Artykuł metodologiczny

Protokół Western Blotting dla małej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/56855

⸱

22 sierpnia 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Southwest Hospital, Third Military Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowy protokół Western blotting został zoptymalizowany do analizy zaledwie 500 hematopoetycznych komórek macierzystych lub progenitorowych. Optymalizacja polega na ostrożnym obchodzeniu się z próbką komórki, ograniczaniu transferów między probówkami i bezpośredniej lizie komórek w buforze próbki Laemmli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są rzadkimi komórkami, a szpik kostny myszy zawiera tylko ~25 000 fenotypowych długoterminowych komórek macierzystych (HSC). Protokół Western blotting został zoptymalizowany i nadaje się do analizy niewielkiej liczby HSC (500 - 15 000 komórek). Fenotypowe HSC oczyszczono, dokładnie zliczono i poddano bezpośredniej lizie w buforze próbki Laemmli. Lizaty zawierające równą liczbę komórek analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a blot przygotowano i przetworzono zgodnie ze standardowymi protokołami Western blot. Korzystając z tego protokołu, można rutynowo analizować od 2 000 do 5 000 komórek HSC, a w niektórych przypadkach dane można uzyskać z zaledwie 500 komórek, w porównaniu do 20 000 do 40 000 komórek podawanych w większości publikacji. Protokół ten powinien być ogólnie stosowany do innych komórek krwiotwórczych i umożliwia rutynową analizę niewielkiej liczby komórek przy użyciu standardowych procedur laboratoryjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) to samoodnawiające się komórki, które mogą dać początek wszystkim liniom krwi. Są to stosunkowo rzadkie komórki w szpiku kostnym, co utrudnia analizy biochemiczne. Podejścia odpowiednie do analizy rzadkich komórek, takie jak cytometria przepływowa, okazały się niezwykle przydatne do ilościowego określania względnych ilości markerów powierzchniowych komórek i białek wewnątrzkomórkowych. Jednak analiza białek wewnątrzkomórkowych wymaga zastosowania procedur przenikania komórek, aby umożliwić dostęp przeciwciał, a nie wszystkie epitopy na powierzchni komórki przeżywają te procedury1,2. Ponadto przeciwciała, które rozróżniają różne izoformy białek lub produkty rozszczepienia, nie są często dostępne dla cytometrii przepływowej, dlatego badacze nadal polegają na Western blot w niektórych rodzajach analiz.

Analiza Western blot lizatów komórkowych jest rutynową procedurą w większości laboratoriów. Komórki mogą być oczyszczane w natywnych warunkach, które zachowują epitopy cząsteczek powierzchniowych komórek, a następnie lizaty komórkowe mogą być przygotowywane i analizowane. Jednak analiza białek w rzadkich pierwotnych populacjach komórek za pomocą Western blot może wymagać eutanazji dużej liczby zwierząt w celu uzyskania wystarczającej liczby komórek. Dokonując niewielkich korekt w kilku etapach, konwencjonalny protokół Western blotting był w stanie wykryć białka w stosunkowo niewielkiej liczbie HSC (500 - 15 000, w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania). Regulacje obejmują dokładne zliczanie komórek, ostrożne obchodzenie się z osadem komórkowym, zmniejszanie transferów komórek między probówkami w celu zminimalizowania utraty komórek oraz lizę określonej liczby komórek za pomocą skoncentrowanego buforu ładującego zawierającego inhibitory proteasomu i fosfatazy. Wiele opublikowanych raportów zawiera Western blot uzyskane z 20 000 lub więcej HSCs3,4,5,6,7; Ta prosta procedura zmniejszy liczbę komórek i zwierząt doświadczalnych potrzebnych do uzyskania równoważnych danych od 4 do 40 razy. Protokół ma na celu normalizację wyników na podstawie każdej komórki, a nie kontroli wewnętrznej. Umożliwia to wykrycie ogólnych spadków poziomu białka, które można przeoczyć, jeśli dane są znormalizowane do kontroli wewnętrznej. Znaczenie normalizacji na podstawie komórki zostało opisane w analizie danych dotyczących ekspresji genów8, a ta sama zasada dotyczy ilościowego oznaczania białek za pomocą Western blot. Ten zoptymalizowany protokół powinien być przydatny dla każdego, kto musi analizować niewielką liczbę komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury muszą być wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami. Procedura została opracowana do analizy mysich krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych (HSC i HP), ale może być dostosowana do analizy innych populacji komórek.

