Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Główną funkcją keratynocytów jest zapewnienie strukturalnej integralności naskórka, a tym samym utrzymanie mechanicznej bariery dla świata zewnętrznego. Ponadto keratynocyty odgrywają istotną rolę w inicjacji, utrzymaniu i regulacji odpowiedzi immunologicznej naskórka, będąc częścią wrodzonego układu odpornościowego reagującego na bodźce antygenowe w szybki, niespecyficzny sposób. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej i wykazujemy, że komórki te reagują na końcowe różnicowanie wywołane wapniem, mierzone zwiększoną ekspresją markera różnicowania inwolukryny. Ponadto pokazujemy, że izolowane keratynocyty reagują na indukowaną przez IL-1β aktywację wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, mierzoną aktywacją szlaku p38 MAPK. Podsumowując, opisujemy metodę izolacji i hodowli pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej osoby. Ponieważ keratynocyty są dominującym typem komórek w naskórku, metoda ta jest przydatna do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.
Wprowadzenie
Skóra jest największym organem ludzkiego ciała i służy jako bariera ochronna przed środowiskiem zewnętrznym. Skóra składa się z dwóch głównych warstw: skóry właściwej i naskórka, przy czym naskórek stanowi najbardziej zewnętrzną warstwę skóry. Najliczniejszym typem komórek w naskórku są keratynocyty stanowiące ponad 95% masy komórkowej1,2. Keratynocyty są utrzymywane na różnych etapach różnicowania w naskórku i są zorganizowane w warstwy podstawne, kolczyste, ziarniste i zrogowaciałe, które odpowiadają określonym etapom różnicowania3. Podstawową funkcją keratynocytów jest zapewnienie integralności strukturalnej naskórka, wytwarzając w ten sposób nienaruszoną barierę dla świata zewnętrznego.
Keratynocyty również reprezentują pierwszą linię obrony przed patogenami w skórze, a zatem odgrywają ważną rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej4,5. Narażenie keratynocytów na bodźce zewnętrzne prowadzi do aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, a następnie do produkcji wielu różnych mediatorów stanu zapalnego, w tym cytokin, chemokin i peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Te białka pochodzące z keratynocytów uczestniczą w odpowiedzi zapalnej poprzez rekrutację i aktywację komórek odpornościowych, takich jak komórki dendrytyczne, neutrofile i specyficzne limfocyty T6,7. W związku z tym, że keratynocyty odgrywają kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, uzasadnieniem przedstawionej tutaj techniki było wygenerowanie modelu in vitro do badania biologii skóry. Pierwotne kultury keratynocytów uzyskane z napletka noworodka są często wykorzystywane do badania biologii skóry8,9. Jednak dzięki opisanej tutaj technice uzyskuje się keratynocyty obu płci, co skutkuje większą różnorodnością biologiczną komórek.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i generowania pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłego człowieka, w tym konserwacji i zamrażania keratynocytów. Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie pierwotnych ludzkich keratynocytów, które można wykorzystać jako model do badania biologii skóry in vitro.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pobieranie próbek skóry od zdrowych dorosłych ochotników poddanych operacji plastycznej wymaga zgody komisji etycznej w instytucjach goszczących. Protokół ten został zatwierdzony przez Regionalną Komisję Etyczną Regionu Midtjylland w Danii (M-20110027). Opisana tutaj metoda wywodzi się z podobnych badań przeprowadzonych przez Maciaqa i wsp.10 oraz Liu i Karasek11.
1. Izolacja keratynocytów od ludzkiej skóry
- Zacznij od przygotowania następujących roztworów: 50 ml roztworu 0,25% trypsyny i 0,1% glukozy w DPBS. Wymieszać i przefiltrować, wysterylizować (0,2 μm) roztwór. Przygotuj 10 ml RPMI-1640 + 2% roztworu FBS, 50 ml DPBS i pożywki bez keratynocytów (KSFM). Dodaj suplementy KSFM i 250 μl gentamycyny do 500 ml KSFM. Przed użyciem podgrzej roztwory do temperatury 37 °C.
- Zbieraj skórę od zdrowych dorosłych ochotników poddawanych operacji plastycznej. Użyte próbki skóry mają wymiary około 10 cm x 15 cm, ale mogą różnić się wielkością. Utrzymuj skórę w chłodzie podczas transportu, transportując próbki skóry w styropianowym pudełku zawierającym element chłodzący. W razie potrzeby próbka skóry może być przechowywana przez noc w temperaturze 4 °C.
- Usuń tłuszcz spod skóry za pomocą wysterylizowanych nożyczek, skalpeli i kleszczy.
