Ten protokół ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchni wysp trzustkowych za pomocą nanopowłoki starPEG z włączoną heparyną poprzez pseudo-bioortogonalną chemię pomiędzy grupami N-hydroksysukcynimidowymi nanopowłoki a grupami aminowymi błony komórkowej wysp trzustkowych.
Artykuł metodologiczny
Inżynieria powierzchni wysp trzustkowych z heparynizowaną nanopowłoką StarPEG
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inżynieria powierzchni komórek może chronić wszczepione komórki przed atakiem immunologicznym gospodarza. Może również przekształcić krajobraz komórkowy, aby poprawić funkcję przeszczepu i przeżycie po przeszczepie. Protokół ten ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchni wysp trzustkowych przy użyciu ultracienkiej nanopowłoki starPEG (Hep-PEG) z włączoną heparyną. Aby wytworzyć nanopowłokę Hep-PEG do inżynierii powierzchni wysp trzustkowych, najpierw zsyntetyzowano bursztynian sukcynimidylu heparyny (Heparyna-NHS) poprzez modyfikację jego grup karboksylowych przy użyciu chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS). Mieszanina Hep-PEG została następnie utworzona przez sieciowanie funkcjonalizowanego końcami aminowymi ośmioramiennego starPEG (starPEG-(NH2)8) i Heparyny-NHS. W celu pokrycia powierzchni wysp mysich wyizolowano mysie wyspy trzustkowe poprzez trawienie kolagenazą i oczyszczanie gradientowe przy użyciu histopaki. Izolowane wyspy trzustkowe były następnie traktowane lodowatym roztworem Hep-PEG przez 10 minut, aby umożliwić kowalencyjne wiązanie między NHS a grupami aminowymi błony komórkowej wysp trzustkowych. Nanopowlekanie Hep-PEG powoduje minimalne zmiany w wielkości i objętości wysp trzustkowych, a heparynizacja wysp trzustkowych za pomocą Hep-PEG może również zmniejszyć natychmiastową reakcję zapalną za pośrednictwem krwi podczas przeszczepu wysp trzustkowych. To "łatwe do przyjęcia" podejście jest wystarczająco łagodne, aby można było przeprowadzić inżynierię powierzchniową żywych komórek bez uszczerbku dla ich żywotności. Biorąc pod uwagę, że heparyna wykazała powinowactwo do wiązania z wieloma cytokinami, nanopowłoka Hep-PEG stanowi również otwartą platformę, która umożliwia włączenie nieograniczonej liczby funkcjonalnych mediatorów biologicznych i wielowarstwowych powierzchni do bioinżynierii powierzchni żywych komórek.
Wprowadzenie
Skuteczność terapeutyczna terapii opartych na komórkach jest ograniczona przez niską retencję komórek i słabą przeżywalność1,2. W celu poprawy wyników terapii komórkowych wykorzystano inżynierię powierzchni komórki poprzez manipulację enzymatyczną, koniugację peptydów, chemię bioortogonalną i fizyczną enkapsulację za pomocą biomateriałów3,4,5,6,7,8,9,10. Obecny protokół ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchniowej żywych komórek za pomocą metody "łatwej do przyjęcia" poprzez nałożenie na powierzchnię komórki ultracienkiej nanopowłoki starPEG (heparyna-PEG) z włączoną heparyną. Inżynieria powierzchniowa wysp trzustkowych została przedstawiona jako przykład ze względu na niejednorodny charakter wysp Langerhansa i dyskredytujące wyniki obecnego klinicznego przeszczepu wysp trzustkowych.
