Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56913

⸱

3 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Streszczenie

Technologia wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi (interferencji RNA) w całym genomie jest szeroko stosowana do wykrywania czynników gospodarza, które wpływają na replikację wirusa. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie tej technologii do odkrywania celów gospodarza, które specyficznie modulują replikację wirusa Maraba, onkolitycznego rabdowirusa i wirusa krowianki, w celu wzmocnienia terapii. Chociaż protokół został przetestowany pod kątem stosowania z onkolitycznym wirusem Maraba i onkolitycznym wirusem krowianki, podejście to ma zastosowanie do innych wirusów onkolitycznych i może być również wykorzystane do identyfikacji celów gospodarza, które modulują replikację wirusa w komórkach ssaków w ogóle. Protokół ten opisuje opracowanie i walidację testu do wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w komórkach ssaków, kluczowe zagadnienia i etapy przygotowawcze ważne dla przeprowadzenia pierwotnego wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi oraz przewodnik krok po kroku dotyczący przeprowadzania pierwotnego wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi; Ponadto szeroko przedstawiono w nim metody przeprowadzania wtórnych i trzeciorzędnych badań walidacyjnych. Zaletą wysokoprzepustowych badań przesiewowych RNAi jest to, że pozwalają skatalogować, w obszerny i bezstronny sposób, czynniki gospodarza, które modulują dowolny aspekt replikacji wirusa, dla którego można opracować test in vitro, taki jak zakaźność, wielkość serii i cytotoksyczność. Ma ona moc odkrywania celów bioterapeutycznych, których nie można było przewidzieć w oparciu o obecną wiedzę.

Wprowadzenie

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNAi całego genomu okazały się nieocenionym narzędziem do ujawniania biologicznych spostrzeżeń w różnych dziedzinach badań, w tym w biologii wirusów. W ciągu ostatniej dekady wiele grup podjęło zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe RNAi oparte na komórkach w celu szczegółowej identyfikacji genów gospodarza, które modulują replikację wirusa (Sprawdzone w1,2,3,4,5,6,7). Co ciekawe, wiele z tych badań przesiewowych przeprowadzono na komórkach nowotworowych, a kilka z nich zawierało wirusy, które są obecnie kandydatami na wirusy onkolityczne, w tym wirus krowianki8,9,10, wirus Myxoma11, wirus opryszczki pospolitej12, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej13,14 i wirus Maraba15. Podczas gdy większość tych badań skupiała się na identyfikacji czynników gospodarza, które wpływają na jakiś aspekt replikacji wirusa, a nie na identyfikacji celów bioterapeutycznych dla wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym, cenne dane można było wydobyć z tych zestawów danych w tym zakresie. Oczywiste jest, że potężny potencjał identyfikacji celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, nie został w pełni wykorzystany.

Obecnie testowane jest mnóstwo platform wirusów onkolitycznych w badaniach przedklinicznych i klinicznych, w tym wirus opryszczki pospolitej, reowirus i wirus krowianki, które odniosły wyraźny sukces w późnych fazach badań klinicznych. W przypadku większości tych platform wysiłki zostały skierowane na zmianę genomów wirusa w celu ulepszenia terapii. Na przykład, aby zwiększyć swoistość nowotworu, określone geny wirusa zostały usunięte lub zmutowane, aby znacznie ograniczyć replikację wirusa w normalnych komórkach, ale nie w komórkach nowotworowych. W niektórych przypadkach dodano transgeny, takie jak GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów granulocytów) w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej lub NIS (symporter jodku sodu), aby umożliwić obrazowanie in vivo i wychwyt radioaktywnego jodku w celach terapeutycznych. Jednak przeprowadzono bardzo niewiele prac skoncentrowanych na manipulowaniu genami gospodarza/guza i badaniu wpływu genów gospodarza/guza na replikację wirusa onkolitycznego. Wraz z pojawieniem się technologii wysokoprzepustowych badań przesiewowych, możliwe jest teraz sondowanie interakcji gospodarz-wirus w skali genomu i rozszyfrowywanie możliwości manipulowania genomem gospodarza w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznym (Recenzja w16,17,18).

Przedstawiliśmy pierwsze badanie, które demonstruje dowód słuszności koncepcji wykorzystania wysokoprzepustowych badań genetycznych do identyfikacji celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym. Aby odkryć geny gospodarza, które modulują onkolizę wirusa Maraba, onkolitycznego rabdowirusa będącego obecnie testowanym w badaniach fazy I i II, przeprowadziliśmy badania przesiewowe RNAi całego genomu na trzech różnych liniach komórek nowotworowych w dwóch egzemplarzach z biblioteką siRNA (krótkie interferujące RNA) ukierunkowaną na 18 120 genów15. Analiza szlaków trafień zidentyfikowanych na ekranach ujawniła wzbogacenie elementów szlaków odpowiedzi na stres ER (retikulum endoplazmatyczne). Wybraliśmy 10 trafień w ramach tych ścieżek do wtórnej walidacji przy użyciu siRNA z różnymi sekwencjami docelowymi niż te z pierwotnego ekranu. W ramach walidacji trzeciorzędowej przeprowadziliśmy eksperyment ratunkowy z IRE1α (enzymem alfa wymagającym inozytolu), aby potwierdzić, że trafienie było celne. Testy in vitro i in vivo z użyciem małocząsteczkowego inhibitora IRE1α wykazały radykalnie zwiększoną skuteczność onkolityczną.

