Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56915

⸱

12 grudnia 2017

 , 
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Streszczenie

Wektory lentiwirusowe są idealnym wyborem do dostarczania komponentom edycji genów do komórek, ze względu na ich zdolność do stabilnej transdukcji szerokiego zakresu komórek i pośredniczenia w wysokim poziomie ekspresji genów. Jednak ich zdolność do integracji z genomem komórki gospodarza zwiększa ryzyko mutagenności insercyjnej, a tym samym budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa i ogranicza ich stosowanie w warunkach klinicznych. Co więcej, trwała ekspresja składników edycji genów dostarczanych przez te kompetentne do integracji wektory lentiwirusowe (ICLV) zwiększa prawdopodobieństwo rozwiązłego celowania w geny. Alternatywnie opracowano nową generację wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV), które rozwiązują wiele z tych problemów. W tym miejscu opisano protokół produkcji nowej i ulepszonej platformy IDLV do edycji genów za pośrednictwem CRISPR oraz wymieniono etapy związane z oczyszczaniem i koncentracją takich wektorów oraz wykazano ich skuteczność transdukcji i edycji genów przy użyciu komórek HEK-293T. Protokół ten jest łatwo skalowalny i może być używany do generowania IDLV o wysokim mianie, które są zdolne do transdukcji komórek in vitro i in vivo. Co więcej, protokół ten można łatwo dostosować do produkcji ICLV.

Wprowadzenie

Precyzyjna edycja genów stanowi fundament głównych postępów biomedycznych obejmujących opracowywanie nowych strategii walki z chorobami genetycznymi. Na czele technologii edycji genów znajduje się metoda oparta na wykorzystaniu systemu clustered regularly-interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9, który został początkowo zidentyfikowany jako element odporności bakteryjnej przeciwko inwazji wirusowego materiału genetycznego (omówiono w referencjach1,2). Główną zaletą systemu CRISPR/Cas9 w porównaniu z innymi narzędziami do edycji genów, takimi jak nukleazy z palcem cynkowym (ZFN) i nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) (omówiono w referencji3), jest względna prostota projektowania plazmidów i konstrukcji komponentów CRISPR — cecha ta przyczyniła się do rozprzestrzenienia edycji genów z kilku wyspecjalizowanych laboratoriów do znacznie szerszej społeczności badawczej. Dodatkowo prostota programowania CRISPR/Cas9 oraz zdolność do multipleksowego rozpoznawania celów dodatkowo zwiększyły popularność tej technologii jako efektywnej kosztowo i łatwej w użyciu. Wśród różnych metod dostarczania takich komponentów do edycji genów do komórek, wektory wirusowe pozostają zdecydowanie najpopularniejszym i najskuteczniejszym systemem.

Wektory lentiwirusowe (LV) stały się preferowanym nośnikiem do dostarczania komponentów systemu CRISPR/Cas9 in vivo w różnorodnych zastosowaniach4,5,6,7. Kilka kluczowych cech sprawia, że LV są popularnym wyborem w tym procesie, w tym ich zdolność do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się, niska immunogenność oraz minimalna toksyczność komórkowa (przegląd w referencji8). W rezultacie terapia genowa z wykorzystaniem LV była stosowana w leczeniu chorób zakaźnych, takich jak HIV-1, HBV i HSV-1, a także w korekcji defektów leżących u podstaw dziedzicznych chorób ludzkich, takich jak mukowiscydoza i neowaskularna zwyrodzenie plamki4,5,7,9,10,11. Ponadto wektory LV zostały skutecznie zmodyfikowane w celu przeprowadzania multipleksowej edycji genów w różnych locus genomowych przy użyciu pojedynczego systemu wektorowego12.

Jednakże immanentna właściwość LV polegająca na integracji z genomem gospodarza może mieć charakter mutagenny i często ogranicza ich użyteczność jako nośników transgenów, zwłaszcza w zastosowaniach klinicznych. Co więcej, ponieważ stabilnie zintegrowane LV wykazują trwałą, wysoką ekspresję transgenów, system ten nie nadaje się do dostarczania komponentów edycji genów, takich jak CRISPR/Cas9; nadekspresja Cas9-guide RNA (gRNA) oraz podobnych białek, takich jak ZFNs, wiąże się z podwyższonym poziomem efektów off-target, obejmujących niepożądane mutacje13,14,15,16,17 i może potencjalnie zwiększać cytotoksyczność18. Dlatego też, aby osiągnąć precyzyjną edycję genów przy minimalnych efektach off-target, niezbędne jest zaprojektowanie systemów umożliwiających przejściową ekspresję komponentów edycji genów.

