Artykuł metodologiczny

Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56908

⸱

30 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dipartimento di Fisica, Università degli Studi di Pavia, 2IRCCS Istituti Clinici Scientifici Maugeri

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanym promieniowaniem rentgenowskim Caco-2 a komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). Protokół rozpoczyna się od napromieniania Caco-2 i ustanowienia kokultury z PBMC; następnie regularnie przez 48 godzin mierzy się przeznabłonkowy opór elektryczny, a western blot wykonuje się zarówno w Caco-2, jak i PBMC.

Streszczenie

Protokół przyjęty w tej pracy ma na celu rozwikłanie, w jaki sposób promienie rentgenowskie zakłócają funkcjonowanie bariery jelitowej, skupiając się na wzajemnym oddziaływaniu między komórkami nowotworu jelita grubego a układem odpornościowym. Rak jelita grubego jest jednym z najczęstszych rodzajów raka, zwykle leczonym chirurgicznie, chemioterapią i radioterapią. Zalety radioterapii w celowaniu w nowotwór są dobrze znane. Jednak nawet ograniczona ekspozycja zdrowych tkanek budzi duże obawy, szczególnie jeśli chodzi o wpływ na barierę jelitową i układ odpornościowy. Przyjęty układ pozwala na badanie wzajemnych oddziaływań pomiędzy dwiema populacjami komórek w stanie bardziej zbliżonym do fizjologicznego, w porównaniu z normalnymi hodowlami komórkowymi. W tym celu uciekamy się do różnych technik i zastosowaliśmy model wspólnej hodowli in vitro, oparty na komórkach Caco-2 zróżnicowanych jako monowarstwa i PBMC, dzielących tę samą pożywkę. Protokół ten został opracowany w celu skoncentrowania się zarówno na efektach makroskopowych, tj. żywotności komórek i trans-epithelial electrical resistance (TEER), jak i, poprzez western blot, zmianach molekularnych, tj. aktywacji szlaku zapalnego w komórkach odpornościowych i ekspresji białka ścisłego połączenia w komórkach Caco-2. Wstępną ocenę wpływu promieniowania na żywotność komórek Caco-2 oceniano za pomocą testów bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) i błękitu trypanowego, podczas gdy TEER mierzono w ustalonych odstępach czasu za pomocą omomierza zaprojektowanego specjalnie dla systemów kohodowli. W ten sposób można wykazać efekty wywołane promieniowaniem, obecność komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), a ostatecznie ich efekt synergiczny. Dzięki tym uzupełniającym technikom zaobserwowaliśmy wysoką radiooporność Caco-2 w zakresie 2 - 10 Gy promieniowania rentgenowskiego oraz zwiększoną przepuszczalność monowarstwy Caco-2 po dodaniu PBMC. W szczególności stwierdzono, że obecność PBMC jest związana ze zmiennością ekspresji białek rusztowania ścisłego połączenia.

Wprowadzenie

Metodologia przyjęta w tej pracy została zaprojektowana do zbadania wzajemnych oddziaływań między komórkami raka jelita grubego a układem odpornościowym, wykorzystując układ bliższy warunkom fizjologicznym w porównaniu do normalnych dwuwymiarowych hodowli komórkowych.

Rak jelita grubego (CRC) jest uważany za trzeci najczęściej występujący rodzaj nowotworu, z ponad milionem przypadków na całym świecie (Global Cancer Observatory, Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem, Światowa Organizacja Zdrowia, http://gco.iarc.fr). Leczenie raka jelita grubego jest rutynowo przeprowadzane za pomocą operacji, chemioterapii lub radioterapii1. W porównaniu z technikami inwazyjnymi, takimi jak chirurgia lub chemioterapia, radioterapia w dużej mierze pozwala uniknąć typowych szkodliwych reakcji ogólnoustrojowych wynikających z tych podejść klinicznych, dzięki miejscowemu dostarczaniu dawki promieniowania. Jednak skutki uboczne mogą wystąpić w otaczających zdrowych tkankach, wywołując stan zapalny z bezpośrednim uszkodzeniem zdrowych komórek i uszkodzeniem, w którym pośredniczą efekty nieukierunkowane2,3,4. Koncentrując się na niepożądanych skutkach napromieniania podczas leczenia raka jelita grubego, należy zbadać dwa aspekty. Po pierwsze, mechanizmy odpowiedzialne za nieprzepuszczalność jelit mogą zostać zmienione przez dostarczanie promieniowania, co z kolei może powodować skutki uboczne z powodu zmienionego powstrzymywania populacji bakterii i parakomórkowego pasażu cząsteczek i substancji rozpuszczonych. Po drugie, obecność tkanki limfatycznej związanej z jelitami (GALT) działa jak placówka układu odpornościowego, z funkcją kontrolowania wzrostu bakterii i pośredniczenia w ogólnej odpowiedzi immunologicznej5,6,7. Aby spełnić te funkcje, zachowana jest nieprzepuszczalność jelitowa dzięki funkcji kompleksów połączeniowych między błonami komórkowymi. Z tych powodów badano szkodliwe konsekwencje wywołane różnymi dawkami promieniowania rentgenowskiego w samych komórkach Caco-2 oraz w kokulturach z PBMC.

Chociaż prowadzenie badań nad hodowlami komórkowymi jest pierwszym punktem badań w badaniach biomedycznych, brak szczegółowej wiedzy na temat mechanizmów kierujących biologią komórki i wzajemnych interakcji między różnymi typami komórek może stać się krytyczny, gdy zbliżamy się do badania fizjologii organów, układów i aparatów, które nie mogą być łatwo odtworzone w laboratorium. Dlatego zdecydowaliśmy się przyjąć konfigurację wspólnej hodowli, pozwalającą zarówno na wspólne badanie dwóch populacji komórek, jak i na analizę aspektów związanych z mechanizmami międzykomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi.

Kokultura jest techniką wykorzystywaną podczas badania funkcji nabłonka i wzajemnych oddziaływań między różnymi typami komórek. W szczególności zastosowanie takiej techniki staje się w naszym przypadku obowiązkowe, ponieważ nabłonek składa się z komórek charakteryzujących się polarnością. W przypadku bariery jelitowej enterocyty wykazują dobrze zdefiniowaną polaryzację, z biegunami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi normalnie oddzielonymi ze względu na obecność ścisłych cząsteczek adhezyjnych tworzących połączenie. Ta podział na przedziały jest potrzebny dla fizjologii tkanki, unikając transportu parakomórkowego i umożliwiając przejście tylko określonych cząsteczek. Ta funkcja jest oczywiście niemożliwa do odtworzenia przy użyciu normalnej konfiguracji hodowli komórek. Co więcej, przyjęcie układu kohodowlanego odtwarza obecność komórek odpornościowych tylko na powierzchni podstawno-bocznej, podczas gdy powierzchnia wierzchołkowa (odpowiadająca światłu jelita) nie styka się bezpośrednio z innymi komórkami.

Ostatnio linie komórkowe Caco-2 zyskały na znaczeniu jako model in vitro bariery jelitowej. Chociaż pochodzą z ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego, komórki Caco-2 zachowują zdolność różnicowania i tworzą funkcjonalną spolaryzowaną monowarstwę8, co pozwala na badanie właściwości błony komórkowej podczas uprawy we wstawce do wspólnej hodowli.

Ponieważ hodowla Caco-2 na porowatej błonie jest dobrze ugruntowanym modelem in vitro monowarstwy jelitowej, postępem stała się kokultura między Caco-2 a innymi komórkami. Ten układ był często stosowany do pomiaru przesłuchów między różnymi typami komórek9 i może być używany do rozwikłania zaburzonej odpowiedzi Caco-2 na bodźce egzogenne w jednoczesnej hodowli, w odniesieniu do Caco-2 hodowanego samodzielnie.

Wiele badań dotyczyło zachowania Caco-2 podczas wspólnej hodowli zarówno z niepatogennymi bakteriami, jak i komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej, aby wyjaśnić w szczególności wzajemne oddziaływanie z układem odpornościowym10. Pozo-Rubio i wsp.11 badał ekspresję kilku cytokin w kokulturze Caco-2/PBMC z bifidobakteriami stymulującymi komórki Caco-2. Ich prace zwróciły uwagę na istotną modyfikację profili ekspresji cytokin w zależności od stymulacji bakteryjnej wykonywanej w obecności/braku PBMC. Ich wyniki prowadzą do wniosku, że obecność PBMC uwrażliwia Caco-2 na bifidobakterie.

Różne reakcje komórek Caco-2 na niepatogenne i chorobotwórcze bakterie zostały ocenione przez różne zespoły badawcze. Parlesak i wsp. 12 wykazał immunosupresyjne działanie komórek Caco-2 na PBMC stymulowany przez Escherichia coli. Co więcej, Haller i wsp. 13 badał odpowiedź komórek Caco-2 stymulowanych zarówno lipopolisacharydem (LPS) z enteropatogennych bakterii E. coli spp., jak i nieenteropatogennych, tj. E.E. coli spp., Lactobacillus spp., wzmacniając przypuszczenie, że odpowiedź komórek Caco-2 ściśle zależy od obecności leukocytów w układzie kohodowlanym.

Przeprowadzając różne uzupełniające testy laboratoryjne (np. western blot, trans-nabłonkowy opór elektryczny, MTT, itp.), oprócz analizy różnych typów komórek hodowanych w kohodowli, cała metodologia obiecuje wyniki, które można uznać za bardziej reprezentatywne dla tego, co naprawdę dzieje się in vivo. Co więcej, taka konfiguracja umożliwia oddzielenie różnych przedziałów kokultury, umożliwiając nie tylko badanie zaangażowanych typów komórek, ale także międzykomórkowych cząsteczek sygnałowych uwalnianych w górnym i dolnym przedziale lub w obecności lub bez kokultury.

Protokół

Następujący protokół obejmuje pobieranie ludzkiej krwi od zdrowych ochotników. Dawcy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed zapisaniem się. Procedura ta jest zgodna z Deklaracją Helsińską, a pobranie krwi zostało wykonane przez profesjonalnego asystenta medycznego.

1. Hodowla komórkowa i konfiguracja kokultury

  1. Na tydzień przed napromienianiem należy przygotować zawiesinę komórek Caco-2 zawierającą 2,5 × 105 komórek/ml w świeżej pożywce RPMI1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Zasiać 2 ml zawiesiny komórkowej w sterylnych wkładkach do hodowli komórkowych o średnicy porów 1 μm dla płytek 6-dołkowych i umieścić wkładkę na płytce 6-dołkowej.
    UWAGA: Wkładki do hodowli komórkowych mogą wymagać aktywacji przez inkubację ze sterylnym kompletnym podłożem przed wysiewem komórek. W takim przypadku pożywki hodowlane należy wyrzucić i zastąpić je pożywką do zawieszania komórek.
  3. Dodać 3 ml świeżej pożywki RPMI1640 uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny do każdej dolnej komory i hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotną atmosferą zawierającą 5% CO2 .
  4. W tym samym dniu, w którym dokonano napromieniania komórek Caco-2, należy pobrać ludzką krew pełną do dostępnych w handlu probówek o pojemności 6 ml pokrytych heparyną litową (rozmiar probówki: 13 x 100 mm).
  5. Następnie wyizoluj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) za pomocą gradientu Ficoll. Aby oddzielić PBMC, umieść 25 ml Ficollu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i nałóż równą objętość krwi pełnej rozcieńczonej w stosunku 1:1 z RPMI1640 na powierzchnię Ficollu.
    UWAGA: Normalny, zdrowy dawca ma zwykle około 4 - 10 × 106 PBMC/ml.
  6. Odwirować probówki o pojemności 50 ml o stężeniu 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Delikatnie zebrać PBMC na granicy faz między Ficollem a osoczem przez aspirację pipetą Pasteura i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  8. Przemyć PBMC dwukrotnie, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirowując PBMC przy 250 x g przez 10 minut.
  9. Hodowla PBMC przez maksymalnie 3-5 godzin w kolbach T25 cm2 w kompletnych pożywkach RPMI1640, jak opisano powyżej, w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2,
    UWAGA: Zebrać PBMC w dniu eksperymentu i wysiać 2 × 106 komórek/basenik, zawieszonych w 3 ml kompletnej pożywki RPMI1640, w dolnej komorze kokultury. Inserty z komórkami Caco-2 przenosi się do studzienek zawierających PBMC 30 minut po ich napromieniowaniu. PBMC pobrany z krwi pełnej nie może być utrzymywany w hodowli dłużej niż około 72 godzin, jeśli nie jest stymulowany np. fitohemaglutynina (PHA), po której dochodzi do utraty żywotności komórek.
    UWAGA: Jakość i bezpieczeństwo całej krwi i produktów krwiopochodnych musi być zagwarantowana podczas całego procesu.

2. Przygotowanie do napromieniowania

Uwaga: Napromienianie komórek Caco-2 zostało przeprowadzone na oddziale radioterapii Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pawia, Włochy) za pomocą akceleratora liniowego rutynowo stosowanego w leczeniu różnych typów nowotworów.

  1. Ustaw energię promieniowania rentgenowskiego fotonów na szczyt 6 MV. Akcelerator liniowy działa w trybie pulsacyjnym (czas między dwoma kolejnymi impulsami wynosi około 4 ms; czas trwania pojedynczego impulsu około 5 μs przy natężeniu dawki do 1 × 10-3 Gy/p).
  2. Umieścić 6-dołkowe płytki zawierające wkładki z Caco-2 na trajektorii promieni rentgenowskich na arkuszu pleksiglasu o grubości 1,4 cm (odpowiadającym odległości nieco większej niż nagromadzenie zużytego promieniowania) w odległości 100 cm od źródła promieniowania.
  3. Umieść bolus o grubości 0,5 cm na każdej próbce przed napromienianiem, aby zagwarantować równowagę składowej promieniowania wstecznie rozproszonego i naładowanych cząstek.
  4. Napromienić komórki (dawki w zakresie 2 - 10 Gy) płaskim i symetrycznym (± 2%) polem promieniowania o wymiarach 20 x 20cm2 i dawką 3 Gy/min.
    UWAGA: Kontrolne komórki napromieniowane "pozorowanymi" poddano takim samym warunkom proceduralnym jak komórki napromieniane, bez wchodzenia do pomieszczenia napromieniania (otrzymana dawka: 0 Gy).
    UWAGA: Urządzenia wytwarzające promieniowanie jonizujące mogą być używane wyłącznie przez wyspecjalizowany personel.

3. Test żywotności komórek (test MTT)

Uwaga: Aktywność metaboliczną komórek Caco-2 oceniono za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT)14.

  1. Nasiona 2 ×10 5 Caco-2 w 24-dołkowej płytce 24 godziny przed napromienianiem w 1,25 ml kompletnej pożywki.
  2. Napromienić komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.4, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  3. 21 godzin po napromienianiu dodać 100 μl 5 mg/ml roztworu MTT i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 3 godziny.
  4. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 1 ml PBS.
  5. Rozpuścić kryształy formazanu, dodając 500 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdej studzienki i ocenić absorbancję za pomocą wielodołkowego czytnika płytek przy λ = 570 nm.
  6. Powtórzyć kroki 3.3 - 3.4 - 3.5 - 3.6 po 45 godzinach od napromieniowania.
    UWAGA: Wyniki są wyświetlane jako perturbacja od odpowiedniego stanu pozorowanego, który jest znormalizowany do 100%.
    UWAGA: DMSO jest środkiem łatwopalnym i drażniącym dla skóry, oczu i układu oddechowego (GHS07, GHS08). W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć je dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. MTT jest środkiem drażniącym skórę, oczy i układ oddechowy (GHS07, GHS08). W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza.

4. Procent oznaczania komórek zdolnych do życia (test wykluczenia barwnika błękitu trypanowego)

UWAGA: Procent żywotnych komórek został oceniony za pomocą testu wykluczenia barwnika błękitu trypanowego.

  1. Nasiona 2 ×10 5 Caco-2 w płytce 24-dołkowej 24 godziny przed napromienianiem w 1,25 ml kompletnej pożywki.
  2. Napromienić komórki dawkami w zakresie 0-10 Gy (patrz kroki 2.1-2.4), a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%CO2 przez 24-48 godzin.
  3. Po upływie dwóch wybranych punktów czasowych umyj komórki PBS, wyrzuć go, a następnie dodaj 100 μl roztworu kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Umieścić komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 na 2 minuty, a następnie dodać pełną pożywkę w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.
  4. Zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl PBS.
  5. Wymieszać zawiesinę komórek z 50 μl roztworu barwnika błękitu trypanowego i inkubować mieszaninę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Policz wybarwione (nieżywotne) i niebarwione (żywotne) komórki za pomocą komory Bürkera.

5. Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER)

  1. Wysiew 5 × 105 komórek Caco-2 na tydzień przed napromienianiem w 6-dołkowych wkładkach do współhodowli (politereftalan etylenu (PET), 2 x 106 porów/cm2).
  2. Na 1 godzinę przed naświetlaniem zmierzyć TEER woltomierzem/omomierzem.
  3. Napromienij komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.4.
  4. Inkubować komórki Caco-2 w obecności/braku kokultury z PBMC w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  5. Przez pierwsze kilka godzin po napromieniowaniu należy mierzyć TEER co godzinę, a następnie co 3 godziny do 48 godzin.

6. Analiza Western Blot Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB i XIAP

  1. Wysiew 5 × 105 komórek na tydzień przed ekspozycją na promieniowanie rentgenowskie w 6-dołkowych płytkach do współhodowli (PET, 2 x 106 porów/cm2) i napromienić komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.4.
  2. Inkubować komórki Caco-2 w obecności/braku kokultury z PBMC w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  3. 48 godzin po napromienianiu przygotować lizaty komórkowe Caco-2 i PBMC, traktując komórki buforem do lizy komórek i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.
  4. Określić ilościowo całkowitą ilość białka metodą kwasu bicinchoninowego (BCA).
    UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.
  5. Zmieszać równe ilości białek ogółem z buforem do próbek Laemli z dodatkiem β-merkaptoetanolu (końcowe stężenie β-merkaptoetanolu wynosi 5%), podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut i wirować je w temperaturze 10 000 x g.
  6. Załaduj próbki do 4 - 20% prefabrykowanego żelu i wykonuj elektroforezę pod napięciem 120 V przez 1 godzinę. Przenieś białka na membranę z polifluorku winyldienu (PVDF).
  7. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania poprzez inkubację membrany PVDF w temperaturze pokojowej z 5% beztłuszczowego mleka w proszku (NFDM) w PBS z dodatkiem 0,2% Tween-20 (PBT). Umyć membranę trzykrotnie 10 ml 0,2% PBT przez 5 minut.
  8. Inkubować błonę z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem na noc w temperaturze 4 °C z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: anty-klaudyna-1, anty-ZO-1, anty-ZO-2, anty-afadina, anty-okludyna, anty-NF-kB, anty-XIAP i antyaktyna. Umyć membranę trzykrotnie 10 ml 0,2% PBT przez 5 minut.
  9. Inkubować błony z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Umyć membranę trzykrotnie 10 ml 0,2% PBT przez 5 minut.
  10. W temperaturze pokojowej wywołuj filmy fotograficzne, inkubując membrany za pomocą ulepszonego zestawu chemoluminescencyjnego.
  11. Pozyskaj filmy fotograficzne za pomocą systemu skanującego i określ ilościowo uzyskane pasma za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.
    UWAGA: Ocenę Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 i ZO-2 przeprowadza się w komórkach Caco-2. Ocena NF-kB i XIAP jest przeprowadzana w PBMC.
    UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Nie wdychać oparów, unikać uwalniania do środowiska oraz nosić środki ochrony indywidualnej i ochrony dróg oddechowych. W przypadku połknięcia należy natychmiast zasięgnąć porady lekarza.

7. Analiza statystyczna

  1. Aby określić, czy narażenie na promieniowanie i kokultura wywołują statystycznie istotne zaburzenia, należy przeprowadzić test dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z wielokrotnymi porównaniami dla powtarzanych pomiarów (z testami post-hoc Bonferroni w celu porównania średnich powtórzonych).
  2. Jeśli nie zaznaczono inaczej, oblicz istotność statystyczną (p) za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. Każda wartość jest średnią z ≥3 niezależnych eksperymentów ± błędem standardowym średniej (SEM).

Wyniki

Na tydzień przed eksperymentem komórki wysiewa się na porowatą membranę wkładki i pozostawia do wzrostu w kolejnych dniach. Poziom konfluencji można sprawdzać za pomocą mikroskopu odwróconego lub poprzez pomiar wartości TEER. W fazie wzrostu wartość TEER stale rośnie, dopóki cała porowata membrana nie zostanie pokryta komórkami i nie utworzą one zróżnicowanej monowarstwy komórkowej. W przypadku szybszej lub wolniejszej proliferacji komórek, eksperyment można rozpocząć w odpowiednio wcześniejszych lub późniejszych punktach czasowych po wysianiu. Po osiągnięciu konfluencji komórki są transportowane do urządzenia do napromieniowania, przy jednoczesnym minimalizowaniu stresu środowiskowego (temperatura lub pH), przed rozpoczęciem kokultury z PBMC lub bez nich, wysianymi w dolnej komorze (Rycina 1A), lub przed oceną proliferacji komórek Caco-2. Biorąc pod uwagę początkową gęstość wysiewu, w dniu 0 komórki powinny osiągnąć 100% konfluencji i utworzyć zróżnicowaną monowarstwę komórek nabłonkowych, co można zaobserwować poprzez plateau wartości TEER przedstawione na Rycina 1B. Po osiągnięciu takiego stanu wartość TEER pozostaje stosunkowo stała przez następny tydzień, pod warunkiem wymiany starej pożywki na świeżą co najmniej raz w tygodniu (Rycina 1B). Jak pokazano na Rycina 1C, test MTT nie wykazuje żadnych statystycznie istotnych zmian w statusie proliferacyjnym komórek Caco-2 ani po 24 h, ani po 48 h, niezależnie od otrzymanej dawki (do 10 Gy).

Inny wynik zaobserwowano w odniesieniu do krótkoterminowej śmiertelności komórek Caco-2. W obu punktach czasowych barwienie błękitem trypanu wykazało zależny od dawki wzrost śmiertelności komórek. Wyniki te wskazują na wyraźny efekt ekspozycji na promieniowanie, choć odsetki martwych komórek wydają się być bardzo niskie, szczególnie biorąc pod uwagę, że najwyższa podana dawka (10 Gy) powoduje śmierć zaledwie około 20% komórek (Rysunek 1D).

Próbki współhodowano z PBMC lub bez nich w dolnej komorze. Biorąc pod uwagę fakt, że PBMC nie otrzymały żadnego zewnętrznego bodźca do proliferacji, uznano, że 48-godzinny eksperyment będzie optymalny, aby uniknąć błędu wynikającego z obumierania PBMC. W związku z tym, począwszy od momentu bezpośrednio poprzedzającego napromieniowanie, wartości TEER były regularnie mierzone przez 48 h, aby monitorować ewentualne efekty przejściowe wywołane protokołem napromieniowania. Jak pokazano na Rysunku 1 E-F, wartości TEER przedstawiono jako zmiany względne w stosunku do stanu przed zabiegiem (które wynosiły od 1200 do 1500 Ω·cm2), aby lepiej uwidocznić zaburzenia wywołane napromieniowaniem rentgenowskim i/lub obecnością bądź brakiem PBMC we współhodowli. W obu przypadkach w pierwszym punkcie czasowym po ekspozycji na promieniowanie wyraźnie widoczny jest początkowy szczyt przejściowy, który można przypisać procedurze napromieniowania.

W przypadku braku ko-kultury z PBMC (Rysunek 1E), wartości TEER pozostają niemal stałe do 48 h, natomiast po ekspozycji na 10 Gy promieniowania rentgenowskiego komórki wykazują przedłużony spadek TEER rozpoczynający się 3 h po napromienianiu. Obecność PBMC całkowicie zmienia dynamikę czasową TEER (Rysunek 1F). Dla wszystkich dawek wyraźny spadek TEER jest obserwowalny od 3 h do około 30 h po napromienianiu, po czym TEER zdaje się stabilizować na stałej wartości (Rysunek 1F).

Poziomy ekspresji kompleksów połączeń ścisłych badano w lizatach komórek Caco-2 za pomocą analizy western blot. Komórki Caco-2 poddano promieniowaniu jonizującym (w dawkach 0, 2 i 10 Gy), a następnie hodowano samodzielnie lub w ko-kulturze z PBMC w dolnej komorze przez 48 h (jak pokazano na Rysunku 2A-F). Stwierdzono, że ekspresja zarówno Claudin-1, jak i Occludin (Rysunek 2A, 2B) nie uległa istotnym zmianom pod wpływem promieniowania rentgenowskiego i/lub ko-kultury z PBMC. Zamiast tego zaobserwowano duże wahania w przypadku białek rusztowaniowych ZO-1, ZO-2 i Afadin (Rysunek 2C, 2D, 2E). W szczególności spadek poziomu ekspresji ZO-2 zaobserwowano już po dawce 2 Gy w ko-kulturze z PBMC, podczas gdy w hodowli monokulturowej Caco-2 spadek ten wystąpił dopiero przy 10 Gy. Poziomy ekspresji Afadin uległy zmianie jedynie po naświetceniu dawką 10 Gy promieni rentgenowskich, z dodatkowym spadkiem w przypadku ko-kultury Caco-2 z PBMC.

Komórki PBMC w kokulturze z Caco-2 przeanalizowano pod kątem stanu zapalnego; w szczególności zbadano poziomy jądrowego czynnika transkrypcyjnego kB (NF-kB) oraz białka inhibitora apoptozy związanego z chromosomem X (XIAP) (Rysunek 2 G-I). Całkowita ilość NF-kB nie uległa zmianie w kokulturze z Caco-2 narażonym na różne dawki promieniowania (Rysunek 2G). Przeciwnie, poziomy XIAP były 4-krotnie wyższe w kokulturach przy dawkach 2 Gy i 10 Gy, choć duże zróżnicowanie wyników wymaga analizy większej liczby próbek w celu zmniejszenia tych wahań i uzyskania lepszej mocy statystycznej.

Jak pokazano na Rysunku 2F oraz 2I, obok oczekiwanej masy cząsteczkowej białka docelowego mogą pojawić się niektóre nieswoiste prążki. Jeśli prążki swoiste i nieswoiste nie są łatwo rozróżnialne, należy rozważyć zastosowanie innych stężeń przeciwciała oraz/lub BSA lub NFDM.

Układ napromieniowania komórek Caco-2, wykres TEER, wykresy aktywności metabolicznej i żywotności komórek, odpowiedź na dawkę.
Rycina 1. Ogólny układ eksperymentalny i makroskopowe efekty ekspozycji na promieniowanie i/lub kokulturę z PBMC. A) Schematyczny opis modelu kokultury. B) Wartości TEER mierzone codziennie od początkowego wysiewu komórek Caco-2 w celu oceny prawidłowego wzrostu i stanu różnicowania monowarstwy. C) Żywotność komórek i D) śmiertelność w komórkach Caco-2 poddanych działaniu promieni rentgenowskich (0, 2, 5 i 10 Gy). E) Pomiary TEER w komórkach Caco-2 napromieniowanych dawkami 0, 2 i 10 Gy promieni rentgenowskich hodowanych bez lub F) z PBMC. Każda wartość jest średnią z ≥3 niezależnych eksperymentów ± SEM. * p-val <0.05; ** p-val < 0.01; *** p-val < 0.001. Wykresy zaadaptowano z Morini et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza zależności dawka-odpowiedź promieniowania, wykresy ekspresji i Western bloty, badanie ekspresji białek.
Rycina 2. Wyniki Western blot lizatów Caco-2 i PBMC. Poziom ekspresji białek połączeń ścisłych (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) i Afadin (E)) w komórkach Caco-2 po ekspozycji na 0, 2 i 10 Gy promieniowania rentgenowskiego oraz w obecności/braku PBMC w ko-kulturze. Wartości zostały znormalizowane względem poziomu aktyny. Ilustracyjne filmy dla każdego białka połączeń ścisłych i warunków przedstawiono w panelu (F). Poziom ekspresji NF-κB (G) i XIAP (H) w komórkach PBMC w ko-kulturze z komórkami Caco-2. Reprezentatywne filmy dla NF-kB, XIAP i aktyny przedstawiono w panelu. Każda wartość jest średnią z ≥3 niezależnych eksperymentów ± SEM. Wykresy zaadaptowano z Morini et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Rak jelita grubego, występujący w dużej liczbie w krajach rozwiniętych, jest jedną z najczęstszych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w populacji. Zwykle leczy się go za pomocą chirurgii, chemioterapii i radioterapii1. W ramach leczenia radioterapią należy zwrócić szczególną uwagę na skutki ekspozycji zdrowych tkanek4; Co więcej, systematyczne badania nad związkiem między narażeniem na promieniowanie a układem odpornościowym mają zasadnicze znaczenie dla rozwoju podejść do radioimmunoterapii3.