Workenhe et al.12 przeprowadził również badanie przesiewowe RNAi całego genomu, korzystając z puli lentiwirusowej biblioteki shRNA (short hairpin) skierowanej do 16 056 genów, aby zidentyfikować czynniki gospodarza ograniczające onkolizę komórek raka piersi z mutacją ludzkiego wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) KM100. W pierwotnym badaniu przesiewowym zidentyfikowali 343 geny, których eliminacja prowadzi do zwiększonej cytotoksyczności komórek zakażonych KM100 w porównaniu z pozorowanymi komórkami; Wybrano 24 z tych genów do wtórnej walidacji. Spośród 24 genów, 8 genów zostało potwierdzonych w wtórnym badaniu przesiewowym, a jednym z nich był SRSF2 (czynnik splicingu bogaty w serynę/argininę 2), który został następnie potwierdzony za pomocą genetycznego eksperymentu ratunkowego podczas walidacji trzeciorzędowej. Grupa zidentyfikowała chemioterapeutyk inhibitora topoizomerazy DNA, który zmniejszył fosforylację SRSF2 i wykazał, że skojarzone leczenie HSV-1 KM100 z tym inhibitorem prowadzi do wydłużenia przeżycia myszy z guzem TUBO.

W wyżej wymienionych badaniach zastosowano podobny przebieg pracy. Każdy z nich rozpoczynał się od podstawowego badania przesiewowego RNAi obejmującego cały genom, po którym następowało wtórne badanie przesiewowe na wybranej liczbie trafień zidentyfikowanych w pierwotnym badaniu przesiewowym. Następnie przeprowadzono trzeciorzędowe badania walidacyjne, które obejmowały potwierdzenie, że trafienie było celowe, poprzez przeprowadzenie genetycznych eksperymentów ratunkowych in vitro, z ostateczną walidacją przeprowadzoną poprzez manipulowanie docelowym produktem genowym in vivo. W tym artykule najpierw przedstawiamy ogólny protokół opracowywania i walidacji wysokoprzepustowego testu przesiewowego siRNA, który obejmuje określenie optymalnych warunków transfekcji, ilości wirusa i czasu trwania infekcji. Oferujemy również szczegółowy protokół przeprowadzania pierwszorzędowego i wysokoprzepustowego badania przesiewowego siRNA, a także ogólny opis metody przeprowadzania walidacji wtórnego badania przesiewowego i walidacji trzeciorzędowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Opracowanie i walidacja wysokoprzepustowego testu przesiewowego siRNA

UWAGA: Do wszystkich eksperymentów używaj pożywek wzrostowych buforowanych przez Hepes, odpowiednich dla każdej linii komórkowej. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem przepływu pracy od optymalizacji testu do walidacji trzeciorzędnej.

