Ten protokół opisuje wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej, zaadsorbowanych związkami zawierającymi długołańcuchowe węglowodory, które mogą być używane do monitorowania fuzji makrofagów żywych próbek i umożliwiają super-rozdzielczość mikroskopii utrwalonych próbek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie powierzchni szklanych o jakości optycznej do badania fuzji makrofagów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wizualizacja powstawania wielojądrowych komórek olbrzymich (MGC) z żywych okazów była wyzwaniem ze względu na fakt, że większość technik obrazowania na żywo wymaga rozchodzenia się światła przez szkło, ale na szkle fuzja makrofagów jest rzadkim zjawiskiem. Protokół ten przedstawia wytwarzanie kilku powierzchni szklanych o jakości optycznej, w których adsorpcja związków zawierających węglowodory długołańcuchowe przekształca szkło w powierzchnię fuzogeniczną. W pierwszej kolejności opisano przygotowanie czystych powierzchni szklanych jako materiału wyjściowego do modyfikacji powierzchni. Po drugie, opracowano metodę adsorpcji związków zawierających węglowodory o długich łańcuchach w celu przekształcenia szkła niefuzogennego w podłoże fuzogeniczne. Po trzecie, protokół ten opisuje wytwarzanie mikrowzorów powierzchniowych, które promują wysoki stopień czasoprzestrzennej kontroli nad powstawaniem MGC. Na koniec opisano wytwarzanie naczyń ze szklanym dnem. Przedstawiono przykłady wykorzystania tego systemu komórkowego in vitro jako modelu do badania fuzji makrofagów i powstawania MGC.
Wprowadzenie
Powstawanie MGC towarzyszy wielu stanom patologicznym w ludzkim ciele wyróżniającym się przewlekłym stanem zapalnym1. Pomimo zgody co do tego, że makrofagi monojądrowe łączą się, tworząc MGCs2, zaskakująco niewiele badań wykazało fuzję w kontekście z żywymi okazami3,4. Dzieje się tak, ponieważ czyste szklane powierzchnie, które są wymagane w większości technik obrazowania, nie sprzyjają fuzji makrofagów, gdy są indukowane przez cytokiny zapalne5. Rzeczywiście, jeśli czyste szkło jest używane jako podłoże do fuzji makrofagów, wówczas obiektywy o małym lub średnim powiększeniu (tj. 10-20X) i ponad 15 godzin ciągłego obrazowania są często wymagane do zaobserwowania pojedynczego zdarzenia fuzji.
Z drugiej strony, fuzogeniczne powierzchnie z tworzywa sztucznego (np. permanox) lub plastik klasy bakteriologicznej sprzyjają fuzji2. Jednak obrazowanie przez plastik jest problematyczne, ponieważ podłoże jest grube i rozprasza światło. Komplikuje to obrazowanie, ponieważ wymagane są obiektywy o dużej odległości roboczej (LWD). Jednak obiektywy LWD mają zwykle słabą zdolność zbierania światła w porównaniu z ich odpowiednikami z korekcją nakrywkową. Co więcej, techniki wykorzystujące zmiany polaryzacji światła przechodzącego przez próbkę, takie jak różnicowy kontrast interferencyjny, są niemożliwe, ponieważ plastik jest dwójłomny. Bariery związane z użyciem tworzyw sztucznych są dodatkowo podkreślone przez fakt, że nie można przewidzieć, gdzie na powierzchni nastąpi fuzja makrofagów/MGC. Łącznie ograniczenia te ograniczają wizualizację fuzji makrofagów do optyki z kontrastem fazowym, wydłużonego całkowitego czasu obrazowania (>15 godzin ciągłej) i niskiej rozdzielczości.
Niedawno zidentyfikowaliśmy wysoce fuzogeniczną powierzchnię szkła podczas przeprowadzania mikroskopii superrozdzielczej pojedynczych cząsteczek z ustalonymi makrofagami/MGCs4. Obserwacja ta była zaskakująca, ponieważ czyste szklane powierzchnie sprzyjają fuzji z bardzo niską szybkością ~ 5% po 24 godzinach w obecności interleukiny-4 (IL-4), jak określono za pomocą wskaźnika fuzji4. Odkryliśmy, że zdolność do promowania fuzji była spowodowana zanieczyszczeniem oleamidem. Adsorpcja oleamidu lub innych związków, które podobnie zawierały węglowodory długołańcuchowe, sprawiła, że szkło stało się fuzogenne. Najbardziej fuzogenny związek (wosk parafinowy) był mikrowzorowany i zapewniał wysoki stopień czasoprzestrzennej kontroli nad fuzją makrofagów oraz 2-krotny wzrost liczby zdarzeń fuzji obserwowanych w tym samym czasie w porównaniu z permanoksem. Te powierzchnie o jakości optycznej dały pierwszy wgląd w cechy morfologiczne i kinetykę, które rządzą powstawaniem MGC u żywych okazów.