- Zapiąć część skóry (około 10 cm x 15 cm) na sterylnej osłonie na wierzchu płytki za pomocą igieł. Najpierw oczyść skórę suchym, wysterylizowanym gazikiem. Następnie oczyść skórę za pomocą wysterylizowanego gazika z 70% etanolem.
- Za pomocą strugarki nożnej odetnij górną warstwę (naskórek) części skóry i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 9 cm. Następnie natychmiast dodaj 25 ml roztworu DPBS/trypsyna/glukozy (przygotowanego w kroku 1.1) do szalki Petriego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą pipety usuń roztwór DPBS/trypsyny/glukozy z szalki Petriego i dodaj 10 ml RPMI-1640 + 2% FBS, aby dezaktywować trypsynę.
- Za pomocą dwóch kleszczy uwolnij teraz komórki naskórka do podłoża, delikatnie zeskrobując i mieszając zarówno naskórek, jak i przedział skórny części skóry.
- Przefiltruj zawiesinę komórek naskórka przez metalowy filtr (otwór o średnicy 1 mm) i zbierz w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj pozostałe skrawki skóry do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml RPMI-1640 bez FBS i wiruj przez 10 sekund. Przefiltrować zawiesinę przez metalowy filtr do probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórek naskórka. Dodaj DPBS do całkowitej objętości 50 ml.
- Odwirować zawiesinę komórkową przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek naskórka w około 10 ml KSFM o temperaturze 37 °C, w zależności od wielkości osadu komórkowego. Policz komórki za pomocą metody barwienia błękitem trypanowym pod mikroskopem. Liczba komórek uzyskanych z odcinka skóry o wymiarach 10 cm x 15 cm wynosi około 50 - 100 x 106 komórek. Do każdej kolby hodowlanejo długości 75 cm2 przenieść 8 x 106 komórek wraz z 12 ml KSFM o temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsnąć kolbami hodowlanymi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
- Inkubować keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy wilgotności 100% i 5% CO2 . Zmień podłoże po 2 dniach i trzy razy w tygodniu. Pasaż komórek, gdy hodowla jest zlewająca się w 70 - 80%, co trwa około 2 tygodni w zależności od szybkości proliferacji keratynocytów.
2. Pasażowanie keratynocytów
- Podgrzać odpowiednią ilość 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do temperatury 37 °C w inkubatorze. Użyj 4,5 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2.
- Usuń pożywkę z komórek i dodaj do komórek 4,5 ml/75 cm2 kolby hodowlanej, wstępnie podgrzany 0,05% roztwór trypsyny-EDTA. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze (37 °C) i po około 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zaczęły się rozluźniać.
- Gdy około 50% komórek się rozluźni, delikatnie uderz kolbą hodowlaną o rękę, aby poluzować pozostałe komórki. Następnie, aby dezaktywować trypsynę, dodaj 6 ml RPMI-1640 + 2% FBS (37 °C) do kolby hodowlanej o długości 75cm2 i przenieś zawiesinę komórkową do probówek o pojemności 50 ml.
- Przepłukać kolby hodowlane 3 ml RPMI 1640 + 2% FBS i dodać do probówek o pojemności 50 ml. Wirować komórki przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić granulowane komórki w 10 ml KSFM (37 °C). Policz komórki i przenieś 3 x 106 komórek do kolby hodowlanej o długości 150cm2 razem z 20 ml KSFM (37 °C). Delikatnie wstrząsnąć kolbą hodowlaną, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Zamroź komórki, gdy hodowla jest zlewająca się w 80 - 90%, co trwa około 4-6 dni w zależności od szybkości proliferacji keratynocytów (patrz sekcja 3, protokół zamrażania poniżej). Rozszerz keratynocyty, aby wytworzyć odpowiednie zamrożone zapasy.
3. Zamrożenie keratynocytów
- Podgrzać odpowiednią ilość 0,05% roztworu trypsyny-EDTA do temperatury 37 °C w inkubatorze. Użyj 9 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA w kolbie hodowlanej o średnicy 150cm2.
- Usunąć pożywkę z komórek i dodać do komórek 9 ml/150 cm2 kolby hodowlanej wstępnie podgrzany 0,05% roztwór trypsyny-EDTA. Umieścić kolbę hodowlaną w inkubatorze (37 °C) i po około 5 minutach sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zaczęły się rozluźniać.
