Artykuł metodologiczny

Inżynieria powierzchni wysp trzustkowych z heparynizowaną nanopowłoką StarPEG

DOI:

10.3791/56879

⸱

23 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Tianjin Key Laboratory of Biomaterial Research, Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchni wysp trzustkowych za pomocą nanopowłoki starPEG z włączoną heparyną poprzez pseudo-bioortogonalną chemię pomiędzy grupami N-hydroksysukcynimidowymi nanopowłoki a grupami aminowymi błony komórkowej wysp trzustkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria powierzchni komórek może chronić wszczepione komórki przed atakiem immunologicznym gospodarza. Może również przekształcić krajobraz komórkowy, aby poprawić funkcję przeszczepu i przeżycie po przeszczepie. Protokół ten ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchni wysp trzustkowych przy użyciu ultracienkiej nanopowłoki starPEG (Hep-PEG) z włączoną heparyną. Aby wytworzyć nanopowłokę Hep-PEG do inżynierii powierzchni wysp trzustkowych, najpierw zsyntetyzowano bursztynian sukcynimidylu heparyny (Heparyna-NHS) poprzez modyfikację jego grup karboksylowych przy użyciu chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS). Mieszanina Hep-PEG została następnie utworzona przez sieciowanie funkcjonalizowanego końcami aminowymi ośmioramiennego starPEG (starPEG-(NH2)8) i Heparyny-NHS. W celu pokrycia powierzchni wysp mysich wyizolowano mysie wyspy trzustkowe poprzez trawienie kolagenazą i oczyszczanie gradientowe przy użyciu histopaki. Izolowane wyspy trzustkowe były następnie traktowane lodowatym roztworem Hep-PEG przez 10 minut, aby umożliwić kowalencyjne wiązanie między NHS a grupami aminowymi błony komórkowej wysp trzustkowych. Nanopowlekanie Hep-PEG powoduje minimalne zmiany w wielkości i objętości wysp trzustkowych, a heparynizacja wysp trzustkowych za pomocą Hep-PEG może również zmniejszyć natychmiastową reakcję zapalną za pośrednictwem krwi podczas przeszczepu wysp trzustkowych. To "łatwe do przyjęcia" podejście jest wystarczająco łagodne, aby można było przeprowadzić inżynierię powierzchniową żywych komórek bez uszczerbku dla ich żywotności. Biorąc pod uwagę, że heparyna wykazała powinowactwo do wiązania z wieloma cytokinami, nanopowłoka Hep-PEG stanowi również otwartą platformę, która umożliwia włączenie nieograniczonej liczby funkcjonalnych mediatorów biologicznych i wielowarstwowych powierzchni do bioinżynierii powierzchni żywych komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność terapeutyczna terapii opartych na komórkach jest ograniczona przez niską retencję komórek i słabą przeżywalność1,2. W celu poprawy wyników terapii komórkowych wykorzystano inżynierię powierzchni komórki poprzez manipulację enzymatyczną, koniugację peptydów, chemię bioortogonalną i fizyczną enkapsulację za pomocą biomateriałów3,4,5,6,7,8,9,10. Obecny protokół ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchniowej żywych komórek za pomocą metody "łatwej do przyjęcia" poprzez nałożenie na powierzchnię komórki ultracienkiej nanopowłoki starPEG (heparyna-PEG) z włączoną heparyną. Inżynieria powierzchniowa wysp trzustkowych została przedstawiona jako przykład ze względu na niejednorodny charakter wysp Langerhansa i dyskredytujące wyniki obecnego klinicznego przeszczepu wysp trzustkowych.

