Geny homeobox są genami regulatorowymi często związanymi z nowotworami u dorosłych organizmów. Zbadaliśmy ich porównawczą ekspresję za pomocą analizy immunohistochemicznej i PCR w czasie rzeczywistym, w prawidłowych i zapalnych błonach śluzowych nosa oraz w nowotworach zatok przynosowych, aby wykorzystać je jako możliwe cele diagnostyczne i terapeutyczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja OTX1 i OTX2 jako dwóch możliwych markerów molekularnych raka zatok przynosowych i nerwiaków zarodkowych węchu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Geny homeoboxa (HB) OTX ulegają ekspresji podczas morfogenezy embrionalnej i podczas rozwoju nabłonka węchowego u dorosłych organizmów. Mutacje zachodzące w tych genach są często związane z nowotworzeniem u człowieka. Obecnie nie ma dostępnych danych dotyczących możliwej korelacji między genami OTX a nowotworami jamy nosowej. Celem tej pracy jest zrozumienie, czy OTX1 i OTX2 można uznać za markery molekularne w rozwoju nowotworów nosa. Wybraliśmy gruczolakorak nosa i zatok przynosowych, aby zbadać ekspresję genów OTX1 i OTX2 za pomocą analiz immunohistochemicznych i PCR w czasie rzeczywistym. Zarówno OTX1, jak i OTX2 były nieobecne we wszystkich próbkach gruczolakoraków zatok przynosowych typu jelitowego (ITAC). mRNA OTX1 zidentyfikowano tylko w gruczolakorakach typu niejelitowego (NITAC), podczas gdy mRNA OTX2 ulegało ekspresji tylko w nerwiakach zarodkowych węchu (ON). Wykazaliśmy, że zróżnicowana ekspresja genów zarówno dla genów OTX1, jak i OTX2 może być użytecznym markerem molekularnym do rozróżnienia różnych typów guzów zatok przynosowych.
Wprowadzenie
OTX Geny HB są homologiem genów orthodenticle (otd) u kręgowców i kodują czynniki transkrypcyjne, które normalnie ulegają ekspresji podczas morfogenezy embrionalnej, ale mogą być również wyrażane w organizmie dorosłego o różnych funkcjach. Podczas rozwoju embrionalnego kontrolują specyfikację tożsamości komórki, różnicowanie komórek i położenie osi ciała¹. Rodzina OTX obejmuje geny OTX1 i OTX2, które pełnią różne funkcje. OTX1 bierze udział w rozwoju mózgu i narządów zmysłów. W organizmie dorosłego ulega ekspresji w narządach zmysłów i jest transkrybowany na niskich poziomach w przednim płacie przysadki mózgowej2; Odgrywa również rolę w hematopoezie, ulegając ekspresji w hematopoetycznych komórkach pluripotencjalnych i progenitorowych3. OTX2 bierze udział w rozwoju głowy rostralnej, a jego translowane białko działa jak morfogen, ponieważ generuje gradient, przez który inne geny są aktywowane lub represjonowane w sposób czasoprzestrzenny, przyczyniając się w ten sposób do proliferacji i różnicowania komórek. W organizmie dorosłego OTX2 znajduje się wyłącznie w splocie naczyniówkowym i szyszynce4.
Mutacje w genach OTX są często związane z pojawieniem się ludzkich wad wrodzonych, somatycznych lub metabolicznych. Mutacje zyskujące lub tracące w genach OTX mogą sprzyjać nowotworzeniu się, jeśli nie są one w stanie prawidłowo kontrolować wzrostu i/lub różnicowania komórek5. W białaczkach i chłoniakach, a także w wielu guzach litych (np. rdzeniakach zarodkowych6, agresywnych chłoniakach nieziarniczych2, rakach piersi7, colorectal cancers8, and retinoblastoma9), zderegulowana ekspresja genów OTX HB jest dobrze udokumentowana10. Ponadto mutacje OTX2 wykazano w przypadkach anoftalmii i mikroftalmii11 ze względu na kluczową rolę tego genu w kontroli rozwoju oka.
