Artykuł metodologiczny

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

DOI:

10.3791/56889

⸱

1 stycznia 2018

 ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie procesów biologicznych komórek podczas przekształcania tożsamości określonych typów komórek dostarcza ważnych informacji na temat mechanizmu, który utrzymuje i chroni tożsamość komórkową. Przekształcanie komórek rozrodczych w specyficzne neurony u nicienia Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest potężnym narzędziem do przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych w celu przeanalizowania szlaków regulacyjnych, które chronią ustaloną tożsamość komórki. Przeprogramowanie komórek rozrodczych na określony typ neuronów określany jako ASE wymaga transgenicznych zwierząt, które pozwalają na szeroką nadekspresję czynnika transkrypcyjnego Zn-palca (TF) CHE-1. Endogenny CHE-1 ulega ekspresji wyłącznie w dwóch neuronach głowy i jest wymagany do określenia losu glutaminergicznego neuronu ASE, który może być łatwo zobrazowany przez reportera gcy-5prom::gfp. Gen trans zawierający konstrukt ekspresji genu che-1 napędzany przez promotor szoku cieplnego pozwala na szeroką błędną ekspresję CHE-1 u całego zwierzęcia po leczeniu szokiem cieplnym. Połączenie RNAi przeciwko czynnikowi regulującemu chromatynę LIN-53 i nadmierna ekspresja che-1 wywołana szokiem cieplnym prowadzi do przeprogramowania komórki rozrodczej w komórki podobne do neuronów ASE. Opisujemy tutaj specyficzną procedurę RNAi i odpowiednie warunki leczenia szokiem cieplnym zwierząt transgenicznych w celu skutecznego wywołania konwersji komórek rozrodczych do neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie losu komórki poprzez ektopową ekspresję TF, taką jak miogenny TF MyoD, który po nadekspresji przekształca fibroblasty bezpośrednio w komórki mięśniopodobne1, jest przedmiotem badań od dziesięcioleci. Jednak zróżnicowane komórki są często oporne na ten proces ze względu na mechanizmy, które chronią ich tożsamość komórkową. Komórki rozrodcze wykazują podobny stopień ochrony i istnieją podstawowe mechanizmy, które często działają jako bariera zapobiegająca przekształcaniu się komórek rozrodczych w inne typy komórek w przypadku nadmiernej ekspresji TF wywołującego los. Zazwyczaj regulacja epigenetyczna, taka jak modyfikacje histonów i struktura chromatyny, stanowi przeszkodę w przekształcaniu losów komórek2,3. Wcześniej zastosowaliśmy genetykę odwrotną przy użyciu knock-downów RNAi u C. elegans i zidentyfikowaliśmy czynniki, które chronią tożsamość komórkową, a tym samym przeciwdziałają przeprogramowaniu komórek rozrodczych w neurony4. W szczególności kompleks represyjny polycomb 2 (PRC2) i wysoce konserwatywny opiekuńczy histon LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 u ludzi) zapobiegają bezpośredniej konwersji komórek rozrodczych w określone typy komórek somatycznych, takie jak neurony smaku glutaminergicznego u C. elegans4,5. Aby zidentyfikować te czynniki barierowe przeprogramowujące komórki rozrodcze, wykorzystaliśmy transgeniczne zwierzęta przenoszące indukowany szokiem cieplnym Zn-finger TF CHE-1. CHE-1 ulega normalnej ekspresji w dwóch neuronach głowy C. elegans, gdzie określa los neuronów smaku glutaminergicznego określanych jako ASE6. Los neuronu ASE może być uwidoczniony przez ekspresję specyficznego dla ASE fluorescencyjnego reportera gcy-5prom::gfp. GCY-5 jest chemoreceptorem ulegającym ekspresji tylko w prawym neuronie ASE7. Po wyczerpaniu lin-53 przez RNAi i indukcji szerokiej ektopowej ekspresji CHE-1 przez szok cieplny, komórki rozrodcze mogą zostać przekształcone w neurony in vivo4,5. Co ważne, czas leczenia RNAi jest kluczowy, ponieważ tylko dorosłe robaki (pokolenie P0) wystawione na działanie RNAi lin-53 dają początek zwierzętom potomnym F1 z linią zarodkową, która jest dopuszczalna do przeprogramowania w neurony4.