Rzeczywiście, kliniczne przeszczepienie wysp trzustkowych jest obecnie wykonywane przez bezpośrednie wstrzyknięcie izolowanych wysp trzustkowych do żyły wrotnej wątroby i ta procedura jest dostępna tylko dla wybranych pacjentów ze względu na niedostatek materiałów dawcy i niską skuteczność terapeutyczną11. Tradycyjnie alginian jest najczęściej stosowanym biomateriałem do enkapsulacji wysp trzustkowych i modyfikacji powierzchni, chociaż jest on daleki od ideału ze względu na niestabilność chemiczną alginianu i zwłóknienie związane ze stanem zapalnym12,13. Ponadto, w porównaniu z naturalną wielkością wysepek, która waha się od 100 do 200 μm, mikrokapsułki alginian-wyspa jest większa, od 400 do 800 μm, co przekracza fizjologiczną odległość dyfuzji tlenu. Następnie opracowano enkapsulację wysepek konforemnych, tj. hermetyzację wysepek bez znaczącej zmiany objętości wysp. W związku z tym opisano osadzanie nanomembran składających się z PEG, tetrafluoroetylenu, membrany silikonowej lub wielowarstwowej nanopowłoki (znanej również jako technika "warstwa po warstwie" [LBL]), co skutkuje poprawą przeżywalności wysp trzustkowych in vitro14,15,16,17,18, chociaż podejście LBL często wymaga długiego okresu przekazywania wysepek w celu osadzenia wielu warstw, co może zagrozić żywotności wysepek. Co więcej, niestabilność nanomembran, która opiera się na oddziaływaniach elektrostatycznych lub kowalencyjnych między warstwami biomembrany lub oddziaływaniach hydrofobowych między nanomembranami a powierzchnią wysepki, również budzi obawy9,14,15,16,22,23,24, 25,26.

Innym czynnikiem ograniczającym, który obciąża wynik terapeutyczny przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwrotnych, jest natychmiastowa reakcja zapalna za pośrednictwem krwi (IBMIR) spowodowana bezpośrednim kontaktem implantowanych wysp trzustkowych z krwią, powodująca agregację płytek krwi, krzepnięcie i niekorzystny efekt immunologiczny lub niepożądaną aktywację komórkową9. Aby rozwiązać te problemy, przygotowano ultracienką nanopowłokę składającą się z glikolu polietylenowego w kształcie gwiazdy (starPEG), która zapewnia jej biokompatybilność i wszechstronność jako materiał obudowy wysepek. Heparyna, silnie siarczanowany glikozaminoglikan, została również włączona do nanopowłoki starPEG ze względu na jej właściwości przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe i zdolność do ułatwiania unaczynienia poprzez rekrutację proangiogennych czynników wzrostu22,23.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie nanopowłoki Starpeg z dodatkiem heparyny