  1. Określenie optymalnych warunków transfekcji
    1. Wybierz linię komórek nowotworowych lub najlepiej wiele linii komórek nowotworowych, za pomocą których zoptymalizujesz warunki transfekcji (np. 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru linii komórkowych).
    2. Wybierz odczynnik do transfekcji lub kilka do przetestowania. Może być konieczne przetestowanie kilku odczynników do transfekcji, ponieważ niektóre mogą być bardziej toksyczne lub wydajne niż inne w danej linii komórkowej. Należy również pamiętać, że niektóre mogą mieć wpływ na infekcję wirusową lub mogą generować wysoki sygnał tła podczas obrazowania.
    3. Zdecyduj się na pozytywne [np. siRNA ukierunkowane na mRNA PLK-1 (Polo Like Kinase 1), które indukuje śmierć komórki] i negatywne kontrole transfekcji (np. nieukierunkowane siRNA).
    4. Postępuj zgodnie z protokołem odwrotnej transfekcji dla konkretnego odczynnika do transfekcji, ale zmieniaj ilość odczynnika do transfekcji (np. 0,05, 0,1, 0,15 i 0,2 μl / dołek) i gęstość wysiewu komórek (np. 625, 1250, 2500 komórek / studzienkę). Uwzględnij powtórzenia następujących warunków: komórki niepoddane działaniu substancji, pozorowane komórki transfekowane (tj. komórki plus odczynnik do transfekcji) oraz komórki transfekowane siRNA z dodatnią i ujemną kontrolą transfekcji (patrz Rysunek 2A dla układu płytki próbki).
      1. Ogólnie rzecz biorąc, należy przygotować rozcieńczenia 80 nM każdego siRNA, aby uzyskać końcowe stężenie w studzience 10 nM (w zależności od biblioteki może być wymagane wyższe stężenie siRNA). O ile nie określono inaczej, rozcieńczyć siRNA rozcieńczalnikiem odczynnika do transfekcji. Przygotować rozcieńczenia odczynnika do transfekcji.
      2. Odpipetować 5 μl siRNA na basenik, a następnie 5 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji. Aby ułatwić ten krok, rozprowadź wzdłuż kolumny 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, siRNA miesza się i sam rozcieńczalnik siRNA (dla nieleczonych i pozorowanych transfekowanych komórek). Rozprowadzić wzdłuż drugiej kolumny rozcieńczony odczynnik do transfekcji i sam rozcieńczalnik odczynnika do transfekcji (dla komórek niepoddanych działaniu substancji).
        1. Za pomocą pipety elektronicznej odpipetować 5 μl/basenik zawartości pierwszej kolumny zawierającej siRNA lub rozcieńczalnik siRNA do odpowiednich studzienek płytki 384-dołkowej, a następnie 5 μl/basenik rozcieńczonego odczynnika do transfekcji lub rozcieńczalnika odczynnika do transfekcji z drugiej kolumny.
      3. Odwirować płytki przy 1026 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i inkubować przez czas określony dla odczynnika do transfekcji (np. 5-20 min).
      4. Podczas inkubacji płytek przygotuj zawiesiny komórek o różnej gęstości. Odpipetować 30 μl zawiesiny komórek do studzienki. Przed umieszczeniem płytek w inkubatorze pozostaw je na 45-60 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić równomierne osiadanie komórek19.
        Uwaga: Jeśli okres inkubacji przewidziany dla odczynnika do transfekcji z siRNA jest krótki, należy przygotować zawiesiny komórek przed inkubacją.
      5. Inkubować przez 48 do 72 godzin, w zależności od żądanej długości powalania wybranej dla ekranu.
    5. Przygotować roztwór utrwalający i barwiący składający się z formaldehydu, Hoechst 33342 i PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) dla końcowego stężenia w każdym dołku 4% formaldehydu i 5 ug/ml Hoechst 33342. W razie potrzeby wypróbuj wyższe (np. 7,5 ug/ml) lub niższe stężenie (np. 2 ug/ml) Hoechsta, jeśli sygnał jest odpowiednio zbyt słaby lub zbyt silny.
    6. Dozować 30 μl roztworu utrwalającego i barwiącego bezpośrednio do wszystkich studzienek. Inkubować płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C. W przypadku korzystania z mikroskopu niekonfokalnego należy umyć płytki PBS za pomocą podkładki do płytek; W większości przypadków mycie nie jest konieczne podczas korzystania z mikroskopu konfokalnego.
    7. Opracuj skrypt do ilościowego określenia liczby komórek w studzience.
      UWAGA: Dostępnych jest kilka pakietów oprogramowania do tego celu i chociaż każdy z nich może mieć różne sposoby generowania skryptów, wszystkie zazwyczaj mają środki do identyfikacji jąder, komórek i regionów zainteresowania, a także obliczania intensywności i właściwości morfologicznych. Opracowując scenariusz przesiewowy, ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas potrzebny na uruchomienie skryptu dla każdej płyty i być może uwzględnić tylko niezbędne pomiary, aby zminimalizować czas przetwarzania. Na przykład, aby określić ilościowo liczbę komórek, można obliczyć obszar Hoechsta na studnię powyżej określonej intensywności; Aby określić ilościowo rozprzestrzenianie się wirusa, można obliczyć obszar GFP (białka zielonej fluorescencji) na studnię powyżej określonej intensywności. "Okrojony" skrypt będzie musiał zostać porównany z bardziej skomplikowanym skryptem, aby upewnić się, że żadne istotne informacje nie zostaną utracone
      8. .
    8. Przeanalizuj wyniki, aby określić optymalne warunki transfekcji, czyli ilość odczynnika do transfekcji i gęstość wysiewu komórek, która powoduje znaczną śmierć komórki (0-30% przeżycia komórki) i jest minimalnie toksyczna dla komórek (np. 90-100% przeżycia komórki). Uwaga: Zaobserwowanie fenotypu śmierci komórki w liniach komórkowych o długim czasie podwojenia może zająć więcej czasu. Zobacz Rysunek 2B i 2C dla reprezentatywnych wyników. Upewnij się również, że komórki transfekowane niedocelowym siRNA są w około 90-100% zlewające się w momencie utrwalenia, ponieważ później będzie się chciało zainfekować komórki, które mają tę konfluencję.
  2. Określenie optymalnej ilości wirusa i czasu trwania infekcji
    1. Wykonać te same etapy transfekcji odwrotnej, jak opisano powyżej (patrz 1.1.4.1 do 1.1.4.4); jednakże stosować tylko optymalne warunki transfekcji (patrz 1.1.8) (np. dla komórek 786-O: 1500 komórek/basenik i 0,05 μL/basenik RNAiMAX) i dodatkowo włączyć dodatkowe studzienki do zakażenia wirusem [np. studzienki z komórkami niepoddanymi działaniu środka, symulowane transfekowane komórki, komórki transfekowane siRNA niebędącym celem oraz komórki transfekowane pozytywnymi kontrolami wirusa, jeśli są znane (tj. siRNA ukierunkowane na geny gospodarza, które hamują lub wzmacniają replikację)].
      1. Zobacz Rysunek 3A dla przykładowego układu płyty. Inkubować przez 48-72 godziny.
    2. Zakażenie dodatkowych studzienek wirusa wirusem onkolitycznym wykazującym ekspresję fluorescencyjnego białka reporterowego (np. GFP) o różnej liczebności infekcji (MOI) (np. 0,001 do 10; Wybrany zakres będzie zależał od poziomu oporności lub podatności linii komórkowej.). Uwzględnij również niezainfekowane studnie. Odmierzyć pipetą 40 μl każdego rozcieńczenia wirusa do studzienki, aby uzyskać końcową objętość 80 μl. Odwirować każdą płytkę o masie 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Po zakażeniu należy w regularnych odstępach czasu (np. co 4-8 godzin) obrazować żywe komórki za pomocą automatycznego mikroskopu o wysokiej zawartości. Zobacz Rysunek 3B i 3C.