Metodologia, którą przyjęliśmy w tej pracy, została dostosowana do badania komórek Caco-2 i przesłuchów PBMC. Skupiliśmy się na wpływie ekspozycji komórek nowotworowych na promieniowanie rentgenowskie, ale ten sam protokół można dostosować do badań ze środkami farmakologicznymi. Będąc bliższym warunkom fizjologicznym w odniesieniu do standardowej hodowli komórek, dużą zaletą tej metody jest możliwość całkowitego rozbioru złożonego systemu, biorąc pod uwagę możliwość analizy zarówno różnych typów komórek, jak i uwalniania cząsteczek sygnałowych do dwóch przedziałów samej kokultury. W ten sposób rutynowo stosowane metody biologiczne mogą pomóc w zrozumieniu mechanizmów związanych z wzajemnymi oddziaływaniami komórkowymi.

Wstępna charakterystyka wpływu promieniowania rentgenowskiego na komórki Caco-2 opierała się na dwóch uzupełniających się pomiarach, tj. teście kolorymetrycznym MTT i teście wykluczenia barwnika błękitu trypanowego. Pozornie niespójne wyniki można wytłumaczyć różnym ukierunkowaniem tych dwóch testów. MTT ocenia aktywność enzymów oksydoreduktazy, podczas gdy niebieski barwnik trypan opiera się na mechanizmie wykluczania żywych komórek.

Badanie wzajemnych oddziaływań Caco-2-PBMC wymaga stworzenia monowarstwy nabłonkowej, która może doprowadzić do całkowitego oddzielenia dwóch przedziałów kokultury. Możliwość wysiewu komórek Caco-2 we wstawce do kokultury pozwala na napromieniowanie tylko tej populacji komórek. Ponieważ kokultura rozpoczyna się po napromieniowaniu, nie ma stronniczości spowodowanej przypadkowym narażeniem na PBMC. Z tą konfiguracją należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia (lub zanieczyszczenia) monowarstwy komórkowej podczas ruchów wkładki z jednej płytki 6-dołkowej do drugiej. Starannie wykonane pomiary TEER są prostą i nieinwazyjną metodą badania przepuszczalności monowarstw. Test ten jest ściśle związany z konfiguracją kokultury i nie jest jedynym wyborem do badania przepuszczalności monowarstw. Pozwala na dobrą powtarzalność pomiarów, gdy jest dobrze skalibrowany ze świeżą, kompletną pożywką. Typowe testy koncentrują się na dyfuzji barwników chemicznych z górnego przedziału "wierzchołkowego" do dolnego "bazobocznego" (np. test izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu)16. Ponieważ jednak PBMC są obecne w przedziale podstawno-bocznym w tym badaniu, zdecydowaliśmy się uniknąć wprowadzania odczynników chemicznych w eksperymentach.

Spośród różnych technik przyjętych w tej pracy, pomiar TEER jest jedynym, który wymaga konfiguracji współhodowli17,18. Jednak inne popularne techniki laboratoryjne zapewniają bardziej pouczające wyniki, gdy są stosowane do komórek w kokulturze, ponieważ pozwalają na badanie konfiguracji bliższej warunkom fizjologicznym, a dane mają większe znaczenie biologiczne. Z drugiej strony należy zauważyć, że wykorzystanie komórek hodowanych na porowatym podłożu może prowadzić do pewnych trudności w operacjach potrzebnych do przygotowania próbek, takich jak liza komórek w celu przygotowania ekstraktów komórkowych do analizy za pomocą western blot.

System przyjęty w tym badaniu ma potencjał do dalszego udoskonalania, m.in. poprzez zastosowanie substancji zdolnych do odtworzenia środowiska macierzy zewnątrzkomórkowej. Spowoduje to jednak również zwiększenie złożoności systemu, a całkowite rozebranie konfiguracji będzie trudniejsze do osiągnięcia.