Wyżej opisana procedura konwersji komórek rozrodczych w neurony u C. elegans może być wykorzystana do badania różnych zagadnień biologicznych, takich jak implikacje szlaków sygnałowych w przeprogramowywaniu losu komórki. Na przykład, użyliśmy indukowanego przez CHE-1 przeprogramowania komórek rozrodczych do neuronów ASE na RNAi przeciwko lin-53 w celu zbadania implikacji szlaku sygnałowego Notch w procesie przeprogramowania komórek rozrodczych8. Wykonując podwójne RNAi w celu jednoczesnego zubożenia lin-53 i genu kodującego demetylazę histonów utx-1, wykazaliśmy, że szlak sygnałowy Notch przeciwdziała wyciszaniu genów za pośrednictwem PRC2 poprzez aktywację ekspresji UTX-1 w klasie linii zarodkowej8. Odkrycie to pokazuje, że konwersja komórek rozrodczych do neuronów opisana w tym protokole może być wykorzystana do badania złożonego procesu biologicznego, takiego jak przeprogramowanie komórkowe w nienaruszonym organizmie oraz w kontekście różnych warunków rozwojowych i środowiskowych. Co więcej, daje perspektywę do rzucenia wyzwania komórkom rozrodczym poprzez nadmierną ekspresję różnych TF indukujących los w celu zbadania ich roli w ograniczaniu plastyczności komórkowej9 lub oceny ich potencjału do indukowania przeprogramowania komórek rozrodczych na inne typy komórek in vivo.

Podczas gdy hodowle tkanek ssaków pozwalają również badać różne aspekty przeprogramowania losu komórek, komórki hodowane w hodowli mają ograniczoną zdolność do naśladowania warunków szlaku sygnałowego w porównaniu do nienaruszonego organizmu. Dlatego C. elegans jest wszechstronnym modelem do badania ról różnych procesów biologicznych, takich jak sygnalizacja Notch podczas przeprogramowania in vivo. Ponadto jest to potężny model do badań genetycznych, który jest stosunkowo łatwy w utrzymaniu i modyfikacji genetycznej przy niskich kosztach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez LaGeSo Berlin, Niemcy

1. Przygotowanie roztworu

  1. Płytki agarowe NGM (1 L)
    1. Dodać 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej (np. Bacto-Peptonu) i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg / ml w 95% zapasie EtOH), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4 i 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml zapasu).
  2. Płytki NGM-Agar RNAi (1 L)
    1. Dodaj 3 g NaCl, 2,5 g pożywki peptonowej i 20 g agaru. Po autoklawowaniu dodać 1 ml cholesterolu (5 mg / ml w 95% zapasie EtOH), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 25 ml 1 M K2PO4, 1 ml amfoterycyny B (2,5 mg / ml zapasu), 1 ml 1 M IPTG i 1 ml karbenicyliny (50 mg / ml).
  3. LB-Agar (1 l)
    1. Dodać 10 g pożywki peptonowej, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 20 g agaru, 10 ml 1 M Tris pH 8,0. DodaćH2Odo 1 L. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml 50 mg/ml karbenicyliny i 2,5 ml 5 mg/ml tetracykliny.
  4. LB Średni (1 L)
    1. Dodać 10 g pożywki peptonowej, 5 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl i 10 ml 1 M Tris pH 8,0. DodaćH2Odo 1 L. Po sterylizacji w autoklawie dodać 1 ml karbenicyliny o stężeniu 50 mg/ml.
  5. Bufor M9 (1 L)
    1. Dodać 6,0 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl i 50 mg żelatyny. Przed użyciem dodać 1 ml 1 M MgSO4.
  6. Roztwór wybielający (10 ml)
    1. Dodać 1 ml NaClO i 2 ml 5 N NaOH. Dodaj H2O do 10 ml.