  1. Synteza bursztynianu sukcynimidylu heparyny (Heparin-NHS)
    1. Odważyć 0,69 g heparyny i rozpuścić w 2,0 ml lodowatej wody dejonizowanej.
    2. Odważyć 0,23 g NHS i rozpuścić w 0,5 ml lodowatej wody dejonizowanej w kolbie okrągłodennej.
    3. Odważyć 0,77 g EDC i rozpuścić w 0,5 ml lodowatej wody dejonizowanej w kolbie okrągłodennej.
    4. Wymieszać roztwory NHS i EDC w kolbie okrągłodennej. Pozostaw zmieszany roztwór na stole w temperaturze pokojowej na 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odwirować mieszaninę EDC NHS o sile 5,031 x g przez 10 minut, aby usunąć nadmiar EDC i NHS.
    6. Dodać 30 ml zimnego etanolu do roztworu mieszaniny i odwirować przy 5,031 x g przez 10 minut.
      1. Powtórz dwa razy.
  2. Przygotowanie nanopowłoki starPEG-heparyna
    1. Dodać 1,0 ml 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 do kolby okrągłodennej.
    2. Dodać 0,67 ml 10% (w/v) heparyny-NHS do tej samej kolby okrągłodennej.
    3. Umieścić zmieszany roztwór starPEG-(NH2)8 i heparyny-NHS w inkubatorze w temperaturze 25 °C na 20 minut, aby uzyskać klarowny roztwór o lepkości.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów, w których wymagana była heparyna znakowana fluorescencyjnie (heparyna FAM), procedura wytwarzania jest taka sama, z wyjątkiem tego, że gwiazda-PEG-(NH2)8 została rozpuszczona w wodzie dejonizowanej uzupełnionej estrem N-sukcynimidylu 5(6)-karboksyfluoresceiny 0,1% (stosunek molowy) starPEG-(NH2)8. )
  3. Charakterystyka nanopowłoki heparyna-PEG za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR)
    1. Przed rozpoczęciem należy opłukać moździerz agatowy, tłuczek i urządzenie do granulowania (małe krążki o średnicy 13 mm) acetonem i wodą dejonizowaną. Przed użyciem wysuszyć szklane naczynia w piekarniku.
    2. Wymieszać około 0,1–1% próbki heparyny-PEG z 200–250 mg drobnego proszku KBr.
    3. Mieszaninę heparyny-PEG i KBr umieścić w zaprawie agatowej i drobno rozdrobnić na małe granulki o średnicy 2 μm.
    4. Przenieś mieszaninę do urządzenia do granulowania. Zastosuj dużą siłę ściskania (8 T/cm2) w próżni przez 1–2 minuty, aby uzyskać przezroczyste granulki.
    5. Delikatnie odciągnij granulki próbki od urządzenia do peletowania. Uważaj, aby nie ciągnąć zbyt mocno, aby nie spowodować pęknięć.
    6. Bardzo ostrożnie przenieś granulki próbki do spektroskopu podczerwieni z transformacją Fouriera w celu określenia struktury chemicznej próbki.
  4. Badanie wewnętrznych porowatych struktur nanopowłoki heparyna-PEG za pomocą skanowanej mikroskopii elektronowej (SEM)
    1. Do poniższych procedur należy przygotować standardową 48-dołkową płytkę do hodowli komórkowej i pipety.
    2. Odpipetować roztwór kopolimeru heparyny-PEG do studzienek 48-dołkowej płytki hodowlanej.
    3. Zamrażać płytkę w temperaturze -80 °C przez 24 godziny.
    4. Lipofilizować próbki w temperaturze -50 °C w środowisku próżniowym (0,1 Pa) przez 24 godziny.
    5. Rozprowadź próbki na lepkiej powierzchni aluminiowego klocka.
    6. Pokryj próbki złotem i obserwuj pod skanowanym mikroskopem elektronowym, aby zaobserwować wewnętrzne porowate struktury.
  5. Badanie powierzchni nanopowłoki heparyna-PEG za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM)
    1. Szkiełka ze szkła krzemionkowego czyścić roztworem piranii (70%H2SO4, 30%H2O2) w temperaturze 80 °C przez 40 min.
    2. Sonikować szkiełka w metanolu przez 10 minut, a następnie w toluenie przez 10 minut.
    3. Wysuszyć szkiełka przez suszenie próżniowe.
    4. Umyj szkiełka dużą ilością roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu (2% w toluenie), delikatnie wstrząśnij.
    5. Sonikować szkiełka w metanolu przez 10 minut, a następnie w toluenie przez 10 minut.
    6. Umieścić 100 μl 3% roztworu heparyny-PEG na powierzchni szkiełek za pomocą standardowej pipety.
    7. Zbadaj powierzchnię heparyny-PEG pod mikroskopem sił atomowych (częstotliwość rezonansowa 50–80 kHz, stała siła 0,350 N m 21, promień końcówki 600 nm).