W tym protokole opisujemy wytwarzanie różnych powierzchni szklanych, które mogą być używane do monitorowania powstawania MGC z żywych okazów. Ponadto pokazujemy, że powierzchnie te są podatne na techniki superrozdzielczości dalekiego pola. Wytwarzanie powierzchni zależy od celu eksperymentu, a każda powierzchnia jest opisana wraz z powiązanymi przykładami w tekście poprzedzającym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury wykorzystujące zwierzęta zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Klinice Mayo, Kampusie Badawczym Janelia i Uniwersytecie Stanowym Arizony.
1. Przygotowanie szkła nakrywkowego oczyszczonego kwasem
UWAGA: Szkło nakrywkowe zakupione od wielu producentów może nie być tak czyste, jak oczekiwano. Rozważ rutynowe czyszczenie partii szkła nakrywkowego przed każdym zabiegiem, w którym w grę wchodzi mikroskopia.
- Kup szkło nakrywkowe o wysokiej rygorystyczności. Zwróć szczególną uwagę, aby wybrać odpowiednią grubość (0,15 lub 0,17 mm).
UWAGA: Wybór grubości szkła nakrywkowego zależy od obiektywu mikroskopu i jest podany bezpośrednio na tubusie obiektywu. - Inkubować szkło nakrywkowe w 12 M kwasie solnym w dobrze wentylowanym dygestoriach chemicznych przez 1 godzinę z sonikacją (42 kHz, 70 W). Powtórz ten krok jeszcze dwa razy ze świeżym 12 M HCl.
- Napełnij osobną zlewkę ultraczystą wodą i dodaj szklankę nakrywkową. Sonikuj szkło nakrywkowe przez 5 - 10 minut w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym. Powtórz ten krok dziesięć razy.
- Inkubować szkło nakrywkowe w czystym acetonie w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym przez 30 minut z sonikacją. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
- Napełnij oddzielną zlewkę sterylną ultraczystą wodą i dodaj szklankę nakrywkową. Sonikuj szkło nakrywkowe przez 5 - 10 minut w dobrze wentylowanym kapturze chemicznym. Powtórz ten krok dziesięć razy.
- Inkubować szkło nakrywkowe w 100% alkoholu etylowym w kapturze chemicznym przez 30 minut z sonikacją. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
UWAGA: Ważna jest czystość alkoholu etylowego. Zanieczyszczenia w postaci rozpuszczonych ciał stałych wysychają na szkle i mogą sprzyjać fuzji makrofagów. - W celu długotrwałego przechowywania wyczyść kwasem szkło nakrywkowe w pojemniku wypełnionym czystym alkoholem etylowym. Alternatywnie osuszyć szkło nakrywkowe azotem gazowym i przechowywać w eksykatorze próżniowym.
2. Przygotowanie fusogenicznych powierzchni o jakości optycznej
- Wysokotopliwy wosk parafinowy o niskiej temperaturze topnienia rozpuść w ultraczystym toluenie.
UWAGA: Stężenia podstawowe przyjmuje się na poziomie 10 mg/ml i rozcieńcza się w stosunku 1:9 w ultraczystym toluenie, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml.
Uwaga: Z toluenem należy obchodzić się ostrożnie jako z teratogenem. Toluen należy utylizować zgodnie z instytucjonalnym planem higieny chemicznej. - Nanieść roztwór roboczy parafiny na suchą, oczyszczoną kwasem szklaną pokrywę w objętości, która równomiernie pokrywa powierzchnię szkła. Zdekantować nadmiar roztworu i osuszyć szkło nakrywkowe azotem lub powietrzem. Do przygotowania luzem użyj słoika Coplin zaprojektowanego tak, aby pomieścić szkło nakrywkowe.
- Wypoleruj szkło nakrywkowe 3 pociągnięciami w osi x, a następnie 3 pociągnięciami w osi y niestrzępiącą się ściereczką (patrz tabela materiałów).
- Bezpośrednio przed przeprowadzeniem eksperymentu umyj szkło nakrywkowe sterylną ultraczystą wodą, a następnie sterylizuj przez 15 - 30 minut światłem ultrafioletowym w biologicznym kapturze ochronnym. Alternatywnie można wysterylizować szkło nakrywkowe za pomocą tlenku etylenu lub promieniowania gamma.
3. Mikrowzorcowanie związków zawierających węglowodory w celu ograniczenia fuzji do określonych regionów
- Osusz oczyszczoną kwasem szklankę nakrywkową i unieruchom szybę na płaskiej powierzchni.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie zanurz siatkę szukacza do skanowania mikroskopii elektronowej ze złotą transmisyjną transmisyjną w roztworze roboczym związku (związków) węglowodorowego. Wybierz związek węglowodorowy, który spełnia cel końcowy eksperymentu (patrz Tabela 1). Odchować nadmiar roztworu, delikatnie stukając w kratkę o bibułę filtracyjną i natychmiast umieścić siatkę na środku szkła nakrywkowego. Pozostaw toluen do wyschnięcia na 2 minuty przed przejściem do następnego kroku.
- Upewnij się, że kratka jest przyklejona do szkła, delikatnie odwracając szkło. Jeśli kratka się odczepi, powtórz krok 3.2, używając nowej szklanki osłonowej.
UWAGA: Jeśli myjka plazmowa nie jest dostępna, pomiń krok 3.4. - Szkło nakrywkowe należy oczyścić plazmowo poprzez obróbkę plazmą gazową próżniową.
UWAGA: Siatka szukacza działa jak maska chroniąca znajdującą się pod spodem powierzchnię zaadsorbowaną przez węglowodory o długich łańcuchach z plazmy. Obszary, które nie są chronione przez siatkę, stają się niefusogenne przez wystawienie na działanie plazmy. Czas, przez jaki szkło nakrywkowe jest wystawione na działanie plazmy, należy określić empirycznie. - Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie zdejmij siatkę z powierzchni szkła, aby odsłonić mikrowzór.
4. Produkcja naczyń ze szklanym dnem
- Wywierć okrągły otwór o średnicy 6 - 10 mm w dnie plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą wiertła stopniowego.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć wiertła stopniowego, aby uzyskać gładkie krawędzie. Jeśli krawędzie są zbyt szorstkie, szkło nakrywkowe nie przylgnie płasko do dna naczynia. Nieidealnie płaskie powierzchnie utrudniają mikroskopię. - Ostrożnie wymieszać i odgazować elastomer silikonowy zgodnie z instrukcjami producenta (tj. polidimetylosiloksan; PDMS).
- Nałożyć cienką warstwę elastomeru tuż obok krawędzi otworu (tj. opisującej) go.
UWAGA: Elastomer powinien wyglądać jak ciągła, choć cienka wstęga otaczająca otwór. - Delikatnie nałożyć na naczynie fuzogeniczne szkło nakrywkowe (opisane w sekcji 2) lub suche, oczyszczone kwasem szkło nakrywkowe (opisane w sekcji 1) w celu zakrycia otworu otoczonego elastomerem. Upewnij się, że szkło nakrywkowe wydaje się zlicować z dnem naczynia i wystaje poza średnicę otworu, tak aby znaczna część szkła stykała się z plastikiem. Utwardzać elastomer przez pieczenie w temperaturze 50 °C przez 2 - 3 godziny.
- Jeśli preferowane jest szkło fuzogeniczne, naczynie i komórki hodowlane należy sterylizować promieniami UV zgodnie ze standardowymi protokołami. Jeśli jednak preferowany jest mikrowzór, przejdź do kroku 3.2 w celu przygotowania mikrowzoru (plazma gazowa używana podczas mikrowzoru sterylizuje naczynie i silnie sprzęga PDMS ze szkłem).
5. Zbieranie makrofagów wywołanych tioglikolanem
- Wstrzyknij 8-tygodniowym myszom C57BL/6 0,5 ml sterylnego roztworu 4% tioglikolanu browarnianego, jak opisano wcześniej3,4,6.
- Siedemdziesiąt dwie godziny później poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji i użytkowania zwierząt, a następnie zbierz makrofagi przez płukanie otrzewnowe lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami uzupełnionym 5 mM etylenodiaminotetraoctanu.