    4. Opracowanie skryptu do ilościowego określania rozprzestrzeniania się wirusa (np. obszar GFP na studzienkę) (patrz 1.1.7). Przeanalizuj obrazy i wybierz punkt czasowy oraz MOI, które pozwalają na wykrycie wzrostów i spadków rozprzestrzeniania się. Upewnij się, że punkt czasowy i MOI mieszczą się w zakresie liniowym, aby ułatwić wykrycie niewielkich zmian w rozprzestrzenianiu się. Oszacuj współczynnik Z (lub Z') dla danego punktu czasowego i MOI.
      UWAGA: Szacowany współczynnik Z = 1 - 3 (σp + σn)/|μp-μ n|, gdzie σp jest odchyleniem standardowym próbki dla pozytywnych kontroli wirusa, a σn jest odchyleniem standardowym próbki dla ujemnych kontroli wirusa; a μp jest średnią z próby z dodatnich kontroli wirusa, a μn średnią z próbek z kontroli ujemnych. Szacowany współczynnik Z wynoszący 0,5 - 1,0 jest uważany za doskonały test i odpowiedni do badań przesiewowych20,21.
    5. Potwierdź, że siRNA z ujemną kontrolą wirusa nie ma wpływu na replikację wirusa, porównując je z pozorowanymi transfekowanymi i nieleczonymi studzienkami. Często konieczne jest przetestowanie wielu kontroli ujemnych, ponieważ niektóre ujemne kontrole siRNA mogą mieć wpływ na replikację wirusa.
  3. Ostateczna walidacja wysokoprzepustowego testu przesiewowego
    1. Powtórz kroki 1.2.1 i 1.2.2 powyżej, ale tylko tym razem zainfekuj komórki optymalnym MOI. Zamiast obrazowania na żywo, należy utrwalić i wybarwić płytkę (zgodnie z opisem w ppkt 1.1.5 i 1.1.6) w optymalnym punkcie czasowym (patrz ppkt 1.2.4).
    2. Wyobraź sobie płytę. Przeanalizuj wyniki za pomocą tego samego skryptu, który zostanie użyty dla ekranu (patrz 1.1.7 i 1.2.4). Należy potwierdzić warunki transfekcji (tj. dobre knockdown w studzienkach transfekowanych z dodatnią kontrolą transfekcji i minimalna toksyczność w studzienkach transfekowanych z ujemną kontrolą transfekcji). Oszacować współczynnik Z w celu określenia wiarygodności testu (zob. ppkt 1.2.4).
  4. Dalsze testy i rozważania dotyczące przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych
    1. Należy sprawdzić trwałość płytek do mikromiareczkowania, ponieważ niektóre z nich mogą pękać podczas wirowania, zwłaszcza gdy pokrywki są założone, a wiele płytek jest odwirowywanych jednocześnie. Aby zmniejszyć pękanie, odwiruj bez pokrywek (pod warunkiem, że płytki mają uszczelki) lub zmniejsz liczbę odwirowanych płytek w wiadrze.
    2. Zbadać stabilność mieszaniny odczynników do transfekcji w czasie. Po dodaniu odczynnika do transfekcji do płytek może wystąpić znaczne opóźnienie przed dodaniem komórek; Dlatego ważne jest, aby wiedzieć, przez jaki czas mieszanina odczynników do transfekcji będzie skuteczna. W przypadku badania przesiewowego może być konieczne przygotowanie komórek przed dodaniem mieszaniny odczynników do transfekcji do płytek.
    3. Przygotuj się do użycia dozownika płynu. Określ objętości wymagane do dozowania odczynnika do transfekcji, komórek, wirusa i fixu, biorąc pod uwagę objętość, którą mieści się rurka, objętość utraconą w wyniku wstępnego dozowania (jeśli urządzenie ma tę funkcję) oraz pozostałą objętość wymaganą w butelkach używanych do dozowania.
      1. Ustaw i przetestuj programy, które będą używane do dozowania odczynnika do transfekcji, komórek i wirusa. Aby zminimalizować straty odczynnika do transfekcji, ogranicz liczbę, jeśli to możliwe, liczby dozowników wstępnych. Ustal protokół kalibracji dozownika płynów i testowania jego dokładności i precyzji.
    4. Przygotować się do masowego dozowania odczynnika do transfekcji, komórek i wirusa
      1. Najpierw określ liczbę płytek do przetworzenia w jednej partii, biorąc pod uwagę liczbę płytek komórek, które można jednocześnie wytrypsynować, liczbę płytek do mikromiareczkowania, które można odwirować jednocześnie, czas potrzebny do przetworzenia jednej partii płytek za pomocą dozownika cieczy, a także czas potrzebny na obrazowanie. Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, przetwarzanie około 30 płytek na raz jest całkiem wykonalne, a przetwarzanie 3 partii płyt jest możliwe do opanowania w ciągu jednego dnia.
      2. Empirycznie zweryfikuj objętość odczynnika do transfekcji wymaganą do przetworzenia jednej partii płytek. Sprawdź, czy ta objętość jest odpowiednia, dozując 5 μl wody destylowanej wielokrotnie na jedną płytkę, tyle ile będzie wymagane do przetworzenia jednej partii.
      3. Aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, należy oszacować czas niezbędny do dozowania komórek w jednej partii płytek. Przygotować butelkę zawierającą objętość komórek wymaganą dla danej partii i dozować komórki do wielu kolumn płytki na raz, w regularnych odstępach czasu przez ten sam czas, jaki będzie potrzebny do dozowania partii płytek. Przetestuj, jak często konieczne będzie mieszanie komórek, aby utrzymać równomierne rozmieszczenie komórek.
      4. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wirusa, powtórzyć tę samą procedurę, co powyżej (patrz 1.4.4.3), ale tym razem dozując wirusa do zlewających się studzienek. Jeśli wirus nie jest równomiernie rozprowadzony, należy rozważyć przygotowanie wirusa w stożkowych probówkach i wirowanie każdej probówki przed dozowaniem.
    5. Śledź wzrost komórek, aby określić oś czasu wyhodowania wystarczającej liczby komórek na ekranie. Określ również średnią liczbę komórek, które można zebrać na płytkę komórek rosnących w fazie logarytmicznej, aby móc oszacować liczbę wymaganą dla ekranu.
  5. Końcowe etapy przygotowań do wysokoprzepustowych badań przesiewowych
    1. Do miesiąca przed rozpoczęciem badania przesiewowego należy określić wszystkie materiały niezbędne do wykonania badania. Zamów wszelkie wymagane odczynniki (patrz Materiały). Upewnij się, że wymagana ilość wirusa jest pod ręką (najlepiej użyć tego samego zapasu, który został użyty podczas optymalizacji).
    2. Do dwóch tygodni przed rozpoczęciem badań przesiewowych należy rozmrozić i wyhodować komórki potrzebne do badania przesiewowego. Zapewnij dostępność wiader wirówek i kwadratowych wiader wirówek.
    3. W ciągu tygodnia poprzedzającego rozpoczęcie badań przesiewowych przygotuj butelki z pożywką do transfekcji odwrotnej i infekcji, zapas 70% etanolu, 2X rozcieńczalnik odczynnika do transfekcji (np. 2X Opti-MEM), jeśli to konieczne (np. jeśli biblioteka siRNA jest rozcieńczona w wodzie wolnej od RNaz, należy użyć 2X do transfekcji komórek) oraz porcje wirusa (jedna na partię płytek). Sprawdź stan komórek.
      1. Przygotować roztwór podstawowy barwnika Hoechst 33342 (np. 5 mg/ml). Przygotuj płytkę równowagi, jeśli będzie potrzebna do wirowania.
      2. Upewnij się, że podkładka do płyt jest w dobrym stanie, jeśli będzie używana. Upewnij się, że dozownik płynu jest prawidłowo skalibrowany i dozuje dokładnie i precyzyjnie. Upewnij się również, że programy są prawidłowo ustawione w dozowniku płynów.