2. Przygotowanie płytek RNAi

Uwaga: C. elegans jest zazwyczaj hodowany w laboratorium na 6 cm płytkach Petriego zawierających 7,5 ml agaru z podłożem wzrostu nicieni (NGM-Agar)10,11. Protokół ten jest zoptymalizowany dla robaków trzymanych w temperaturze 15 °C. Do przygotowania płytek z NGM należy stosować standardowe techniki sterylne, aby zapobiec skażeniu grzybiczemu i bakteryjnemu. Poniżej znajduje się protokół przygotowania płytek NGM uzupełnionych odczynnikami do RNAi.

  1. Przygotować 6-centymetrowe płytki RNAi NGM-Agar zawierające 1 mM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 50 μg/ml karbenicyliny. Pozostaw je do wyschnięcia na 24 – 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności12.
    1. Płytki RNAi należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Nie stosować, jeśli jest starszy niż 14 dni.
  2. Wybierz klon bakterii RNAi (Escherichia coli HT115) zawierający plazmid L4440 z sekwencją DNA genu lin-53 z zamrożonego zapasu glicerolu z dostępnej biblioteki RNAi13 na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, stosując trójfazowy wzór smugowy. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C przez noc12. Ten klon umożliwia zależną od IPTG produkcję lin-53 dsRNA w bakteriach.
    1. Dodatkowo hoduj bakterie RNAi, które zawierają plazmid L4440 bez żadnej sekwencji genów, jako pusty wektor control14.
  3. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię z lin-53 lub pustych płytek agarowych wektorowych LB za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl i zaszczep każdą z nich w oddzielnej probówce hodowlanej zawierającej 2 ml płynnego podłoża LB 14 uzupełnionego 50 μg / ml karbenicyliny. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C, aż osiągną gęstość optyczną (OD) 0,6 – 0,8 przy długości fali 600 nm. Zmierz średnicę zewnętrzną za pomocą spektrofotometru15.
    UWAGA: Płynna pożywka LB nie powinna zawierać tetracykliny, w przeciwieństwie do płytki agarowej LB używanej do usuwania bakterii z glicerolu, ponieważ włączenie tetracykliny podczas karmienia prowadzi do zmniejszenia wydajności RNAi 12
  4. Dodać 500 μl każdej kultury bakteryjnej (lin-53 lub pusty wektor) do 6 cm płytek RNAi NGM-Agar za pomocą multipipety. Inkubować płytki z zamkniętą pokrywką przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności do wyschnięcia. W tym czasie IPTG w płytkach NGM będzie indukować produkcję dsRNA w bakteriach.
    1. Użyj co najmniej 3 płytek na kulturę bakteryjną na eksperyment. Zapewni to 3 techniczne powtórzenia dla każdego eksperymentu.
  5. Wysuszone płytki RNAi NGM-agar z bakteriami należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do dwóch tygodni.

