Artykuł metodologiczny

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56911

⸱

7 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology, University of Miami

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Staje się coraz bardziej jasne, że aktywność obwodów nerwowych u zachowujących się zwierząt znacznie różni się od tej obserwowanej u zwierząt znieczulonych lub unieruchomionych. Wysoce czułe, genetycznie kodowane fluorescencyjne reportery Ca2+ zrewolucjonizowały rejestrację aktywności komórek i synaps przy użyciu nieinwazyjnych podejść optycznych u zachowujących się zwierząt. W połączeniu z technikami genetycznymi i optogenetycznymi można zidentyfikować mechanizmy molekularne, które modulują aktywność komórek i obwodów podczas różnych stanów zachowania.

Tutaj opisujemy metody ratiometrycznego obrazowania Ca2+ pojedynczych neuronów u swobodnie zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans. Demonstrujemy prostą technikę montażu, która delikatnie nakłada robaki rosnące na standardowym bloku agarowym z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) szklanym szkiełkiem nakrywkowym, umożliwiając rejestrowanie zwierząt w wysokiej rozdzielczości podczas nieograniczonego ruchu i zachowania. Dzięki tej technice używamy czułego reportera Ca2 + GCaMP5 do rejestrowania zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2 + w serotoninergicznych neuronach hermafrodytycznych (HSN), gdy kierują one zachowaniem związanym ze składaniem jaj. Poprzez koekspresję mCherry, niewrażliwego na Ca2+ białka fluorescencyjnego, możemy śledzić położenie HSN w zakresie ~ 1 μm i korygować wahania fluorescencji spowodowane zmianami ostrości lub ruchu. Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu w podczerwieni pozwala na rejestrowanie zachowań i śledzenie zwierząt za pomocą zmotoryzowanego stolika. Integrując te mikroskopijne techniki i strumienie danych, możemy rejestrować aktywność Ca2+ w obwodzie składania jaj C. elegans w miarę jego przechodzenia między stanami nieaktywnego i aktywnego zachowania w ciągu kilkudziesięciu minut.

Wprowadzenie

Głównym celem neuronauki jest zrozumienie, w jaki sposób neurony komunikują się w obwodach, aby kierować zachowaniem zwierząt. Obwody neuronalne integrują szereg różnych sygnałów sensorycznych w celu zmiany aktywności obwodu, napędzając w ten sposób zmiany behawioralne niezbędne zwierzętom do reagowania na ich środowisko. Nicień, C. elegans, ma prosty układ nerwowy z 302 neuronami, których połączenia synaptyczne zostały całkowicie zmapowane1. Dodatkowo, geny kodujące białka zaangażowane w neuroprzekaźnictwo są wysoce konserwatywne między C. elegans a ssakami2. Pomimo anatomicznej prostoty układu nerwowego, wykazuje złożony repertuar zachowanych zachowań, zapewniając żyzną platformę do zrozumienia, w jaki sposób neurony regulują zachowanie3.

C. elegans jest podatny na zastosowanie szerokiej gamy podejść, takich jak manipulacja genetyczna, laserowa ablacja komórek, techniki elektrofizjologiczne, a także obrazowanie optyczne in vivo4,5. Ostatnie badania stworzyły szczegółowe mapy głównych systemów sygnalizacji neuroprzekaźników u C. elegans, w tym cholinergicznych i GABA-ergicznych sieci neuronalnych. Badania te, wraz z trwającymi badaniami mającymi na celu mapowanie ekspresji wszystkich neuronalnych receptorów sprzężonych z białkiem G, stawiają ten model w wyjątkowej pozycji do wykorzystania bardzo szczegółowych map strukturalnych i funkcjonalnych połączeń neuronalnych, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób te różne neuroprzekaźniki sygnalizują przez różne receptory i skale czasowe, aby sterować różnymi aspektami zachowania zwierząt.

Aby badać dynamiczne wzorce aktywności neuronalnej w dowolnym systemie, niezbędnym warunkiem wstępnym jest opracowanie solidnych metodologii rejestrowania aktywności w pojedynczych neuronach lub całych obwodach podczas zachowań. Szczególnie ważna jest możliwość stosowania takich podejść optycznych do wizualizacji aktywności presynaptycznej, która napędza fuzję pęcherzyków synaptycznych. Szybkie i bardzo czułe reportery fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego Ca2+, wraz z rosnącą dostępnością czułych fotodetektorów, zrewolucjonizowały rejestrację aktywności komórek i synaps u obudzonych, żywych zwierząt podczas zachowania. Ponieważ głównym wynikiem synaptycznej aktywności elektrycznej jest regulacja kanałów Ca2 +, uważa się, że zmiany w wewnątrzkomórkowym Ca2 + wiernie oddają behawioralnie istotne zmiany w aktywności komórki.

W tym badaniu prezentujemy podejście do wykonywania ratiometrycznego obrazowania Ca2+ w serotoninergicznym neuronach ruchowych HSN, które promują zachowania związane ze składaniem jaj u C. elegans6,7. Podejście to opiera się na wcześniejszych wysiłkach mających na celu wizualizację aktywności Ca2+ u C. elegans i obwodu składania jaj podczas zachowania5,8,9,10,11. Metoda pozwala na jednoczesne skorelowanie obserwowanych zmian w aktywności komórek/obwodów ze zdarzeniami związanymi ze składaniem jaj, a także zmianami w stanie lokomotorycznym zwierząt. Chociaż używamy tego podejścia do badania aktywności u dorosłych robaków, niepublikowane prace z naszego laboratorium pokazują, że podejście to można rozszerzyć również na młode zwierzęta w czwartym stadium larwalnym (L4). Jest prawdopodobne, że aktywność innych neuronów C. elegans, które funkcjonują w odrębnych obwodach i zachowaniach, powinna być podobnie dostępna za pomocą tej techniki. Inne niedawno opracowane szybkie wskaźniki Ca2+ z nienakładającymi się widmami emisji12,13,14,15,16, narzędzia optogenetyczne17, oraz genetycznie kodowane wskaźniki optyczne napięcia membrany18, powinny pozwolić nam na przeprowadzenie wnikliwych "całkowicie optycznych" badań nad tym, w jaki sposób zmiany w aktywności obwodów nerwowych napędzają różne stany zachowania.

