Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

19.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56845

⸱

19 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Streszczenie

Mikrobiom jelitowy człowieka odgrywa kluczową rolę w ochronie komórek przed urazami, w przetwarzaniu energii i składników odżywczych oraz w promowaniu odporności. Odchylenia od tego, co uważa się za zdrowy skład mikrobioty (dysbioza), mogą upośledzać funkcje życiowe, prowadząc do stanów patologicznych. Ostatnie i trwające wysiłki badawcze są ukierunkowane na scharakteryzowanie powiązań między składem mikrobiologicznym a zdrowiem i chorobą człowieka.

Postępy w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości umożliwiają scharakteryzowanie składu mikrobiologicznego jelit. Metody te obejmują sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA i sekwencjonowanie typu shotgun. Sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA służy do profilowania składu taksonomicznego, podczas gdy sekwencjonowanie typu shotgun dostarcza dodatkowych informacji na temat przewidywań genów i adnotacji funkcjonalnej. Zaletą stosowania metody sekwencjonowania celowanego regionu zmiennego genu 16S rRNA jest jej znacznie niższy koszt w porównaniu z sekwencjonowaniem typu shotgun. Różnice w sekwencji w genie 16S rRNA są wykorzystywane jako mikrobiologiczny odcisk palca do identyfikacji i ilościowego określenia różnych taksonów w pojedynczej próbce.

Główne międzynarodowe wysiłki wprowadziły standardy sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Jednak kilka badań wskazuje na powszechne źródło zmienności spowodowanej efektem partii. Aby zminimalizować ten efekt, należy wdrożyć ujednolicone protokoły pobierania, przetwarzania i sekwencjonowania próbek. Protokół ten proponuje integrację szeroko stosowanych protokołów, począwszy od pobierania próbek kału po analizę danych. Protokół ten obejmuje bezkolumnowe, bezpośrednie podejście PCR, które umożliwia jednoczesną obsługę i ekstrakcję DNA dużej liczby próbek kału, wraz z amplifikacją PCR regionu V4. Ponadto protokół opisuje potok analizy i udostępnia skrypt korzystający z najnowszej wersji QIIME (QIIME 2 wersja 2017.7.0 i DADA2). Ten protokół krok po kroku ma na celu poprowadzenie osób zainteresowanych rozpoczęciem stosowania sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA w solidny, reprodukcyjny, łatwy w użyciu i szczegółowy sposób.

Wprowadzenie

Podjęto skoncentrowane wysiłki, aby lepiej zrozumieć różnorodność i obfitość mikrobiomu, co jest kolejnym aspektem uchwycenia różnic i podobieństw między osobami w zdrowych i patologicznych warunkach. Wiek2,3, geografia4, lifestyle5,6, oraz choroba5 okazały się być związane ze składem mikrobiomu jelitowego, ale wiele schorzeń i populacji nie zostało jeszcze w pełni scharakteryzowanych. Ostatnio doniesiono, że mikrobiom może być modyfikowany do zastosowań terapeutycznych7,8,9. Dlatego dodatkowy wgląd w związek między różnymi warunkami fizjologicznymi a składem mikrobiologicznym jest pierwszym krokiem w kierunku optymalizacji potencjalnych przyszłych modyfikacji.