W ostatnich latach opracowano wiele platform dostarczania w celu przejściowej ekspresji CRISPR/Cas9 w komórkach16,19,20,21 (przegląd w referencji22). Obejmują one metody opierające się na bezpośrednim wprowadzaniu oczyszczonego białka Cas9 wraz z odpowiednimi przewodnimi RNA do komórek, co okazało się bardziej skuteczne w ukierunkowanej edycji genów w porównaniu z transfekcją za pomocą plazmidów16. Badania wykazały, że kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) składające się z cząsteczek gRNA/Cas9 są szybko degradowane po przeprowadzeniu cięcia DNA w miejscach docelowych, co sugeruje, że krótkotrwała ekspresja tych komponentów jest wystarczająca do uzyskania skutecznej edycji genów16. Można przypuszczać, że nieintegrujące platformy wektorów wirusowych, takie jak wektory wirusów adeno-zależnych (AAV), mogą stanowić realną alternatywę dla dostarczania mechanizmów edycji genów do komórek. Niestety, kapsydy AAV posiadają znacznie niższą zdolność pakowania niż LV (<5kb), co poważnie ogranicza możliwość zapakowania wieloskładnikowego zestawu CRISPR w ramach pojedynczego wektora (przegląd w referencji8). Warto zauważyć, że dodanie związków hamujących deacetylazy histonowe (np. maślan sodu23) lub blokujących cykl komórkowy (np. kofeinę24) może zwiększać miana lentiwirusów. Pomimo postępów, systemy ekspresji przejściowej opracowane do tej pory wciąż borykają się z kilkoma wadami, takimi jak niższa wydajność produkcji, co prowadzi do zredukowanych mian wirusów, oraz niska wydajność transdukcji wirusów generowanych za pomocą takich podejść25.

Lentiwirusowe wektory pozbawione integrazą (IDLVs) stanowią istotny postęp w opracowywaniu nośników dostarczania genów, ponieważ łączą zdolność pakowania charakterystyczną dla LV z dodatkową zaletą utrzymywania episomalnego w komórkach, podobnie jak w przypadku AAV. Cechy te pozwalają IDLVs w dużej mierze uniknąć głównych problemów związanych z wektorami integrującymi, takich jak ciągła nadekspresja potencjalnie genotoksycznych elementów oraz mutagenność indukowana przez integrację. Wcześniej wykazano, że IDLVs mogą być skutecznie modyfikowane w celu zwiększenia ekspresji genów episomalnych26,27. W odniesieniu do dostarczania CRISPR/Cas9 za pomocą IDLV, niskie miana produkcji oraz niższa ekspresja genomów przenoszonych episomalnie w porównaniu z systemami lentiwirusowymi posiadającymi integrazę ograniczają ich użyteczność jako bona fide narzędzi do dostarczania transgenicznych konstruktów do edycji genomu. Niedawno wykazaliśmy, że zarówno ekspresja transgenu, jak i miana wirusowe związane z produkcją IDLV są znacząco zwiększone dzięki włączeniu miejsc wiązania dla czynnika transkrypcyjnego Sp1 w obrębie wirusowej kasety ekspresyjnej28. Zmodyfikowane IDLVs skutecznie wspierały edycję genów za pośrednictwem CRISPR zarówno in vitro (w komórkach HEK-293T), jak i in vivo (w postmitotycznych neuronach mózgowych), wywołując przy tym minimalną liczbę mutacji poza docelowych w porównaniu z odpowiadającymi im systemami opartymi na ICLV28. Podsumowując, opracowaliśmy nowy, kompaktowy, zintegrowany zestaw narzędzi CRISPR przenoszony na platformie IDLV i opisaliśmy różnorodne zalety stosowania takiego nośnika w celu usprawnienia edycji genów.