Rzeczywiście, kliniczne przeszczepienie wysp trzustkowych jest obecnie wykonywane przez bezpośrednie wstrzyknięcie izolowanych wysp trzustkowych do żyły wrotnej wątroby i ta procedura jest dostępna tylko dla wybranych pacjentów ze względu na niedostatek materiałów dawcy i niską skuteczność terapeutyczną11. Tradycyjnie alginian jest najczęściej stosowanym biomateriałem do enkapsulacji wysp trzustkowych i modyfikacji powierzchni, chociaż jest on daleki od ideału ze względu na niestabilność chemiczną alginianu i zwłóknienie związane ze stanem zapalnym12,13. Ponadto, w porównaniu z naturalną wielkością wysepek, która waha się od 100 do 200 μm, mikrokapsułki alginian-wyspa jest większa, od 400 do 800 μm, co przekracza fizjologiczną odległość dyfuzji tlenu. Następnie opracowano enkapsulację wysepek konforemnych, tj. hermetyzację wysepek bez znaczącej zmiany objętości wysp. W związku z tym opisano osadzanie nanomembran składających się z PEG, tetrafluoroetylenu, membrany silikonowej lub wielowarstwowej nanopowłoki (znanej również jako technika "warstwa po warstwie" [LBL]), co skutkuje poprawą przeżywalności wysp trzustkowych in vitro14,15,16,17,18, chociaż podejście LBL często wymaga długiego okresu przekazywania wysepek w celu osadzenia wielu warstw, co może zagrozić żywotności wysepek. Co więcej, niestabilność nanomembran, która opiera się na oddziaływaniach elektrostatycznych lub kowalencyjnych między warstwami biomembrany lub oddziaływaniach hydrofobowych między nanomembranami a powierzchnią wysepki, również budzi obawy9,14,15,16,22,23,24, 25,26.
Innym czynnikiem ograniczającym, który obciąża wynik terapeutyczny przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwrotnych, jest natychmiastowa reakcja zapalna za pośrednictwem krwi (IBMIR) spowodowana bezpośrednim kontaktem implantowanych wysp trzustkowych z krwią, powodująca agregację płytek krwi, krzepnięcie i niekorzystny efekt immunologiczny lub niepożądaną aktywację komórkową9. Aby rozwiązać te problemy, przygotowano ultracienką nanopowłokę składającą się z glikolu polietylenowego w kształcie gwiazdy (starPEG), która zapewnia jej biokompatybilność i wszechstronność jako materiał obudowy wysepek. Heparyna, silnie siarczanowany glikozaminoglikan, została również włączona do nanopowłoki starPEG ze względu na jej właściwości przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe i zdolność do ułatwiania unaczynienia poprzez rekrutację proangiogennych czynników wzrostu22,23.
Protokół
1. Wytwarzanie nanopowłoki Starpeg z dodatkiem heparyny
- Synteza bursztynianu sukcynimidylu heparyny (Heparin-NHS)
- Odważyć 0,69 g heparyny i rozpuścić w 2,0 ml lodowatej wody dejonizowanej.
- Odważyć 0,23 g NHS i rozpuścić w 0,5 ml lodowatej wody dejonizowanej w kolbie okrągłodennej.
- Odważyć 0,77 g EDC i rozpuścić w 0,5 ml lodowatej wody dejonizowanej w kolbie okrągłodennej.
- Wymieszać roztwory NHS i EDC w kolbie okrągłodennej. Pozostaw zmieszany roztwór na stole w temperaturze pokojowej na 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Odwirować mieszaninę EDC NHS o sile 5,031 x g przez 10 minut, aby usunąć nadmiar EDC i NHS.
- Dodać 30 ml zimnego etanolu do roztworu mieszaniny i odwirować przy 5,031 x g przez 10 minut.
- Powtórz dwa razy.
- Przygotowanie nanopowłoki starPEG-heparyna
- Dodać 1,0 ml 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 do kolby okrągłodennej.
- Dodać 0,67 ml 10% (w/v) heparyny-NHS do tej samej kolby okrągłodennej.
- Umieścić zmieszany roztwór starPEG-(NH2)8 i heparyny-NHS w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 20 minut, aby uzyskać klarowny roztwór o lepkości.
UWAGA: W przypadku eksperymentów, w których wymagana była heparyna znakowana fluorescencyjnie (heparyna FAM), procedura wytwarzania jest taka sama, z wyjątkiem tego, że gwiazda-PEG-(NH2)8 została rozpuszczona w wodzie dejonizowanej uzupełnionej estrem N-sukcynimidylu 5(6)-karboksyfluoresceiny 0,1% (stosunek molowy) starPEG-(NH2)8. )
- Charakterystyka nanopowłoki heparyna-PEG za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR)
- Przed rozpoczęciem należy opłukać moździerz agatowy, tłuczek i urządzenie do granulowania (małe krążki o średnicy 13 mm) acetonem i wodą dejonizowaną. Przed użyciem wysuszyć szklane naczynia w piekarniku.