2. Przeprowadzanie głównego ekranu o wysokiej przepustowości

UWAGA: Przed rozpoczęciem badania przesiewowego RNAi, płytki mikromiareczkowe (np. płytki 384-dołkowe) muszą być połączone z biblioteką siRNA i kontrolnymi badaniami przesiewowymi. Poniższe kroki najlepiej wykonywać przez dwie osoby, przy czym jedna osoba (tj. osoba A) jest przede wszystkim odpowiedzialna za dozowanie odczynnika do transfekcji i komórek na płytkach, a druga osoba (tj. osoba B) jest odpowiedzialna za odwirowanie płytek bezpośrednio przed transfekcją i za przygotowanie komórek. W nawiasach znajdują się szczegółowe informacje dotyczące przetwarzania jednej partii 33 płytek (tj. połowy biblioteki) z linią komórkową 786-O.

  1. Przygotowanie do transfekcji odwrotnej
    1. Osoba A: Umieść wystarczającą ilość pożywki, trypsyny i PBS niezbędną do przetworzenia jednej partii płytek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Opcjonalnie: Trypsynizuj płytkę komórek i policz liczbę komórek na płytce, aby w czasie rzeczywistym oszacować liczbę płytek wymaganych na partię.
    2. Weź partię talerzy (np. 33 talerze) z zamrażarki i odczekaj 20-30 minut, aby talerze mogły się rozmrozić. Podczas rozmrażania płytek wykonaj następujące czynności.
      1. Osoba A: Odpipetować do stożkowych probówek o pojemności 50 ml ilość rozcieńczalnika odczynnika do transfekcji niezbędną do przetworzenia jednej partii płytek (np. 2 x 37,125 ml) i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Napełnij dwie butelki 70% etanolem (np. butelki o pojemności 250-500 ml). Napełnij dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml PBS i jedną wodą destylowaną.
      2. Osoba A: Zanurz rurkę dozownika płynu w butelce z 70% etanolem. Jeśli wszystkie końcówki nie będą używane do dozowania odczynnika do transfekcji (np. jeśli zewnętrzne dołki płytki nie są używane), najpierw odłącz niepotrzebne rurki. Umieść kawałek taśmy maskującej wokół rurki, aby zaznaczyć punkt, poniżej którego rurkę można uznać za sterylną. Zalać około 25 ml. Wlej dodatkowy etanol do butelki, aby zastąpić utraconą objętość. Pozostaw rurkę w etanolu na co najmniej 5 minut.
      3. Osoba B: Przygotuj się do trypsynizacji komórek. Spryskaj kaptur do hodowli tkankowych (TC) 70% etanolem. Spryskać i umieścić niezbędne pipety, końcówki, butelki i probówki do mikrofuge do przygotowania komórek w kapturze (patrz 2.2.1.1 i 2.2.1.2). Odwirować szczelnie zamknięte płytki w zestawach przy 1026 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zdjąć pokrywki z płytek w okapie TC, jeśli wcześniej stwierdzono, że płytki mogą pęknąć podczas wirowania, gdy pokrywki są założone (patrz 1.4.1).
    3. Osoba A: Usuń uszczelki z płyt. Przed, w trakcie lub po usunięciu uszczelek (w zależności od wymaganej długości inkubacji) należy odpipetować wymaganą ilość odczynnika do transfekcji (np. 375 μl/probówkę dla końcowego stężenia 0,05 μl RNAiMAX/basenik) do stożkowych probówek zawierających wstępnie podgrzany rozcieńczalnik odczynnika do transfekcji (np. 37,125 ml/probówkę).
    4. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez czas określony dla używanego odczynnika do transfekcji (np. 0-10 min).
  2. Odwrotna transfekcja
    1. Poproś osobę B o wykonanie następujących zadań.
      1. Rozpocznij trypsynizację komórek (np. 3 płytki z komórkami 786-O). Odessać pożywkę z każdej płytki. Spłucz 9 ml PBS. Odmierzyć pipetą 3 ml trypsyny na płytkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez około 5 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 22 ml pożywki. Pibułuj w górę i w dół 10 razy.
      2. Połączyć zawiesinę komórkową z każdej płytki do hodowli tkankowej w sterylnej butelce. Wymieszaj zawiesinę komórkową przez odwrócenie. Odmierzyć pipetę o objętości 1 ml zawiesiny komórkowej do dwóch oddzielnych probówek do mikrofuge. Wyjmij próbkę z każdej probówki do mikrofuge i policz komórki. Obliczyć objętość zawiesiny komórek wymaganą dla wymaganej gęstości (np. 1500 komórek/basenik) i przygotować wystarczającą ilość rozcieńczonej zawiesiny komórek (np. 500 ml), aby dozować ją na jedną partię płytek.
    2. Poproś osobę A o wykonanie następujących zadań równolegle z osobą B.
      1. Opróżnij rurkę dozownika cieczy z etanolu. Zalać rurkę około 25 ml PBS, a następnie opróżnić rurkę. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z rurką, aby upewnić się, że odcinek rurki poniżej taśmy maskującej, który zostanie zanurzony w odczynniku do transfekcji, a następnie w zawiesinie komórek, jest utrzymywany w sterylności. Oddziel płytki, które można bezpiecznie wykonać za pomocą jednej stożkowej probówki z roztworem odczynnika do transfekcji.
      2. Pipetować roztwory odczynników do transfekcji w górę i w dół 10 razy. Zalać rurkę roztworem odczynnika do transfekcji. Aby zminimalizować utratę odczynnika do transfekcji, zalać roztworem tylko tyle, aby ledwo oczyścić końcówki. Wybierz odpowiedni program w dozowniku płynów i dozuj 5 μl odczynnika do transfekcji na dołek.
        UWAGA: Uważnie monitoruj poziom odczynnika do transfekcji, aby został on uzupełniony przed wyczerpaniem. Ukończenie płytek, które są oddzielone, powinno stanowić wskazówkę do dodania większej ilości roztworu odczynnika do transfekcji.