W niniejszym dokumencie opisano protokół produkcji systemu IDLV-CRISPR/Cas9, obejmujący poszczególne etapy składania, oczyszczania, zagęszczania i miareczkowania IDLV, a także strategie walidacji skuteczności edycji genów za pomocą tych wektorów. Protokół ten można łatwo skalować w zależności od potrzeb badaczy i został on opracowany tak, aby skutecznie generować wektory LV o mianach w zakresie 1 x 1010 jednostek transdukcyjnych (TU)/mL. Wektory wytworzone zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystane do wydajnego zakażania kilku różnych typów komórek, w tym trudnych do transdukcji embrionalnych komórek macierzystych, komórek krwiotwórczych (limfocytów T i makrofagów) oraz neuronów hodowlanych i wstrzykiwanych in vivo. Ponadto protokół ten jest równie odpowiedni do produkcji wektorów lentiwirusowych kompetentnych integrazowo w podobnych ilościach.

Edycja genów; domeny wiążące cynk, katalityczne i wiążące DNA; elektroforeza w żelu, schemat plazmidu.
Rycina 1: Pakowanie IDLV. (a) Schemat białka integrazą typu dzikiego (b) Modyfikowany plazmid został wyprowadzony z psPAX2 (szczegóły patrz w sekcji Metody, konstrukcja plazmidu). Reprezentatywny obraz żelu agarozy klonów przesiewanych pod kątem zmutowanych klonów integrazą. Próbki DNA przygotowane za pomocą standardowego mini-zestawu do izolacji plazmidowego DNA analizowano poprzez trawienie EcoRV i SphI. Prawidłowo trawiony klon (numer 5, przerywana czerwona ramka) został następnie zweryfikowany za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania (Sanger) pod kątem substytucji D64E w INT. Kaseta pakująca pozbawiona integrazą została nazwana pBK43. (c) Schemat protokołu przejściowej transfekcji zastosowanego do generowania wektorów IDLV-CRISPR/Cas9, przedstawiający komórki 293T transfekowane kasetami VSV-G, pakującą oraz kasetą transgenu (plazmid all-in-one Sp1-CRISPR/Cas9). Cząstki wirusowe wypączkowujące z błony komórkowej zawierają pełnowymiarowe RNA wektora (wyrażane z kasety transgenu). Zastosowano drugą generację systemu pakowania IDLV, która obejmuje białka regulacyjne Tat i Rev. Ekspresja Rev jest dodatkowo uzupełniana z oddzielnej kasety (plazmid RSV-REV). Skróty: LTR – długa powtórka końcowa, VSV-G – białko G wirusa zapalenia jam ustnych pęcherzykowego, pCMV – promotor cytomegalowirusa; promotor wirusa białaczkowego ptaków (RSV); RRE – element odpowiedzi Rev (Rev Response Element). Inne elementy regulacyjne w kasecie ekspresyjnej obejmują miejsca wiązania Sp1, element odpowiedzi Rev (RRE), posttranskrypcyjny element regulacyjny wirusa zapalenia wątroby świstaka (WPRE), promotor czynnika elongacyjnego 1α (EFS-NC), element pakowania wektora ψ (psi), ludzki promotor Cytomegalowirusa (hCMV) oraz ludzki promotor U6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek HEK-293T i wysiew komórek do transfekcji

UWAGA: Komórki ludzkiej embrionalnej nerki 293T (HEK-293T) hoduje się w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej z dodatkiem żelaza i promotorów wzrostu oraz 1x roztwór antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych (roztwór 100x zawiera 10 000 jednostek penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 µg amfoterycyny B na mL). Pożywka jest dodatkowo suplementowana 1x pirogronianem sodu, 1x mieszaniną nieistotnych aminokwasów oraz 2 mM L-glutaminą (stok 200 mM L-alanyl-L-glutaminy w 0,85% NaCl). Komórki hoduje się na płytkach do hodowli tkanek o średnicy 100 mm (przybliżona powierzchnia wzrostu wynosi 55 cm²). Stosowany stosunek podziału to 1:10, przy pasażowaniu co 2-3 dni. Do dysocjacji komórek między pasażami stosuje się Trypsynę-EDTA 0,05%. Aby zachować spójność między eksperymentami, zaleca się testowanie surowic cielęcych przy zmianie partii/serii oraz monitorowanie wszelkich zmian w tempie wzrostu komórek, wydajności transfekcji i produkcji wektorów.