2. Inżynieria powierzchni mysich wysepek z nanopowłoką heparynowo-PEG

  1. Powłoka powierzchni wysepek myszy nanopowłoką heparynowo-PEG
    1. Ekstrakcja mysich wysp przez trawienie kolagenazą i oczyszczanie gradientowe histopatyczne, jak wcześniej opisano w JoVE19.
    2. Ręcznie wybierz 200 wysepek pod mikroskopem preparacyjnym do probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 500 μl PBS do wysepek i odwirować przy 503 x g przez 1 min.
    4. Zdjąć sklarowany osad i dodać 250 μl roztworu heparyny-PEG i trzymać mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Pipetować w górę i w dół, aby wyspy trzaskowe dobrze wymieszały się z roztworem heparyny-PEG.
    5. Wirować przy 503 x g przez 1 min.
    6. Usunąć supernatant i dodać 500 μl PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.
    7. Wirować przy 503 x g przez 1 minutę, usunąć supernatant i zachować wysepki do dalszego wykorzystania. Do badania mysich wysp trzustkowych pokrytych heparyną-PEG, FAM-heparyna-PEG została użyta do powlekania wysp trzustkowych zgodnie z poniższymi krokami.
  2. Badanie mysich wysp trzustkowych pokrytych nanopowłoką FAM-heparyna-PEG
    1. Dodać 1-2 ml RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą do powlekanych wysp trzustkowych i przenieść te wyspy do nienaładowanego sterylnego naczynia do hodowli bakteryjnej.
    2. Obserwuj morfologię i sygnały fluorescencyjne wysp pokrytych nanopowłoką FAM-heparyna-PEG pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.