Protokół

1. Szczepy, pożywki hodowlane i montowanie zwierząt

  1. Hoduj robaki C. elegans w temperaturze 20 °C na standardowych 60-milimetrowych płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) obsianych pokarmem bakteryjnym OP50 E. coli19.
  2. Przygotuj dwa plazmidy dla każdego interesującego promotora specyficznego dla komórki: jeden, napędzający ekspresję GCaMP5 do rejestrowania wewnątrzkomórkowego Ca2+, a drugi, napędzający ekspresję mCherry, aby umożliwić ratiometryczną kwantyfikację zmian fluorescencji GCaMP5 i uprościć znajdowanie i pomiar obiektów.
    UWAGA: Obrazowanie ratiometryczne GCaMP5:mCherry koryguje fluktuacje fluorescencji GCaMP5, które wynikają ze zmian ostrości i ruchu zwierząt, a nie rzeczywistych zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2+.
  3. Wstrzyknij plazmidy wyrażające GCaMP5 i mCherry wraz z widocznym plazmidem markera ratunkowego pL15EK do gonad zmutowanych zwierząt LX1832 lite-1 (ce314), lin-15 (n765ts) X i odzyskaj zwierzęta inne niż Muv lin-15 (+) z ekspresją GCaMP5 i mCherry z trans20,21,22. Użyj zmutowanego tła lite-1, aby zmniejszyć unikanie niebieskiego światła23,24.
  4. Integracja transgenów z chromosomami w celu zmniejszenia mozaicyzmu i uproszczenia generowania złożonych zmutowanych szczepów25.
    UWAGA: Opisany tutaj szczep LX2004 przenosi zintegrowany transgen o wysokiej kopii, który eksprymuje GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora nlp-3 (patrz Tabela materiałów)26,27,28,29. Stwierdzono, że promotor nlp-3 napędza silną ekspresję w HSN późnego L4 i dorosłych zwierząt, nie powodując znaczących wad w rozwoju HSN lub zachowaniu związanym ze składaniem jaj w porównaniu z innymi testowanymi promotorami (np. TPH-1, EGL-6 i UNC-86). Ten szczep i inne, które wyrażają GCaMP5 i mCherry w neuronach ruchowych rdzenia brzusznego (VC), mięśniach sromu i komórkach neuroendokrynnych uv1 są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center, a szczegóły ich budowy zostały opisane27.
  5. Nałóż pokarm bakteryjny OP50 z płytki agarowej NGM z nasionami na dno kilofa z platynowymi robakami i użyj go do przeniesienia ~ 20 późnych zwierząt L4 LX2004, które wykazują ekspresję GCaMP5 i mCherry w HSN z promotora nlp-3. Upewnij się, że rozwijający się srom pojawia się w mikroskopie stereoskopowym jako wyraźna ciemna plama otoczona białym półksiężycem. Inkubować zwierzęta w temperaturze 20 °C przez 24–40 godzin.
  6. Po inkubacji nałóż OP50 na zbiór i przenieś ~ 3 robaki na niezasianą płytkę NGM, pozostawiając niewielką ilość pokarmu, aby robaki mogły się nimi żywić podczas obrazowania. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo pokarmu, ponieważ zbyt mało pokarmu bakteryjnego zachęci robaki do oddalania się od środka talerza, podczas gdy zbyt dużo pokarmu zwiększy fluorescencję tła i spowoduje niedotlenienie.
  7. Użyj płaskiej, zaokrąglonej szpatułki, aby wyciąć kawałek o wymiarach ~ 20 mm x 20 mm z płytki zawierającej robaki i przenieś kawałek zadrukowaną stroną do dołu na środek czystego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 60 mm #1.5 (Rysunek 1). Rozpocznij aplikację z jednej strony, aby pęcherzyki nie zostały uwięzione pod szkiełkiem nakrywkowym i nie zakłócały obrazowania. Nałóż szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm #1 na wierzch kawałka, aby zmniejszyć przywieranie i parowanie.

2. Konfiguracja sprzętu i oprzyrządowania

  1. Umieść inscenizowane, transgeniczne robaki na stoliku mikroskopu odwróconego z obiektywem planapochromatycznym o aperturze 20x ≥ 0,7 z aperturą numeryczną, zmotoryzowanym stolikiem XY sterowanym za pomocą joysticka, rozdzielaczem obrazu i filtrami fluorescencyjnymi do jednoczesnego wzbudzenia i emisji GCaMP5 i mCherry, kamerami do obrazowania fluorescencyjnego i obrazowania w podczerwieni w jasnym polu oraz systemem oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) (Rysunek 2A).
    UWAGA: Rozdzielacz wiązki 80/20 wysyła 80% sygnału obrazu do kamery fluorescencyjnej i 20% do kamery jasnego pola. Można również użyć mikroskopu pionowego, ale w tym przypadku fragment NGM powinien być umieszczony między szkiełkiem podstawowym a dużym szkiełkiem nakrywkowym.
    1. Użyj okularów lornetkowych, aby wybrać robaka do obrazowania. Po wybraniu zwierzęcia wsuń filtr podczerwieni na miejsce nad skraplaczem.
  2. Wyzwalacze logiki tranzystor-tranzystor (TTL)
    1. Podłącz koncentryczne z każdej z trzech linii wyjściowych wyzwalacza TTL w kamerze fluorescencyjnej. Podłącz pierwsze wyjście do wejścia BNC #3 systemu oświetlenia LED.
    2. Podłącz drugie wyjście do adaptera BNC "bananowego" za pomocą zielonych i brązowych przewodów z 8-pinowego złącza GPIO biegnącego odpowiednio do wejścia GPIO #3 (pin 4) i masy (pin 5) kamery na podczerwień.
    3. Podłącz trzecie wyjście do adaptera BNC "bananowego" z przewodami połączeniowymi biegnącymi do wejścia cyfrowego #8 i masy w cyfrowym urządzeniu akwizycyjnym (Rysunek 2B).
  3. Cyfrowe urządzenie akwizycyjne (DAQ)
    1. Podłącz płytkę mikrokontrolera DAQ (patrz tabela materiałów) do komputera za pomocą USB. Zaktualizuj oprogramowanie układowe za pomocą standardowego protokołu Firmata (patrz tabela materiałów) i skonfiguruj port USB do komunikacji z prędkością 57600 bodów.
  4. Diody led
    1. Uruchom oprogramowanie sterownika LED (patrz tabela materiałów). Przełącz tryb wyzwalania z "Ciągły" na "Bramkowany" i wybierz kanał wyzwalania "3" dla diod LED 470 i 590 nm.
    2. Włącz i wprowadź moc LED dla każdej diody LED (np. ustaw diodę LED 470 nm na 20%, a diodę LED 590 nm na 40%).
  5. Uruchom skrypt komunikacji etapu szeregowego "XY-stage-final" w Bonsai (zobacz tabelę materiałów)30. Kliknij szary węzeł 'CsvWriter' i wybierz folder, w którym chcesz zapisać nagrane informacje o etapie X i Y (Rysunek 3). Naciśnij zielony grot strzałki na pasku narzędzi, aby zainicjować DAQ.
    UWAGA: Skrypt rozpocznie rejestrowanie pozycji X i Y stage, gdy kamera fluorescencyjna wyśle sygnał TTL. Ten skrypt wyprowadza cztery kolumny danych: numer ramki, pozycję X (μm), pozycję Y (μm) i interwał między ramkami (s).
  6. W oprogramowaniu do nagrywania kamery na podczerwień (patrz Spis materiałów) w sekcji "Niestandardowe tryby wideo" wybierz "Tryb 1" (binning 2 x 2; 1,024 x 1,024 pikseli) i "Format pikseli Raw 8". W sekcji "Trigger / Strobe" ustaw linię wejściową wyzwalacza (GPIO) na "3", polaryzację na "High", "Mode" na "14". Przełącz opcję "Włącz", aby zatrzymać akwizycję klatek do momentu odebrania sygnału wyzwalającego TTL.
    1. Pozostawiając to okno otwarte, kliknij czerwony przycisk "Nagraj" na głównym pasku narzędzi widoku kamery. Wybierz folder, w którym mają zostać zapisane sekwencje obrazów. Wybierz tryb nagrywania "Buforowany" i zapisz "Obrazy" w formacie JPEG. Kliknij "Rozpocznij nagrywanie", aby zainicjować przejęcie.
  7. Kamera fluorescencyjna i rozdzielacz obrazu
    UWAGA: Kanały fluorescencyjne GCaMP5 i mCherry muszą być pobierane jednocześnie, aby zapewnić prawidłową rejestrację obrazu do ilościowego pomiaru ratiometrycznego. Rozdzielacz obrazu umożliwia dwukanałową akwizycję fluorescencji GCaMP5 i mCherry na jednym czujniku.
    1. W zakładce "Przechwytywanie" w oprogramowaniu do akwizycji obrazu (patrz tabela materiałów) ustaw czas ekspozycji na 10 ms, binning na 4x i głębię obrazu na 16 bitów. Wybierz wyśrodkowaną podtablicę kamery o szerokości 512 pikseli i wysokości 256 pikseli. Kliknij "Pokaż opcje wyzwalacza wyjściowego" i ustaw wszystkie wyzwalacze na "Pozytywne".
      UWAGA: DAQ może czasami przegapić wyzwalacze TTL, jeśli są one wygaszone 10 ms lub mniej.
    2. Upewnij się, że "Wyzwalacz 1" i "Wyzwalacz 2" są ustawione na "Ekspozycja", podczas gdy "Wyzwalacz 3" jest ustawiony na "Programowalny" z "Okresem" 25 ms. Na karcie "Sekwencja" wybierz "Upływ czasu" z "Opóźnieniem pola1" wynoszącym 50 ms, aby zbierać obrazy z częstotliwością 20 Hz. Wybierz opcję "Zapisz w tymczasowym buforze".
  8. Wzmocnienie PMT i intensywność lasera podczas trójkanałowego obrazowania konfokalnego
    1. Ustaw wzmocnienie PMT tak, aby fluorescencja tła znajdowała się na poziomie nieco powyżej minimum (poziom czerni). Zwiększaj moc lasera 561 nm (zielonego) do momentu, gdy na końcu presynaptycznym w kanale mCherry zostanie zaobserwowany pojedynczy nasycony piksel 12-bitowy lub 16-bitowy.
    2. Dostosuj intensywność lasera 488 nm (niebieskiego) tak, aby fluorescencja GCaMP5 była widoczna tylko na końcu presynaptycznym nad tłem. To niskie ustawienie zapobiega nasyceniu pikseli GCaMP5, gdy fluorescencja wzrasta w odpowiedzi na silne stany nieustalone Ca2+. Otwórz otwór konfokalny do końca, aby zmaksymalizować przechwytywanie światła.