3. Przygotowanie szczepu BAT28 C. elegans

  1. Utrzymuj szczep robaka BAT288 zawierający transgeny otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] i ntIs1 [gcy-5prom::gfp] na bakteriach OP50 za pomocą standardowych płytek NGM-Agar w temperaturze 15 °C.
    Uwaga: Szczegółowy protokół dotyczący hodowli nicieni można znaleźć na stronie 10. rol-6 (su1006) jest dominującym allelem i powszechnie stosowanym fenotypowym markerem iniekcji16, który powoduje typowy ruch toczenia. Jest używany w transgenie otIs305 do śledzenia hsp-16.2prom::che-1.
    1. Utrzymuj szczep BAT28 w temperaturze 15 °C przez cały czas, aby zapobiec ostrożnej aktywacji transgenu hsp-16.2prom::che-1. Zmniejsz narażenie na temperatury wyższe niż 15 °C, jednocześnie radząc sobie z obciążeniem w jak największym stopniu.
  2. Aby zsynchronizować starzenie się robaków, użyj techniki wybielania17.
    1. Zmyć 6 cm płytki agarowe NGM zawierające dorosłe osobniki i jaja BAT28 za pomocą 900 μl buforu M9. Robaki granulowane przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.
    2. Dodaj 0,5 – 1 ml roztworu wybielającego i potrząsaj probówką przez około 1 minutę, aż dorosłe robaki zaczną pękać. Monitoruj za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego.
    3. Robaki osadzane przez odwirowanie przy 900 x g przez 1 min. Usunąć supernatant.
    4. Przemyć osad robaka 3 razy, dodając 800 μl buforu M9 i odwirowując przy 900 x g.
    5. Oczyszczone jaja umieszczamy na świeżych płytkach NGM wysianych bakteriami OP50. Wyhodować wybieloną populację na bakteriach OP50 w temperaturze 15 °C, aż osiągną stadium L4 (około 4 dni). Larwy L4 można rozpoznać po białej plamie mniej więcej w połowie długości brzusznej strony robaka18 przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego.
      Uwaga: Aby osiągnąć fenotyp konwersji komórki rozrodczej do neuronu po wyczerpaniu lin-53, musi on zostać zubożony w pokoleniu rodzicielskim (P0). Punktacja dla fenotypu konwersji jest przeprowadzana w następnym pokoleniu (pokolenie potomne F1). Aby osiągnąć zubożony lin-53 już w P0, zwierzęta L4 są poddawane działaniu RNAi.
  3. Ręcznie przenieś 50 robaków etapowych L4 na replikę za pomocą platynowego drutu na płytkę NGM, która nie zawiera żadnych bakterii i pozwól robakom odsunąć się od przenoszonych bakterii OP50. Pozwól robakom poruszać się po talerzu przez około 5 minut. Użyj bakterii z płytek RNAi NGM-Agar uprzednio obsianych bakteriami lin-53 RNAi (lub kontrolą pustego wektora), aby przenieść się na odpowiednie płytki RNAi.
    1. Unikaj przenoszenia bakterii OP50 na właściwe płytki RNAi. Pracuj szybko, aby zminimalizować czas ekspozycji szczepu na temperatury wyższe niż 15 °C.
  4. Inkubować robaki na płytkach RNAi NGM-Agar w temperaturze 15 °C przez około 7 dni, aż potomstwo robaków F1 osiągnie stadium L3 – L4. Można je wyraźnie oddzielić od zwierząt P0, ponieważ są większe i grubsze niż potomstwo F1.
    1. Sprawdź wzrokowo pod standardowym mikroskopem stereoskopowym, czy robaki potomne F1 wykazują fenotyp wystającego sromu (pvul), jak pokazano na Rysunek 1. RNAi przeciwko lin-53 ma działanie plejotropowe i powoduje fenotyp pvul, który można wykorzystać do oceny, czy RNAi przeciwko lin-53 zakończyło się sukcesem.
      Uwaga: RNAi przeciwko lin-53 może również powodować śmiertelność zarodków F1. Efekt ten nasila się, jeśli płytki są wystawione na działanie temperatury wyższej niż 15 °C, zanim zwierzęta osiągną etap L3 – L4. Martwe zarodki można rozpoznać po zatrzymaniu rozwoju i braku wylęgu.
    2. Inkubuj płytki w ciemności, ponieważ IPTG jest wrażliwy na światło.

4. Indukcja przeprogramowania komórek rozrodczych

  1. Inkubować badane płytki RNAi zawierające lin-53 i puste potomstwo F1 potraktowane RNAi wektorem przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności w celu aktywacji CHE-1. Użyj wentylowanego inkubatora, ponieważ pozwala to na bardziej efektywny szok cieplny.
  2. Pozwolić zwierzętom, które poddały się szokowi cieplnemu, dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez noc w ciemności.
  3. Używając standardowego mikroskopu stereoskopowego sprzężonego z fluorescencyjnym źródłem światła, zbadaj zwierzęta pod filtrem GFP pod kątem sygnałów pochodzących z gcy-5prom::gfp w środkowej części ciała robaków, jak pokazano na Rysunek 2. Ustaw mikroskop dla sygnałów GFP: maksimum wzbudzenia przy 488 nm z maksimum emisji przy 509 nm.
  4. Oceń stopień konwersji komórki rozrodczej do neuronu, montując zwierzęta z sygnałami GFP w środkowej części ciała na szkiełkach mikroskopowych zawierających podkładkę agarową19.
    1. Policz liczbę zwierząt wykazujących konwersję komórki rozrodczej do neuronu w porównaniu z ciemnymi zwierzętami, aby ocenić penetrację fenotypu. Zazwyczaj około 30% zwierząt wykazuje dyskretne sygnały GFP w linii zarodkowej po wyczerpaniu lin-53, podczas gdy nie więcej niż 5% zwierząt wykazuje rozproszone sygnały GFP w linii zarodkowej po pustym wektorze RNAi.  