3. Funkcja wysepek myszy pokrytych heparyną i PEG w porównaniu z wysepkami niepowlekanymi

  1. Żywotność mysich wysp trzustkowych pokrytych heparyną i PEG
    1. Ręcznie wybierz 20 mysich wysepek pokrytych heparyną i PEG i umieść je w jednym dołku 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
    2. Napełnij w sumie 10 studzienek 20 mysim wysepkami pokrytymi heparyną PEG dla każdej studzienki.
    3. Ręcznie wybierz 20 niepowlekanych wysepek kontrolnych i umieść je w jednym dołku tej samej 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
    4. Napełnij łącznie 10 studzienek 20 niepowlekanymi wysepkami kontrolnymi dla każdej studzienki.
    5. Umieść 200 μl RPMI 1640 uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, która zawiera wysepki i utrzymuj w kulturze przez 14 dni.
    6. Pożywkę do hodowli wysp trzustkowych należy wymieniać co 2 dni.
    7. Pod koniec 14 dni w hodowli należy potraktować wysepki żywym/martwym zestawem do barwienia i obserwować pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
    8. Policz komórki PI+ (czerwone) w każdej wysepce pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
  2. Rewaskularyzacja mysich wysp trzustkowych pokrytych heparyną i PEG in vitro
    1. Wszystkie eksperymentalne tworzywa sztuczne, w tym płytki hodowlane i końcówki pipet, należy schłodzić co najmniej 12 godzin przed użyciem.
    2. Umieść 24-dołkowe miejsce na podkładce chłodzącej. Dodaj 250 μl lodowatego Matrigelu o zredukowanym czynniku wzrostu do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Umieścić powlekaną płytkę 24-dołkową w temperaturze 4 °C na co najmniej 30 minut.
    3. Podczas gdy roztwór matrycy ustawia się w lodówce, trypsynizuj komórki śródbłonka trzustki myszy Mile Sven 1 (MS1).
      1. Usunąć wszystkie pożywki hodowlane z kolby do hodowli tkankowych. Przepłukać kolbę 5 ml PBS.
      2. Usuń PBS i dodaj 3 ml trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty w standardowym inkubatorze.
      3. Lekko postukać w dno kolby, aby odłączyć komórki i dodać 5 ml pożywki uzupełnionej surowicą.
    4. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 1 000 x g przez 5 minut.
    5. Zdjąć supernatant i dodać 5 ml PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać.
    6. Odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut i zdjąć supernatant.
    7. Dodaj pożywkę DMEM uzupełnioną surowicą do probówki i zasiej 50 000 komórek do każdego dołka 24-dołkowej płytki pokrytej roztworem matrycy.
    8. Dodaj 5 wysepek pokrytych heparyną-PEG lub niepowlekanych wysepek kontrolnych do każdej studzienki.
    9. Dodaj pożywkę DMEM uzupełnioną surowicą do każdego dołka, w sumie 500 μl na studzienkę.
    10. Obserwuj formowanie się probówki po 4 i 24 godzinach inkubacji pod mikroskopem świetlnym.
  3. Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny przez wyspy trzustkowe pokryte heparyną-PEG
    UWAGA: Aby ocenić, czy nanopowłoka wpłynie na funkcję mysich wysp trzustkowych, oceniono stymulowane glukozą wydzielanie insuliny przez wyspy trzustkowe pokryte heparyną-PEG i niepowlekane.
    1. Ręcznie wybierz 30 wysepek pokrytych heparyną-PEG lub niepowlekanych wysepek kontrolnych do jednej probówki o pojemności 1,5 ml. Przygotuj w sumie 10 probówek dla wysp powlekanych i niepowlekanych.
    2. Dodać 1 ml roztworu soli fizjologicznej uzupełnionego o 2 mmol/l glukozy20 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny
      UWAGA: Przepis na fizjologiczny roztwór soli znajduje się w Tabeli 1. Podczas inkubacji w inkubatorze należy trzymać luźną nasadkę probówek.
    3. Usuń jak najwięcej roztworu.
    4. Stymulować wyspy trzustkowe, dodając 600 μl roztworu soli fizjologicznej uzupełnionego 20 mmol/l glukozy w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    5. Zebrać 200 μl supernatantu z każdej probówki w celu ilościowego określenia poziomu testu ELISA insuliny za pomocą komercyjnego zestawu ELISA do insuliny.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanopowłoka heparyna-PEG została zsyntetyzowana przez koniugację starPEG-(NH2)8 i heparyny przy użyciu EDC i NHS jako czynników sprzęgających (Rysunek 1). Strukturę chemiczną nanopowłoki heparyna-PEG zbadano za pomocą FT-IR i jak pokazano na Ryc. 2, charakterystyczne piki heparyny można było zaobserwować na wysokości 3300–3600 cm-1, odpowiadające grupom hydroksylowym heparyny (Rysunek 2 czerwony). Spadek amplitudy piku na poziomie 3300–3600 cm-1 (Rysunek 2 niebieski) reprezentuje koniugację między grupami amidowymi gwiazdyPEG-(NH2)8 a grupą karbonylową heparyny. Amplituda piku 1 650 cm-1 odpowiada wibracjom rozciągającym karbonylu amidu została również zmniejszona, co wskazuje na wystarczającą reakcję między grupami karboksylowymi heparyny z bursztynianem sukcynimidylu i aminą starPEG-(NH2)8. Struktura powierzchniowa nanopowłoki heparyna-PEG została zbadana za pomocą mikroskopii sił atomowych i pokazano na przykładzie Lou i wsp., że nanopowłoka miała około 30 nm wysokości i 2 μm szerokości z małymi porowatymi cechami (ciemnymi plamkami) o średnicy od 100 do 200 nm10. Dane uzyskane ze skanowanej mikroskopii elektronicznej potwierdzają również wysoce połączoną porowatą strukturę heparyny-PEG (Ryc. 3), co sugeruje, że może ona być odpowiednia dla przeżycia komórek podczas dostarczania in vivo.