      3. Odwirować płytki przy 1026 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Tym razem pokrywki będą założone, więc może być konieczne odwirowanie mniejszej liczby płytek na raz, aby zapobiec pękaniu (np. 2 płytki na wiadro). Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez czas określony dla używanego odczynnika do transfekcji (np. 10-20 min).
      4. Podczas inkubacji opróżnij rurkę z roztworem odczynnika do transfekcji i umieść ją w pełnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS. Przepłukać rurkę około 25 ml PBS, zalewając i opróżniając.
        1. Jeśli do dozowania komórek ma być używanych więcej końcówek niż do dozowania odczynnika do transfekcji, ponownie podłącz nieużywaną rurkę i ponownie wysterylizuj wszystkie rurki 70% etanolem przed przepłukaniem rurki PBS (patrz 2.1.2.2).
      5. Po przygotowaniu wymieszać butelkę zawierającą zawiesinę komórkową. Umieść rurkę w zawiesinie ogniw i zalej na tyle, aby zobaczyć, że każda końcówka dozuje się prawidłowo. Dozować 30 μl zawiesiny komórek na dołek na wszystkie płytki. W razie potrzeby mieszać zawiesinę komórek w regularnych odstępach czasu, aby uniknąć osiadania.
        UWAGA: Czasami kropelki zawiesiny zawierające podłoże mogą przyklejać się do boków końcówek. Gdy to zaobserwujesz, odessaj tak szybko, jak to możliwe lub przetrzyj niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem.
      6. Opróżnij rurkę zawiesiny ogniw. Przepłucz rurkę około 25 ml PBS, a następnie około 50 ml wody destylowanej.
    3. Pozostaw płytki na 45-60 minut od momentu wysiewu komórek w temperaturze pokojowej przed powrotem do inkubatora. Inkubować płytki w niezakłóconym inkubatorze przez żądany czas wyciszania genów (np. 48 godzin) (patrz 1.1.4.5).
  3. Zakażać
    1. Aby zaoszczędzić czas, dzień przed zakażeniem komórek należy odpipetować do sterylnych butelek dokładną ilość pożywki potrzebną do zakażenia każdej partii płytek, w tym pożywki do niezakażonych studzienek (np. 2 x 350 ml i 2 x 50 ml dla 33 płytek). Ponadto przetestuj dozownik płynu pod kątem precyzji i dokładności, a w razie potrzeby dokonaj ponownej kalibracji.
    2. Ogrzać podłoże w temperaturze 37 °C. Napełnić dwie butelki 70% etanolem, dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml z PBS i jedną z wodą destylowaną. Sprawdź, czy wirówka ma temperaturę pokojową.
    3. Wysterylizuj rurkę 70% etanolem i przepłucz PBS, jak opisano wcześniej (patrz 2.1.2.2 i 2.2.2.1). Podczas gdy rurka znajduje się w etanolu, odpipetować dokładną ilość wirusa potrzebną do butelki zawierającej pożywkę uprzednio przygotowaną do zakażenia (patrz ppkt 2.3.1). Przepłukać rurkę PBS, zalewając ją 25 ml, a następnie opróżniając.
    4. Wyjmij płytki z inkubatora i umieść je w okapie TC. Zagruntować rurki mediami. Dozować 40 μl pożywki do niezainfekowanych studzienek kontrolnych. Opróżnij rurkę z pożywki i spłucz 25 ml PBS. (patrz 2.2.2.5 dla UWAGI)
    5. Po wymieszaniu wirusa umieścić rurkę w butelce zawierającej wirusa. Dozować 40 μl wirusa na płytki. Odwirowywać płytki przez 30 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze. Inkubować płytki przez poprzednio ustalony okres czasu (np. 24 godziny) (patrz ppkt 1.2.4).
  4. Utrwalanie i barwienie komórek
    1. Aby zaoszczędzić czas, dzień przed utrwalaniem przygotuj butelkę roztworu utrwalającego i barwiącego zawierającego formaldehyd i PBS (np. 179 ml 37% formaldehydu i 270 ml PBS dla końcowego stężenia 4% formaldehydu) dla każdej partii płytek, ale pomiń barwienie Hoechst. Przechowywać w łatwopalnej szafce z dala od światła.
    2. Przepłukać rurkę 70% etanolem i PBS, jak opisano wcześniej (patrz 2.1.2.2 i 2.2.2.1). Dodać wymaganą objętość Hoechst (np. 2,5 ml z 5 mg/ml Hoechst dla końcowego stężenia w studzience 7,5 μg/ml) do roztworu utrwalającego i barwiącego i wymieszać.
    3. Dozować 30 μl roztworu utrwalającego i barwiącego na wszystkie płytki. Umieść płytki w inkubatorze na 30 minut. Po inkubacji nałożyć uszczelki na płytki i przechowywać płytki w temperaturze 4°C, chroniąc je przed światłem. W razie potrzeby umyć płytki (patrz 1.1.6).
  5. Obrazowanie i analiza obrazu
    1. Obrazuj płytki za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu o wysokiej zawartości. Użyj wcześniej określonych ustawień, ale najpierw przetestuj ustawienia, aby upewnić się, że nie trzeba wprowadzać żadnych zmian.
    2. Określić ilościowo obszar GFP (lub innego fluorescencyjnego reportera) i obszar Hoechsta na studzienkę, korzystając z wcześniej opracowanego skryptu (patrz 1.3.2). Przetestuj skrypt z kilkoma płytami, aby określić, czy należy wprowadzić jakiekolwiek niewielkie modyfikacje, zanim przeanalizujesz wszystkie płytki.
    3. Zidentyfikuj trafienia. Uwaga: Metoda solidnego wskaźnika Z-score/MAD (mediany odchylenia bezwzględnego) jest często stosowaną w tym celu. Zazwyczaj wyniki >2 lub <-2 są ustawiane jako punkty odcięcia. Metodę tę najlepiej stosować, gdy próbki siRNA są losowo rozmieszczone na płytkach, a nie na przykład pogrupowane według funkcji, ponieważ próbki są używane de facto jako kontrole ujemne. Odfiltruj cytotoksyczne siRNA, ponieważ oczekuje się, że niespecyficznie zmniejszą one rozprzestrzenianie się wirusa (zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat filtrowania uderzeń cytotoksycznych).