  1. Rozpocznij nową hodowlę, używając komórek o niskim numerze pasażu (zaleca się nieużywania komórek po 15. pasażu lub w przypadku spowolnienia wzrostu), wysiewając je na 10-cm płytkę do hodowli tkankowej. Do wzrostu komórek należy stosować DMEM uzupełniony o 10% surowicy. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych. Do liczenia komórek we wszystkich kolejnych krokach używaj standardowego hemocytometru.
  2. Gdy komórki osiągną 90 - 95% konfluencji, prześiew je na 15-cm płytki do hodowli tkankowej (patrz poniżej, kroki 1.3 - 1.5).
  3. Aby prześiać komórki, odessij pożywkę z konfluencyjnej płytki i delikatnie wypłucz sterylnym 1x PBS. Inkubuj komórki z 2 mL odczynnika dysocjującego (np. Trypsyna-EDTA) w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 min. Dodaj 8 mL pożywki zawierającej surowicę w celu inaktywacji odczynnika dysocjującego i trituruj 10 - 15 razy za pomocą pipety serologicznej 10 mL, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Resuspenduj komórki w pożywce hodowlanej, aby uzyskać gęstość komórek około 4 x 106 komórek/mL.
  4. Aby zwiększyć przyleganie do podłoża, pokryj wcześniej 15-cm płytki 0,2% żelatyną, dodając 8 mL żelatyny na płytkę. Rozprowadź równomiernie po powierzchni płytki, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 min, a następnie odessij ciecz.
  5. Dopełnij całkowitą objętość każdej płytki do 25 mL ciepłą (37 °C) pożywką dla HEK-293 T (patrz uwaga pod krokiem 1) i zasiaj płytki, dodając 2,5 mL komórek (łącznie ~1 x 107 komórek/płytkę). Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc lub do osiągnięcia 70 - 80% konfluencji.
    UWAGA: Do produkcji można wykorzystać do sześciu 15-cm płytek. Dostosuj objętość pożywki na płytkę do ~20 - 22 mL w przypadku użycia więcej niż czterech płytek (uzasadnienie znajduje się w kroku 5 protokołu).

2. Transfekcja komórek HEK-293T z użyciem protokołu opartego na fosforanie wapnia

  1. Odczynniki do transfekcji
    1. Aby przygotować 2x roztwór buforowy BES BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), połączyć 16,36 g NaCl, 10,65 g BES (N, N-bis (2-hydroksyetyl)-2-aminoetanosulfonianu) oraz 0,21 g Na2HPO4. Dodać podwójnie destylowaną wodę H2O (dd-H2O) do objętości 900 mL. Rozpuścić, dotytrować do pH 6,95 za pomocą 1M NaOH i doprowadzić objętość do 1 L. Przefiltrować przez jednostkę filtrującą 0,22 µM. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować 1M CaCl2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 µM. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Obejrzeć płytki wysiane dzień wcześniej. Komórki są gotowe do transfekcji, gdy osiągną 70–80% konfluencji.
  3. Odssać stare medium z płytek i ostrożnie dodać świeżo przygotowane medium bez surowicy.
    UWAGA: Szczegóły dotyczące wybranych plazmidów i ich przygotowania znajdują się w Pliku uzupełniającym 1–Plazmidy.
  4. Przygotować mieszaninę plazmidową, przenosząc odpowiednie ilości czterech plazmidów do stożkowatej probówki 15-mL. Dla jednej płytki 15-cm użyć 37,5 µg wektora transferowego CRISPR/Cas9 (pBK198 lub pBK189), 25 µg pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G oraz 6,25 µg pREV (Rysunek 1c).
  5. Dodać 312,5 µL 1M CaCl2 do mieszaniny plazmidowej. Następnie dodać do 1,25 mL sterylnej dd-H20.
  6. Powoli (kroplami) dodać 1,25 mL roztworu 2x BBS, mieszając całość na wortexie. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać mieszaninę do transfekcji kroplami na każdą płytkę 15-cm (2,5 mL na płytkę). Delikatnie zakręcić płytkami i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 2–3 h. Następnie dodać 2,5 mL (10%) surowicy na płytkę i kontynuować inkubację przez noc (12–18 h).
    UWAGA: Niektóre laboratoria używają inkubatorów z 3% CO2 w celu stabilizacji pH medium. Nie obserwujemy jednak żadnej różnicy w wydajności transfekcji między 3% a 5% CO2. Ponadto wielkość precipitates CaPO4 jest kluczowa dla wydajności transfekcji; mieszanina do transfekcji musi być klarowna przed dodaniem jej do komórek. Jeśli mieszanina zmętnieje podczas inkubacji, należy przygotować świeży 2x BBS (pH = 6,95).