Zestawy do kohodowli komórek z pewnością stanowią potężne narzędzie dla postępu badań in vitro i dla zrozumienia złożonych systemów. Technika ta może przyczynić się do poszerzenia wiedzy na temat podstawowych mechanizmów, dostarczając nowych danych wejściowych do podstawowych badań naukowych nad sygnalizacją molekularną oraz z możliwymi zastosowaniami do modulacji aktywności układu odpornościowego w ramach onkologicznego klinicznego postępowania z pacjentem.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Włoski Instytut Fizyki Jądrowej (INFN) częściowo sfinansował tę pracę poprzez projekt INFN-MERIDIAN. Autorzy dziękują prof. Edoardo Milottiemu (Wydział Fizyki, Uniwersytet w Trieście, Włochy) za koordynację projektu INFN-MERIDIAN; Dr. Roberto Chignola (Wydział Biotechnologii, Uniwersytet w Weronie, Włochy) za dostarczenie komórek Caco-2, omomierza oraz za cenną pomoc i szkolenie. Dziękujemy również firmie Agnese Solari za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ThinCert
6-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych do płytek wielodołkowych		Greiner Bio-one657610Sprzęt
do hodowli komórkowych Płytka wielodołkowa, 6-dołkowa Greiner Bio-one657160Plastikowa
płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 24 dołk Greiner Bio-one662160Plastik
RPMI 1640 bez L-GlutaminyOdczynniki Lonza12-167F
Surowica bydlęca płoduOdczynniki LonzaDE14-801
L-glutamina 200 mMOdczynniki Lonza17-605C
  10K/10KLonza17-602EOdczynniki
CO2Heal ForceHF240Sprzęt
Ficoll Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771z odczynnikami
, 50 mL, PP, ze stożkowym dnem PlastikowaGreiner Bio-one227261
15 mL, PP, stożkowe dnoz tworzywa sztucznegoGreiner Bio-one188261
Sprzęt
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP3813Odczynniki
Kolba do hodowli komórkowych, 25 cm2, PSGreiner Bio-one690175Plastikowy
akcelerator liniowy Clinac 2100VarianCLINAC 2100C/DSprzęt
3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium bromek (MTT)Sigma-AldrichM5655Odczynniki
OdczynnikiSigma-AldrichD8418
Wielodołkowy czytnik płytekSprzęt doDV990BV6Trypan
Blue Roztwór 0,4 % Odczynniki AmrescoK940
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT4049Odczynniki
1,5 ml probówkiEppendorf0030125150Odczynniki
Millicell-ERS woltomierz/omomierz MilliporeMERS 00001Sprzęt
Bufor do lizy komórek (10x)Technologia sygnalizacji komórkowej9803Odczynniki
Bü rker HemocytometrSigma-AldrichBR719520Sprzęt
Zestaw do oznaczania ilościowego białek BCA OdczynnikiAbcam ab102536
2x Bufor do próbek Laemmli BioRad#1610737Odczynniki
2-merkaptoetanol Odczynniki BioRad#1610710
Accublock Cyfrowa Sucha KąpielLabnet International Inc.D1100Wyposażenie
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 dołków, 30 i mikro; LBioRad#4568093 Odczynniki
Mini-PROTEAN  Pionowe ogniwo do elektroforezy Tetra do mini żeli prefabrykowanych, 4-żeloweBioRad#1658004Sprzęt
PowerPac HC Zasilacz wysokoprądowyBioRad#1645052 sprzęt
Standardy blottingu Precision Plus Protein WesternC BioRad#1610385 Odczynniki
10x Bufor do biegania Tris/Glycine/SDSBioRad#1610732 Odczynniki
Trans-Blot  Pakiety transferowe Turbo Mini PVDFOdczynnikiBioRad#1704156
Trans-Blot  System Turbo Transfer SprzętBioRad#1704150Bloker
klasy Blotting Odczynniki BioRad#1706404
Tween-20Sigma-Aldrich93773Odczynniki
Claudin-1 (D5H1D) XP  Królik mAb Technologia sygnalizacji komórkowej#13255Odczynniki
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906Odczynniki
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb Technologia sygnalizacji komórkowej#8193Odczynniki
Przeciwciało ZO-2 Technologia sygnalizacji komórkowej#2847Odczynniki
Afadin (D1Y3Z) Technologiasygnalizacji komórkowej #13531Odczynniki
Przeciwciało anty-okludynoweMiliporeABT146Odczynniki
Przeciwciało anty-NF-kB p65 [E379]Abcamab32536Odczynniki
Przeciwciało anty-XIAP Abcamab21278Odczynniki
Amersham ECL Mysz IgG, Cały Ab sprzężony z HRP (od owiec)GE Healthcare Life SciencesNA931VOdczynniki
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (od osła)GE Healthcare Life SciencesNA934VOdczynniki
Clarity Western ECL Substrate, 200 mLBioRad#1705060 Odczynniki
Strumień opieki  Kodak  autoradiografia GBX wywoływacz/uzupełniaczSigma-AldrichP7042Odczynniki
Carestream  Kodak  autoradiografia GBX utrwalacz/uzupełniaczSigma-AldrichP7167Odczynniki
Carestream  Kodak  BioMax  folia lekkaSigma-AldrichZ370401Odczynniki
Gel Doc EZ SystemBioRad#1708270 sprzęt
Probówka rurka , Wirówka ThermoScientific CL31R# mAb królika

Bibliografia

  1. Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
  2. Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
  3. Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29(2016).
  4. Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
  5. Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505(2015).
  6. Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
  7. Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
  8. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  9. Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
  10. Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
  11. Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
  12. Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
  13. Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  14. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  15. Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
  16. Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
  17. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja PBMCnaświetlanie promieniami rentgenowskimipomiar TEERanaliza Western blottest MTTtest z błękitem trypanowymbiałka połączeń ścisłychsygnalizacja NF-kappa B
Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.