- Wymieszać około 0,1–1% próbki heparyny-PEG z 200–250 mg drobnego proszku KBr.
- Mieszaninę heparyny-PEG i KBr umieścić w zaprawie agatowej i drobno rozdrobnić na małe granulki o średnicy 2 μm.
- Przenieś mieszaninę do urządzenia do granulowania. Zastosuj dużą siłę ściskania (8 T/cm2) w próżni przez 1–2 minuty, aby uzyskać przezroczyste granulki.
- Delikatnie odciągnij granulki próbki od urządzenia do peletowania. Uważaj, aby nie ciągnąć zbyt mocno, aby nie spowodować pęknięć.
- Bardzo ostrożnie przenieś granulki próbki do spektroskopu podczerwieni z transformacją Fouriera w celu określenia struktury chemicznej próbki.
- Badanie wewnętrznych porowatych struktur nanopowłoki heparyna-PEG za pomocą skanowanej mikroskopii elektronowej (SEM)
- Do poniższych procedur należy przygotować standardową 48-dołkową płytkę do hodowli komórkowej i pipety.
- Odpipetować roztwór kopolimeru heparyny-PEG do studzienek 48-dołkowej płytki hodowlanej.
- Zamrażać płytkę w temperaturze -80 °C przez 24 godziny.
- Lipofilizować próbki w temperaturze -50 °C w środowisku próżniowym (0,1 Pa) przez 24 godziny.
- Rozprowadź próbki na lepkiej powierzchni aluminiowego klocka.
- Pokryj próbki złotem i obserwuj pod skanowanym mikroskopem elektronowym, aby zaobserwować wewnętrzne porowate struktury.
- Badanie powierzchni nanopowłoki heparyna-PEG za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)
- Szkiełka ze szkła krzemionkowego czyścić roztworem piranii (70%H2SO4, 30%H2O2) w temperaturze 80 °C przez 40 min.
- Sonikować szkiełka w metanolu przez 10 minut, a następnie w toluenie przez 10 minut.
- Wysuszyć szkiełka przez suszenie próżniowe.
- Umyj szkiełka dużą ilością roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu (2% w toluenie), delikatnie wstrząśnij.
- Sonikować szkiełka w metanolu przez 10 minut, a następnie w toluenie przez 10 minut.
- Umieścić 100 μl 3% roztworu heparyny-PEG na powierzchni szkiełek za pomocą standardowej pipety.
- Zbadaj powierzchnię heparyny-PEG pod mikroskopem sił atomowych (częstotliwość rezonansowa 50–80 kHz, stała siła 0,350 N m 21, promień końcówki 600 nm).
2. Inżynieria powierzchni mysich wysepek z nanopowłoką heparynowo-PEG
- Powłoka powierzchni wysepek myszy nanopowłoką heparynowo-PEG
- Ekstrakcja mysich wysp przez trawienie kolagenazą i oczyszczanie gradientowe histopatyczne, jak wcześniej opisano w JoVE19.
- Ręcznie wybierz 200 wysepek pod mikroskopem preparacyjnym do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Dodać 500 μl PBS do wysepek i odwirować przy 503 x g przez 1 min.
- Zdjąć sklarowany osad i dodać 250 μl roztworu heparyny-PEG i trzymać mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Pipetować w górę i w dół, aby wyspy trzaskowe dobrze wymieszały się z roztworem heparyny-PEG.
- Wirować przy 503 x g przez 1 min.
- Usunąć supernatant i dodać 500 μl PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.
- Wirować przy 503 x g przez 1 minutę, usunąć supernatant i zachować wysepki do dalszego wykorzystania. Do badania mysich wysp trzustkowych pokrytych heparyną-PEG, FAM-heparyna-PEG została użyta do powlekania wysp trzustkowych zgodnie z poniższymi krokami.
- Badanie mysich wysp trzustkowych pokrytych nanopowłoką FAM-heparyna-PEG
- Dodać 1-2 ml RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą do powlekanych wysp trzustkowych i przenieść te wyspy do nienaładowanego sterylnego naczynia do hodowli bakteryjnej.