- Gdy około 50% komórek się rozluźni, delikatnie uderz kolbą hodowlaną o rękę, aby poluzować pozostałe komórki. Następnie, aby dezaktywować trypsynę, dodaj 12 ml RPMI-1640 + 2% FBS (37 °C) do kolby hodowlanej o średnicy 150cm2 i odessaj zawiesinę komórek do probówek o pojemności 50 ml.
- Przepłukać kolby hodowlane 6 ml RPMI 1640 + 2% FBS i dodać do probówek o pojemności 50 ml. Wirować probówki przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Przygotować lodowato zimne medium do zamrażania komórek (KSFM + 10% DMSO).
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w KSFM + 10% DMSO, policzyć komórki i zamrozić komórki w gęstości 6 x 106 komórek/ml przy użyciu standardowych metod kriokonserwacji powolnego zamrażania12.
- Przechowuj keratynocyty w ciekłym azocie (faza parowa) do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
4. Rozmrażanie i hodowla zamrożonych keratynocytów
- Odpowiednie zamrożone fiolki należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Użyj 70% etanolu do czyszczenia zewnętrznej części kriowialu. Przenieść odpowiednią liczbę komórek (około 15 000 komórek/cm2) do kolby hodowlanej i natychmiast dodać wstępnie ogrzaną pożywkę wzrostową (KSFM) do kolby hodowlanej.
Można użyć kolb hodowlanych o dowolnym rozmiarze, w zależności od konfiguracji eksperymentu. - Użyć 5 ml pożywki hodowlanej do kolby hodowlanejo średnicy 25 cm2. Liczba komórek dodanych do kolby hodowlanej może się różnić, ponieważ wzrost komórek różni się w zależności od dawcy. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy wilgotności 100% i 5% CO2 .
- Zmień podłoże po 2 dniach i trzy razy w tygodniu, używając świeżego, wstępnie podgrzanego KSFM.
Uwaga: Nasze dane wykazały, że średnio 95% komórek wyizolowanych za pomocą opisanego tutaj protokołu jest dodatnich dla markera keratynocytów cytokeratyny-1413.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Różnicowanie końcowe indukowane wapniem
Ludzkie keratynocyty ulegają różnicowaniu końcowemu po potraktowaniu wapniem14,15,16. Pierwotne ludzkie keratynocyty wyizolowano i hodowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Po osiągnięciu konfluencji na poziomie około 50 - 60%, komórki stymulowano wapniem (1,2 mM) lub placebo, a zdjęcia komórek wykonano w dniu 0, 1 i 2. Rycina 1 prze...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy, jak łatwo wyizolować pierwotne ludzkie keratynocyty ze skóry dorosłego człowieka i jak hodować je in vitro. Model ten może mieć szerokie zastosowanie w badaniach biologii komórek naskórka i może być przydatny dla naukowców zainteresowanych badaniem chorób skóry.
Niektóre z zalet opisanego tutaj protokołu polegają na tym, że w przeciwieństwie do keratynocytów wyizolowanych z napletka noworodka uzyskanego od nowonarodzonych mężczyzn poddawanych obrzezaniu, pierw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
. Autor nie pozostaje w konflikcie interesów.
Podziękowania
Autor pragnie podziękować Annette Blak Rasmussen i Kristine Moeller za ich wsparcie techniczne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Pożywka do hodowli komórkowych |
| Suplementy KSFM | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Suplementy dla KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS bez wapnia i magnezu |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimetylosulfoksydek |
| Gentamycyna | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych |
| Filtr sterylizacyjny | Sartorius | 16534 | Filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 i mikro; m |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T7409 | Służy do trypsynizacji komórek |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G7528-RPMI-1640 | |
| ThermoFisher Scientific | 61870-010-FBS | ||
| ThermoFisher Scientific | 16000044 | Służy do inaktywacji kleszczy trypsyny | |
| - | można użyć | ||
| Nożyczki | - | można użyć nożyczek dowolnej firmy | |
| Skalpel | Swann Morton | 0501 | Można użyć skalpeli dowolnej firmy |
| 70% etanolu | - | -- | |
| Gaziki | NOBAMED | 875420 | użyć nakładek z gazy od dowolnego dostawcy |
| Strugarka nożna | Credo Solingen | 1510 | Można użyć |
| Szalki Petriego | TPP | 93100 | Można używać szalek Petriego od dowolnego dostawcy |
| Filtr metalowy | - | Wewnętrzny filtr metalowy o średnicy 1 mm | |
| 75 cm2 kolby hodowlane | NUNC | ||
| 156499-150 cm2 Termos | TTP | 90151-0,05 | |
| % Roztwór trypsyny-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Służy do trypsynizacji komórek podczas pasażu |
Bibliografia
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