1. Izolacja mysich HSC i HP metodą cytometrii przepływowej

  1. Pobieranie mysich komórek szpiku kostnego zgodnie z opisem w literaturze6.
    UWAGA: W danych przedstawionych w Rysunek 1 i Rysunek 2, szpik kostny został pobrany od myszy C57BL/6J.
  2. Wykonaj zubożenie linii komórek szpiku kostnego za pomocą zestawu do zmniejszania linii myszy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Inkubuj komórki z przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki będącym przedmiotem zainteresowania, zgodnie z opisem7. W eksperymentach pokazanych na Rysunek 1 i Rysunek 2, zastosowano przeciwciała przeciwko markerom Sca-1, Kit, Flt3 i linii (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 i Ter119.
  4. Sortuj 2 000 - 20 000 komórek Lin-Sca1+Kit+ Flt3- komórek (HSC) lub komórek Lin-Sca1-Kit+ (HPs) do 1,5 ml probówek Eppendorfa zawierających 0,1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    UWAGA: W przypadku danych pokazanych na Rysunek 1 i Rysunek 2, komórki zostały posortowane za pomocą cytometru przepływowego z dyszą 70 μM. Maksymalna objętość kolekcji wynosi 1,4 ml.

2. Przygotowanie próbki

UWAGA: Ten krok jest krytyczny. Próbkę należy przetworzyć bardzo ostrożnie. Podczas usuwania supernatantu należy bardzo uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.

  1. Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające posortowane komórki w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C, 500 x g, przez 5 minut. Bardzo delikatnie usunąć całość z wyjątkiem około 100 μl supernatantu z osadu komórkowego za pomocą pipety i końcówki do pipety o pojemności 20 μl. Nie naruszaj pelletu.
    1. Jeśli próbka zawiera mniej niż 5,000 komórek, a całkowita objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 0,2 ml, przed odwirowaniem należy najpierw przenieść komórki do probówek PCR o niskim poziomie wiązania 0,2 ml.
    2. Jeśli próbka zawiera mniej niż 5 000 komórek, a objętość jest większa niż 0,2 ml, należy odwirować komórki za pomocą wirówki w temperaturze 4 °C, 500 x g, przez 5 minut i usunąć wszystkie oprócz 200 μl supernatantu. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pozostałych 200 μl supernatantu, a następnie przenieść komórki do probówek PCR o pojemności 0,2 ml i ponownie odwirować. Usuń wszystkie oprócz 20 - 30 μl z osadu po drugim wirowaniu i ponownie zawieś ogniwa.
  2. Zawiesić komórki w supernatancie pozostawionym w probówce. W razie potrzeby dodaj dodatkowy PBS w 2% FBS/PBS (można również użyć 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS lub samego PBS), aby uzyskać stężenie 5 x104 do 5 x 105 komórek/ml.
    UWAGA: Użyj liczby komórek zebranych za pomocą cytometrii, aby oszacować objętość użytą do zawieszenia komórek.
  3. Użyj 2 - 5 μl ponownie zawieszonych komórek, aby określić dokładne stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (zgodnie z instrukcjami producenta) lub hemocytometru9.
  4. Przenieść objętość ponownie zawieszonych komórek zawierających żądaną liczbę komórek do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Na potrzeby eksperymentu w Rysunek 1, przeniesiono 2 000, 1 000 lub 500 HSC lub HP. Pożądana liczba komórek zależy od siły sygnału uzyskanego przez Western blot i jest określana empirycznie. Wykonaj transfer za pomocą końcówki do pipety Eppendorf o pojemności 20 μl lub 100 μl.
  5. Odwirować komórki w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C, 500 x g, przez 5 minut.
  6. Aby wygenerować 100x roztwory podstawowe, rozpuść inhibitory proteasomu i fosfatazy w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Przygotować 2 do próbek Laemmli, rozcieńczając 4 razy bufor do próbek Laemmli dostarczony przez producenta równoważną ilością wody destylowanej. Dodać odpowiednią ilość 100x zapasu inhibitorów proteasomów i fosfataz, aby uzyskać końcowe stężenie 2x inhibitorów w 2x buforze próbki Laemmli.
    UWAGA: Bufor do próbek 2x Laemmli można wykonać z wyprzedzeniem, ale inhibitory proteasomu i fosfatazy należy dodać bezpośrednio przed dodaniem buforu próbki 2x Laemmli (plus inhibitory) do osadu komórkowego w celu lizy komórek, jak opisano w następnym kroku.
  8. Ostrożnie usunąć część supernatantu z osadu komórkowego i do supernatantu pozostałego w probówce z osadem komórkowym dodać równą objętość 2x buforu próbki Laemmli oraz inhibitorów proteasomu i fosfatazy, aby osiągnąć końcowe stężenie 500 komórek/μl w 1x buforze próbki Laemmli.
    UWAGA: Na przykład, jeśli przeniesiesz 2 000 komórek o łącznej objętości 20 μl do probówki w kroku 2.5, po odwirowaniu komórek (krok 2.6) powinieneś usunąć 18 μl supernatantu z osadu, a do pozostałych 2 μl supernatantu dodać równą objętość (2 μl) 2x buforu próbki Laemmli, aby osiągnąć końcowe stężenie 500 komórek/μl w 1x Bufor do pobierania próbek Laemmli.
  9. Ponownie zawiesić osad, aby jak najszybciej wytworzyć lizat. W tym momencie próbki mogą być natychmiast elektroforezowane za pomocą żeli SDS-PAGE lub mogą być zatrzaskowo zamrożone w cieczyN2 i przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Elektroforeza

