Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

Metodologia przyjęta w tej pracy została zaprojektowana do zbadania wzajemnych oddziaływań między komórkami raka jelita grubego a układem odpornościowym, wykorzystując układ bliższy warunkom fizjologicznym w porównaniu do normalnych dwuwymiarowych hodowli komórkowych.

Rak jelita grubego (CRC) jest uważany za trzeci najczęściej występujący rodzaj nowotworu, z ponad milionem przypadków na całym świecie (Global Cancer Observatory, Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem, Światowa Organizacja Zdrowia, http://gco.iarc.fr). Leczenie raka jelita grubego jest rutynowo przeprowadzane za pomocą operacji, chemioterapii lub radioterapii¹. W porównaniu z technikami inwazyjnymi, takimi jak chirurgia lub chemioterapia, radioterapia w dużej mierze pozwala uniknąć typowych szkodliwych reakcji ogólnoustrojowych wynikających z tych podejść klinicznych, dzięki miejscowemu dostarczaniu dawki promieniowania. Jednak skutki uboczne mogą wystąpić w otaczających zdrowych tkankach, wywołując stan zapalny z bezpośrednim uszkodzeniem zdrowych komórek i uszkodzeniem, w którym pośredniczą efekty nieukierunkowane^2,3,4. Koncentrując się na niepożądanych skutkach napromieniania podczas leczenia raka jelita grubego, należy zbadać dwa aspekty. Po pierwsze, mechanizmy odpowiedzialne za nieprzepuszczalność jelit mogą zostać zmienione przez dostarczanie promieniowania, co z kolei może powodować skutki uboczne z powodu zmienionego powstrzymywania populacji bakterii i parakomórkowego pasażu cząsteczek i substancji rozpuszczonych. Po drugie, obecność tkanki limfatycznej związanej z jelitami (GALT) działa jak placówka układu odpornościowego, z funkcją kontrolowania wzrostu bakterii i pośredniczenia w ogólnej odpowiedzi immunologicznej5^,6,7. Aby spełnić te funkcje, zachowana jest nieprzepuszczalność jelitowa dzięki funkcji kompleksów połączeniowych między błonami komórkowymi. Z tych powodów badano szkodliwe konsekwencje wywołane różnymi dawkami promieniowania rentgenowskiego w samych komórkach Caco-2 oraz w kokulturach z PBMC.

Chociaż prowadzenie badań nad hodowlami komórkowymi jest pierwszym punktem badań w badaniach biomedycznych, brak szczegółowej wiedzy na temat mechanizmów kierujących biologią komórki i wzajemnych interakcji między różnymi typami komórek może stać się krytyczny, gdy zbliżamy się do badania fizjologii organów, układów i aparatów, które nie mogą być łatwo odtworzone w laboratorium. Dlatego zdecydowaliśmy się przyjąć konfigurację wspólnej hodowli, pozwalającą zarówno na wspólne badanie dwóch populacji komórek, jak i na analizę aspektów związanych z mechanizmami międzykomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi.

Kokultura jest techniką wykorzystywaną podczas badania funkcji nabłonka i wzajemnych oddziaływań między różnymi typami komórek. W szczególności zastosowanie takiej techniki staje się w naszym przypadku obowiązkowe, ponieważ nabłonek składa się z komórek charakteryzujących się polarnością. W przypadku bariery jelitowej enterocyty wykazują dobrze zdefiniowaną polaryzację, z biegunami wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi normalnie oddzielonymi ze względu na obecność ścisłych cząsteczek adhezyjnych tworzących połączenie. Ta podział na przedziały jest potrzebny dla fizjologii tkanki, unikając transportu parakomórkowego i umożliwiając przejście tylko określonych cząsteczek. Ta funkcja jest oczywiście niemożliwa do odtworzenia przy użyciu normalnej konfiguracji hodowli komórek. Co więcej, przyjęcie układu kohodowlanego odtwarza obecność komórek odpornościowych tylko na powierzchni podstawno-bocznej, podczas gdy powierzchnia wierzchołkowa (odpowiadająca światłu jelita) nie styka się bezpośrednio z innymi komórkami.

Ostatnio linie komórkowe Caco-2 zyskały na znaczeniu jako model in vitro bariery jelitowej. Chociaż pochodzą z ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego, komórki Caco-2 zachowują zdolność różnicowania i tworzą funkcjonalną spolaryzowaną monowarstwę⁸, co pozwala na badanie właściwości błony komórkowej podczas uprawy we wstawce do wspólnej hodowli.

Ponieważ hodowla Caco-2 na porowatej błonie jest dobrze ugruntowanym modelem in vitro monowarstwy jelitowej, postępem stała się kokultura między Caco-2 a innymi komórkami. Ten układ był często stosowany do pomiaru przesłuchów między różnymi typami komórek⁹ i może być używany do rozwikłania zaburzonej odpowiedzi Caco-2 na bodźce egzogenne w jednoczesnej hodowli, w odniesieniu do Caco-2 hodowanego samodzielnie.

Wiele badań dotyczyło zachowania Caco-2 podczas wspólnej hodowli zarówno z niepatogennymi bakteriami, jak i komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej, aby wyjaśnić w szczególności wzajemne oddziaływanie z układem odpornościowym¹⁰. Pozo-Rubio i wsp.¹¹ badał ekspresję kilku cytokin w kokulturze Caco-2/PBMC z bifidobakteriami stymulującymi komórki Caco-2. Ich prace zwróciły uwagę na istotną modyfikację profili ekspresji cytokin w zależności od stymulacji bakteryjnej wykonywanej w obecności/braku PBMC. Ich wyniki prowadzą do wniosku, że obecność PBMC uwrażliwia Caco-2 na bifidobakterie.

Różne reakcje komórek Caco-2 na niepatogenne i chorobotwórcze bakterie zostały ocenione przez różne zespoły badawcze. Parlesak i wsp. ¹² wykazał immunosupresyjne działanie komórek Caco-2 na PBMC stymulowany przez Escherichia coli. Co więcej, Haller i wsp. ¹³ badał odpowiedź komórek Caco-2 stymulowanych zarówno lipopolisacharydem (LPS) z enteropatogennych bakterii E. coli spp., jak i nieenteropatogennych, tj. E.E. coli spp., Lactobacillus spp., wzmacniając przypuszczenie, że odpowiedź komórek Caco-2 ściśle zależy od obecności leukocytów w układzie kohodowlanym.

Przeprowadzając różne uzupełniające testy laboratoryjne (np. western blot, trans-nabłonkowy opór elektryczny, MTT, itp.), oprócz analizy różnych typów komórek hodowanych w kohodowli, cała metodologia obiecuje wyniki, które można uznać za bardziej reprezentatywne dla tego, co naprawdę dzieje się in vivo. Co więcej, taka konfiguracja umożliwia oddzielenie różnych przedziałów kokultury, umożliwiając nie tylko badanie zaangażowanych typów komórek, ale także międzykomórkowych cząsteczek sygnałowych uwalnianych w górnym i dolnym przedziale lub w obecności lub bez kokultury.

Następujący protokół obejmuje pobieranie ludzkiej krwi od zdrowych ochotników. Dawcy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed zapisaniem się. Procedura ta jest zgodna z Deklaracją Helsińską, a pobranie krwi zostało wykonane przez profesjonalnego asystenta medycznego.

1. Hodowla komórkowa i konfiguracja kokultury

1. Na tydzień przed napromienianiem należy przygotować zawiesinę komórek Caco-2 zawierającą 2,5 × 10⁵ komórek/ml w świeżej pożywce RPMI1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
2. Zasiać 2 ml zawiesiny komórkowej w sterylnych wkładkach do hodowli komórkowych o średnicy porów 1 μm dla płytek 6-dołkowych i umieścić wkładkę na płytce 6-dołkowej.
   UWAGA: Wkładki do hodowli komórkowych mogą wymagać aktywacji przez inkubację ze sterylnym kompletnym podłożem przed wysiewem komórek. W takim przypadku pożywki hodowlane należy wyrzucić i zastąpić je pożywką do zawieszania komórek.
3. Dodać 3 ml świeżej pożywki RPMI1640 uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny do każdej dolnej komory i hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotną atmosferą zawierającą 5% CO₂ .
4. W tym samym dniu, w którym dokonano napromieniania komórek Caco-2, należy pobrać ludzką krew pełną do dostępnych w handlu probówek o pojemności 6 ml pokrytych heparyną litową (rozmiar probówki: 13 x 100 mm).
5. Następnie wyizoluj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) za pomocą gradientu Ficoll. Aby oddzielić PBMC, umieść 25 ml Ficollu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i nałóż równą objętość krwi pełnej rozcieńczonej w stosunku 1:1 z RPMI1640 na powierzchnię Ficollu.
   UWAGA: Normalny, zdrowy dawca ma zwykle około 4 - 10 × 10⁶ PBMC/ml.
6. Odwirować probówki o pojemności 50 ml o stężeniu 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Delikatnie zebrać PBMC na granicy faz między Ficollem a osoczem przez aspirację pipetą Pasteura i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
8. Przemyć PBMC dwukrotnie, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirowując PBMC przy 250 x g przez 10 minut.
9. Hodowla PBMC przez maksymalnie 3-5 godzin w kolbach T25 cm² w kompletnych pożywkach RPMI1640, jak opisano powyżej, w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂,
   UWAGA: Zebrać PBMC w dniu eksperymentu i wysiać 2 × 10⁶ komórek/basenik, zawieszonych w 3 ml kompletnej pożywki RPMI1640, w dolnej komorze kokultury. Inserty z komórkami Caco-2 przenosi się do studzienek zawierających PBMC 30 minut po ich napromieniowaniu. PBMC pobrany z krwi pełnej nie może być utrzymywany w hodowli dłużej niż około 72 godzin, jeśli nie jest stymulowany np. fitohemaglutynina (PHA), po której dochodzi do utraty żywotności komórek.
   UWAGA: Jakość i bezpieczeństwo całej krwi i produktów krwiopochodnych musi być zagwarantowana podczas całego procesu.

2. Przygotowanie do napromieniowania

Uwaga: Napromienianie komórek Caco-2 zostało przeprowadzone na oddziale radioterapii Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pawia, Włochy) za pomocą akceleratora liniowego rutynowo stosowanego w leczeniu różnych typów nowotworów.

1. Ustaw energię promieniowania rentgenowskiego fotonów na szczyt 6 MV. Akcelerator liniowy działa w trybie pulsacyjnym (czas między dwoma kolejnymi impulsami wynosi około 4 ms; czas trwania pojedynczego impulsu około 5 μs przy natężeniu dawki do 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Umieścić 6-dołkowe płytki zawierające wkładki z Caco-2 na trajektorii promieni rentgenowskich na arkuszu pleksiglasu o grubości 1,4 cm (odpowiadającym odległości nieco większej niż nagromadzenie zużytego promieniowania) w odległości 100 cm od źródła promieniowania.
3. Umieść bolus o grubości 0,5 cm na każdej próbce przed napromienianiem, aby zagwarantować równowagę składowej promieniowania wstecznie rozproszonego i naładowanych cząstek.
4. Napromienić komórki (dawki w zakresie 2 - 10 Gy) płaskim i symetrycznym (± 2%) polem promieniowania o wymiarach 20 x 20^cm2 i dawką 3 Gy/min.
   UWAGA: Kontrolne komórki napromieniowane "pozorowanymi" poddano takim samym warunkom proceduralnym jak komórki napromieniane, bez wchodzenia do pomieszczenia napromieniania (otrzymana dawka: 0 Gy).
   UWAGA: Urządzenia wytwarzające promieniowanie jonizujące mogą być używane wyłącznie przez wyspecjalizowany personel.

3. Test żywotności komórek (test MTT)

Uwaga: Aktywność metaboliczną komórek Caco-2 oceniono za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT)¹⁴.

1. Nasiona 2 ×^{10 5} Caco-2 w 24-dołkowej płytce 24 godziny przed napromienianiem w 1,25 ml kompletnej pożywki.
2. Napromienić komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.4, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ .
3. 21 godzin po napromienianiu dodać 100 μl 5 mg/ml roztworu MTT i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ przez 3 godziny.
4. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 1 ml PBS.
5. Rozpuścić kryształy formazanu, dodając 500 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdej studzienki i ocenić absorbancję za pomocą wielodołkowego czytnika płytek przy λ = 570 nm.
6. Powtórzyć kroki 3.3 - 3.4 - 3.5 - 3.6 po 45 godzinach od napromieniowania.
   UWAGA: Wyniki są wyświetlane jako perturbacja od odpowiedniego stanu pozorowanego, który jest znormalizowany do 100%.
   UWAGA: DMSO jest środkiem łatwopalnym i drażniącym dla skóry, oczu i układu oddechowego (GHS07, GHS08). W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć je dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. MTT jest środkiem drażniącym skórę, oczy i układ oddechowy (GHS07, GHS08). W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza.

4. Procent oznaczania komórek zdolnych do życia (test wykluczenia barwnika błękitu trypanowego)

UWAGA: Procent żywotnych komórek został oceniony za pomocą testu wykluczenia barwnika błękitu trypanowego.

1. Nasiona 2 ×^{10 5} Caco-2 w płytce 24-dołkowej 24 godziny przed napromienianiem w 1,25 ml kompletnej pożywki.
2. Napromienić komórki dawkami w zakresie 0-10 Gy (patrz kroki 2.1-2.4), a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%_CO2 przez 24-48 godzin.
3. Po upływie dwóch wybranych punktów czasowych umyj komórki PBS, wyrzuć go, a następnie dodaj 100 μl roztworu kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Umieścić komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ na 2 minuty, a następnie dodać pełną pożywkę w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej.
4. Zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl PBS.
5. Wymieszać zawiesinę komórek z 50 μl roztworu barwnika błękitu trypanowego i inkubować mieszaninę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Policz wybarwione (nieżywotne) i niebarwione (żywotne) komórki za pomocą komory Bürkera.

5. Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER)

1. Wysiew 5 × 10⁵ komórek Caco-2 na tydzień przed napromienianiem w 6-dołkowych wkładkach do współhodowli (politereftalan etylenu (PET), 2 x 10⁶ porów/cm²).
2. Na 1 godzinę przed naświetlaniem zmierzyć TEER woltomierzem/omomierzem.
3. Napromienij komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.4.
4. Inkubować komórki Caco-2 w obecności/braku kokultury z PBMC w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ .
5. Przez pierwsze kilka godzin po napromieniowaniu należy mierzyć TEER co godzinę, a następnie co 3 godziny do 48 godzin.

6. Analiza Western Blot Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB i XIAP

1. Wysiew 5 × 10⁵ komórek na tydzień przed ekspozycją na promieniowanie rentgenowskie w 6-dołkowych płytkach do współhodowli (PET, 2 x 10⁶ porów/cm²) i napromienić komórki zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.4.
2. Inkubować komórki Caco-2 w obecności/braku kokultury z PBMC w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ .
3. 48 godzin po napromienianiu przygotować lizaty komórkowe Caco-2 i PBMC, traktując komórki buforem do lizy komórek i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.
4. Określić ilościowo całkowitą ilość białka metodą kwasu bicinchoninowego (BCA).
   UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.
5. Zmieszać równe ilości białek ogółem z buforem do próbek Laemli z dodatkiem β-merkaptoetanolu (końcowe stężenie β-merkaptoetanolu wynosi 5%), podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut i wirować je w temperaturze 10 000 x g.
6. Załaduj próbki do 4 - 20% prefabrykowanego żelu i wykonuj elektroforezę pod napięciem 120 V przez 1 godzinę. Przenieś białka na membranę z polifluorku winyldienu (PVDF).
7. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania poprzez inkubację membrany PVDF w temperaturze pokojowej z 5% beztłuszczowego mleka w proszku (NFDM) w PBS z dodatkiem 0,2% Tween-20 (PBT). Umyć membranę trzykrotnie 10 ml 0,2% PBT przez 5 minut.
8. Inkubować błonę z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem na noc w temperaturze 4 °C z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: anty-klaudyna-1, anty-ZO-1, anty-ZO-2, anty-afadina, anty-okludyna, anty-NF-kB, anty-XIAP i antyaktyna. Umyć membranę trzykrotnie 10 ml 0,2% PBT przez 5 minut.
9. Inkubować błony z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Umyć membranę trzykrotnie 10 ml 0,2% PBT przez 5 minut.
10. W temperaturze pokojowej wywołuj filmy fotograficzne, inkubując membrany za pomocą ulepszonego zestawu chemoluminescencyjnego.
11. Pozyskaj filmy fotograficzne za pomocą systemu skanującego i określ ilościowo uzyskane pasma za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.
    UWAGA: Ocenę Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 i ZO-2 przeprowadza się w komórkach Caco-2. Ocena NF-kB i XIAP jest przeprowadzana w PBMC.
    UWAGA: β-merkaptoetanol jest toksyczny (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Nie wdychać oparów, unikać uwalniania do środowiska oraz nosić środki ochrony indywidualnej i ochrony dróg oddechowych. W przypadku połknięcia należy natychmiast zasięgnąć porady lekarza.

7. Analiza statystyczna

1. Aby określić, czy narażenie na promieniowanie i kokultura wywołują statystycznie istotne zaburzenia, należy przeprowadzić test dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z wielokrotnymi porównaniami dla powtarzanych pomiarów (z testami post-hoc Bonferroni w celu porównania średnich powtórzonych).
2. Jeśli nie zaznaczono inaczej, oblicz istotność statystyczną (p) za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. Każda wartość jest średnią z ≥3 niezależnych eksperymentów ± błędem standardowym średniej (SEM).

Na tydzień przed eksperymentem, komórki są wysiewane na porowatą membranę wkładu i pozostawiane do wzrostu przez kolejne dni. Poziom zbiegu można sprawdzić za pomocą mikroskopu odwróconego lub poprzez pomiar wartości TEER. Rzeczywiście, w fazie wzrostu TEER rośnie, aż cała porowata błona zostanie pokryta komórkami i utworzą one zróżnicowaną monowarstwę komórkową. Jeśli komórki rozmnażają się szybciej/wolniej, eksperyment może rozpocząć się wcześniej/później po zasianiu. W przypadku zbiegu, komórki są następnie przenoszone do zakładu napromieniania, minimalizując przenoszony stres środowiskowy (temperatura lub pH), przed rozpoczęciem kohodowli z/bez PBMC, wysiewanymi w dolnej komorze (Rysunek 1A) lub oceniając proliferację komórek Caco-2. Biorąc pod uwagę początkową gęstość wysiewu, w dniu 0 komórki powinny osiągnąć 100% konfluencji i utworzyć zróżnicowaną monowarstwę komórek nabłonkowych, którą można zaobserwować przez plateau w TEER pokazanym na Rysunek 1B. Gdy komórki osiągną taki status, wartość TEER jest utrzymywana na względnie stałym poziomie przez następny tydzień, o ile stara pożywka hodowlana zostanie zastąpiona świeżą pożywką, co najmniej raz w tygodniu (Rysunek 1B). Jak pokazano w Rysunek 1C, test MTT nie wykazuje żadnej statystycznie istotnej zmiany statusu proliferacyjnego komórek Caco-2 ani po 24 godzinach, ani po 48 godzinach, niezależnie od otrzymanej dawki (do 10 Gy).

Zaobserwowano inny wynik dotyczący krótkoterminowej śmiertelności komórek Caco-2. W obu punktach czasowych barwienie błękitem trypanowym wykazuje zależny od dawki wzrost śmiertelności komórek. Wyniki te pokazują wyraźny wpływ ekspozycji na promieniowanie, chociaż odsetek martwych komórek wydaje się być bardzo niski, szczególnie jeśli weźmie się pod uwagę, że najwyższa dostarczona dawka (10 Gy) powoduje tylko około 20% śmierci komórki (Rysunek 1D).

Próbki były hodowane wspólnie z PBMC lub bez niego w dolnej komorze. Biorąc pod uwagę fakt, że PBMC nie otrzymał żadnego zewnętrznego bodźca do proliferacji, 48-godzinny eksperyment uznano za idealny, aby uniknąć zaniku uprzedzeń wprowadzonych przez PBMC. W związku z tym, począwszy od momentu bezpośrednio poprzedzającego napromienianie, TEER był regularnie mierzony przez 48 godzin, aby śledzić możliwe przejściowe skutki spowodowane protokołem napromieniania. Jak pokazano na Rysunek 1 E-F, wartości TEER są przedstawione jako względne zmiany w stosunku do stanu wstępnie poddanego obróbce (które były rzędu 1200 - 1500 Ω·cm2), aby lepiej podkreślić perturbację wywołaną promieniowaniem rentgenowskim i/lub obecność/brak PBMC w kokulturze. W obu przypadkach początkowy przejściowy szczyt może być wyraźnie widoczny w pierwszym punkcie czasowym po ekspozycji na promieniowanie, co można przypisać procedurze napromieniania.

Gdy nie jest w kokulturze z PBMC (Rysunek 1E), wartości TEER są prawie stałe do 48 godzin, podczas gdy po 10 Gy prześwietleń rentgenowskich komórki wykazują przedłużony spadek TEER, począwszy od 3 godzin po napromieniowaniu. Obecność PBMC całkowicie modyfikuje dynamikę czasową TEER (Rysunek 1F). Dla wszystkich dawek wyraźnie obserwuje się zmniejszenie TEER od 3 godzin do około 30 godzin po napromieniowaniu, gdy TEER wydaje się utrzymywać na stałej wartości (Rysunek 1F).

Poziomy ekspresji kompleksów połączeń ścisłych zostały zbadane w lizatach komórek Caco-2 za pomocą testu western blot. Komórki Caco-2 wystawiono na działanie promieniowania jonizującego (w dawkach 0, 2 i 10 Gy), a następnie hodowano samodzielnie lub w kokulturze z PBMC w dolnej komorze przez 48 godzin (jak pokazano na Rysunek 2A-F). Stwierdzono, że zarówno Claudin-1, jak i Occludin (Figura 2A, 2B) nie uległy znaczącym zmianom w wyniku prześwietlenia rentgenowskiego i / lub kohodowli z PBMC. Duże fluktuacje zaobserwowano natomiast w białkach rusztowania ZO-1, ZO-2 i Afadin (Rysunek 2C, 2D, 2E). W szczególności zmniejszenie poziomów ekspresji ZO-2 obserwuje się już po 2 Gy w kohodowli z PBMC i dopiero po 10 Gy, gdy Caco-2 rosły samodzielnie. Poziomy ekspresji afadyny zmieniają się natomiast dopiero po 10 Gy promieniowania rentgenowskiego, z dodatkowym zmniejszeniem, gdy Caco-2 są współhodowane z PBMC.

PBMC współhodowane z Caco-2 zostały przeanalizowane pod kątem stanu zapalnego, w szczególności zbadano poziomy jądrowego czynnika transkrypcyjnego kB (NF-kB) i inhibitora białka apoptozy sprzężonego z chromosomem X (XIAP) (Rysunek 2 G-I). Całkowita ilość NF-kB nie została zmieniona przez kokulturę z Caco-2 wystawioną na różne dawki promieniowania (Rysunek 2G). Wręcz przeciwnie, poziomy XIAP były 4-krotnie regulowane w górę zarówno w kokulturach 2 Gy, jak i 10 Gy, chociaż duże różnice wymagają większej liczby analizowanych próbek w celu zmniejszenia takich wahań i uzyskania lepszej mocy statystycznej.

Jak pokazano w Rysunek 2F i 2I, niektóre niespecyficzne prążki mogą pojawić się obok oczekiwanej masy cząsteczkowej interesującego nas białka. O ile prawdziwe i niespecyficzne prążki nie są łatwe do odróżnienia, należy wziąć pod uwagę różne stężenia przeciwciał i/lub BSA lub NFDM.

Rysunek 1. Ogólna konfiguracja doświadczalna i makroskopowe skutki narażenia na promieniowanie i/lub kohodowli PBMC. A) Schematyczne przedstawienie modelu kokultury. B) Wartości TEER mierzone codziennie od początkowego nasienia komórek Caco-2 w celu oceny prawidłowego stanu wzrostu i różnicowania monowarstwy. C) Żywotność komórek i D) śmiertelność w Caco-2 wystawionym na działanie promieni rentgenowskich (0, 2, 5 i 10 Gy). E) Pomiary TEER w komórkach Caco-2 napromieniowanych 0, 2 i 10 Gy promieniami rentgenowskimi hodowanymi bez lub F) PBMC. Każda wartość jest średnią z ≥3 niezależnych eksperymentów ± SEM. * p-val <0,05; ** p-va l< 0,01; p-val < 0,001. Wykresy zaczerpnięte z Morini et al. 15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Wyniki Western Blot lizatów Caco-2 i PBMC. Poziom ekspresji białek połączeń ścisłych (Claudin-1 (A), Okludyna (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) i Afadin (E)) w Caco-2 po 0, 2 i 10 Gy promieniowania rentgenowskiego oraz w obecności/braku PBMC w kohodowli. Wartości są znormalizowane na poziomie aktyny. Filmy ilustracyjne dla każdego białka i warunków połączenia ścisłego przedstawiono w panelu (F). Poziom ekspresji NF-κB (G) i XIAP (H) w PBMC hodowanych jednocześnie z komórkami Caco-2. Reprezentatywne filmy dla NF-kB, XIAP i Actin są pokazane w panelu. Każda wartość jest średnią z ≥3 niezależnych eksperymentów ± SEM. Wykresy zaczerpnięte z Morini et al. 15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.