Zbadano powłokę powierzchniową izolowanych mysich wysepek i, jak pokazano na Rysunek 4, cienka warstwa nanopowłoki, pokazana przez zieloną fluorescencję, została równomiernie nałożona na powierzchnię pokrytych wysepek, nie powodując widocznych zmian w objętości/rozmiarze wysepek. Podczas powlekania zaleca się trzymanie wysepek na lodzie, aby zachować ich żywotność. Podobnie, okres powlekania, w tym przypadku 10 minut, został również zoptymalizowany, aby umożliwić utrzymanie żywotności wysepek. Warto zauważyć, że dla lepszej obserwacji nanopowłoki bardziej odpowiednia byłaby mikroskopia elektronowa, która bada przekroje czynne powlekanych wysepek, jak wcześniej informowano9,16 byłaby bardziej odpowiednia, chociaż dane byłyby generowane ze stałych i osadzonych wysepek, a nie z żywych wysepek w kulturze.

Jeśli chodzi o przeżywalność i funkcję powlekanych wysp trzustkowych, rewaskularyzacja i funkcje wysp trzustkowych zostały ocenione in vitro. Biorąc pod uwagę korzystne właściwości heparyny, funkcjonalizacja heparyny na powierzchni wyspy trzustkowej może ułatwić rewaskularyzację wysp trzustkowych w hodowli, a w konsekwencji ich przetrwanie. Zaobserwowaliśmy, że mysie wysepki pokryte heparyną i PEG wykazywały solidną żywotność wysepek w hodowli (Ryc. 5). Znacznie bardziej zaawansowane tworzenie naczyń było również widoczne w komórkach śródbłonka wysp trzustkowych (MS1), które były hodowane wspólnie z wyspami pokrytymi heparyną-PEG, na co wskazują wydłużone struktury podobne do mikronaczyń i sieciowe struktury naczyniowe (Figura 6).

Proces nanopowlekania nie miał wpływu na stymulowaną glukozą zdolność wydzielania insuliny przez wyspy wyspowe pokryte heparyną i PEG. Niski poziom wydzielania insuliny obserwowano we wszystkich leczonych grupach, gdy wyspy trzustkowe były perfundowane fizjologicznym roztworem soli uzupełnionym substymulującym poziomem glukozy (2 mmol/L; Rysunek 7). Gdy wyspy trzustkowe stymulowano ponadfizjologicznym poziomem glukozy (20 mmol/l glukozy), obserwowano wzrost wydzielania insuliny we wszystkich leczonych grupach.