3. Obrazowanie ratiometryczne Ca2+ i rejestracja zachowania

  1. W zakładce "Sekwencja" w oprogramowaniu do akwizycji fluorescencji kliknij "Start", aby rozpocząć nagrywanie. Śledź robaka za pomocą joysticka, utrzymując ostrość na interesujących komórkach i synapsach w centrum pola widzenia (FOV). Kliknij przycisk "Statystyki" w oknie histogramu, aby wyświetlić statystyki pikseli każdego kanału.
  2. Dostosuj moc diody LED, aby zapewnić maksymalną jednopikselową fluorescencję mCherry na końcu presynaptycznym wynoszącą ≥ 8 000 zliczeń (~ 4 000 fotoelektronów), co daje ~ 12-bitowy zakres dynamiki powyżej tła (~ 100 fotoelektronów). Sygnały GCaMP5 na końcu presynaptycznym podczas spoczynku (niskiego) Ca2+ powinny mieć około ~ 2,500 zliczeń - tylko widoczne nad tłem.
  3. Nagrywaj do momentu osiągnięcia jednego stanu aktywnego składania jaj; zwykle dzieje się to co 20-30 minut u robaka typu dzikiego7. Zapisz 10-minutowy podzbiór (12 001 klatek), 6 000 klatek przed i po pierwszym zdarzeniu składania jaj (klatka 6 001). Upewnij się, że zachowałeś ten sam podzbiór obrazów w jasnym polu zachowania robaków i punktów czasowych pozycji stolika XY, w przeciwnym razie precyzyjna synchronizacja strumieni danych zostanie utracona.
  4. Użyj ImageJ i wtyczki BioFormats (patrz Spis materiałów), aby przekonwertować sekwencje obrazów do formatu Image Cytometry Standard (.ics), aby można je było zaimportować do oprogramowania Ratiometric Quantitation.

4. Segmentacja obrazów i analiza ilościowa

  1. Zaimportuj sekwencje obrazów do oprogramowania Ratiometric Quantitation (patrz Tabela materiałów). Kliknij "Automatyczny kontrast" w menu "Narzędzia" i dostosuj kontrast każdego kanału, aby ustalić odpowiednie poziomy czerni (~ 1 800) i bieli (10 000). Wybierz opcję "Zmień kolory..." w menu Narzędzia, aby potwierdzić, że przypisania kolorów kanałów mCherry i GCaMP5 są poprawne (Rysunek 4A - C).
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy szereg czasowy w zakładce "Sekwencja" i ustaw go na 20 klatek/s i 1,25 μm/piksel.
  2. Wybierz "Proporcje" z menu "Narzędzia" i wybierz "GCaMP5" dla "Kanału A" i "mCherry" dla "Kanału B". Kliknij "Oblicz" obok "Próg", aby odjąć tło od każdej sekwencji obrazów. Zaznacz "Zastosuj tęczową tablicę LUT do kanału proporcji".
    UWAGA: W przypadku nagrania ze średnim stosunkiem wyjściowym wynoszącym 0,3 (niskie Ca2+) i maksymalnym stosunkiem 2-3 (wysokie Ca2+) odpowiednia tabela przeglądowa będzie miała wartość od 0 (niebieski) do 1 (czerwony).
  3. Wygeneruj kanał współczynnika modulacji intensywności za pomocą kanału mCherry (Rysunek 4D). Kanał Intensity Modulated Ratio to obraz składający się z milionów kolorów, w którym proporcje kolorów są odwzorowywane na jasność kanału mCherry.
  4. Na karcie "Pomiary" utwórz protokół wyszukiwania obiektów, przeciągając narzędzie "Znajdź obiekty przy użyciu intensywności" do panelu "Protokół". Kliknij "koło zębate", aby ustawić okno z wartościami intensywności mCherry i znaleźć obiekty.
    1. Wybierz wartości intensywności ≥ 2 odchyleniami standardowymi (SD) powyżej tła (np. dolna granica ~ 2 500, górna granica 65 535). Upewnij się, że wykryto koniec presynaptyczny i że z menu Measurements (Pomiary) wybrano opcję "automatycznie aktualizuj informacje zwrotne".
      UWAGA: Oprogramowanie może również identyfikować obiekty na podstawie ich odchylenia standardowego od tła przy użyciu powiązanego protokołu "Intensywność SD". Jeśli jednak szczególnie jasny obiekt wejdzie w pole widzenia, może radykalnie zmienić średnią intensywność w tych punktach czasowych, wpływając na odcięcia intensywności używane do znalezienia HSN. Ta zmienność nie wystąpi, jeśli do znajdowania obiektów używane są surowe wartości intensywności.
  5. W razie potrzeby dodaj dodatkowe filtry ukierunkowane tylko na kanał mCherry (rozmiar, maksymalna intensywność itp.), aby wykluczyć niepożądane obiekty, takie jak fluorescencja głowy, ogona i jelit. Wybierz opcję "Utwórz element pomiaru" z menu Pomiary i wybierz "Wszystkie punkty czasowe"
    UWAGA: Spowoduje to wykonanie protokołu, zapisując wszystkie pomiary do pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (.csv), który należy wyeksportować za pomocą polecenia "export" w menu Plik.
  6. Otwórz plik exported.csv i skopiuj dane punktu czasu, obszaru (μm2), średniej (kanał stosunkowy), środka ciężkości X (μm) i środka ciężkości Y (μm) do nowego arkusza. Eksportuj plik a.csv bez nagłówków kolumn. Oprogramowanie do ilościowego określania wskaźnikowego może sklasyfikować komórkę zainteresowania jako jeden lub więcej obiektów na punkt czasowy.
    1. Aby ponownie połączyć te obiekty, użyj niestandardowego skryptu "AnalzyeGCaMP_2017.m".
      UWAGA: Skrypt identyfikuje również piki Ca2+ (stosunek) w danych i zapisuje a.csv plik z ich punktami czasowymi, amplitudami pików i szerokościami pików. Generuje również pliki postscript dla nieprzetworzonych i adnotowanych ścieżek proporcji. Na podstawie tych informacji należy określić amplitudę przejściową Ca2+ i interwał między stanami przejściowymi.
  7. Dodaj wyjściowe wartości środka ciężkości X i Y z każdego obiektu fluorescencji do wartości X i Y zarejestrowanych przez skrypt etapu XY z Bonsai. Użyj pozycji XY netto, aby wygenerować ślad lokomocji robaka i obliczyć przemieszczenie i prędkość komórki, które towarzyszą różnym stanom zachowania31.
  8. Zaimportuj zarejestrowane obrazy w jasnym polu do ImageJ jako wirtualny stos. Opisuj wydarzenia związane ze składaniem jaj i inne zachowania. Porównaj czas tych zdarzeń z pikami Ca2+ ze śladu ilorazowego.

Wyniki

Opisana tutaj prosta technika montażu (Rysunek 1) powoduje minimalne zmiany w środowisku hodowlanym stadiów L4 oraz dorosłych C. elegans, umożliwiając jednocześnie rejestrację o wysokiej rozdzielczości u aktywnych zwierząt przez szkiełko podstawowe (Rysunek 4). Synchronizacja źródeł światła LED, sterowników stolika i czasów ekspozycji kamery pozwala na akwizycję danych z wielu strumieni z częstotliwością 20 frames/s przez maksymalnie 1 h. Średnie powiększenie (20x) z obiektywami o wysokiej aperturze numerycznej (0,7-0,8) zapewnia dobrą rozdzielczość przestrzenną regionu synaptycznego w obwodzie zachowania składania jaj, nawet przy binningu 4 x 4 piksele (1,25 µm/pixel). Symultaniczna akwizycja sygnałów fluorescencyjnych GCaMP5 i mCherry (Rysunek 4A, B) jest wykorzystywana do wygenerowania kanału stosunku piksel po pikselu, który kompensuje zmiany w ruchu i ostrości obrazu zwierzęcia (Rysunek 4D). Presynaptyczne zakończenie neuronów HSN jest tak duże, jak wiele ciał komórek neuronalnych u C. elegans, dzięki czemu zmiany stężenia presynaptycznego Ca2+ w HSN mogą być wyraźnie wizualizowane. Duże pole widzenia (FOV) kamery w jasnym polu podczerwieni pozwala na ręczne śledzenie nicienia podczas rejestracji (Rysunek 4E). Dla każdego osobnika zmiany wewnątrzkomórkowego Ca2+ mogą być skorelowane z zachowaniami widocznymi w obrazowaniu w jasnym polu, w tym z uwalnianiem jaj oraz zmianami w lokomocji (Rysunek 4E).

Ilościowe oznaczenie Ca2+ w neuronach HSN oraz prędkości potwierdza, że nicienie zmieniają sposób poruszania się podczas przechodzenia do zachowania składania jaj. Występują istotne różnice w prędkości nicieni przed, w trakcie i po aktywnym stanie składania jaj (Rycina 5A). Nie jest to spowodowane szumem właściwym dla systemu obrazowania lub śledzenia. Przybliżając pojedyncze zdarzenie składania jaj, obserwujemy silną zmianę fluorescencji GCaMP5 (ΔF/F) przed samym zdarzeniem, podczas gdy fluorescencja mCherry pozostaje relatywnie niezmieniona (Rycina 5B). Pomiar zmian stosunku GCaMP5:mCherry (ΔR/R) wyraźnie wykazuje przejściowy wzrost poziomu Ca2+ w HSN na około 4 s przed uwolnieniem jaja (Rycina 5B). Jednocześnie ze skurczem mięśni sromowych następuje wyraźne spowolnienie lokomocji nicienia, które kończy się w momencie uwolnienia jaja. Wcześniejsze wyniki wykazały, że cholinergiczne neurony ruchowe VC, unerwione przez neurony HSN, wykazują szczytową aktywność podczas silnych skurczów mięśni sromowych oraz podczas uwalniania jaj 8,10,27. Wykazaliśmy również, że optogenetyczna aktywacja neuronów VC powoduje natychmiastowe spowolnienie lokomocji, co sugeruje, że neurony VC mogą być aktywowane przez skurcz mięśni sromowych, spowalniając tym samym lokomocję aż do otrzymania sygnału zwrotnego o uwolnieniu jaja27.

Opisany system obrazowania i śledzenia umożliwia wizualizację organizacji przestrzennej zachowań związanych ze składaniem jaj (Rycina 5C). Jak wykazano wcześniej, nicienie wchodzą w fazę przedłużonego ruchu postępowego tuż przed wystąpieniem stanu aktywnego32. Nicienie spędzają większość czasu na żerowaniu na bakteriach w centrum fragmentu agaru. Przed wejściem w stan aktywny nicienie oddalają się od pożywienia, co zbiega się w czasie z pojawieniem się rzadkich przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ w neuronach HSN. Aktywność HSN przechodzi następnie w fazę gwałtownych wyładowań, z kilkoma gęsto rozmieszczonymi impulsami Ca2+ w HSN, które podtrzymują proces składania jaj. Następnie nicienie często zawracają, wznawiają ruch postępowy i składają jaja w drodze powrotnej do pozycji startowej w pobliżu bakterii OP50. Przypuszczamy, że zmiany lokalnego stężenia O2 i/lub CO2 mogą wpływać na miejsce, w którym nicienie decydują się złożyć jaja33,34.

Schemat równowagi statycznej z układem nicieni OP50 na płytce NGM do eksperymentu biologicznego.
Rysunek 1. C. elegans technika montażu do obrazowania wysokiej rozdzielczości aktywności obwodu odpowiedzialnego za składanie jaj oraz powiązanego z nim zachowania. Góra, końcowy preparat widoczany z boku. Dół, końcowy preparat widziany przez spód dużego szkiełka nakrywki. Strzałki wskazują bakteryjny pokarm OP50, C. elegans robaki i jaja, uwięzione pomiędzy fragmentem agaru NGM a dużym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 60 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat mikroskopu fluorescencyjnego; obrazowanie GFP, mCherry; pomiar Ca²⁺ i pozycji komórki; zachowanie nicieni.
Rysunek 2. Ratiometryczne obrazowanie Ca2+ w szerokim polu oraz rejestracja zachowania na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym. (A) Pozycja i zachowanie nicieni są rejestrowane w polu jasnym za pomocą obiektywu Plan-Apochromat 20x (0.8 NA) przy użyciu światła podczerwonego (750-790 nm) (fioletowe strzałki) emitowanego z lampy halogenowej przez fragment podłoża NGM. Do utrzymania nicienia w polu widzenia podczas rejestracji służy joystick i sterownik zmotoryzowanego stolika. Pozycja stolika (Δx, Δy) jest przesyłana do komputera przez port szeregowy. Białka GCaMP5 i mCherry ekspresowane w nicieniu są wzbudzane za pomocą diod elektroluminescencyjnych (LED) o długości fali 470 nm (niebieskie strzałki) i 590 nm (żółte strzałki). Emitowana fluorescencja GCaMP5 (zielone strzałki) i mCherry (pomarańczowe strzałki) wraz ze światłem podczerwonym przechodzi przez wielopasmowe lustro dichroiczne (patrz Tabela materiałów). Dzielnik wiązki 80/20 kieruje 20% światła przez reduktor 0.63x do rejestracji na kamerze CMOS czułej na podczerwień (fioletowa strzałka). Pozostałe 80% światła jest kierowane przez port boczny mikroskopu do rozdzielacza obrazu, który rozdziela fluorescencję GCaMP5 i mCherry na oddzielne połowy kamery sCMOS, jednocześnie usuwając podczerwone światło pola jasnego. Dane z obu kamer są przesyłane do komputera za pomocą kabli USB3. Porty wyzwalające z fluorescencyjnej kamery sCMOS (niebieskie) służą do wysyłania wyzwalaczy TTL +5V do systemu oświetlenia LED, podczerwonej kamery pola jasnego oraz cyfrowego urządzenia akwizycji danych (DAQ). (B) Sygnały wyjściowe TTL z wyzwalacza 3 są wykrywane przez DAQ na cyfrowym pinie nr 8 i przesyłane do komputera przez połączenie USB. Te wejścia cyfrowe wyzwalają komendę szeregową „where XY” ze skryptu oprogramowania Bonsai (XY-stage-final), która odczytuje pozycję X i Y stolika dla każdego zarejestrowanego obrazu fluorescencji GCaMP5/mCherry oraz obrazu podczerwonego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat blokowy przetwarzania danych; szeregowe wejście/wyjście danych, parsowanie w języku Python, kompresja, wyjście do pliku CSV.
Rysunek 3: Układ skryptu komunikacji szeregowej stołu XY-stage-final w programie Bonsai. Górny węzeł DigitalInput (różowy) odczytuje triggery TTL wchodzące do pinu nr 8 modułu DAQ. Dla każdego dodatniego napięcia TTL (zielony), DAQ tworzy znacznik czasu (niebieski) i wysyła ciąg znaków „Where XY?” (różowy) do sterownika stołu za pośrednictwem portu szeregowego (szary). Węzeł SerialStringRead (różowy) odczytuje odpowiedź z współrzędnymi X i Y ze sterownika stołu. Ciąg ten jest następnie przeliczany na mikrony i rozdzielany na współrzędne stołu X i Y. Na koniec cztery te strumienie są łączone za pomocą węzła zip (niebieski) i zapisywane w czterokolumnowym pliku .csv: licznik klatek odebranych sygnałów TTL (węzeł Range, różowy), współrzędne X i Y oraz odstęp między kolejnymi punktami czasowymi (zazwyczaj ~ 50 ms przy rejestracji z częstotliwością 20 Hz). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna środkowej części ciała, GCaMP5 i mCherry, dwukanałowa, pole jasne C. elegans.
Rycina 4: Reprezentatywne mikrografie fluorescencji HSN oraz obraz całego zwierzęcia w polu jasnym podczas zachowania składania jaj. (A-D) Jednoczesne obrazowanie ratiometryczne fluorescencji GCaMP5 i mCherry w neuronach HSN tuż przed wydaleniem jaja. Zakończenia presynaptyczne HSN zaznaczono grotami strzałek. (C) Nałożenie fluorescencji GCaMP5 i mCherry. (D) Stosunek GCaMP5:mCherry modulowany intensywnością; wysoki stosunek (kolor czerwony) wskazuje na wysoką wewnątrzkomórkową zawartość Ca2+ w zakończeniu presynaptycznym. (E) Obraz całego nicienia w polu jasnym tuż po złożeniu jaj. Groty strzałek wskazują przednią i tylną połowę wulwy, przez którą składane są jaja. Pasek skali dla wszystkich obrazów wynosi 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza obrazowania Ca²⁺ z wykorzystaniem stosunku GCaMP5:mCherry; wykres śledzi prędkość nicienia i zdarzenie uwalniania jaj.
Rycina 5: Rejestracja Ca2+ w neuronach HSN i prędkości lokomocji podczas zachowania składania jaj. (A) Przebiegi zmian stosunku GCaMP5:mCherry w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe przejściowe wzrosty Ca2+ (ΔR/R; czerwone) wraz z chwilową prędkością nicienia (µm/s; niebieskie). Zdarzenia składania jaj są oznaczone grotami strzałek. (B) Przebiegi fluorescencji GCaMP5 w HSN (zielone; ΔF/F), fluorescencji mCherry (czerwone; ΔF/F), stosunku fluorescencji GCaMP5:mCherry (czarne; ΔR/R) oraz prędkości nicienia (niebieskie) w okolicach momentu uwalniania jaja. (C) Organizacja przestrzenna zachowań składania jaj i lokomocji podczas całego 10-minutowego zapisu. Tor ruchu nicienia uzyskano z informacji o stole XY, które dodano do pozycji centroidu HSN wyznaczonej na podstawie rejestracji fluorescencji mCherry. Oznaczono czas wystąpienia przejść HSN (czerwone koła), zdarzeń składania jaj (czarne groty strzałek) oraz początek i koniec rejestracji (zielone i niebieskie romby). Pasek skali odpowiada 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Transgeny:

Ponieważ ekspresja mCherry została poprawiona poprzez optymalizację kodonów i insercję intronów (a większość dostępnych reporterów GCaMP tego nie zrobiła), wstrzyknij ~ 4 razy więcej plazmidu eksprymującego GCaMP5, aby zapewnić porównywalne poziomy fluorescencji GCaMP5 podczas silnych stanów przejściowych Ca2 +. Uratowanie mutacji lin-15 (n765ts) pozwala na łatwe odzyskanie transgenicznych zwierząt przy minimalnym wpływie na składanie jaj i inne zachowania35. Transgeny powinny być zintegrowane w celu zapewnienia jednolitych warunków ekspresji i obrazowania u różnych zwierząt25. Selektywne markery, w tym oporność na antybiotyki36,37 i ratowanie wrażliwych na temperaturę letalów38 również powinny działać, ale ponieważ zwierzęta nietransgeniczne są martwe, potwierdzenie integracji transgenu i homozygotyczności jest trudniejsze w porównaniu z markerami, które prezentują widoczny fenotyp25. Należy unikać dominujących markerów, które zakłócają normalną lokomocję i zmniejszają sprawność, takich jak rol-6(dm)39. Obrazowanie w zmutowanym tle lite-1 jest niezbędne do zmniejszenia reakcji ucieczki światła niebieskiego podczas obrazowania 23,40,41. Dodatkowa mutacja gur-3, która działa równolegle do lite-1, może dodatkowo zminimalizować zachowanie resztkowe i zmiany fizjologiczne spowodowane przez niebieskie światło42. Dogodnie, gur-3, lite-1 i lin-15 znajdują się w prawej połowie chromosomu X, co powinno uprościć budowę nowych szczepów do obrazowania Ca2+ i eksperymentów optogenetycznych.

Ponieważ czasy naświetlania są krótkie, a obrazy są zbierane z częstotliwością 20 Hz, sygnały GCaMP5 i mCherry muszą być jasne. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem hałaśliwych nagrań Ca2+ jest słaba fluorescencja spowodowana słabą ekspresją reporterową. Promotorzy powinni być również odpowiednio dokładni dla regionu, który jest fotografowany. Ponieważ ciało komórki HSN i synapsy na mięśniach sromu znajdują się w centrum ciała, dodatkowa ekspresja z promotora nlp-3 w głowie i ogonie jest zwykle poza polem widzenia i może być wykluczona za pomocą dodatkowych filtrów w oprogramowaniu Ratiometric Quantitation. Aby upewnić się, że obserwowane zmiany we fluorescencji GCaMP5 wynikają z rzeczywistych zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2+, transgeny kontrolne eksprymujące GFP zamiast GCaMP5 powinny być niezależnie przygotowane i przeanalizowane26. Nowsze reportery Ca2+ o różnej czułości Ca2+, kinetyce i kolorach rozszerzyły wybór dostępnych narzędzi do obrazowania, ale każdy nowy reporter powinien być walidowany przy użyciu niewrażliwego na Ca2+ wariantu fluorescencyjnego14,16.

Media:

Płytki NGM do obrazowania powinny być przygotowane z wysokiej jakości agaru. Agar niższej jakości nie rozpuści się całkowicie po autoklawowaniu, pozostawiając małe cząstki, które rozpraszają światło podczas obrazowania i zwiększając fluorescencję tła. Zamiast tego można użyć agarozy klasy biologii molekularnej, ale dodana ilość powinna zostać zmniejszona, aby utrzymać równoważną twardość płytki.

Porównania z innymi metodami montażu:

Poprzednie podejścia do aktywności obrazu w obwodzie zachowania składania jaj wykorzystywały robaki unieruchomione klejem do podkładki agarozowej. W tych warunkach aktywność obwodu i zachowanie związane ze składaniem jaj nie są korzystne bez zmniejszenia osmolarności pożywekhodowlanych 8,10,44,45. Ostatnie dowody sugerują, że kilka zachowań robaków jest modulowanych przez stan lokomocji, co rodzi pytania o związek aktywności komórek obserwowanej u unieruchomionych zwierząt z tą obserwowaną u swobodnie zachowujących się zwierząt. Wykazaliśmy niedawno, że aktywność obwodu składania jaj jest nieoczekiwanie fazowana wraz z lokomocją26,27. Podobnie, podzielona na przedziały sygnalizacja Ca2 + w interneuronie RIA integruje aktywność neuronów czuciowych i neuronów ruchowych głowy podczas ruchów żerowania46. Zachowaniom defekacyjnym towarzyszy również precyzyjna i stereotypowa zmiana w lokomocji, która pozwala zwierzętom oddalić się od miejsca żerowania przed wydaleniem odpadów47. Łącznie wyniki te sugerują, że krótkie zapisy aktywności obwodów u unieruchomionych zwierząt mogą zasadniczo różnić się od tych uzyskanych u swobodnie zachowujących się zwierząt.

Pomimo tego, że robak znajduje się bezpośrednio pod szkiełkiem nakrywkowym, zachowanie przypomina to, co można zobaczyć na standardowych płytkach NGM. Złożone jaja wykluwają się, a niewielka ilość zdeponowanego pokarmu pozwala larwom L1 wyrosnąć na dorosłe osobniki (dane nie pokazane). Duży rozmiar kawałka agaru pozwala na rozsądną wymianę gazową i jest odporny na odwodnienie, chociaż zbyt duża ilość jedzenia zwiększy fluorescencję tła. Chociaż ta metoda działa najlepiej w przypadku dorosłych, technika ta może być również stosowana do obrazowania zwierząt L4. Jednak grubość warstwy wodnej między kawałkiem a szkiełkiem nakrywkowym jest taka, że mniejsze larwy mają trudności z czołganiem się i często mogą zostać uwięzione w śladzie poruszającego się dorosłego osobnika.

Ograniczeniem tej techniki montażu jest to, że bezpośrednia mechaniczna lub chemiczna stymulacja określonych obszarów ciała jest trudna. Ostatnie osiągnięcia w technikach oświetlenia wzorzystego pozwalają na oddzielne wzbudzenie opsyn mikrobiologicznych wyrażanych na głowie lub ogonie z oddzielnym oświetleniem i wykrywaniem fluorescencji GCaMP/mCherry w środkowej części ciała48,49. W rezultacie, być może uda się przezwyciężyć ten problem za pomocą podejść optogenetycznych.

Porównania z innymi metodami obrazowania Ca2+:

Metoda ta bardzo dobrze sprawdza się w rejestrowaniu zmian w cytoplazmatycznym Ca2+ z pojedynczych, rozdzielczych komórek i ich regionów synaptycznych. Obrazowanie wolumetryczne neuronów w głowie w czasie rzeczywistym zostało ostatnio osiągnięte przy użyciu położenia jąder komórkowych do identyfikacji komórek i ilościowego określenia zmian w wapniu nukleoplazmatycznym 50,51,52. Związek między jądrowym i synaptycznym Ca2+ pozostaje niejasny. Nasze dane sugerują, że najbardziej rzucające się w oczy zmiany w wewnątrzkomórkowym Ca2 + HSN występują na końcach presynaptycznych z dala od somy komórki (ryc. 4D). Presynaptyczne końce neuronów HSN i VC są osadzone w postsynaptycznych mięśniach sromu26. Nie jest jasne, czy rozdzielczość w wymiarze Z byłaby wystarczająca nawet przy użyciu technik wirującego dysku lub arkusza świetlnego, aby przypisać presynaptyczne sygnały Ca2 + do określonych komórek bez polegania w jakiś sposób na somatycznym wapniu w celu identyfikacji komórek. Korzystając z opisanych tutaj technik, każde 10-minutowe, dwukanałowe nagranie z 12 001 16-bitowymi obrazami TIFF o rozdzielczości 256 x 256 pikseli wynosi ~4 GB. Kanały z modulacją współczynnika i intensywności podwajają rozmiar pliku do ~ 8 GB. Typowy eksperyment z udziałem 10 zwierząt z każdego z dwóch genotypów (dzikiego i eksperymentalnego) generuje prawie 150 GB danych pierwotnych, a ich zebranie i analiza wymaga 20 godzin. Analizy wolumetryczne z 10 warstwami Z na punkt czasowy wymagałyby o rząd wielkości więcej danych i czasu analitycznego, co wyjaśnia, dlaczego przeprowadzono tak niewiele takich badań.

Sprzęt:

Rejestrujemy i analizujemy sekwencje obrazów na dwuprocesorowych stacjach roboczych z wysokowydajnymi kartami graficznymi (np. do gier), 64 GB pamięci RAM i wysokowydajnymi dyskami półprzewodnikowymi (patrz tabela materiałów). Dane powinny być przechowywane na nadmiarowej macierzy niezależnych dysków (RAID) w sieci i tworzone są kopie zapasowe w chmurze w zewnętrznym centrum danych.

Zalecamy stosowanie skolimowanych diod LED o dużej mocy do impulsowego wzbudzenia fluorescencji nad metalohalogenkowymi lub rtęciowymi źródłami światła. Dostępnych na rynku jest kilka dostępnych na rynku wielokolorowych systemów LED. Podczas gdy niektóre z tych systemów LED mają wyższy koszt początkowy, mają długą żywotność (> 20 000 godzin), mogą jednocześnie wzbudzać cztery lub więcej różnych fluoroforów i oferują precyzyjną kontrolę czasową za pomocą interfejsu szeregowego i/lub TTL o niskim opóźnieniu (czas przełączania 10-300 μs). Wyzwalanie zapewnia, że próbka jest podświetlana tylko wtedy, gdy dane są faktycznie zbierane. Zazwyczaj stosujemy ekspozycję 10 ms co 50 ms (20% stawki pracy). Zmniejsza to fototoksyczność i rozmycie ruchu podczas przechwytywania obrazu, jak wcześniej informowano43.

Używamy kamer sCMOS ze względu na ich szybkość i dużą gamę małych, czułych pikseli. Kamera EM-CCD jest droższą alternatywą, ale efekty "rozkwitu" mogą spowodować, że przechwycone fotoelektrony rozleją się na sąsiednie piksele. Nowe kamery sCMOS w technologii BSI mają podobną czułość na światło jak EM-CCD przy znacznie niższych kosztach. Niezależnie od tego, który czujnik jest używany, kanały GCaMP5 i mCherry muszą być uzyskane jednocześnie. Sekwencyjne przechwytywanie w poruszających się robakach doprowadzi do źle zarejestrowanych obrazów, które nie nadają się do ilościowego pomiaru ratiometrycznego. Obrazowanie dwukanałowe można wykonać w jednej kamerze po podziale kanałów za pomocą rozdzielacza obrazu (ilustracja 2) lub przy użyciu dwóch identycznych kamer. Zakres dynamiczny obrazów 16-bitowych jest zalecany w stosunku do obrazów 8-bitowych w celu dokładnego ilościowego określenia proporcji. W przypadku obrazów zachowania robaków w jasnym polu rejestrujemy je za pomocą 1 cala. Kamera USB3 o rozdzielczości 4,1 MP w bliskiej podczerwieni do przechwytywania dużych 8-bitowych sekwencji obrazów 2 x 2 binned 1 024 x 1 024 po kompresji JPEG. Większe pole widzenia dostępne w nowszych modelach mikroskopów pozwala na wizualizację dorosłego robaka z 20-krotnym powiększeniem po 0,63-krotnym powiększeniu przy niewielkim winietowaniu (Rysunek 4E).

Zalecamy używanie standardowych sygnałów napięciowych TTL do synchronizacji oświetlenia i przechwytywania klatek. Ze względu na potencjalne opóźnienia w różnych programach, zalecamy użytkownikom skonfigurowanie kamery fluorescencyjnej z wyjściami wyzwalającymi jako głównej z wyjściami TTL sterującymi wszystkimi innymi urządzeniami. W ten sposób informacje o jasnym polu i położeniu sceny będą zbierane dla każdego pomiaru Ca2+ .

Szczelinowe lub rezonansowe mikroskopy konfokalne ze skaningiem punktowym, zwykle spotykane we wspólnych obiektach konfokalnych, zapewniają również doskonałą wydajność podczas ratiometrycznego obrazowania Ca2+ . Takie instrumenty mogą być używane do przechwytywania dwóch lub więcej kanałów fluorescencyjnych wraz z jasnym polem24. W takim przypadku otwór konfokalny powinien być otwarty do maksymalnej średnicy, a detektor spektralny powinien być użyty do oddzielenia sygnałów GCaMP5, mCherry i podczerwonego jasnego pola. Maksymalizuje to zbieranie światła z grubego (~ 20 μm) warstwy, jednocześnie umożliwiając odrzucenie nieostrej fluorescencji. Jednym minusem jest mniejsze pole widzenia i więcej ograniczeń dotyczących dostosowywania sprzętu i oprogramowania.

Oprogramowanie:

Większość producentów dostarcza i instaluje swoje kamery i mikroskopy z zastrzeżonym oprogramowaniem, w tym konfiguracją wejść i wyjść wyzwalających. Funkcje i wydajność tego oprogramowania podczas nagrywania mogą się różnić. Ponieważ szybko poruszające się robaki mogą być trudne do śledzenia, wyświetlanie obrazu podczas nagrywania musi być płynne i stabilne przy 20 Hz. Aby poprawić wydajność, sekwencje obrazów mogą być tymczasowo zapisywane w pamięci RAM z podzbiorami istotnymi dla zachowania zapisanymi na końcu eksperymentu. Te dwukanałowe pliki sekwencji obrazów można przekonwertować do otwartego formatu Image Cytometry Standard (.ics) w celu zaimportowania do oprogramowania Ratiometric Quantitation. OME-TIFF to nowszy format obrazu typu open source, chociaż różne instalacje mogą nie być w stanie zapisać sekwencji obrazów TIFF większych niż 4 GB.

