Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Ayelet Di Segni; Tzipi Braun; Marina BenShoshan; Sarit Farage Barhom; Efrat Glick Saar; Karen Cesarkas; James E. Squires; Nathan Keller; Yael Haberman

doi:10.3791/56845

Artykuł metodologiczny

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

DOI:

10.3791/56845

⸱

19 marca 2018

Ayelet Di Segni¹ , Tzipi Braun¹ , Marina BenShoshan¹ , Sarit Farage Barhom¹ , Efrat Glick Saar¹ , Karen Cesarkas¹ , James E. Squires² , Nathan Keller¹^,³ , Yael Haberman¹^,⁴

¹Sheba Medical Center, ²Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, ³Ariel University, ⁴Cincinnati Children's Hospital Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiom jelitowy człowieka odgrywa kluczową rolę w ochronie komórek przed urazami, w przetwarzaniu energii i składników odżywczych oraz w promowaniu odporności. Odchylenia od tego, co uważa się za zdrowy skład mikrobioty (dysbioza), mogą upośledzać funkcje życiowe, prowadząc do stanów patologicznych. Ostatnie i trwające wysiłki badawcze są ukierunkowane na scharakteryzowanie powiązań między składem mikrobiologicznym a zdrowiem i chorobą człowieka.

Postępy w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości umożliwiają scharakteryzowanie składu mikrobiologicznego jelit. Metody te obejmują sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA i sekwencjonowanie typu shotgun. Sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA służy do profilowania składu taksonomicznego, podczas gdy sekwencjonowanie typu shotgun dostarcza dodatkowych informacji na temat przewidywań genów i adnotacji funkcjonalnej. Zaletą stosowania metody sekwencjonowania celowanego regionu zmiennego genu 16S rRNA jest jej znacznie niższy koszt w porównaniu z sekwencjonowaniem typu shotgun. Różnice w sekwencji w genie 16S rRNA są wykorzystywane jako mikrobiologiczny odcisk palca do identyfikacji i ilościowego określenia różnych taksonów w pojedynczej próbce.

Główne międzynarodowe wysiłki wprowadziły standardy sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Jednak kilka badań wskazuje na powszechne źródło zmienności spowodowanej efektem partii. Aby zminimalizować ten efekt, należy wdrożyć ujednolicone protokoły pobierania, przetwarzania i sekwencjonowania próbek. Protokół ten proponuje integrację szeroko stosowanych protokołów, począwszy od pobierania próbek kału po analizę danych. Protokół ten obejmuje bezkolumnowe, bezpośrednie podejście PCR, które umożliwia jednoczesną obsługę i ekstrakcję DNA dużej liczby próbek kału, wraz z amplifikacją PCR regionu V4. Ponadto protokół opisuje potok analizy i udostępnia skrypt korzystający z najnowszej wersji QIIME (QIIME 2 wersja 2017.7.0 i DADA2). Ten protokół krok po kroku ma na celu poprowadzenie osób zainteresowanych rozpoczęciem stosowania sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA w solidny, reprodukcyjny, łatwy w użyciu i szczegółowy sposób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podjęto skoncentrowane wysiłki, aby lepiej zrozumieć różnorodność i obfitość mikrobiomu, co jest kolejnym aspektem uchwycenia różnic i podobieństw między osobami w zdrowych i patologicznych warunkach. Wiek²^,³, geografia⁴, lifestyle⁵^,⁶, oraz choroba⁵ okazały się być związane ze składem mikrobiomu jelitowego, ale wiele schorzeń i populacji nie zostało jeszcze w pełni scharakteryzowanych. Ostatnio doniesiono, że mikrobiom może być modyfikowany do zastosowań terapeutycznych⁷^,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etyczna zgoda na badanie została udzielona przez Lokalną Komisję Etyki Badań Sheba, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Protokół otrzymał wyjątek od zgody pacjenta od lokalnej Komisji ds. Oceny Etycznej, ponieważ materiał kałowy, który został użyty, został już przesłany do rdzenia mikrobiologicznego w ramach badań klinicznych i bez możliwych do zidentyfikowania informacji o pacjencie innych niż wiek, płeć i wyniki mikrobiologiczne. Uzyskano pisemną, świadomą zgodę od zdrowych ochotników, a Instytucjonalna Komisja Rewizyjna zatwierdziła badanie. Niektóre z tych próbek zostały już uwzględnione w poprzedniej analizie<....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczna ilustracja protokołu jest pokazana w Rysunek 1.

Prospektywnie pobraliśmy próbki kału od hospitalizowanych pacjentów z podejrzeniem biegunki zakaźnej. Próbki te zostały przesłane do Laboratorium Mikrobiologii Klinicznej w Centrum Medycznym Sheba między lutym a majem 2015 r., jak opisano wcześniej¹. Próbki kału poddano konwencjonalnej hodowli mikrobiologicznej wyko.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie 16S rRNA-amplicon i metagenomika zyskały popularność w zastosowaniach mikrobiologii klinicznej 21,22,23. Techniki te są korzystne ze względu na ich zwiększoną zdolność do wychwytywania taksonów nadających się do hodowli i niehodowlanych, dostarczając danych na temat względnej liczebności patogennego inokulum oraz ich zdolności do dokładniejszej identyfikacji wielodrobnoustrojowego zakaźnego odcisku palca

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez program I-CORE (granty nr 41/11), Izraelską Fundację Naukową (grant nr 908/15) oraz Europejską Organizację ds. Leśniowskiego-Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (ECCO).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Startery	Zintegrowane technologie DNA (IDT)
Roztwór ekstrakcyjny	Sigma-Aldrich	E7526
Roztwór do rozcieńczania	Sigma-Aldrich	D5688
Zestaw do PCR Kapa HiFi HotStart ReadyMix	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR Master mix
Quant-iT Zestaw odczynników PicoGreen dsDNA	Invitrogen	P7589	dsDNA odczynnik do oznaczania ilościowego
MinElute Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen	28606
Agaroza	Amresco	0710-250G
Ultra czysta woda Bez dnazy i rnaz	Przemysł biologiczny	01-866-1A
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS	Sondy molekularne	Zestaw do wykrywania dsDNA	Q32854
Wysoka czułość D1000	Agilent Technologies	Taśma sitowa 5067-5582	separacja i analiza
Test taśmy ekranowej	Odczynniki Agilent Technologies	5067-5583	do bibliotek DNA
PhiX Control v3	Biblioteka kontrolna Illumina	15017666
MiSeq Reagent Kit v2 (cykl 500)	Illumina	MS-102-2003
Bromek etydyny	Amresco	E406-10mL-TAM
2 mL kolekcja probówki	SARSTEDT	72.695.400	Probówki zbiorcze Safe Seal
Plastikowy wacik w patyczku w probówce PP	STERYLNE	WNĘTRZE 23117
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Equipment
Maszyna do PCR	Applied Biosystems	2720 Termocykler
Maszyna do sekwencjonowania	Illumina	Miseq
Stacja robocza PCR	Biosan

Vortexer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2

Nożyczki do czyszczenia UV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
De Filippo, C., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie amplikon w 16S rRNA pobieranie pr bek ka u ekstrakcja DNA amplifikacja PCR region V4 QIIME 2 DADA2 przygotowanie biblioteki elektroforeza w elu analiza g wnych wsp rz dnych

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły