Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja endogennej auksyny i cytokininy podczas hodowli międzywęźlowej Ipecac

DOI:

10.3791/56902

⸱

15 marca 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pędy przybyszowe mogą być indukowane na międzywęzłowych segmentach ipecac bez leczenia fitohormonami. Aby ocenić dynamikę fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych, zmierzyliśmy endogenną auksynę i cytokininę w segmentach międzywęzłowych za pomocą LC-MS / MS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przypadkowe tworzenie pędów jest ważną techniką dla rozmnażania ważnych ekonomicznie roślin uprawnych i dla regeneracji roślin transgenicznych. Leczenie fitohormonami jest wymagane do indukcji pędów przybyszowych u większości gatunków. To, czy można indukować pędy przybyszowe, zależy od równowagi między poziomami auksyny i cytokininy (CK). Wiele wysiłku wkłada się w określenie optymalnych stężeń i kombinacji fitohormonów w każdej tkance używanej jako eksplantaty i w każdym gatunku rośliny. Jednak w ipecac pędy przybyszowe można indukować na segmentach międzywęzłowych w pożywce hodowlanej bez leczenia fitohormonami. Pozwala to na ocenę wrodzonej plastyczności ipecac dla różnicowania komórek. Aby wywołać pędy przybyszowe w ipecac, hodowaliśmy segmenty międzywęzłowe w temperaturze 24 °C pod 15 μmol m−2 s−1 światła w 14-godzinnym cyklu świetlnym/10-godzinnym cyklu ciemnym na wolnym od fitohormonów podłożu B5 zestalonym z 0,2% gumy gellan przez 5 tygodni. Aby zbadać dynamikę fitohormonów podczas tworzenia pędów przypadkowych, zmierzyliśmy endogenny kwas indolo-3-octowy i CK w segmentach za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas LC-MS / MS. Metoda ta pozwala w prosty sposób na analizę poziomu endogennego kwasu indolo-3-octowego i CKs. Może być stosowany do badania dynamiki endogennej auksyny i CK podczas organogenezy u innych gatunków roślin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) zaproponował koncepcję "totipotencji", dzięki której komórki roślinne mogą dzielić, różnicować i regenerować całe rośliny, nawet po ich wcześniejszym różnicowaniu w określone typy komórek u dojrzałych roślin1. W kulturach tkankowych o tym, czy można indukować regenerację roślin, decyduje kombinacja i stężenie egzogennie stosowanych fitohormonów w pożywce wzrostowej. Skoog i Miller odkryli, że pędy przybyszowe mogą być indukowane z kalusa tytoniu na pożywce zawierającej wysoki stosunek CK do auksyn, podczas gdy korzenie przybyszowe mogą być indukowane na pożywce o niskim stosunku2. Od czasu tego odkrycia, hodowla tkankowa jest szeroko stosowana do rozmnażania roślin uprawnych o znaczeniu gospodarczym oraz do regeneracji roślin transgenicznych3. Pędy przybyszowe mogą być indukowane z tkanek innych niż merystem wierzchołkowy pędów, takich jak liście, korzenie i międzywęźla. Leczenie fitohormonami jest wymagane do indukcji pędów przybyszowych u większości gatunków roślin. Jednak optymalne stężenia i kombinacje różnią się w zależności od gatunku i tkanek stosowanych jako eksplantaty. W związku z tym wiele wysiłku wkłada się w określenie optymalnych stężeń i kombinacji fitohormonów do eksperymentów.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) to roślina lecznicza, która zawiera alkaloidy, takie jak emetyna i cefalina, głównie w korzeniach4. Ekstrakty z korzeni są używane jako środek wykrztuśny, wymiotny i amebiobójczy5. Chociaż ipecac rośnie naturalnie w tropikalnych lasach deszczowych Brazylii, niechętnie zawiązuje nasiona w kulturze, a szybkość kiełkowania spada podczas przechowywania nasion w Japonii, w chłodniejszym klimacie6. Zamiast tego rozmnaża się go przez hodowlę tkankową, w której najbardziej efektywną metodą jest przypadkowe tworzenie pędów na międzywęźlach7,8. Co ciekawe, pędy przybyszowe mogą być indukowane u tego gatunku bez leczenia fitohormonami8.

Pędy przybyszowe powstają na naskórku w okolicy wierzchołkowej segmentów międzywęzłowych bez modzelenia, ale nie w obszarze podstawnym9. Różnica ta wskazuje na polarność tkanek w segmentach międzywęzłowych, która prawdopodobnie podlega regulacji fitohormonalnej. System hodowli ipecac daje wyjątkową możliwość analizy zmian poziomu endogennych fitohormonów podczas tworzenia pędów przybyszowych. Tutaj przedstawiamy naszą metodę analizy endogennych poziomów jednej auksyny (kwasu indolo-3-octowego (IAA)) i czterech CK (izopentenyloadenina (iP), rybozyd izopentenylogeniny (iPR), trans-zeatyna (tZ) i rybozyd trans-zeatyny (tZR)) w segmentach międzywęzłowych za pomocą LC-MS / MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Ipecac (C. ipecacuanha) został użyty w tym badaniu, ponieważ ułatwia analizę endogennych fitohormonów.

1. Warunki wzrostu do wywołania przypadkowych pędów Ipecac

  1. Przygotuj wolne od fitohormonów podłoże B5 dostosowane do pH 5,710 i dodaj 0,2% gumy gellan. Sterylizuj w autoklawie.
  2. Wlać 25 ml autoklalawowanej pożywki na sterylną szalkę Petriego (90 mm × 20 mm).
  3. Wytnij 8-milimetrowe segmenty międzywęzłowe sadzonek ipecac za pomocą skalpela chirurgicznego z ostrzem nr 22 na sterylnej płytce akrylowej i umieść na podłożu (Ryc. 1).
  4. Hodowla na pożywce B5 wolnej od fitohormonów w temperaturze 24 °C w temperaturze 15 μmol m−2 s−1 światła w 14-godzinnym cyklu światła/10-godzinnym ciemnym cyklu przez 5 tygodni.
  5. Zidentyfikuj obszary od I (wierzchołkowe) do IV (podstawowe) w każdym segmencie (Rysunek 1B). Raz w tygodniu policz pod mikroskopem liczbę pędów przybyszowych > długości 0,3 mm w każdym regionie.