- Obserwuj morfologię i sygnały fluorescencyjne wysp pokrytych nanopowłoką FAM-heparyna-PEG pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
3. Funkcja wysepek myszy pokrytych heparyną i PEG w porównaniu z wysepkami niepowlekanymi
- Żywotność mysich wysp trzustkowych pokrytych heparyną i PEG
- Ręcznie wybierz 20 mysich wysepek pokrytych heparyną i PEG i umieść je w jednym dołku 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
- Napełnij w sumie 10 studzienek 20 mysim wysepkami pokrytymi heparyną PEG dla każdej studzienki.
- Ręcznie wybierz 20 niepowlekanych wysepek kontrolnych i umieść je w jednym dołku tej samej 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
- Napełnij łącznie 10 studzienek 20 niepowlekanymi wysepkami kontrolnymi dla każdej studzienki.
- Umieść 200 μl RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, która zawiera wysepki i utrzymuj w kulturze przez 14 dni.
- Pożywkę do hodowli wysp trzustkowych należy wymieniać co 2 dni.
- Pod koniec 14 dni w hodowli należy potraktować wysepki żywym/martwym zestawem do barwienia i obserwować pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
- Policz komórki PI+ (czerwone) w każdej wysepce pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
- Rewaskularyzacja mysich wysp trzustkowych pokrytych heparyną i PEG in vitro
- Wszystkie eksperymentalne tworzywa sztuczne, w tym płytki hodowlane i końcówki pipet, należy schłodzić co najmniej 12 godzin przed użyciem.
- Umieść 24-dołkowe miejsce na podkładce chłodzącej. Dodaj 250 μl lodowatego Matrigelu o zredukowanym czynniku wzrostu do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Umieścić powlekaną płytkę 24-dołkową w temperaturze 4 °C na co najmniej 30 minut.
- Podczas gdy roztwór matrycy ustawia się w lodówce, trypsynizuj komórki śródbłonka trzustki myszy Mile Sven 1 (MS1).
- Usunąć wszystkie pożywki hodowlane z kolby do hodowli tkankowych. Przepłukać kolbę 5 ml PBS.
- Usuń PBS i dodaj 3 ml trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty w standardowym inkubatorze.
- Lekko postukać w dno kolby, aby odłączyć komórki i dodać 5 ml pożywki uzupełnionej surowicą.
- Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 1 000 x g przez 5 minut.
- Zdjąć supernatant i dodać 5 ml PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.
- Odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut i zdjąć supernatant.
- Dodaj pożywkę DMEM uzupełnioną surowicą do probówki i zasiej 50 000 komórek do każdego dołka 24-dołkowej płytki pokrytej roztworem matrycy.
- Dodaj 5 wysepek pokrytych heparyną-PEG lub niepowlekanych wysepek kontrolnych do każdej studzienki.
- Dodaj pożywkę DMEM uzupełnioną surowicą do każdego dołka, w sumie 500 μl na studzienkę.
- Obserwuj formowanie się probówki po 4 i 24 godzinach inkubacji pod mikroskopem świetlnym.
- Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny przez wyspy trzustkowe pokryte heparyną-PEG
UWAGA: Aby ocenić, czy nanopowłoka wpłynie na funkcję mysich wysp trzustkowych, oceniono stymulowane glukozą wydzielanie insuliny przez wyspy trzustkowe pokryte heparyną-PEG i niepowlekane.- Ręcznie wybierz 30 wysepek pokrytych heparyną-PEG lub niepowlekanych wysepek kontrolnych do jednej probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj w sumie 10 probówek dla wysp powlekanych i niepowlekanych.
- Dodać 1 ml roztworu soli fizjologicznej uzupełnionego o 2 mmol/l glukozy20 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny
UWAGA: Przepis na fizjologiczny roztwór soli znajduje się w Tabeli 1. Podczas inkubacji w inkubatorze należy trzymać luźną nasadkę probówek. - Usuń jak najwięcej roztworu.
- Stymulować wyspy trzustkowe, dodając 600 μl roztworu soli fizjologicznej uzupełnionego 20 mmol/l glukozy w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Zebrać 200 μl supernatantu z każdej probówki w celu ilościowego określenia poziomu testu ELISA insuliny za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do insuliny.