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w Rysunek 1, zwierzęta F1, które wykazują fenotyp pvul, ilustrują udane zastosowanie lin-53 RNAi. Zwierzęta te są podatne na przekształcanie swoich komórek rozrodczych w komórki podobne do neuronów ASE po indukcji szoku cieplnego nadmiernej ekspresji che-1, jak pokazano w Rysunek 2. W przeciwieństwie do robaków, które rosły na kontrolnym pustym wektorze RNAi lin-53, leczenie RNAi da zwierzęta, które wykazują ektopowe sygnały GFP w środkowej części ciała po szoku cieplnym i inkubacji w temperaturze 25 °C przez noc, jak opisano wcześniej4,8. Bliższe badanie tych robaków pod mikroskopem epifluorescencyjnym ujawnia, że komórki wykazujące sygnały GFP wykazują również projekcje podobne do neuronów (Rysunek 2B, białe strzałki), które są typowe dla komórek neuronalnych. Jeśli RNAi przeciwko lin-53 nie powiodło się lub warunki szoku cieplnego były nieodpowiednie, sygnały GFP będą podobne do tych u kontrolnych zwierząt traktowanych RNAi (Rysunek 2). Co ważne, należy unikać wywoływania nadmiernej ekspresji che-1 poprzez indukcję ciepła, zanim zwierzęta osiągną środkowy etap L3. Zwierzęta, które były zbyt młode w czasie indukcji nadekspresji che-1, mogą wykazywać ektopową ekspresję gcy-5prom::gfp w innych obszarach ciała, takich jak rozwijający się srom, jak pokazano w Rysunek 313.