3. Wtórna walidacja trafień za pomocą biblioteki shRNA TRC (The RNAi Consortium)

UWAGA: Zobacz Dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wyboru trafień do wtórnej walidacji i możliwych technologii przesiewowych. Jeśli technologia siRNA zostanie wybrana do wtórnej walidacji, można zastosować ten sam protokół opracowywania i walidacji testu, który został użyty do pierwotnego badania przesiewowego (patrz 1).

  1. Uzyskaj niestandardową bibliotekę shRNA TRC ukierunkowaną na geny kandydujące jako zapasy glicerolu.
  2. Przygotować plazmidowe DNA o jakości transfekcji z zapasów glicerolu. Uwaga: Szczegółowy protokół (tj. "Preparat glicerolu i plazmidowego DNA shRNA/sgRNA/ORF") można znaleźć tutaj: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Wytwarzaj lentiwirusy wykazujące ekspresję shRNA, ukierunkowane na geny będące przedmiotem zainteresowania za pomocą plazmidów DNA. Uwaga: Szczegółowy protokół produkcji lentiwirusa na płytkach 96-dołkowych [tj. "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput Viral Production (96 well)"] można znaleźć tutaj: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infekuj komórki lentiwirusami. Uwaga: Szczegółowy protokół infekcji lentiwirusowej w płytkach 96-dołkowych (tj. "Zakażenie lentiwirusowe") jest dostępny online pod adresem http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral%20infection%20200909.pdf.
  5. Zakażenie komórek wirusem onkolitycznym należy przeprowadzić albo po selekcji puromycyny (patrz 3.4 dla protokołu selekcji) komórek poddanych pomyślnej transdukcji lub bezpośrednio po transdukcji (bez selekcji puromycyny). Aby określić optymalną ilość wirusa i czas trwania inkubacji z wirusem, należy użyć tej samej metody, która jest używana w przypadku głównego badania przesiewowego.

4. Walidacja trzeciorzędna

UWAGA: Celem walidacji trzeciorzędnej jest przede wszystkim potwierdzenie, że trafienie jest celne, specyficzne dla nowotworu i zwiększa skuteczność in vivo. Można również sprawdzić, czy moduluje rozprzestrzenianie się w całym spektrum linii komórek nowotworowych

