcher, R. G. The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions. Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).
  9. Matsumoto, B. Cell biological applications of confocal microscopy. , Elsevier. (2002).
  10. Errington, R. J., White, N. S. Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy. Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).
  11. Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation. Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).
  12. Molenaar, R. J., et al. Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198. Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).
  13. Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma. Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).
  14. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , Sixth, Garland Science, Taylor and Francis Group. (2015).
  15. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. Biochemistry. , Eighth edition, W.HFreeman & Company, a Macmillan Education Imprint. (2015).
  16. Webb, E. C. International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press (1992).
  17. Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry). J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).
  18. van Lith, S. A., et al. Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers? Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno dehydrogenazyanaliza ilo ciowanitroblue tetrazoliumwytr canie formazanumikroskopia monochromatycznabadania inhibicji enzymatycznejmetabolizm kom rkowy

Powiązane artykuły