Schemat oczyszczania wirusów przedstawiający etapy wirowania, gradientu sacharozy i resuspensji w PBS.
Rycina 2: Koncentracja cząsteczek wirusowych z wykorzystaniem protokołu podwójnego gradientu sacharozy. Cząsteczki wirusowe zebrane z nadfiltratu (SN) nanosi się na gradient sacharozy. Do stworzenia gradientu wykorzystuje się 70%, 60%, 30% i 20% roztwory sacharozy. Po wirowaniu cząsteczki zebrane z frakcji 30 - 60% sacharozy nanosi się ponownie na 20% poduszkę sacharozową w celu ich wytrącenia. Końcowy osad zawierający oczyszczone cząsteczki wirusowe resuspendsuje się w 1x PBS do dalszego wykorzystania (szczegóły znajdują się w tekście). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Dzień po transfekcji

  1. Obserwuj komórki, aby upewnić się, że w tym momencie osiągają one blisko 100% konfluencji, przy minimalnej lub żadnej śmierci komórek. Wymień medium, dodając 25 mL świeżego DMEM + 10% serum do każdej płytki. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez kolejne 48 h.
    UWAGA: Dostosuj objętość medium w kroku 3.1, jeśli używasz więcej niż sześciu płytek 15 cm (patrz Krok 5.2, Uwaga).

4. Pobieranie wirusa

  1. Ostrożnie zbierz supernatant ze wszystkich płytek do hodowli tkanek zawierających transfektowane komórki, używając sterylnej pipety Pasteura 10 mL, i połącz go w probówkach wirówek o pojemności 50 mL.
  2. Klaruj zawiesinę poprzez wirowanie przy 400 - 450 x g przez 10 min w wirówce stołowej. Przefiltruj supernatant przez jednostkę filtracyjną próżniową 0,45 µm.
    UWAGA: Przefiltrowany supernatant można przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 dni przed przystąpieniem do zagęszczania lub podzielić na aликwoty i przechowywać w temperaturze -80 °C. Przewidywane miana niezagęszczonych preparatów wirusowych IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 powinny wynosić ~2 x 107 TU/mL (Determination miana opisano w kroku 6). Należy jednak unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania preparatów wirusowych, ponieważ każdy cykl zamrażania i rozmrażania powoduje utratę 10 - 20% miana funkcjonalnego.

5. Koncentracja cząsteczek wirusowych poprzez ultrawirowanie

UWAGA: Stosujemy metodę oczyszczania z podwójnym użyciem sacharozy, która składa się z dwóch etapów: etapu gradientu sacharozowego oraz etapu poduszki sacharozowej (Rysunek 2).