Wyniki
Nanopowłokę z heparyny-PEG zsyntetyzowano poprzez konjugację starPEG-(NH2)8 i heparyny przy użyciu EDC i NHS jako czynników sprzęgających (Rysunek 1). Strukturę chemiczną nanopowłoki z heparyny-PEG zbadano za pomocą spektroskopii FT-IR i jak pokazano na Rysunku 2, charakterystyczne piki heparyny zaobserwowano w zakresie 3 30–3 60 cm-1, co odpowiada grupom hydroksylowym heparyny (Rysunek 2 czerwony). Spadek amplitudy piku przy 3 30–3 600 cm-1 (Rysunek 2 niebieski) reprezentuje konjugację pomiędzy grupami amidowymi starPEG-(NH2)8 a grupą karbonylową heparyny. Zredukowana została również amplituda piku 1 650 cm-1, odpowiadającego drganiom rozciągającym grupy karbonylowej amidu, co wskazuje na wystarczającą reakcję grup karboksylowych heparyny z bursztynianem sukcynymidylowym i aminą starPEG-(NH2)8. Strukturę powierzchni nanopowłoki z heparyny-PEG zbadano za pomocą mikroskopii sił atomowych i jak wykazali Lou et al., nanopowłoka miała wysokość około 30 nm i szerokość 2 µm z niewielkimi porowatymi elementami (ciemne punkty) o średnicy od 100 do 20 nm10. Dane uzyskane z mikroskopii elektronowej z modulacją skanowania potwierdzają również wysoce połączoną strukturę porowatą heparyny-PEG (Rysunek 3), co sugeruje, że może ona być odpowiednia dla przeżywalności komórek podczas dostarczania in vivo.
Zbadano powłokę powierzchniową izolowanych wysepek myszy i jak przedstawiono na Rysunku 4, cienka warstwa nanopowłoki, widoczna jako zielona fluorescencja, została równomiernie naniesiona na powierzchnię powlekanych wysepek, nie powodując widocznych zmian w ich objętości lub rozmiarze. Podczas powlekania zaleca się przechowywanie wysepek w lodzie w celu utrzymania ich żywotności. Podobnie czas powlekania, który w tym przypadku wynosił 10 min, został zoptymalizowany, aby umożliwić zachowanie żywotności wysepek. Warto zaznaczyć, że dla lepszej obserwacji nanopowłoki bardziej odpowiednia byłaby mikroskopia elektronowa badająca przekroje poprzeczne powlekanych wysepek, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami9,16, choć dane byłyby generowane z wysepek utrwalonych i zatopionych w medium, a nie z żywych wysepek w hodowli.
W odniesieniu do przeżywalności i funkcji powlekanych wysp, oceniano rewascularyzację i funkcje wysp in vitro. Biorąc pod uwagę korzystne właściwości heparyny, funkcjonalizacja powierzchni wysp heparyną mogłaby ułatwić rewascularyzację wysp w hodowli, a w konsekwencji ich przeżycie. Zaobserwowano, że mysie wyspy powlekane heparyną-PEG wykazywały wysoką żywotność w hodowli (Rysunek 5). Znacznie bardziej zaawansowana formacja naczyń była również widoczna w przypadku komórek śródbłonka wysp (MS1) współhodowanych z wyspami powlekanymi heparyną-PEG, co objawiało się obecnością wydłużonych struktur przypominających mikronaczynia oraz sieciowatych struktur naczyniowych (Rysunek 6).
Proces nanopowlekania nie wpłynął na zdolność do glukozyzależnego wydzielania insuliny w przypadku wysp powlekanych heparyną-PEG. Niski poziom wydzielania insuliny zaobserwowano we wszystkich grupach badawczych podczas perfuzji wysp fizjologicznym roztworem soli uzupełnionym o podstymulacyjny poziom glukozy (2 mmol/L; Rycina 7). Po stymulacji wysp nadfizjologicznym poziomem glukozy (20 mmol/L glukozy) we wszystkich grupach badawczych odnotowano wzrost wydzielania insuliny.