Tradycyjne metody hodowli mikrobiologicznej są ograniczone przez niskie plony10,11, i są konceptualizowane jako stan binarny, w którym bakteria jest albo obecna w jelitach, albo nie. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie oparte na DNA zrewolucjonizowało ekologię drobnoustrojów, umożliwiając schwytanie wszystkich członków społeczności mikrobiologicznej. Jednak długość i jakość odczytu sekwencji pozostają istotnymi barierami dla dokładnego przypisania taksonomii12. Co więcej, eksperymenty oparte na wysokiej przepustowości mogą ucierpieć z powodu efektów wsadowych, w których na pomiary mają wpływ zmienne niebiologiczne lub nienaukowe13. W ostatnich latach powstało kilka programów mających na celu badanie ludzkiego mikrobiomu, w tym American Gut project, United States (US) Human Microbiome Project i United Kingdom (UK) MetaHIT. Inicjatywy te wygenerowały ogromne ilości danych, które nie są łatwe do porównania ze względu na brak spójności w ich podejściu. Różne międzynarodowe projekty, takie jak Międzynarodowe Konsorcjum Mikrobiomu Człowieka, projekt Międzynarodowe Standardy Mikrobiomu Człowieka oraz Narodowy Instytut Standardów i Technologii (NIST) próbowały rozwiązać niektóre z tych problemów14 i opracowały standardy pomiarów mikrobiomu, które powinny umożliwić osiągnięcie wiarygodnych wyników reprodukcyjnych. Opisany tutaj jest zintegrowany protokół kilku szeroko stosowanych metod15,16 dla wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA (16S-seq), zaczynając od pobierania próbek kału poprzez analizy danych. Protokół opisuje podejście PCR bez kolumn, pierwotnie zaprojektowane do bezpośredniej ekstrakcji DNA roślinnego16, aby umożliwić jednoczesną obsługę dużej liczby próbek kału w stosunkowo krótkim czasie z wysokiej jakości amplifikowanym DNA do ukierunkowanego sekwencjonowania zmiennego mikrobiologicznego regionu V4 na wspólnej platformie sekwencjonowania. Protokół ten ma na celu poprowadzenie naukowców zainteresowanych zainicjowaniem stosowania sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA w solidny, reprodukcyjny, łatwy w użyciu i szczegółowy sposób, przy użyciu ważnych elementów kontrolnych. Posiadanie szczegółowego i szczegółowego protokołu krok po kroku może zminimalizować efekt wsadowy, a tym samym umożliwi bardziej porównywalne wyniki sekwencjonowania między laboratoriami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Etyczna zgoda na badanie została udzielona przez Lokalną Komisję Etyki Badań Sheba, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Protokół otrzymał wyjątek od zgody pacjenta od lokalnej Komisji ds. Oceny Etycznej, ponieważ materiał kałowy, który został użyty, został już przesłany do rdzenia mikrobiologicznego w ramach badań klinicznych i bez możliwych do zidentyfikowania informacji o pacjencie innych niż wiek, płeć i wyniki mikrobiologiczne. Uzyskano pisemną, świadomą zgodę od zdrowych ochotników, a Instytucjonalna Komisja Rewizyjna zatwierdziła badanie. Niektóre z tych próbek zostały już uwzględnione w poprzedniej analizie1.

1. Postępowanie z próbkami

  1. Pobrać rozmaz o wielkości około 5mm2 (mniej więcej wielkości gumki do ołówka) ze świeżej próbki kału za pomocą sterylnego wacika w probówce (patrz Tabela materiałów). Wszystkie waciki zawierające próbki kału należy przechowywać w temperaturze -80 °C w ciągu 24 godzin. Wymazy z kału mogą tam pozostać do czasu dalszego przetwarzania.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Rozmrozić roztwory do ekstrakcji i rozcieńczania w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).
  2. Przenieś wymazówkę kałową do pustej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów). Dostosuj rozmiar patyczka do wacika, przecinając go czystymi nożyczkami, aby umożliwić zamknięcie probówki przy minimalnym zanieczyszczeniu krzyżowym. Dodaj 250 μl roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki zbiorczej zawierającej wymaz kałowy i wymieszaj wirowo.
  3. Podgrzewać próbki przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej (95–100 °C). Dodać 250 μl roztworu rozcieńczającego do każdej próbki i wymieszać.
  4. Przechowywać probówki o pojemności 2 ml zawierające wyekstrahowane DNA i wacik w temperaturze 4 °C.

3. PCR i przygotowanie biblioteki

Dla kroków 3.1 i 3.2, pracuj na stacji roboczej PCR, która zapewnia czyste, wolne od szablonów i amplikonów środowisko.