  1. Napełnij stożkowe probówki do ultrawirówki w następującej kolejności, aby stworzyć gradient sacharozy: 0,5 mL 70% sacharozy (rozpuszczonej w 1x PBS), 0,5 mL 60% sacharozy (rozpuszczonej w DMEM), 1 mL 30% sacharozy (rozpuszczonej w DMEM) oraz 2 mL 20% sacharozy (rozpuszczonej w 1x PBS).
  2. Ostrożnie dodaj supernatant zawierający wirusy do gradientu. Ponieważ całkowita objętość supernatantu z czterech płytek 15 cm wynosi 100 mL, użyj sześciu probówek do ultrawirówki podczas jednego cyklu, aby przetworzyć pełną objętość supernatantu wirusowego.
    1. Każda probówka do ultrawirówki użyta w tym kroku ma pojemność do 30 mL (wliczając objętość sacharozy); rozdziel supernatant wirusowy równomiernie pomiędzy probówki, pozostawiając co najmniej 10% wolnej przestrzeni nad cieczą, aby zapobiec rozlaniu.
    2. Dostosuj objętość hodowli do ~20 - 22 mL na płytkę, gdy w każdym eksperymencie używasz więcej niż czterech płytek 15 cm, tak aby końcowa objętość połączonego supernatantu wirusowego mogła łatwo zmieścić się w sześciu probówkach do ultrawirówki.
    3. Wypełnij probówki do ultrawirówki co najmniej do trzech czwartych ich całkowitej pojemności, w przeciwnym razie podczas wirowania może dojść do pęknięcia probówek, co może skutkować utratą próbki i/lub uszkodzeniem sprzętu.
  3. Zrównoważ probówki za pomocą 1x PBS i wiruj próbki przy 70 000 x g przez 2 h w temperaturze 17 °C (szczegóły dotyczące rotora znajdują się w Tabeli Materiałów).
    UWAGA: Aby zapobiec zaburzeniu warstw sacharozy podczas przyspieszania, ustaw ultrawirówkę tak, aby powoli rozpędzała rotor do 200 rpm w ciągu pierwszych 3 min wirowania. Podobnie ustaw ultrawirówkę tak, aby powoli zwalniała rotor z 200 rpm do 0 rpm w ciągu 3 min na koniec wirowania.
  4. Ostrożnie zbierz frakcje 30 - 60% sacharozy do czystych probówek (Rysunek 2). Dodaj zimny 1x PBS do połączonych frakcji i uzupełnij objętość do 100 mL; wymieszaj, pipetując ciecz kilka razy w górę i w dół.
  5. Przejdź do etapu poduszki sacharozowej, ostrożnie nakładając preparat wirusowy na poduszkę sacharozową. W tym celu dodaj do probówki 4 mL 20% sacharozy (w 1x PBS), a następnie ~20 - 25 mL roztworu wirusowego na probówkę. Jeśli probówki są wypełnione w mniej niż trzech czwartych objętości, uzupełnij je sterylnym 1x PBS.
  6. Ostrożnie zrównoważ i wiruj próbki przy 70 000 x g przez 2 h w 17 °C, analogicznie jak poprzednio. Odlej supernatant i pozwól pozostałej cieczy spłynąć, odwracając probówki na ręcznikach papierowych.
  7. Odsaj pozostałe krople, aby usunąć całą ciecz z granulatu. Na tym etapie granulaty zawierające wirusy powinny być ledwo widoczne jako małe, przezroczyste punkty.
  8. Resuspenduj granulaty, dodając 70 µL 1x PBS do pierwszej probówki i dokładnie pipetując zawiesinę, a następnie przenosząc zawiesinę do kolejnej probówki i mieszając w ten sam sposób, aż wszystkie granulaty zostaną resuspendowane.
  9. Przepłucz probówki dodatkowymi 50 µL zimnego 1x PBS i wymieszaj jak wcześniej. Upewnij się, że łączna objętość końcowej zawiesiny wynosi ~120 µL i ma lekko mleczny wygląd; oczyść ją poprzez wirowanie przy 10 000 x g przez 30 s w mikrocentrifugowaniu stołowym.
  10. Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrocentryfugi, przygotuj aliquoty po 10 µL i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i odmrażania próbek lentiwirusowych. Poza przypadkami, gdy wymagane jest wirowanie, należy dążyć do przeprowadzania pozostałych kroków w komorach do hodowli tkanek lub wyznaczonych pomieszczeniach do hodowli tkanek, stosując odpowiednie środki bezpieczeństwa biologicznego (patrz Dyskusja).