  1. Potwierdzenie, że knockdown genu kandydującego jest zgodny z celem
    1. Najpierw potwierdź, że istnieje korelacja między fenotypem a wyciszeniem genów. Użyj tego samego testu, który został opracowany dla badania przesiewowego lub zmodyfikuj go dla formatu 6-dołkowego, aby ocenić wzmocnienie lub zahamowanie rozprzestrzeniania się w większym formacie. Przeprowadź przebieg czasowy z komórkami transfekowanymi siRNA, celując w gen(y) interesującego wirusa plus i minus.
    2. Zobrazuj studzienki zawierające komórki zakażone wirusem i zbieraj lizaty komórkowe z niezainfekowanych studzienek w regularnych odstępach czasu. Określ, czy istnieje korelacja między wyciszaniem genów a wzmocnieniem lub zahamowaniem rozprzestrzeniania się. Oceń wyciszenie genów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) i/lub Western blot.
    3. Przeprowadź genetyczny eksperyment ratunkowy, aby potwierdzić, że trafienie było celne. Uwaga: W typowym eksperymencie ratunkowym gen kandydujący jest powalany za pomocą RNAi, podczas gdy w tym samym czasie komórki są przejściowo transfekowane cDNA opornym na RNAi (np. ortologiem genu) eksprymującym gen kandydujący w celu określenia, czy fenotyp genu jest przywrócony, czy "uratowany". Można również zastosować stabilne linie komórkowe z nadekspresją opornego na RNAi cDNA genu kandydującego.
    4. Alternatywnie, zamiast genetycznego eksperymentu ratunkowego, użyj wielu testów ortogonalnych, aby potwierdzić, że trafienie jest celne [np. Określ, czy ten sam fenotyp uzyskuje się po nokautacji docelowego genu z wieloma siRNA, po nokautacji docelowego genu w wielu stabilnych liniach komórkowych wyrażających shRNA przeciwko genowi docelowemu oraz po nokaucie za pomocą technologii CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 w wielu liniach komórkowych.].
  2. Potwierdzenie, że trafienie jest specyficzne dla guza i moduluje rozprzestrzenianie się w szeregu linii komórek nowotworowych
    1. Przeprowadzić podobny test jak w ppkt 4.1.1, ale z normalnymi komórkami, jak również z innymi liniami komórek nowotworowych.
  3. Potwierdzenie, że manipulacja genem kandydującym zwiększa skuteczność in vivo
    UWAGA: Poniżej opisano trzy możliwe metody manipulowania celem genu in vivo.
    1. Znajdź lek, aby manipulować celem genu. Jeśli istnieje lek, taki jak inhibitor małocząsteczkowy, który jest ukierunkowany na ten sam gen, podawaj go z wirusem onkolitycznym in vivo. Ważne jest, aby określić optymalny czas podawania leku.
    2. Zaprojektuj wirusa tak, aby hamował lub nadmierną ekspresję docelowego genu w zależności od tego, czy ktoś chce zahamować, czy wzmocnić cel genu. Aby zahamować gen, należy zmodyfikować wirusa onkolitycznego tak, aby wyrażał dominujący negatyw genu lub wyrażał shRNA ukierunkowany na gen. Aby zwiększyć ekspresję docelowego genu, sklonuj wirusa onkolitycznego z transgenem powodującym nadekspresję genu.
    3. Inżynieria linii komórkowych z genem powalonym lub znokautowanym za pomocą odpowiednio technologii shRNA lub CRISPR-Cas9. Wszczepić zmodyfikowaną linię komórkową i linię komórkową typu dzikiego in vivo, a następnie zainfekować wirusem onkolitycznym. Uwaga: Ta metoda służy jako dowód słuszności zasady i może pomóc w ustaleniu, czy warto byłoby zainwestować dodatkowy czas i zasoby w opracowanie leku do manipulowania genem in vivo, na przykład.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd schematu postępowania w celu identyfikacji celów gospodarza w celu usprawnienia terapii wirusami onkolitycznymi przedstawiono na Rysunku 1.

Jak pokazano na Rysunku 1, krytycznym pierwszym krokiem w przeprowadzaniu wysokoprzepustowego screeningu RNAi jest opracowanie testu. Rysunek 2A przedstawia przykładowy układ płytki dla testu o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania wysokoprzepustowych badań przesiewowych RNAi w celu identyfikacji celów gospodarza, którymi można manipulować w celu wzmocnienia terapii wirusem onkolitycznym. Zostało to z powodzeniem przetestowane z onkolitycznym wirusem Maraba i onkolitycznym wirusem krowianki, ale, jak wspomniano, można je dostosować do stosowania z innymi wirusami onkolitycznym lub ogólnie innymi wirusami w celu identyfikacji genów gospodarza, które modulują replikację wirusa. Protokół badań przesiewow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Ontario Institute for Cancer Research, Canada Foundation for Innovation, Ottawa Regional Cancer Foundation oraz Terry Fox Research Institute. K.J.A. był wspierany przez Vanier Canada Graduate Scholarship, Canadian Institute for Health Research-Master's Award oraz Ontario Graduate Scholarship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biblioteka Consumables
siRNAGE DharmaconG-005005-02
Corning 384-dołkowa płytkaCorning3985
Falcon 384-dołkowaBecton Dickinson353962
WaterSigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars Kontrola negatywna siRNAQiagenSI03650318
siGenome Nieukierunkowana pula siRNA #2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM/WYSOKI poziom glukozyGE Healthcare Nauki przyrodniczeSH30022.01
Surowica bydlęcapłodu SigmaF15051-500ML
Roztwór HEPES (1M)SigmaH3535-100ML
Penicylina-Streptomycyna 100X roztwórGE Healthcare Nauki przyrodniczeSV30010
Trypsyna-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific2500056
DPBS/ModyfikowanyGE Healthcare Life SciencesSH30028.02
Lipofektamina RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778100
Oligofektamina.Thermo Fisher Scientific1225011
Opti-MEMThermo Fisher Scientific22600-050
Sól sodowa rezazurynySigmaR7017-5G
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH21492
Formaldehyd (37% wagowo)Butelki Fisher ScientificF79-4
500 mlCorning
Samoprzylepna folia uszczelniająca do mikropłytekExcel Scientific361006007
Zrywalna folia termozgrzewalnaThermo Fisher ScientificAB-3720
BioTek MicroFlo Select Kaseta dozownikaFisher Scientific11-120-625
NazwaCompanyKatalog NumerKomentarze
Equipment
MicroFlo Select (dozownik płynów)Fisher Scientific11120621
BioTek Synergy HT czytnik płytekBiotekN/A
Opera Instrument do obrazowania i analizyPerkinElmerHH10000115
KiNEDx Analiza i automatyzacja pików ramienia robotycznego(dawniej Peak Robotics)KX-300-660
Automatyczny inkubator Cytomat serii 24CThermo Fisher Scientific50080227
JANUS Zautomatyzowana stacja roboczaPerkinElmerAJI4M01
KaruzelaAnaliza i automatyzacja pików (dawniej Peak Robotics)Nie dotyczy
zgrzewarki do płyt Alps 3000Thermo Fisher ScientificAB-3000
430282 płytowa

Bibliografia

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431(2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Identyfikacja czynnik w gospodarzatest replikacji wirusawysokoprzepustowe przesiewanieprzygotowanie odczynnika do transfekcjiprzygotowanie zawiesiny kom rkowejprotok zaka ania wirusemwt rne badania walidacyjnetrzeciorz dowe metody walidacyjne

Powiązane artykuły