figure-results-1
Rysunek 1: Struktura chemiczna nanopowłoki Hep-PEG dla inżynierii powierzchni wysp trzustkowych. Powłokę wysp trzustkowych uzyskano przez kowalencyjne sieciowanie między heparyną-NHS a aminami pierwszorzędowymi w błonie komórkowej i gwiazdą PEG-(NH2)8. Każda cząsteczka heparyny posiada wiele grup karboksylowych, z których każda została zmodyfikowana tak, aby miała grupę NHS. Grupy karboksylowe aktywowane przez NHS będą reagować z pierwszorzędowymi aminami białka, tworząc wiązania amidowe, za pomocą których stabilizowana jest nanopowłoka Hep-PEG i wysp trzustkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Widmo w podczerwieni nanopowłoki gwiazda-PEG-(NH2)8, heparyny i Hep-PEG w stanie suchym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Zeskanowane obrazy z mikroskopii elektronicznej Hep-PEG w stanie wysuszonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy wysp trzustkowych pokrytych heparyną i PEG pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Heparyna była wstępnie znakowana FAM (pokazana na zielono). Obrazy reprezentują 100 wysepek. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wysepki pokryte heparyną i PEG wykazywały solidną żywotność. (A) Dane przedstawione jako średnia± błąd standardowy średnich, n = 50 wysepek na grupę. (B) Żywe komórki pokazano na zielono, a martwe komórki na czerwono. Podziałka = 100 μm. Obrazy reprezentują 50 wysepek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Nanopowłoka heparyna-PEG ułatwia rewaskularyzację wewnątrz wysp trzustkowych. Tworzenie probówki Matrigel komórek MS1 hodowanych wspólnie z wyspami trzustkowymi pokrytymi heparyną-PEG i niepowlekanymi wysepkami kontrolnymi. Zdjęcia wykonano o godz. 4 i 24. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Nanopowłoka heparyna-PEG nie powoduje żadnych zmian w funkcji wydzielania insuliny przez wyspy trzustkowe. Wysepki pokryte heparyną-PEG i niepowlekane wyspy kontrolne (po 30 każda) wystawiono na działanie glukozy o stężeniu 2 mmol/L (biały pasek) lub 20 mmol/L (pasek) przez 30 minut. Wydzielanie insuliny w odpowiedzi na stężenie glukozy 20 mmol/l było porównywalne między wyspami trzustkowymi powlekanymi i kontrolnymi. Dane są przedstawiane jako średnia ± błąd standardowy średnich, n = 10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule demonstrujemy "łatwe do przyjęcia" podejście do inżynierii powierzchni żywych komórek nanopowłoki starPEG z włączoną heparyną za pomocą pseudo-bioortogonalnej chemii między grupami N-hydroksysukcynimidowymi nanopowłoki a grupami aminowymi błony powierzchniowej wysp trzustkowych. Rzeczywiście, grupy aminowe w błonach komórkowych są wysoce reaktywne, w wyniku czego wcześniejsze badania wykazały interakcje między pierwszorzędowymi grupami aminowymi z aktywowanym estrem N-hydroksysukcynimidylu (NHS) w warunkach fizjologicznych 14,16,21. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że włączenie heparyny, silnie siarczanowanego glikozaminoglikanu i ważnego składnika macierzy zewnątrzkomórkowej, podczas enkapsulacji wysp trzustkowych, może prowadzić do zwiększonej rewaskularyzacji po przeszczepie i zmniejszenia IBMIR22,23. Biorąc pod uwagę biokompatybilność PEG i wielowartościowe właściwości heparyny, użyliśmy 8-ramiennego PEG do maksymalnego obciążenia heparyną podczas wytwarzania nanopowłoki. Heparyna została zmodyfikowana za pomocą -NHS, który następnie reagował z grupami -NH2 na błonie komórkowej wysp trzustkowych. Umożliwiając tworzenie wiązania kowalencyjnego między -NH2 (błony komórkowej) a -NHS Hep-PEG, wysepki byłyby łatwo "powlekane" przez PEG z heparyną, tworząc w ten sposób nano-cienką warstwę (nanopowłokę) na zewnętrznej powierzchni wysp trzustkowych.

Obecne podejście różni się od wcześniej opublikowanych metod, które również wybrały PEG jako główny polimer do mikrokapsułkowania wysp trzustkowych, ponieważ zastosowano pseudo-bioortogonalną chemię między -NHS (nanopowłoki) a -NH2 błony komórkowej wysp trzustkowych. Biorąc pod uwagę, że stabilność powłoki wyspy/komórki, szczególnie w złożonym środowisku, takim jak osocze, ma kluczowe znaczenie dla rewaskularyzacji i przeżycia po przeszczepie, tworzenie się między -NHS i -NH2 byłoby bardziej stabilne w porównaniu z hydrofobowym oddziaływaniem między PEG a błoną komórkową24, oddziaływaniami elektrostatycznymi 9,15,24,25,26lub biologiczne powiązanie między biotyną streptawidyną14.

Ponadto, w przeciwieństwie do podejścia polegającego na powlekaniu wysepek, które opiera się na podejściu LBL z wydłużonym okresem obróbki wysepek w przypadku osadzania wielowarstwowego 14,16,25, obecna technika wymaga również minimalnego przetwarzania i bardzo krótkiego okresu powlekania izolowanych wysepek. Oba te czynniki są niezbędne do przetrwania wysp trzustkowych po przeszczepie, ponieważ żywotność wysp trzustkowych jest często zagrożona już po izolacji wysp trzustkowych z powodu uszkodzonego ECM podczas trawienia enzymatycznego. Jednak jednym z ograniczeń obecnego podejścia jest to, że w przeciwieństwie do LBL, za pomocą którego grubość powłoki zewnętrznej może być kontrolowana poprzez zwiększanie lub zmniejszanie liczby osadzanych warstw, grubość nanopowłoki Hep-PEG nie może być na razie dostosowana.