6. Oznaczanie miana wirusa

  1. Metoda enzymatycznej immunosorpcyjnej analizy (ELISA) dla białka p24
    UWAGA: Analizę przeprowadza się przy użyciu płytek 96-dołkowych o wysokim powinowactwie wiązania, zgodnie z instrukcjami zestawu HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit z programu NIH AIDS Vaccine Program (patrz Tabela materiałów) z wprowadzonymi modyfikacjami29.
    1. Następnego dnia przemyć dołki trzy razy 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym PBS (roztwór PBS-T). Pokryć płytkę 100 µL przeciwciał monoklonalnych anty-p24 w rozcieńczeniu 1:1500 w 1x PBS i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Aby wyeliminować niespecyficzne wiązanie, zablokować płytkę za pomocą 200 µL 1% BSA w PBS; przemyć trzy razy 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym PBS (roztwór PBS-T) przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotowanie próbek: W przypadku skoncentrowanych preparatów wektorów rozcieńczyć 1 µL próbki 100-krotnie, dodając 89 µL dd-H20 i 10 µL Triton X-100 (stężenie końcowe 10%). W przypadku preparatów nieskoncentrowanych przygotować próbki rozcieńczone dziesięciokrotnie (dodać 80 µL dd-H20 i 10 µL Triton X-100 (stężenie końcowe 10%) do 10 µL próbki).
      UWAGA: Na tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas do późniejszego użycia.
    4. Przygotować standardy HIV-1, stosując 2-krotne rozcieńczenia seryjne (ze stężeniem początkowym 5 ng/mL).
    5. Rozcieńczyć skoncentrowane próbki (z wcześniej rozcieńczonych zapasów 1:100) w medium RPMI 1640 uzupełnionym o 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:10 000, 1:50 000 i 1:250 000. Rozcieńczyć próbki nieskoncentrowane (z wcześniej rozcieńczonych zapasów 1:10) w medium RPMI 1640 uzupełnionym o 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:500, 1:2500 i 1:12 500.
    6. Nanieść próbki na płytkę w trzech powtórzeniach i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Następnego dnia przemyć dołki sześć razy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h z 100 µL poliklonalnych króliczych przeciwciał anty-p24, rozcieńczonych 1:1000 w RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA i 2% normalnego surowicy mysiej (NMS).
    8. Przemyć sześć razy w opisany wyżej sposób i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h z kozimi przeciwciałami anty-króliczymi IgG sprzężonymi z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonymi 1:10 000 w RPMI 1640 uzupełnionym o 5% normalnej surowicy koziej, 2% NMS, 0,25% BSA i 0,01% Tween 20.
    9. Przemyć płytkę w opisany wyżej sposób i inkubować z substratem peroksydazy TMB w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    10. Zatrzymać reakcję, dodając 100 µL 1 N HCL. Zmierzyć absorbancję próbek przy 450 nm przy użyciu czytnika płytek absorbancyjnych.
  2. Pomiar intensywności fluorescencyjnego reportera
    1. Metoda FACS
      UWAGA: Stopień utraty sygnału GFP w komórkach można dokładnie oszacować, mierząc średnią intensywność fluorescencji komórek przetransdukowanych za pomocą cytometrii przepływowej. W celu analizy, prezentacji i interpretacji danych FACS należy odwołać się do aktualnej publikacji 28. Protokół opisano poniżej.
      1. Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne preparatu wirusowego w 1x PBS (od 10-1 do 10-5).
      2. Zasiać około 5 x 105 komórek 293T w każdym dołku płytki 6-dołkowej w końcowej objętości 2 mL na dołek. Dodać 10 µL każdego rozcieńczenia wirusa do komórek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 h.
      3. zebrać komórki do analizy FACS w następujący sposób: dodać 200 µL 0,05% roztworu Trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 min. Dodać 2 mL kompletnego medium DMEM i zebrać próbki do stożkowych probówek 15 mL.
      4. Odwirować komórki przy 400 x g w temperaturze 4 °C i resuspendować osad w 500 µL zimnego 1x PBS.
      5. W celu fiksacji dodać do tej zawiesiny taką samą objętość 4% roztworu formaldehydu i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
      6. Odwirować ufiksowane komórki i resuspendować w 1 mL 1x PBS. Przeanalizować ekspresję GFP za pomocą urządzenia FACS, zgodnie z opisem Ortinskiego i wsp.28. W skrócie, użyć następującego wzoru do wyznaczenia funkcjonalnego miana wirusa:
        Wzór obliczeniowy jednostek transdukcyjnych, przedstawiający równanie wyznaczania TU na mL z zmiennymi.
        UWAGA: Tutaj Tg = liczba policzonych komórek GFP-dodatnich; Tn = całkowita liczba policzonych komórek; N = całkowita liczba przetransdukowanych komórek; V = objętość (w µL) użyta do transdukcji. Na przykład: Jeśli 1 x 106 komórek przetransdukowano za pomocą 10 µL wirusa, policzono 2 x 104 komórek, z czego 5 x 103 były GFP-dodatnie, na podstawie powyższego równania miano funkcjonalne wyniosłoby:
        Wzór obliczeniowy miana lentiwirusowego, obejmuje miareczkowanie, terapię genową, analizę naukową.
    2. Liczenie komórek GFP-dodatnich
      1. Obliczyć wielokrotność infekcji (MOI) zastosowaną do transdukcji. Przetestować szeroki zakres MOI (1 - 10); zwiększanie MOI skutkuje wyższą wydajnością transdukcji.
      2. Przed transfekcją zasiać płytkę 6-dołkową w ilości około 3 - 4 x 105 komórek na dołek. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji >90% (zazwyczaj w ciągu 24 h), przeprowadzić transdukcję za pomocą oczyszczonego wirusa przy wcześniej określonych wartościach MOI.
      3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek i monitorować komórki w regularnych odstępach czasu przez 1 - 7 dni pod kątem zmian w sygnale GFP.
      4. Policzyć liczbę komórek GFP-dodatnich za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw PLAN 4X, 0,1 N.A, powiększenie 40X) wyposażonego w zestaw filtrów GFP (długość fali wzbudzenia - 470 nm, długość fali emisji - 525 nm), używając komórek naiwnych (nieprzetransdukowanych) do określenia populacji komórek GFP-ujemnych i dodatnich.
      5. Oszacować końcowe miano, korygując o współczynnik rozcieńczenia i objętość, korzystając z następującego wzoru:
        Wzór równania jednostek transdukcyjnych: TU/mL = (N)×(D)×(M)/V, istotny dla analizy transferu genów.
        UWAGA: Tutaj N = liczba komórek GFP-dodatnich, D = współczynnik rozcieńczenia, M = współczynnik powiększenia (zazwyczaj 20X), V = objętość wirusa użyta do transdukcji. Na przykład, dla 20 policzonych komórek GFP-dodatnich (N) przy rozcieńczeniu 10-4 (1:10 000) w próbce 10 µL (V) przy powiększeniu 20X (M), wartość (D) skutkowałaby mianem funkcjonalnym wynoszącym (20 x 104) x (20) x (10) x (100*) = 4 x 108 TU/mL.
        (*korekta do wartości na mL)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja wydajności nokautu wektorów IDLV-CRISPR/Cas9
W celu walidacji wydajności średniowanego przez CRISPR/Cas9 nokautu genów wykorzystaliśmy komórki 293T wykazujące ekspresję GFP jako model. Komórki GFP+ wygenerowano poprzez transdukcję komórek HEK-293T wektorem pLenti-GFP (vBK201a) przy MOI wynoszącym 0,5 (Rysunek 3b, panel „no-virus”). Kaseta wektora all-in-one sgRNA-do-GFP/Cas9 została zapakowana do cząstek IDLV lub ICLV, a wydajno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