W kontekście nowotworów litych, odkrycie markerów molekularnych i fenotypowych jest ważnym wyzwaniem dla diagnozy, klasyfikacji i leczenia kilku typów nowotworów11, w tym tych, które pochodzą z jamy nosowej i zatok przynosowych. W rzeczywistości, pomimo tego, że obszary te zajmują tylko skromną przestrzeń anatomiczną, nabłonek błony śluzowej, gruczoły, tkanki miękkie, kości, chrząstki lub komórki nerwowe/neuroektodermalne i hematolimfoidalne mogą być często miejscem pochodzenia złożonych i histologicznie różnych grup nowotworów. Różne typy nowotworów obejmujących drogi przynosowe prezentują różnorodne cechy, które przezwyciężają to, co zwykle obserwuje się w górnym odcinku przewodu pokarmowego, a nawet w większości części ciała12. Nowotwory zatok przynosowych są rzadkie i występują z roczną częstością 1:100 000 mieszkańców na całym świecie, co uniemożliwia badania dotyczące szlaków zaangażowanych w nowotworzenie i testowanie alternatywnych strategii leczenia. Mimo to postępy w technikach obrazowania, metodach chirurgicznych i radioterapii poprawiły kliniczne leczenie raka zatok przynosowych. Co więcej, rozwój linii komórkowych, a także modeli zwierzęcych i profilowanie genetyczne nowotworów stanowią obecnie podstawę dla przyszłych celowanych terapii przeciwnowotworowych13. Do tej pory nie ma doniesień dotyczących ekspresji OTX1 i/lub OTX2 w nowotworach jamy nosowej, zatok przynosowych i nosogardzieli. Ponieważ wcześniej zaobserwowaliśmy, że OTX1 i OTX2 są zaangażowane w raka piersi7, zastanawialiśmy się, czy te geny mogą być obecne nie tylko w prawidłowej błonie śluzowej nosa, ale także w guzach jamy nosowej. Aby osiągnąć ten cel, uzyskaliśmy z Zakładu Patologii "Ospedale di Circolo" w Varese próbki prawidłowej błony śluzowej oraz gruczolakoraka nosa i zatok nosowych pobrane w latach 1985-2012 i sklasyfikowane zgodnie z klasyfikacją Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) nowotworów głowy i szyi. Zdecydowaliśmy się na ich analizę za pomocą PCR w czasie rzeczywistym i analiz immunohistochemicznych oraz oceniliśmy ekspresję OTX1 i OTX2, aby określić, czy można je uznać za markery molekularne dla tego typu nowotworów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską (1975) za pisemną świadomą zgodą i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu Insubria w Varese.
1. Pobieranie próbek
- Zbierz i podziel wszystkie ludzkie próbki zatopione w parafinie (FFPE) na różne podgrupy zgodnie z klasyfikacją WHO nowotworów głowy i szyi14.
nuta: Tutaj użyliśmy następujących próbek: Prawidłowa błona śluzowa zatok przynosowych jako kontrola (10 próbek); Brodawczak odwrócony (IP, kod ICD-O 8121/1); ITAC zatokowo-nosowy (kod ICD-O 8144/3, 32 próbki); NITAC (kod ICD-O 8140/3, 12 próbek); rak gruczołowo-torbielowaty (ACC, kod ICD-O 8200/3); Gruczolak pleomorficzny (PA, kod ICD-O 8941/3); ON (kod ICD-O 9522/3, 13 próbek); Słabo zróżnicowany rak neuroendokrynny (PDNEC, kod ICD-O 8041/3, 19 próbek); Guz neuroendokrynny (NET, kod ICD-O 8041/3).
2. Immunochemia
- Deparafinowanie i rehydratacja skrawków
- Podgrzewać szkiełka podstawowe w piecu w temperaturze 60 °C przez 30 minut i ponownie uwodnić odcinki FFPE o grubości 3 μm, używając sera alkoholowego do wody.
- Krótko umyj szkiełka w ksylenie przez 10 minut i powtórz ten krok; myj szkiełka przez 5 minut w 100% alkoholu i powtórz ten krok kolejno używając 95%, 85% i 75% alkoholu. Płucz szkiełka przez 5 minut w wodzie destylowanej.
- Blokowanie aktywności endogennej
- Zablokuj aktywność endogenną, umieszczając szkiełka w 3% wodnym roztworze nadtlenku wodoru na 12 minut.
- Pobieranie antygenu
- Przeprowadzić pobieranie antygenu przez traktowanie 10 mM buforem cytrynianowym (pH 6) przez 10 minut w kuchence mikrofalowej.
- Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
- Umyj skrawki w buforze TBS (pH 7,4), a następnie dodaj roztwór blokujący na 10 minut.
- Umyj skrawki w buforze TBS (pH 7,4), a następnie dodaj 0,2% Triton X.
- Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z kozim przeciwciałem anty-ludzkim OTX2 rozcieńczonym w stosunku 1:100.
- Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
- Inkubować skrawki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z biotynylowanym drugorzędowym przeciwciałem przeciw kozom królika rozcieńczonym w stosunku 1:200, a następnie kompleksem peroksydazy ABC (patrz tabele materiałów).
- Rozwój reakcji immunologicznej
- Opracuj reakcję immunologiczną za pomocą tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny i przeciwzabarwić jądra hematoksyliną Harrisa.