figure-results-1
Rysunek 1: Fenotyp Pvul spowodowany przez RNAi przeciwko lin-53. (Góra) Obraz DIC robaków potomnych L4 / młodego dorosłego stadium F1 pochodzących od matek kontrolnych lub leczonych lin-53 RNAi. Paski skali = 20 μm. (Na dole) Zwierzęta leczone RNAi lin-53 wykazują fenotyp wystającego sromu (pvul) (czarne groty strzał). Fenotyp pvul potwierdza, że RNAi przeciwko lin-53 było skuteczne. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Robaki z pomyślnie przeprogramowaną komórką rozrodczą na neurony. (A) Zwierzęta szczepu BAT28 hodowane na pustym wektorze nie wykazują sygnałów GFP w linii zarodkowej po indukcji szoku cieplnego nadekspresji che-1. Przerywana biała linia obrysowuje robaka. Paski skali = 20 μm. (B) W przeciwieństwie do zwierząt ze szczepu BAT28 hodowanych na pustym wektorze kontroli RNAi, zwierzęta hodowane na lin-53 RNAi wyświetlają sygnały gcy-5prom::gfp w środkowej części ciała. Zdjęcia środkowej części ciała z sygnałami GFP wykonane w powiększeniu 63x ujawniają komórki GFP-dodatnie pokazujące wypukłości (białe groty strzałek). Ta cecha morfologiczna wskazuje, że komórki rozrodcze uległy przekształceniu w komórki podobne do neuronów ASE. Białe gwiazdki oznaczają autofluorescencję pochodzącą z jelit. Wszystkie zdjęcia zostały uzyskane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego o powiększeniu 20x i powiększeniu 63x. Przerywana biała linia wyznacza robaki. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wczesny etap robaka z ektopowym GFP. Zwierzęta ze szczepu BAT28 wyhodowane na pustych bakteriach wektorowych RNAi, które zostały wywołane szokiem cieplnym z powodu nadekspresji che-1 we wczesnych stadiach larwalnych, takich jak L2, wykazują sygnały GFP w obszarze środkowej części ciała (białe gwiazdki). Sygnały te nie są spowodowane przeprogramowaniem komórek rozrodczych. Przerywana biała linia obrysowuje robaka. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż opisany protokół wykorzystujący transgeniczny szczep C. elegans BAT28 i RNAi przeciwko lin-53 jest prosty, kilka kroków ma kluczowe znaczenie w celu zapewnienia oczekiwanego wyniku przeprogramowania komórki rozrodczej w neuron. Ważne jest, aby szczep BAT28 był utrzymywany w temperaturze 15 °C przez cały czas przed eksperymentami. Podczas obchodzenia się z odmianą i jej konserwacji, czas przebywania w temperaturach powyżej 15 °C musi być jak najbardziej zminimalizowany. Odpowiednie warunki szoku cieplnego są ważne, ponieważ niewystarczająca indukcja nadekspresji che-1 nie spowoduje konwersji komórek rozrodczych do neuronów ASE. Można to wykryć, mierząc penetrację fenotypu, jak opisano w protokole. Rozległy szok cieplny może prowadzić do śmiertelności zwierząt. Na przykład płyty, które zostały umieszczone w pobliżu ścian wewnętrznych lub na dnie statycznego inkubatora powietrza, często są poddawane intensywnej obróbce cieplnej. Dlatego zaleca się stosowanie wentylowanego inkubatora ciepła. Dodatkowo, czas indukcji szoku cieplnego ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierna ekspresja che-1 podczas stadiów larwalnych wcześniej niż L3 może prowadzić do ektopowej indukcji gcy-5prom::gfp w różnych obszarach ciała, takich jak srom (Figura 3)9. Co więcej, rozległy szok cieplny można wykryć na podstawie penetracji fenotypu u zwierząt z pustym wektorem RNAi, która nie powinna sięgać 5% i zwiększonej autofluorescencji innych tkanek, a mianowicie jelita.

Sporadycznie bakterie RNAi mogą tracić swoją aktywność, aby efektywnie wytwarzać dsRNA docelowego genu. Niestety, nie można tego wykryć przed eksperymentem RNAi. W takich przypadkach należy wyhodować świeżą smugę z glicerolu, jak opisano w sekcji 2 protokołu. Jeśli nadal nie ma widocznego fenotypu plejotropowego spowodowanego przez RNAi, takiego jak fenotyp pvul spowodowany udanym RNAi przeciwko lin-53, należy przeprowadzić izolację plazmidowego DNA z odpowiednich bakterii i świeże bakterie HT115 muszą zostać przekształcone w plazmid L4400 zawierający sekwencję lin-53 .

Co ważne, szczep BAT28 ma fenotyp rolkowy spowodowany markerem iniekcyjnym pRF4, który był używany podczas transgenezy zwierząt z konstruktem DNA hsp-16.2prom::che-1 . Czasami zwierzęta tracą fenotyp toczenia, co może wskazywać na wyciszenie transgenu hsp-16.2prom::che-1 . Aby prawidłowo utrzymać szczep BAT28, wybierz 10 zwierząt rolkowych na świeży talerz i rozmnażaj, wybierając zwierzęta do toczenia.