  1. Oznacz startery (Tabela 1) zgodnie z ich kodem kreskowym. Rozcieńczyć każdy podkład w wodzie podwójnie destylowanej (DDW) do stężenia 50 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Do reakcji PCR należy używać płytki 96-dołkowej. Każda płytka może zawierać 32 różne próbki, które są oznaczone 32 różnymi starterami indeksującymi. Rozmrozić starter do przodu i 32 startery odwrotne w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć je do 5 μM.
  3. Przygotuj mieszaniny reakcyjne PCR na 100 reakcji (końcowa objętość w każdym dołku wyniesie 20 μl), mieszając 100 μl 5 μM startera Forward, 1 ml mieszanki 2X PCR Master i 400 μL DDW. Umieść 15 μl tej mieszanki PCR w każdym dołku (łącznie 96 dołków). Dodaj 1 μl każdego 5 μM odwróconego indeksowanego startera do 3 różnych dołków (32 różne startery w trzech egzemplarzach dają w sumie 96 dołków).
  4. W strefie dedykowanej do pre-PCR, czyli czystej ławce, która jest wolna od matryc i amplikonów, dodaj 4 μl każdej wyekstrahowanej próbki DNA do mieszanin reakcyjnych (każda wyekstrahowana próbka DNA jest amplifikowana w trzech egzemplarzach — 32 próbki na płytkę 96-dołkową).
  5. Uruchomić PCR z następującymi ustawieniami: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
  6. Na innej ławce, która zostanie zdefiniowana jako dedykowana strefa po PCR, połącz każdą potrójną reakcję PCR w jednej probówce objętościowej (60 μl na próbkę).
  7. Aby ocenić jakość amplikonów PCR, należy przeprowadzić 4 μl każdej połączonej reakcji PCR na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Przy długości fali UV 260 nm dodatnie amplikony pojawią się w oczekiwanym paśmie 375–425 pz. Tylko te amplikony zostaną uwzględnione w kolejnych krokach.
    UWAGA: Każda próbka jest amplifikowana w trzech egzemplarzach, co oznacza, że każda próbka jest amplifikowana w 3 różnych reakcjach PCR. Nie skaluj w górę.

4. Kwantyfikacja i czyszczenie biblioteki

  1. Aby uzyskać pulę stężeń równomolowych wszystkich próbek PCR, należy określić ilościowo każdy amplikon za pomocą dwuniciowego DNA (odczynnik dsDNA kwantyfikuje) fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów), odpowiedniego do jednoczesnej kwantyfikacji dużej ilości próbek.
    UWAGA: Ponieważ zakres rozmiarów amplikonu jest niejednoznaczny, rzeczywista ilość w nanogramach jest używana do obciążenia stężenia równomolowego.
  2. Połączyć 500 ng każdej próbki w jednej, sterylnej probówce. Wirować do mieszania.
  3. Uruchom 200 μl wspólnej biblioteki na 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wyekstrahować pasma 375–425 pz z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów) i wymyć zbiorczą bibliotekę w 80 μl DDW.
    UWAGA: Biblioteka w puli powinna mieć tak dobrany rozmiar, aby zredukować niespecyficzne produkty amplifikacji z DNA gospodarza.
  4. Zmierz końcowe stężenie w bibliotece za pomocą bardzo czułego zestawu do wykrywania dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Zmierz dokładny rozmiar biblioteki za pomocą bardzo czułego zestawu do separacji i analizy bibliotek DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).

5. Sekwencjonowanie

  1. Rozcieńczyć bibliotekę puli do godziny 7 pM z dodaniem 20% biblioteki kontrolnej (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem maszyny sekwencjonującej.
  2. Do sekwencjonowania należy używać specjalnie zaprojektowanych starterów do odczytu, które są komplementarne do starterów wzmacniających V4 (patrz Tabela 1).
  3. Użyj trzeciego, specjalnie zaprojektowanego startera sekwencjonowania, który odczytuje kod kreskowy w dodatkowym cyklu (patrz tabela 1) i generuje odczyty sparowanych końców o długości 175 zasad w każdym kierunku, zgodnie ze specyfikacjami producenta.
  4. Uruchom maszynę sekwencjonującą i uzyskaj pliki FASTQ zgodnie z protokołem producenta.