Rysunek 1: Struktura chemiczna nanopowłoki Hep-PEG do inżynierii powierzchni wysp trzustkowych. Powłokę wysepek uzyskano poprzez kowalencyjne sieciowanie heparyny-NHS i amin pierwszorzędowych w błonie komórkowej oraz star-PEG-(NH2)2)8Każda cząsteczka heparyny posiada wiele grup karboksylowych, które zmodyfikowano tak, aby każda z nich posiadała grupę NHS. Grupy karboksylowe aktywowane przez NHS będą reagować z aminami pierwszorzędowymi białka, tworząc wiązania amidowe, dzięki którym nanopowłoka z Hep-PEG oraz wysepki zostaną ustabilizowane. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Widmo podczerwone star-PEG-(NH2)2)8, heparyna oraz nanopowłoka Hep-PEG w stanie wysuszonym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 3: Obrazy z pomiaru skaningowej mikroskopii elektronowej Hep-PEG w stanie wysuszonym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy wysp powlekanych heparyną-PEG pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Heparynę wcześniej znakowano FAM (kolor zielony). Obrazy są reprezentatywne dla 10 wysepek. Pasek skali = 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Wyspyletniczki pokryte powłoką z heparyny-PEG wykazały wysoką żywotność. (A) Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej, n = 50 wysepek na grupę. (B) Żywe komórki zaznaczono kolorem zielonym, a martwe komórki kolorem czerwonym. Pasek skali = 100 µmObrazy są reprezentatywne dla 50 wysepek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Nanopowłoka z heparyny-PEG wspomaga rewaskularyzację wewnątrzwyspową. Tworzenie struktur rurkowatych przez komórki MS1 w Matrigelu w hodowli współdzielonej z wysepkami powlekanymi heparyną-PEG oraz kontrolnymi wysepkami niepowlekanymi. Obrazy wykonano po 4 i 24 godzinach. Pasek skali = 100 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rysunek 7: Nanopowłoka z heparyny-PEG nie wpływa na funkcję wydzielania insuliny przez wysepki. Wyspawy pokryte heparyną-PEG oraz wyspawy kontrolne niepokryte (po 30 sztuk) poddano działaniu glukozy w stężeniu 2 mmol/L (biały słupek) lub 20 mmol/L (czarny słupek) przez 30 min. Wydzielanie insuliny w odpowiedzi na 20 mmol/L glukozy było porównywalne w przypadku wyspaw pokrytych i kontrolnych. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej, n = 10. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.
Dyskusja
W tym artykule demonstrujemy "łatwe do przyjęcia" podejście do inżynierii powierzchni żywych komórek nanopowłoki starPEG z włączoną heparyną za pomocą pseudo-bioortogonalnej chemii między grupami N-hydroksysukcynimidowymi nanopowłoki a grupami aminowymi błony powierzchniowej wysp trzustkowych. Rzeczywiście, grupy aminowe w błonach komórkowych są wysoce reaktywne, w wyniku czego wcześniejsze badania wykazały interakcje między pierwszorzędowymi grupami aminowymi z aktywowanym estrem N-hydroksysukcynimidylu (NHS) w warunkach fizjologicznych 14,16,21. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że włączenie heparyny, silnie siarczanowanego glikozaminoglikanu i ważnego składnika macierzy zewnątrzkomórkowej, podczas enkapsulacji wysp trzustkowych, może prowadzić do zwiększonej rewaskularyzacji po przeszczepie i zmniejszenia IBMIR22,23. Biorąc pod uwagę biokompatybilność PEG i wielowartościowe właściwości heparyny, użyliśmy 8-ramiennego PEG do maksymalnego obciążenia heparyną podczas wytwarzania nanopowłoki. Heparyna została zmodyfikowana za pomocą -NHS, który następnie reagował z grupami -NH2 na błonie komórkowej wysp trzustkowych. Umożliwiając tworzenie wiązania kowalencyjnego między -NH2 (błony komórkowej) a -NHS Hep-PEG, wysepki byłyby łatwo "powlekane" przez PEG z heparyną, tworząc w ten sposób nano-cienką warstwę (nanopowłokę) na zewnętrznej powierzchni wysp trzustkowych.
Obecne podejście różni się od wcześniej opublikowanych metod, które również wybrały PEG jako główny polimer do mikrokapsułkowania wysp trzustkowych, ponieważ zastosowano pseudo-bioortogonalną chemię między -NHS (nanopowłoki) a -NH2 błony komórkowej wysp trzustkowych. Biorąc pod uwagę, że stabilność powłoki wyspy/komórki, szczególnie w złożonym środowisku, takim jak osocze, ma kluczowe znaczenie dla rewaskularyzacji i przeżycia po przeszczepie, tworzenie się między -NHS i -NH2 byłoby bardziej stabilne w porównaniu z hydrofobowym oddziaływaniem między PEG a błoną komórkową24, oddziaływaniami elektrostatycznymi 9,15,24,25,26lub biologiczne powiązanie między biotyną streptawidyną14.