- Montaż i obrazowanie
- Odwodnić skrawki za pomocą skali alkoholowej w kształcie półksiężyca i sklarować je za pomocą substancji oczyszczającej pochodzenia terpenowego (patrz tabela materiałów). Osadź sekcje w medium montażowym, umieść je na szkiełku mikroskopowym i obserwuj skrawki przez mikroskop optyczny.
3. Ekstrakcja RNA i odwrotna transkrypcja
- Ekstrakcja RNA
- Pobrać RNA z skrawków, wykonując pierwszy etap protokołu immunoprecypitacji (patrz sekcja 2.1) i przechowywać szkiełka w wodzie destylowanej. Nakładaj na siebie niebarwione skrawki z odpowiadającymi im skrawkami barwionymi hematoksyliną-eozyną w celu zidentyfikowania interesujących fragmentów.
- Ekstrakcję RNA należy przeprowadzić za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA dla próbek FFPE (patrz tabela materiałów) i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Odwrotna transkrypcja RNA
- Użyj komercyjnego zestawu do retrotranskrypcji RNA na cDNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem. Dokonaj transkrypcji wstecznej co najmniej 1,000 ng całkowitego RNA, aby wykonać kilka analiz.
4. PCR w czasie rzeczywistym i analiza danych
- PCR w czasie rzeczywistym
- Wykonuj ilościowe analizy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) za pomocą technologii opartej na sondzie (patrz tabela materiałów) i termocyklera.
- Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR
- Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR, używając 12,5 μl mieszanki głównej na bazie sondy, po 1,25 μl każdej z sond OTX1, OTX2 i ACTB (patrz tabela materiałów), 50 ng cDNA i wody wolnej od nukleaz o całkowitej objętości do 25 μl.
- Wykonaj wszystkie reakcje w trzech egzemplarzach, używając genu ACTB jako endogennej kontroli w celu normalizacji poziomów ekspresji genów.
- Odwirować płytkę o sile 1,109 x g przez 3 minuty i przechowywać płytkę chronioną przed światłem w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia doświadczenia.
- Ustawianie termocyklera
- Ustaw profil termocyklera z początkowym cyklem gorącego startu w temperaturze 50 °C przez 2 minuty i 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cyklami w temperaturze 95 °C przez 15 s i cyklem końcowym w temperaturze 60 °C przez 1 minutę.
- Analizy poziomu ekspresji genów
- Normalizacja poziomów ekspresji genów za pomocą metody porównawczego progu cyklu (ΔCt) przy użyciu genu ACTB jako kontroli endogennej.
- Oceń poziomy ekspresji genów za pomocą metody 2-ΔCt i wykreśl wyniki.
- Analizy statystyczne
- Wykonuj analizy statystyczne za pomocą testu t-Studenta, biorąc pod uwagę statystycznie istotne wyniki o p < 0,05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W normalnej błonie śluzowej zaobserwowano silną i jednorodną reaktywność jądrową dla genów OTX zarówno w rzęskowym obrzeżonym nabłonku typu oddechowego, jak i w komórkach gruczołowych podśluzówkowych (Rycina 1A). Stwierdzono ekspresję jądrową OTX1 we wszystkich próbkach NITAC (Rycina 1B), podczas gdy w ITAC odnotowano niewielką lub brak immunoreaktywności (Rycina 1C). Intensywna immunoreaktywność wys...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to pokazuje po raz pierwszy, że w oparciu o poziomy mRNA, geny HB OTX1 i OTX2 ulegają ekspresji w prawidłowej błonie śluzowej zatok przynosowych i gruczołach podśluzówkowych, polipach zapalnych, brodawczakach Schneidera zatok przynosowych oraz w różnych nowotworach nabłonkowych i neuroektodermalnych, w tym rakach płaskonabłonkowych, gruczolakorakach zatok typu niejelitowego, guzach gruczołu ślinowego, nowotworach neuroendokrynnych i ON.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia oraz Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, bez AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Sonda Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB | Applied Biosystem | Wycofany z produkcji. Sekwencja chroniona prawami autorskimi | |
| Sonda OTX1 | Applied Biosystem | Poza produkcją. Sekwencja chroniona prawami autorskimi | |
| Sonda OTX2 | Applied Biosystem | Poza produkcją. Sekwencja chroniona prawem autorskim | |
| Wodny nadtlenek wodoru | Merk | 1072090250 | |
| Bufor cytrynianowy | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Anti-OTX2 Anti-OTX2 Anti-OTX2 | Laboratories | Poza produkcją. Numer katalogowy niedostępny | |
| Rabbit Anti-Goat Anti-Gobody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Tetrahydrokloryd 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear Bioptica | W01030799 |
Bibliografia
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence? Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, WHO Press. (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