2. Ekstrakcja i oczyszczanie fitohormonów

  1. Umieść kulkę cyrkonu o średnicy 5 mm w każdej z czterech probówek na próbki o pojemności 2 ml.
  2. Pokrój segmenty na obszary od I do IV (każdy o długości 2 mm) za pomocą skalpela chirurgicznego na sterylnej płytce akrylowej.
  3. Zebrać osiem segmentów każdego regionu w oddzielnych probówkach na próbki (10-30 mg świeżej masy).
  4. Zważyć, a następnie zamrozić próbki w ciekłym azocie.
  5. Rozdrobnić zamrożone próbki za pomocą homogenizatora na bazie kulek.
  6. Zawiesić rozdrobnione próbki w 1 ml acetonitrylu zawierającym 500 pg każdego wewnętrznego wzorca auksyny i CK (d5-IAA, d 5-tZ, d5-tZR, d6-iP, d6-iPR) za pomocą mieszalnika wirowego.
  7. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie odwirować w temperaturze 3 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Umyć osad w 80% (v/v) acetonitrylu zawierającym 1% (v/v) kwas octowy. Ponownie odwirować przy 3 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć supernatanty (z etapów 2.7 i 2.8) w jednorazowej szklanej probówce.
  9. Dodać 600 μl wody zawierającej 1% (v/v) kwasu octowego do każdego połączonego supernatantu i odparować acetonitryl za pomocą koncentratora próżniowego.
  10. Zrównoważyć wkłady kolumny hydrofilowo-lipofilowej (HLB), nakładając po 1 ml acetonitrylu, metanolu i wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.
  11. Nałożyć jeden roztwór próbki na zrównoważony wkład HLB.
  12. Umyć wkłady 1 ml wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.
  13. Eluować wszystkie hormony za pomocą 2 ml 80% (v/v) acetonitrylu zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego w szklanej probówce.
  14. Odparować acetonitryl w eluacie w celu otrzymania ekstraktu w wodzie zawierającej 1% (v/v) kwasu octowego za pomocą koncentratora próżniowego.
    UWAGA: Nie susz tego całkowicie.
  15. Zrównoważyć wkłady kolumnowe z mocną kationowymiennością w trybie mieszanym (MCX), stosując 1 ml acetonitrylu, 1 ml metanolu, 0,5 ml 0,1 M HCl i 1 ml wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.
  16. Nałożyć jeden roztwór próbki na zrównoważony wkład MCX.
  17. Umyć wkłady 1 ml wody zawierającej 1% (v/v) kwas octowy.
  18. Elute IAA za pomocą 2 ml 30% (v/v) acetonitrylu zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego w szklanej probówce.
  19. Umyć wkłady 2 ml 80% (v/v) acetonitrylu zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego.
  20. Umyj wkłady 2 ml wody i 1 ml wody zawierającej 5% wodnego roztworu amoniaku.
  21. Eluować CK za pomocą 2 ml 60% (v/v) acetonitrylu zawierającego 5% wodnego amoniaku w szklanej probówce.
  22. Odparować rozpuszczalnik każdej frakcji hormonalnej za pomocą koncentratora próżniowego i przechowywać w temperaturze -30 °C do czasu analizy LC-MS/MS.

3. Analiza LC-MS/MS dla IAA i CK

  1. Rozpuścić każdy ekstrakt hormonalny w probówce z 600 μl metanolu i przenieść roztwór do fiolki z zakręcaną szyjką do całkowitego odzyskiwania. Odparować rozpuszczalnik za pomocą koncentratora próżniowego.
  2. Frakcję IAA rozpuścić w 20 μl 30% (v/v) acetonitrylu, a frakcje CK w 20 μl wody zawierającej 1% (v/v) kwasu octowego w fiolkach z całkowitym odzyskiem z gwintowaną szyjką.
  3. Analizuj próbki w trybie jonów dodatnich w systemie MS z potrójnym kwadrupolem wyposażonym w system HPLC.
    UWAGA: Ustawiamy warunki HPLC zgodnie z tabelą 1.
    1. Do elucji IAA należy użyć gradientu binarnego 5%-50% rozpuszczalnika B przez 7 minut, następnie zwiększyć o 98% rozpuszczalnika B i przytrzymać przez 1 minutę, a następnie zrównoważyć przez 2 minuty przy 5% rozpuszczalniku B przez wstrzyknięcie gniazda.
    2. Do elucji CK należy użyć gradientu binarnego 2%-40% rozpuszczalnika B w ciągu 5 minut, 40%-70% rozpuszczalnika B w ciągu 7 minut, następnie zwiększyć o 95% rozpuszczalnika B i utrzymać przez 1 minutę, a następnie zrównoważyć przez 2 minuty przy 2% rozpuszczalniku B przez wstrzyknięcie gniazda.
    3. Ustawić parametry jonizacji elektronopryskowej (ESI)-MS źródła jonów zgodnie z tabelą 2.
  4. Przejście do monitorowania wielu reakcji (MRM) należy wykorzystać do oznaczania ilościowego każdego analitu wymienionego w tabeli 3.
  5. Określ ilościowo endogenne poziomy IAA i CK w stosunku do krzywej wzorcowej stosunku wzorców nieznakowanych do wzorców znakowanych deuterem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpierwszym tygodniu nie uformowały się żadne przypadkowe pędy. W2 tygodniu pojawiły się małe pędy. W 3 i 4 tygodniu liczba pędów zwiększyła się głównie w obszarach wierzchołkowych (I i II) (Ryc. 2A). W 5tygodniu liczba pędów wynosiła około 7 w regionie I i 5 w regionie II (Ryc. 2B). Natomiast w regionach III i IV powstało tylko kilka pędów.