Ponadto, ze względu na łagodny stan, w którym zachodzi reakcja chemiczna między -NHS i -NH2 , obecne podejście ma zastosowanie w inżynierii powierzchni żywych komórek nie ograniczając się do wysp trzustkowych, ale do większości terapii komórkowych. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że heparyna wchodzi w interakcje z szeregiem cytokin i biologicznie aktywnych cząsteczek, nanopowłoka Hep-PEG stanowi również otwartą platformę, która ma potencjał do włączenia nieograniczonej liczby mediatorów biologicznych, a także interfejsów dla bardziej złożonej inżynierii powierzchni komórki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe Narodowych Funduszy Nauk Przyrodniczych Chin (31770968) oraz Programu Badawczego Fundacji Zastosowań i Zaawansowanych Technologii w Tianjin (17JCZDJC33400).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reagent
StreptozototinSigmaS0130
HistopaqueSigma10831
RPMI 1640GIBCO, firmy Life Technologies31800022
Surowica bydlęcapłodu, firmy Life Technologies16000-044
Penicylina StreptomycynaGIBCO, firmy Life Technologies15140
Roztwór do dysocjacji komórekGIBCO, firmy Life Technologies13150-016
DMEMGIBCO, firmy Life Technologies12800017
Roztwór D-(+)-glukozySigmaG8644
488 falloidynaSigmaA12379
CFSESigma21888-25mg-F
Annexin V/PI zestaw apoptozyDojindoAD10
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Kolagenaza z Clostridium, typ XISigmaC7657
HeparynaSigma-AldrichH3149
NHSSigma-Aldrich56480
EDCSigma-Aldrich3449
8-ramienny PEGJ& K Scientific Ltd1685176
FAMSigma-AldrichM041100
5(6)-karboksyfluoresceina N-sukcynimidyl esterSigma-Aldrich21888
KBrJ& K Scientific Ltd32036
3-aminopropylo-trietoksysilan Sigma-AldrichA3648
toluenJ& K Scientific LtdS-15497-20X
Zestaw do barwienia żywego/martwegoBiovision, USK501
BD MatrigelTM, matryca błony podstawnej, obniżony czynnik wzrostuBD Bioscience354230
Chlorek sodu, 99,5%J& K Scientific Ltd105864
Chlorek potasu, 99%, ekstra czystyJ& K Scientific Ltd991468
Wodorowęglan sodu, 99,7%, odczynnik ACSJ& K Scientific Ltd988639
Chlorek magnezu sześciowodny, 99%, odczynnik ACSJ& K Scientific Ltd182158
Diwodorofosforan potasu, 99%, ekstra czystyJ& K Scientific Ltd128839
Siarczan magnezu siedmiowodny, 99%, do analizyJ& K Scientific Ltd119370
Roztwór chlorku wapnia objętościowy, 1,0 M CaCl2J& K Scientific Ltd21114
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichV900933
Zestaw ELISA insuliny dla szczurów/myszyMillipore-lincoEZRMI-13K
PBS Hyclone AAJ207798

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
  2. Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
  3. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
  4. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
  5. Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
  6. Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
  7. Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
  8. Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
  9. Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
  10. Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
  11. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  12. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
  13. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  14. Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
  15. Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
  16. Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
  17. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
  18. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
  19. Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
  20. Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
  21. Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
  22. Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
  23. Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
  24. Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
  25. Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
  26. Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Heparin NanocoatingStarPEG CoatingIslet IsolationCollagenase DigestionHistopaque PurificationHeparin NHS SynthesisEDC NHS CouplingFluorescence MicroscopyFTIR Analysis

Powiązane artykuły