Zastosowanie protokołu jest ograniczone do procedury F1 RNAi, co oznacza, że zwierzęta, których rodzice (pokolenie P0) nie byli narażeni na RNAi lin-53 , nie wykażą konwersji komórek rozrodczych do neuronów z powodu ratowania matki4. Alternatywna procedura przekształcania komórek rozrodczych w neurony została opisana przez Cioska i współpracowników15 przy użyciu knock-down RNAi gld-1 i mex-3 bez nadmiernej ekspresji czynnika transkrypcyjnego. Jednak uzyskane neurony nie należą do określonego typu neuronów, a komórki rozrodcze również przekształcają się w komórki mięśniopodobne po ubytku gld-1 i mex-315 za pośrednictwem RNAi. Wcześniej wykazano, że RNAi przeciwko lin-53 umożliwia konwersję komórek rozrodczych w komórki podobne do neuronów GABA-ergicznych po nadmiernej ekspresji czynnika transkrypcyjnego homedomeny typu Pitx UNC-3016 zamiast CHE-14. W przyszłości można przetestować różne czynniki transkrypcyjne indukujące los, czy komórki rozrodcze zubożone w lin-53 mogą zostać przekształcone w inne typy komórek niż określone neurony. W tym kontekście, nadekspresja miogennego czynnika transkrypcyjnego bHLH HLH-1, homologu ssaka MyoD17, indukuje konwersję komórki rozrodczej do mięśni na lin-53 RNAi5. Ustalone przeprogramowanie komórek rozrodczych do określonego typu komórek somatycznych na podstawie RNAi lin-53 i nadmierna ekspresja odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego indukującego los mogą być wykorzystane do wielu różnych genetycznych badań przesiewowych. Takie ekrany supresorowe lub wzmacniające mogą pomóc w przeanalizowaniu szlaków regulacyjnych, które odgrywają rolę podczas konwersji losu komórki.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Alinie El-Khalili i Martinie Hajduskovej za pomoc techniczną. Dziękujemy członkom grupy Tursun za komentarze do manuskryptu. Praca ta była sponsorowana przez ERC-StG-2014-637530 i ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 i jest wspierana przez Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbruecka w Stowarzyszeniu Helmholtza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals 
Agar-Agar, Kobe IRoth5210.1
Bactopeptone A. Hartenstein GmbH211 677Peptone Media 
Ekstrakt drożdżowy AppliChemA1552,0100
Amfoterycyna BUSBiologicalA2220
CaCl2Merck Biosciences208290
CholesterolRoth8866.2
ŻelatynaRoth4275.3
IPTGSigma15502-10G
K2PO4RothT875.2
KH2PO4Roth 3904.2
MgSO4VWR25,163,364
Na2HPO4RothP030.1
NaClRoth9265.1
NaClORoth9062.3
NaOH (5 N)Roth KK71.1
TrisRothAE15.2
KarbenicylinaRoth634412
TetracyklinaRoth2371.2
Inkubatory
Inkubator New Brunswick Scientific C24M1247-0052do inkubatora szoku cieplnego
 Sanyo MIR-55534210do utrzymania szczepów robaków w temperaturze 15 & deg; C lub 25 ° C
mikroskopy
Mikroskop fluorescencyjnyM205 FALeica
(obrazowanie) + kameraAxio Imager 2Mikroskop Zeiss
(obrazowanie) + kameraMikroskop stereoskopowy SensicamPCO
SMZ745Nikon
bakteryjny szczepy
Escherichia coli HT115F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lizogen: lavUV5
promotor -Polimeraza T7) (indukowana przez IPTG polimeraza T7) (RNAse
III minus).
Escherichia coli OP50  Uracil auksotrof, szczep E. coli
Worm szczepy
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::
3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.		pochodzi z OH9846 przez 4x więcej krzyżówek wstecznych z
klonami N2RNAi
lin-53SourceBioscienceID I-4D14Biblioteka Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
pusty vetor: L4440Addgene #1654
Misc.
Robak Wykonane samodzielnie przy użyciu pipety Pasteura i drutu platynowego
Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), (1987).
  2. Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. , 1-12 (2015).
  3. Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).
  4. Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331 (6015), 304-308 (2011).
  5. Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. , 1-9 (2012).
  6. Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).
  7. Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).
  8. Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
  9. Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100(2017).
  10. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  12. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  13. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  14. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).
  15. Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311 (5762), 851-853 (2006).
  16. Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).
  17. Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).
  18. Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).
  19. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , 1-75 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reprogramowanie kom rek zarodkowychneurony C elegansRNAi LIN 53szok termiczny CHE 1konwersja neuron w ASEmikroskopia fluorescencyjnasynchronizacja wieku nicienitechnika wybielaniaekspresja transgenuprzesiew genetyczny

Powiązane artykuły