<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować rozmieszczenie fitohormonów biorących udział w organogenezie, ważne jest użycie materiałów roślinnych, w których organogenezę można zaobserwować na pożywce wolnej od fitohormonów, ponieważ gdy fitohormony są egzogennie stosowane do eksplantatów w celu indukowania pędów lub korzeni, wpływają one na cały eksplant, co utrudnia ocenę wrodzonej plastyczności roślin w różnicowaniu komórek i organogenezie. Pędy przybyszowe można indukować na pożywkach hodowlanych wolnych od fitohormonów u innych gatunków rośl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Panu Akirze Murakamiemu z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Toyo oraz Panu Koudai Taniguchi z Centrum Technologii Rolniczych Gunma za ich pomoc techniczną. Jesteśmy również wdzięczni profesorowi Shosaku Kashiwada i dr Umie Maheswari Rajagopalan z Uniwersytetu Toyo za ich sugestie. Badanie to było częściowo wspierane przez Centrum Badawcze Nauk o Życiu i Środowisku Uniwersytetu Toyo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[2H5]kwas indolo-3-octowyOlchemlm Ltd031 1531Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS[
2H5]trans-zeatinOlchemlm Ltd030 0301Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS
[2H5]rybozyd trans-zeatynyOlchemlm Ltd030 0311Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS[
2H6]N6-izopentenyloadeninaOlchemlm Ltd030 0161Wzorzec wewnętrzny dla LC-MS/MS
[2H6]N6-izopentenyloadenozynaOlchemlm Ltd030 0171Wewnętrzny wzorzec dla kwasu
indolo-3-octowegoWAKO098 00181norma dla LC-MS/MS
trans-zeatinSIGMA-ALDRICHZ0876 5MGnorma dla rybozydu trans-zeatyny LC-MS/MS
Wako262 01081norma dla LC-MS/MS
N6-izopentenyl adeninaSIGMA-ALDRICHD7674 1Gwzorzec dla LC-MS/MS
N6-izopentenyloadenozynaACROS ORGANICS22648 1000wzorzec dla LC-MS/MS
acetonitryl hypergrade dla LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000rozpuszczalnik do LC-MS/MS
Woda do chromatografii LiChrosolvMERCK1.15333.1000rozpuszczalnik do LC-MS/MS
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 ccWodaWAT094225kolumna nabojowa
Oasis MCX 30 mg/1 ccWoda186000252kolumna naboju
szyjką fiolka do całkowitego odzyskiwaniaWody186002805
niebieskie, 12 x 32 mm nakrętka z szyjką i przegrodą PTFE/silikonWody
Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mmWoda186002350kolumna UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mmAgilent699775-902Kolumna UPLC
Mikroskop cyfrowyLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
Ostrze chirurgicznePióronr 22
Rękojeść skalpelaFeatherNo. 4
Savant SpeedVac/Separator pary z fregeracjąKoncentrator próżniowyThermo Fisher ScientificSPD111/RVT4104
Jednorazowa szklana toczka (13x100 mm)IWAKI9832-1310
Sterylna szalka PetriegoINA OPTICAI-90-20
LC-MS/MS z 186000274

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza cytokininmetoda LC MS MStworzenie p d w przybysz ychkultura mi dzyw li ipekakdynamika fitohormon whodowla tkanek ro linnychoznaczanie ilo ci hormon wpod o e z gum gellanowkoncentrator pr niowy

Powiązane artykuły