6. Przetwarzanie danych

  1. Zszyj ze sobą i przetwórz nakładające się na siebie sparowane pliki FASTQ w potoku selekcji danych zaimplementowanym w QIIME 2 w wersji 2017.7.017. Demultipleksuj odczyty zgodnie z kodami kreskowymi specyficznymi dla próbki.
  2. Użyj DADA218 do kontroli jakości i wykrywania wariantów sekwencji (SVs). Truncate odczytuje na 13 bazach od końca 3' i 15 bazach od końca 5', odrzucanie odczytuje z więcej niż 2 oczekiwanymi błędami. Zidentyfikuj i usuń chimery za pomocą metody konsensusu - chimery są wykrywane w próbkach pojedynczo, a sekwencje uznane za chimeryczne w wystarczającej części próbek są usuwane.
  3. Wykonaj klasyfikację taksonomiczną SVs przy użyciu naiwnego klasyfikatora dopasowanego Bayesa, wytrenowanego w bazie danych Greengenes 99% tożsamości z sierpnia 2013 r6, dla 175 długich odczytów i zestawu starterów do przodu/do tyłu.
  4. Rozrzedzić wszystkie próbki do głębokości 2 146 sekwencji.
  5. Użyj nieważonego UniFrac do pomiaru różnorodności β (między różnorodnością próby19,20) na rozrzedzonych próbkach, aby uniknąć wpływu wielkości próby.
  6. Wynikowa macierz odległości służy do przeprowadzenia analizy współrzędnych głównych (PCoA).
    UWAGA: Skrypt przetwarzania danych i pliki mapowania są dostarczane jako materiał uzupełniający (Materiał uzupełniający 1 i 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny rysunek protokołu przedstawiono na Rysunku 1.

Prospektywnie zebrano próbki kału od pacjentów hospitalizowanych z podejrzeniem infekcyjnej biegunki. Próbki te zostały przekazane do Laboratorium Mikrobiologii Klinicznej w Sheba Medical Center między lutym a majem 2015 roku, zgodnie z wcześniejszym opisem1. Próbki kału poddano równolegle konwencjonalnej hodowli mikr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sekwencjonowanie 16S rRNA-amplicon i metagenomika zyskały popularność w zastosowaniach mikrobiologii klinicznej 21,22,23. Techniki te są korzystne ze względu na ich zwiększoną zdolność do wychwytywania taksonów nadających się do hodowli i niehodowlanych, dostarczając danych na temat względnej liczebności patogennego inokulum oraz ich zdolności do dokładniejszej identyfikacji wielodrobnoustrojowego zakaźnego odcisku palca

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez program I-CORE (granty nr 41/11), Izraelską Fundację Naukową (grant nr 908/15) oraz Europejską Organizację ds. Leśniowskiego-Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (ECCO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
StarteryZintegrowane technologie DNA (IDT)
Roztwór ekstrakcyjnySigma-AldrichE7526
Roztwór do rozcieńczaniaSigma-AldrichD5688
Zestaw do PCR Kapa HiFi HotStart ReadyMixKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT Zestaw odczynników PicoGreen dsDNAInvitrogenP7589dsDNA odczynnik do oznaczania ilościowego
MinElute Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28606
AgarozaAmresco0710-250G
Ultra czysta woda Bez dnazy i rnazPrzemysł biologiczny01-866-1A
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HSSondy molekularneZestaw do wykrywania dsDNAQ32854
Wysoka czułość D1000Agilent TechnologiesTaśma sitowa 5067-5582separacja i analiza
Test taśmy ekranowejOdczynniki Agilent Technologies5067-5583do bibliotek DNA
PhiX Control v3Biblioteka kontrolna Illumina15017666
MiSeq Reagent Kit v2 (cykl 500)IlluminaMS-102-2003
Bromek etydynyAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL kolekcja probówkiSARSTEDT72.695.400Probówki zbiorcze Safe Seal
Plastikowy wacik w patyczku w probówce PPSTERYLNEWNĘTRZE 23117
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Equipment
Maszyna do PCRApplied Biosystems2720 Termocykler
Maszyna do sekwencjonowaniaIlluminaMiseq
Stacja robocza PCRBiosan
VortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2
Nożyczki do czyszczenia UV

Bibliografia

  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617(2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226(2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie amplikon w 16S rRNApobieranie pr bek ka uekstrakcja DNAamplifikacja PCRregion V4QIIME 2DADA2przygotowanie bibliotekielektroforeza w eluanaliza g wnych wsp rz dnych
Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.