Kluczową cechą procesu kwantyfikacji jest wygenerowanie kanału proporcji, a następnie bezstronna procedura segmentacji obrazu przy użyciu fluorescencji mCherry w celu znalezienia interesujących komórek. Z każdego znalezionego obiektu obliczany jest rozmiar obiektu, położenie środka ciężkości XY oraz minimalne, średnie i maksymalne wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału (w tym kanału stosunkowego). Razem wartości te są wykorzystywane do ilościowego określania zmian w wewnątrzkomórkowym Ca2+ w każdym punkcie czasowym nagrania. Pomiary obiektów dla każdego punktu czasowego są następnie eksportowane jako plik a.csv celu przeprowadzenia kolejnych analiz.

Głównym ograniczeniem opisanego tutaj protokołu jest zależność od przenoszenia danych w różnych formach przez mozaikę produktów programowych. Dodatkową irytacją jest to, że niektóre programy są otwarte i bezpłatne, podczas gdy inne są zamknięte, drogie i nierównomiernie aktualizowane. Dużym ulepszeniem byłoby użycie lub opracowanie jednego oprogramowania (najlepiej open source), które zapewnia podobny poziom wydajności i łatwości obsługi od momentu pozyskania do analizy. Jak wspomniano powyżej, analiza ratiometryczna podwaja zarówno rozmiar pliku, jak i czas wymagany do ukończenia eksperymentu. Generowanie sterowników kamery, które można zintegrować z konfigurowalnymi przez użytkownika strukturami, takimi jak Bonsai, umożliwiłoby zbieranie i analizowanie obrazów i innych strumieni danych w czasie rzeczywistym, znacznie poprawiając przepustowość.

Perspektywy na przyszłość:

Podczas gdy zazwyczaj śledzimy ruchy robaków ręcznie, śledzenie środka ciężkości robaka wykrytego w nagraniach w podczerwieni w jasnym lub ciemnym polu powinno pozwolić na dodatkowe węzły przetwarzania obrazu, które zapewniają regulację pozycji stolika w pętli zamkniętej i automatyczne śledzenie (Rysunek 3 i dane nie pokazane). Większość zapisów fluorescencyjnych uzyskanych tą metodą jest ciemna i pozbawiona interesujących biologicznie danych. Techniki przetwarzania obrazów po akwizycji na podstawie czujnika lub w czasie rzeczywistym, które przycinają sekwencje obrazów do odpowiednich obiektów, pozwoliłyby na zwiększenie rozdzielczości przestrzennej i przyspieszyłyby proces analizy danych, szczególnie jeśli dla każdego punktu czasowego zbierane są dodatkowe wycinki Z w celu wizualizacji aktywności we wszystkich komórkach pre- i postsynaptycznych w obwodzie.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu NINDS dla KMC (R01 NS086932). LMN otrzymał wsparcie z grantu z programu NIGMS IMSD (R25 GM076419). Szczepy użyte w tym badaniu C. elegans Genetics Center, które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dziękujemy Jamesowi Bakerowi i Masonowi Kleinowi za pomocne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C. elegans wzrost, uprawa i montaż
Escherichia coli szczep bakterii, OP50Caenorhabditis Genetic CenterOP50Pokarm dla C. elegans. Uracyl auksotrof. E. coli B. Poziom bezpieczeństwa biologicznego 1
HSN GCaMP5 + mSzczep robaka wiśniowegoCaenorhabditis Genetic CenterLX2004Zintegrowany transgen wykorzystujący promotor nlp-3 do napędzania ekspresji GCaMP5 i mCherry w HSN.  Pełny genotyp:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) do przygotowania transgenuautorLX1832Szczep do odzyskiwania transgenów o wysokiej kopii po mikroiniekcji plazmidem ratunkowym pL15EK lin-15(n765ts). Posiada również mutację linked lite-1(ce314), która zmniejsza wrażliwość na światło niebieskie. Dostępne od autora na żądanie
pL15EK lin-15a/b genomiczny plazmid ratunkowyautorpL15EKPlazmid ratunkowy do odzyskiwania zwierząt transgenicznych po wstrzyknięciu do szczepu LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X. Dostępne od autora na życzenie
pKMC299 autor plazmidupKMC299Plazmid do ekspresji mCherry w HSN z promotora nlp-3. Posiada nlp-3 3' nietranslowany region
plazmidu pKMC300 autor plazmidupKMC300Plazmid do ekspresji GCaMP5 w HSN z promotora nlp-3. Ma nlp-3 3' nietranslowany region
Fosforan potasu MonobasicSigmaP8281Do przygotowania płytek NGM
Fosforan potasu DibasicSigmaP5655Do przygotowania płytek NGM
Siarczan magnezu siedmiowodnyAmresco0662Do przygotowania płytek NGM
Chlorek wapnia dwuwodnyAlfa Aesar12312Do przygotowania płytek NGM
PeptoneBecton Dickinson211820Do przygotowania płytek NGM
Chlorek soduAmresco0241Do przygotowania płytek NGM
CholesterolAlfaAesar A11470Do przygotowania płytek NGM
Agar, Bakteriologiczny typu A, UltrapureAffymetrix10906Do przygotowania płytek NGM
Szalki Petriego 60 mmVWR25384-164 Do przygotowania płyt NGM
Okulary nakrywkowe 24 x 60 mm, #1.5VWR48393-251Szkło nakrywkowe, przez które obrazowane są robaki
Okulary nakrywkowe 22 x 22 mm, #1VWR48366-067Szkło nakrywkowe, które zakrywa górną część kawałka agaru
Mikroskop stereoskopowy z podstawą światła przechodzącegoLeicaM50Mikroskop preparacyjny do konserwacji, etapowania i montażu szczepu robaka
Drut platynowo-irydowy, (80:20), 0,2 mmALFA AESARAA39526-BWDo przenoszenia ślimaków
Mikroskop do obrazowania wapnia
Antywibracyjny stół powietrznyTMC63-544Micro-g' Stół laboratoryjny 30" x 48" z 4" CleanTop M6 na górze 25mm
Odwrócony mikroskop złożonyZeiss431007-9902-000Axio Observer.Z1 odwrócony mikroskop
Sideport L80/R100 (3-pozycyjny)Zeiss425165-0000-000Aby przekierować 20% mocy wyjściowej do kamery w jasnym polu (CMOS), 80% do kamery fluorescencyjnej (sCMOS)
Oświetlenie odchylane do tyłu CarrierZeiss423920-0000-000Do obrazowania w podczerwieni/zachowaniu
Obudowa lampy 12V/100W z/ KolektorZeiss423000-9901-000Do obrazowania w podczerwieni/zachowaniu
Lampa halogenowa 12V/ 100WZeiss380059-1660-000Do obrazowania w podczerwieni/zachowaniu. Diody LED ze światłem białym nie emitują znacznego światła podczerwonego, więc nie pozwolą na obrazowanie w jasnym polu po filtrze pasmowo-przepustowym podczerwieni
32 mm Filtr pasmowoprzepustowy podczerwieni (750-790 nm) do lampy halogenowejZeiss447958-9000-000BP 750-790; DMR 32mm, do oświetlenia w podczerwieni dla jasnego pola i zachowania
6-filtrowa głowica rewolwerowa skraplacza (LD 0.55 H/DIC/Ph), zmotoryzowanaZeiss424244-0000-000Do obrazowania w podczerwieni/behawioralnej
Kondensator i MigawkaZeiss423921-0000-000Do obrazowania w podczerwieni / zachowaniu
Okular lornetkowy z fototubusem do kamery CMOS na podczerwieńZeiss425536-0000-000Do obrazowania w podczerwieni / behawioralnej
Okular 10x, 23mmZeiss444036-9000-000Do lokalizacji robaka na kawałku agaru
Adapter C-Mount 2/3" 0,63x demagnifierZeiss426113-0000-000Mocowanie do Kamera CMOS
podczerwień Kamera CMOS do jasnego pola podczerwieni i zachowania (czujnik 1")FLIR (dawniej Point Grey Research)GS3-U3-41C6NIR-CKamera do obrazowania w jasnym polu
Karta kontrolera hosta USB 3.0FLIR (dawniej Point Grey Research)ACC-01-1202Fresco FL1100, 4
porty 8 pinów, GPIO 1 m, okrągłe złącze Hirose HR25 FLIR (dawniej Point Grey Research)ACC-01-3000do wyzwalania TTL. Zielony przewód łączy się z GPIO3 / Pin 4, a brązowy przewód łączy się z uziemieniem / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27Zeiss420650-9901-000Najlepsza kombinacja powiększenia, apertury numerycznej i odległości roboczej
6-sześcienna wieżyczka reflektorowa, zmotoryzowanaZeiss424947-0000-000Do obrazowania fluorescencyjnego
Fluorescencyjny pociąg świetlny, zmotoryzowanyZeiss423607-0000-000Do obrazowania fluorescencyjnego
Migawka fluorescencyjnaZeiss423625-0000-000Do obrazowania fluorescencyjnego
Kostka filtra z podwójnym wzbudzeniem i emisją GFP i mCherry (do mikroskopu)Zeiss489062-9901-000Zestaw filtrów FL 62 HE BFP+GFP+HcRed do obrazowania fluorescencyjnego
System oświetlenia LEDZeiss423052-9501-000Wyzwalany system LED Colibri.2 do oświetlenia fluorescencyjnego
Moduł LED GFP (470 nm)Zeiss423052-9052-000Colibri.2 LED do wzbudzenia fluorescencji GFP
Moduł mCherry LED (590 nm)Zeiss423052-9082-000Colibri.2 LED do wzbudzenia fluorescencji mCherry
Suwak zatrzymania przysłony do urządzeń ze światłem padającymZeiss000000-1062-360Przysłona polowa ograniczająca oświetlenie LED do pola widzenia kamery
Adapter C-Mount 1" 1.0xZeiss426114-0000-000Adapter do rozdzielacza obrazu i kamery fluorescencyjnej sCMOS
Rozdzielacz obrazuHamamatsuA12801-01Gemini W-View, można używać innych rozdzielaczy obrazu, ale mogą one nie być zoptymalizowane pod kątem dużego rozmiaru matrycy kamer sCMOS
GFP / mCherry zwierciadło dichroiczne (rozdzielacz obrazu)SemrockDi02-R594-25x36Rozdzielanie GCaMP5 z mCherry i podczerwieni sygnały
Filtr emisyjny GFP (rozdzielacz obrazu)SemrockFF01-525/30-25Przechwytywanie fluorescencji GCaMP5
mCherry/ filtr emisyjny (rozdzielacz obrazu)SemrockFF01-647/57-25Ten filtr jest niezbędny, aby wykluczyć światło podczerwone używane do obrazowania w jasnym polu
Kamera sCMOS do fluorescencji (czujnik 1")HamamatsuA12802-01 / C11440-22CUOrca FLASH 4.0 V2. Nowsze modele pozwalają na osobne ustawienia akwizycji obrazu na osobnych połówkach matrycy, umożliwiając akwizycję obrazów dwukanałowych w połączeniu z rozdzielaczem obrazu
Motorized XY StageMä RZHÄ użytkownikSCAN IM 130 x 100Ruch stolika; rozdzielczość XY tego stolika wynosi 0,2&mikro; m na krok 
Kontroler XY Stage z joystickiemLUDLMAC6000, joystick XYRęczne śledzenie robaków. MAC6000 kontroler należy podłączyć do komputera PC poprzez port szeregowy (RS-232) skonfigurowany do 115200 bodów
Digital Acquisition Board (DAQ)ArduinoUnoOdbieranie wyzwalaczy TTL z kamery sCMOS. Uno powinien być załadowany standardowym pakietem Firmata, a port USB komputera skonfigurowany do 57600 bodów
BNC męski na męski BNC - 6 stópZłącza Hosa TechnologyHOBB6BNC do wyzwalania TTL
Pozłacany koncentryczny BNC męski na męski SMA (8,8")uxcell608641773651Do podłączenia wyjść wyzwalających kamerę fluorescencyjną
adapter głowicy obrotowej BNCHantekRRBNCTH21Przejściówka BNC na wtyk bananowy (4mm)
Złącze BNC żeńskie na żeńskieDiageng20130530009Adapter BNC żeński na żeński do podłączenia wyjścia BNC z kamery do wtyku bananowego
Bezlutowane elastyczne przewody połączeniowe do płytki stykowejZ& TGK1212827Aby podłączyć wyjścia wyzwalające BNC do Arduiono DAQ.  Mężczyzna do mężczyzny.
Wysokowydajna stacja roboczaHPZ820Windows 7, 64 GB pamięci RAM, procesor Dual Xeon, dysk półprzewodnikowy C: dysk, port szeregowy (RS-232), wiele gniazd PCIe3 do łączności Ethernet, karty USB 3.0 i dodatkowe dyski półprzewodnikowe
Dysk SSD M.2SamsungMZ-V5P512BWSzybkie przesyłanie strumieniowe i analiza danych obrazu
Adapter dysku SSD M.2  dla stacji roboczychLycomDT-120Adapter M.2 do PCIe 3.0 4-pasmowy
Sieciowa pamięć masowaSynologyDS-2415+Przechowywanie i analiza danych obrazowania
Dyski twardeWestern DigitalWD80EFZXRED 8 TB, klasa 5400 obr./min SATA 6 Gb/s 128 MB pamięci podręcznej 3,5 cala. Przechowywanie danych obrazowania (10 dysków + redundancja 2 dysków)
Software
Fluorescence AcquisitionHamamatsuHCImage DIANagrywanie dwukanałowych (GCaMP5 i mCherry) sekwencji obrazów fluorescencyjnych z prędkością 20 kl./s
Akwizycja jasnego polaFLIR (dawniej Point Grey Research)FlycaptureNagrywanie sekwencji
obrazów JPEG w jasnym poluStage Serial Port ReaderBonsaihttps://bitbucket.org/horizongir/bonsaiUłatwia śledzenie robaków podczas zachowania
Oprogramowanie kontrolera LEDTest ZeissMicro Toolbox 2011Aby ustawić intensywność i wejścia wyzwalające dla różnych diod LED w jednostce Colibri.2
ImageJ NIHhttps://imagej.net/Fiji/DownloadsProsty przegląd sekwencji obrazów i zmian formatowania w celu importu do oprogramowania Ratiometric Quantitation
ExcelMicrosoft  2002984-001-000001Do generowania podzbiorów danych o wartościach oddzielonych przecinkami z Volocity do analizy MATLAB
Znajdowanie pikówMATLABR2017aSkrypt używany do obliczeń cech piku współczynnika
Kwantymetryczne Atut kwantymetrycznejElmerVolocity 6.3Ułatwia obliczanie ratiometrycznych kanałów obrazu, segmentację obrazu w celu znalezienia obiektów i pomiar proporcji znalezionych obiektów
Scripts
XY-stage-final.bonsaiBonsaiCzytnik DAQ i portu szeregowego wyzwalany przez TTLRejestruje pozycję stopnia X i Y (w mikronach), gdy dołączone Arduino odbiera dodatni sygnał TTL z kamery sCMOS podczas ekspozycji klatki. Skrypt zapisuje plik .csv z czterema kolumnami: numerem klatki, pozycją X (mikrony), pozycją Y (mikronami) i czasem, jaki upłynął między klatkami (zwykle ~50 ms przy nagrywaniu z prędkością 20 kl./s).  Pozycje stolika X i Y z tego wyjścia (odpowiednio kolumny 2 i 3) są dodawane do pozycji środka ciężkości X i Y ze skryptu AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB (odpowiednio kolumny 4 i 5), aby uzyskać końcową pozycję X i Y obiektu fluorescencyjnego dla nagrania. 
na

Bibliografia

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81(2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198(2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773(2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126(2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378(2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697(2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7(2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174(2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reporter GCaMP5fluorescencja mCherryneurony HSNzachowanie zwi zane ze sk adaniem jajpod wietlenie podczerwoneakwizycja fluorescencjisegmentacja obrazuanaliza stosunku

Powiązane artykuły