  1. Podgrzewać lizaty w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C lub we wrzącej wodzie przez 5 minut.
  2. Elektroforeza 1 - 40 μL lizatów (zawierających od 500 do 20 000 odpowiedników komórek) przez żele SDS-PAGE przy napięciu 100 V przy użyciu standardowych protokołów10.
    UWAGA: Objętość lizatu załadowanego do żelu zależy od liczby komórek potrzebnych do wygenerowania pożądanego sygnału i będzie zależeć od obfitości interesującego białka i jakości przeciwciała. Dane w Rysunek 1 uzyskano z 2 000, 1 000 i 500 odpowiedników komórek lizatu. Szerokość studni powinna mieścić się w zakresie od 3 mm do 1,5 mm. Zęby 1,5 mm można wyciąć z dostępnego w handlu grzebienia z szerszymi zębami za pomocą nożyczek.

4. Transfer i blokada

UWAGA: Wykonaj Western blot zgodnie ze standardowymi protokołami11. Kroki są pokrótce opisane tutaj:

  1. Membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) należy wstępnie potraktować metanolem przez 10 s, a następnie krótko umyć membranę wodą destylowaną.
  2. Przenieść białko z żelu SDS-PAGE do błony zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji dostarczonej przez producenta aparatu transferowego.
  3. Po przeniesieniu zablokuj błonę 2 ml 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBST (PBS z 0,1% Tween) przez noc w temperaturze 4 °C zgodnie ze standardowymi protokołami11.

5. Oznaczanie przeciwciał

  1. Inkubować błonę z przeciwciałami na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C, stosując rozcieńczenia przeciwciał zalecane przez dostawcę.
    UWAGA: W Tabeli materiałów pokazane są przeciwciała, które zwalidowaliśmy dla HSC i HP oraz odpowiadające im rozcieńczenia przeciwciał. Wykonaj znakowanie przeciwciał przy użyciu standardowych procedur8.