Ponadto, w przeciwieństwie do podejścia polegającego na powlekaniu wysepek, które opiera się na podejściu LBL z wydłużonym okresem obróbki wysepek w przypadku osadzania wielowarstwowego 14,16,25, obecna technika wymaga również minimalnego przetwarzania i bardzo krótkiego okresu powlekania izolowanych wysepek. Oba te czynniki są niezbędne do przetrwania wysp trzustkowych po przeszczepie, ponieważ żywotność wysp trzustkowych jest często zagrożona już po izolacji wysp trzustkowych z powodu uszkodzonego ECM podczas trawienia enzymatycznego. Jednak jednym z ograniczeń obecnego podejścia jest to, że w przeciwieństwie do LBL, za pomocą którego grubość powłoki zewnętrznej może być kontrolowana poprzez zwiększanie lub zmniejszanie liczby osadzanych warstw, grubość nanopowłoki Hep-PEG nie może być na razie dostosowana.
Ponadto, ze względu na łagodny stan, w którym zachodzi reakcja chemiczna między -NHS i -NH2 , obecne podejście ma zastosowanie w inżynierii powierzchni żywych komórek nie ograniczając się do wysp trzustkowych, ale do większości terapii komórkowych. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że heparyna wchodzi w interakcje z szeregiem cytokin i biologicznie aktywnych cząsteczek, nanopowłoka Hep-PEG stanowi również otwartą platformę, która ma potencjał do włączenia nieograniczonej liczby mediatorów biologicznych, a także interfejsów dla bardziej złożonej inżynierii powierzchni komórki.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe Narodowych Funduszy Nauk Przyrodniczych Chin (31770968) oraz Programu Badawczego Fundacji Zastosowań i Zaawansowanych Technologii w Tianjin (17JCZDJC33400).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Streptozototin | Sigma | S0130 | |
| Histopaque | Sigma | 10831 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, firmy Life Technologies | 31800022 | |
| Surowica bydlęca | płodu, firmy Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicylina Streptomycyna | GIBCO, firmy Life Technologies | 15140 | |
| Roztwór do dysocjacji komórek | GIBCO, firmy Life Technologies | 13150-016 | |
| DMEM | GIBCO, firmy Life Technologies | 12800017 | |
| Roztwór D-(+)-glukozy | Sigma | G8644 | |
| 488 falloidyna | Sigma | A12379 | |
| CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
| Annexin V/PI zestaw apoptozy | Dojindo | AD10 | |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Kolagenaza z Clostridium, typ XI | Sigma | C7657 | |
| Heparyna | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
| EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
| 8-ramienny PEG | J& K Scientific Ltd | 1685176 | |
| FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
| 5(6)-karboksyfluoresceina N-sukcynimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
| KBr | J& K Scientific Ltd | 32036 | |
| 3-aminopropylo-trietoksysilan | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| toluen | J& K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
| Zestaw do barwienia żywego/martwego | Biovision, US | K501 | |
| BD MatrigelTM, matryca błony podstawnej, obniżony czynnik wzrostu | BD Bioscience | 354230 | |
| Chlorek sodu, 99,5% | J& K Scientific Ltd | 105864 | |
| Chlorek potasu, 99%, ekstra czysty | J& K Scientific Ltd | 991468 | |
| Wodorowęglan sodu, 99,7%, odczynnik ACS | J& K Scientific Ltd | 988639 | |
| Chlorek magnezu sześciowodny, 99%, odczynnik ACS | J& K Scientific Ltd | 182158 | |
| Diwodorofosforan potasu, 99%, ekstra czysty | J& K Scientific Ltd | 128839 | |
| Siarczan magnezu siedmiowodny, 99%, do analizy | J& K Scientific Ltd | 119370 | |
| Roztwór chlorku wapnia objętościowy, 1,0 M CaCl2 | J& K Scientific Ltd | 21114 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| Zestaw ELISA insuliny dla szczurów/myszy | Millipore-linco | EZRMI-13K |
Bibliografia
- Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
- Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
- Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
- Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
- Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
- Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
- Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
- Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
- Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
- Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
- Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
- Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
- Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
- Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
- Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
- Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
- Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
- Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
- Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
- Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).
Przedruki i uprawnienia