- Odwirować makrofagi przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić w 1 ml DMEM:F12 uzupełnionym 15 mM HEPES, 10% FBS i 1% antybiotykami (pożywka hodowlana).
UWAGA: Komórki są następnie zliczane za pomocą hemocytometru Neubauera. Makrofagi rozcieńcza się do odpowiedniego stężenia i nakłada na powierzchnie. Liczba komórek, które należy zastosować na danej powierzchni, powinna być dokładnie rozważona przez badacza na potrzeby pytania doświadczalnego. Zapoznaj się ze znanymi normami w literaturze podstawowej. - Po 30 minutach umyj powierzchnie HBSS uzupełnionym 0,1% BSA w celu usunięcia nieprzylegających komórek i zastąp je świeżą pożywką hodowlaną. Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (5% CO2 w powietrzu w temperaturze 37 °C).
- 2 godziny później odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką hodowlaną uzupełnioną 10 ng/ml IL-4. Zobrazuj komórki zgodnie z opisem w innym miejscu4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Parametry fizykochemiczne materiałów mają ogromny wpływ na stopień fuzji makrofagów7,8,9,10. Ponadto wiadomo, że zanieczyszczenia powierzchniowe promują fuzję makrofagów11. Dlatego ważne jest, aby zacząć od czystego szkiełka podstawowego jako kontroli negatywnej dla fuzji makrofagów. Po oczyszczeniu zgodnie z opisem w protokole 1, szkiełk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Potrzeba zidentyfikowania, a następnie opracowania powierzchni szklanych o jakości optycznej, które sprzyjają fuzji makrofagów, wynikała z faktu, że do niedawna żadne opublikowane badanie nie wizualizowało bezpośrednio fuzji makrofagów w kontekście żywych okazów 3,4. Wynika to z faktu, że powszechnie stosowane fuzogeniczne powierzchnie z tworzywa sztucznego wymagają obiektywów LWD i są w dużej mierze ograniczone do optyki z kontrastem fazowym. Bariery te zostały ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Pragniemy podziękować członkom laboratorium Ugarova i badaczom z Centrum Biologii Metabolicznej i Naczyniowej za pomocną dyskusję na temat tej pracy. James Faust pragnie wyrazić swoją wdzięczność instruktorom na kursie mikroskopii super rozdzielczej w Europejskim Laboratorium Biologii Molekularnej w 2015 roku. Pragniemy podziękować Satya Khuon z Janelia za pomoc w przygotowaniu próbki do LLSM. Podczas recenzji i kręcenia części filmowej James Faust był wspierany przez stypendium T32 Fellowship (5T32DK007569-28). Komponent Lattice Light Sheet tej pracy był wspierany przez HHMI oraz Fundację Betty i Gordona Moore'ów. T.U. jest finansowany z grantu NIH HL63199.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Środek do czyszczenia plazmowego | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Siatka szukacza | Mikroskopia elektronowa nauki | G400F1-Au | każda złota siatka TEM będzie działać |
| Szkło osłonowe (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | używaj tylko szkła nakrywkowego o wysokiej rygorystyczności |
| Wosk parafinowy | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Wazelina | Sigma Aldrich | 16415 | musi być wolny od alfa-tokoferolu, jeśli jest podstawiony |
| Oleamid | Sigma Aldrich | O2136 | przygotować świeży |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluen | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Aceton | VWR International | BDH1101 | |
| Etanol | Mikroskopia elektronowa nauki | 15050 | używać nisko rozpuszczonego ciała stałe etanol |
| Kwas solny | Fischer Scientific | A144C-212 | stosować do mycia kwasem szkła nakrywkowego |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mieszać w stosunku 1:10 i utwardzać w temperaturze 50 &; C na |
| szalkę Petriego 4 h 35 mm | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Kleszcze Dumont nr 5 | Mikroskopia elektronowa sciences | 72705 | idealna do usuwania siatki TEM w sekcji 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | zawiera 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA roztwór | Sigma Aldrich | A9576 | stosować w stężeniu 0,1% w HBSS do przemywania nieprzylegających makrofagów |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | podwielokrotność przy 10 μ g/ml i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | do stosowania do utrwalonych próbek lub technik, które nie wymagają środków kontrastowych |
| Myszy eGFP-LifeAct | nie | nie dotyczy zastosowanie do obrazowania fluorescencyjnego na żywo | |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | Służy do polerowania powierzchni zaadsorbowanych przez węglowodory |
Bibliografia
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