6. Wykrywanie

  1. Umyj membranę 3 razy po 5 minut na każde pranie w PBST w temperaturze pokojowej.
  2. Inkubować błonę z 2 ml wzmocnionego buforu chemiluminescencyjnego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Sygnały można wykryć za pomocą systemu obrazowania zgodnego z instrukcjami producenta lub filmu autoradiograficznego i procesora filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki z 500 - 2,000 oczyszczonych HSC i HP są pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2. Sygnał β-aktyny w Rysunek 1 można wykryć już z zaledwie 500 HSC i HP oczyszczonych ze szpiku kostnego jednej myszy. Należy zauważyć, że ładowanie lizatów do studzienek 1,5 mm wytwarzało znacznie silniejszy sygnał o mocy 500 KM niż ładowanie do studzienek 3,0 mm. Rysunek 2 to Western blot EIF4G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western Blotting jest powszechną techniką wykrywania określonych białek i aktywacji szlaków sygnałowych w tkankach lub komórkach. Wprowadzając niewielkie poprawki do powszechnie stosowanej procedury, byliśmy w stanie rutynowo wykryć 15 różnych białek (Tabela Materiałów) w 15 000 HSC, a w niektórych przypadkach nawet w 500 HSC. Najbardziej krytycznymi krokami w tym protokole są: 1) dokładne zliczanie komórek, 2) minimalizacja liczby transferów między probówkami oraz 3) liza komórek bezpośrednio za pomocą ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grant R01 CA149976 (N.A.S) z National Institutes of Health wsparł tę pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Fisher ScientificBP166-500SDS-PAGE
TEMEDFisher ScientificBP150-20SDS-PAGE
30% roztwór akrylamidu BisBio-Rad1610158SDS-PAGE
1,5 M Tris-HCl pH8,8TEKNOVAT1588SDS-PAGE
1,0 M Tris-HCl pH 6,8TEKNOVAT1068SDS PAGE
Nadsiarczan amonuFisher ScientificBP179-25SDS-PAGE
MINI-PROTEAN 3 grzebieńBio-Rad1653360SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658005EDUSDS-Page
Bio-Rad1704155EDUtransfer
Zasilacz PowerPac HCBio-Rad1645052EDUelektroforeza
System obrazowaniaBio-Rad1708195detekcja sygnału
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747EDUprzygotowanie próbki
10x Tris/Glycine/SDS BuforelektroforezyBio-Rad1610732EDU
2-merkaptoetanolBio-Rad1610710EDUPrzygotowanie próbki
RTA Mini PVDF Zestaw transferowy dla 40 osób blotyTransfer 1704272 Bio-Rad
Koktajl inhibitorów proteazy Przygotowaniepróbki11697498001 Sigma
Koktajle inhibitorów fosfatazy ZłotabiotechnologiaGB-450-1Przygotowanie próbki
EIF4GSygnalizacja komórkowaPrzeciwciało 2469WB, zwalidowane w 1000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): Ryc. 2
p-Rps6Sygnalizacja komórkowaPrzeciwciało 4858WB, zwalidowane na 1000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): Fig2
aktyna (sprzężona z HRP)abcamab49900Przeciwciało WB, zwalidowane w 500 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 5000
odniesienie (rysunek): Rys. 1, Rys. 2
LC-3Abcamab48394Przeciwciało WB, zwalidowane na 15000 komórek
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 5)
S6Cell Signaling2317, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (ryc.
) Przeciwciało EBP1Cell Signaling9644WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000 < br / > odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)
p-4EBP1Sygnalizacja komórkowaPrzeciwciało 2855WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)
Sygnalizacja komórkowaTSC24308WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)
Sygnalizacja komórkowaHSP90Przeciwciało 4877WB, zwalidowane na 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 5)
Sygnalizacja komórkowaPTENPrzeciwciało 9188WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (rys. 1
Sygnalizacja komórkowamTOR2983Przeciwciało WB, zwalidowane na 15000 komórek
stężenie przeciwciał: 1: 1000
odniesienie (rysunek): ref5 (rys. 1
p-mTORSygnalizacja komórkowa5536Przeciwciało WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000 < br / > odniesienie (rysunek): ref5 (rys. 1
PP2ABCell Signaling4953Przeciwciało WB, zwalidowane w 15000 komórkach
Stężenie przeciwciał: 1: 1000 < br / > odniesienie (rysunek): ref5 (FigS1)
p-AMPKaPrzeciwciało sygnalizujące komórki2535WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1: 1000 < br / > odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. S1)
aktynaSanta Cruzsc-47778Przeciwciało WB, zwalidowane w 15000 komórkach
stężenie przeciwciał: 1:3000
odniesienie (rysunek): ref5 (ryc. 4)
zestaw do zubożenia linii (mysz)Miltenyi Biotec130-090-858hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych
kolumny LSMiltenyi Biotec130-041-305oczyszczanie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych
SCFPeproTech250-03stymulacja fosforylacji
APC-Cy7 przeciwciało c-kitThermoFisherA15423sortowanie komórek
anty-B220ThermoFisher48-0452-82sortowanie komórek
anty-CD3eThermoFisher48-0031-82sortowanie komórek
anty-Mac1ThermoFisher48-0112-82sortowanie komórek
anty-Gr1ThermoFisher48-5931-82sortowanie komórek
anty-Ter119ThermoFisher48-5921-82sortowanie komórek
Płytki dystansowe ze zintegrowanym 1,0 mm PrzekładkiBio-Rad1653311SDS-PAGE
BSAResearch Products InternationalA30075blokująca błonę
Atlanta BiologicalsA12450średni suplement
licznik komórekInvitrogenAMQAF1000zliczający komórki
ThermoFisher  S17040zliczanie komórek
flimDetekcja sygnałuDenville ScientificE3012
filmów medycznychDetekcja sygnałuKonicaSRC-101A
Supersignal West Femto Maksymalna czułość PodłożeTherom Scientific34096Detekcja sygnału
Allegra X-15R (Rotor SX4750A)Próbka Beckman CoulterX-15R przygotowanie
BLUEstain drabinka białkowaGold BiotechnologyP007-500sorter komórek do elektroforezy
BDFACSAria IIprzygotowanie próbki
IncublockDenville ScientificI0510elektroforeza
System transferu do WB przeciwciało 4 Przeciwciało ) ) ) oczyszczanie surowica hemocytometr procesor

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SDS PAGEliczenie kom rekbufor Laemmliego do pr bekinhibitor fosfatazyinhibitor proteasomuwzmocniona chemiluminescencjabeta aktynacytometria przep ywowa

Powiązane artykuły