IDLV zaczęły pojawiać się jako narzędzie z wyboru do edycji genów in vivo, zwłaszcza w kontekście chorób genetycznych, głównie ze względu na niskie ryzyko mutagenezy związane z tymi wektorami w porównaniu z integrującymi platformami dostarczania22,28. W obecnym manuskrypcie staraliśmy się szczegółowo opisać protokół związany z produkcją ulepszonego systemu IDLV-CRISPR/Cas9 typu "wszystko w jednym", który został niedawno opracowany w naszym laboratorium

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Patent USC-499-P (1175) został złożony przez Uniwersytet Południowej Karoliny w związku z pracą opisaną w tym rękopisie.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Wydziałowi Neurobiologii, Duke University School of Medicine oraz Dziekanatowi ds. Nauk Podstawowych, Duke University. Dziękujemy również członkom Duke Viral Vector Core za komentarze do manuskryptu. Plasmid pLenti CRISPRv2 został podarowany przez Feng Zhang (Broad Institute). System pakowania LV, w tym plazmidy psPAX2, VSV-G, pMD2.G i pRSV-Rev, był miłym prezentem od Didiera Trono (EPFL, Szwajcaria). Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione przez University Of South Carolina School Of Medicine, grant RDF18080-E202 (B.K).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Optima XPN-80 UltrawirówkaBeckman CoulterA99839
Wirówka stołowa Allegra 25RBeckman Coulter369434
xMark Microplate Czytnik płytek absorbancyjnychBio-Rad1681150
BD FACSBecton Dickinson338960
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeicaDM IRB2
0.45-μ m jednostka filtrująca, 500 mlCorning430773
Stożkowe dolne probówki ultrawirówkoweSeton Scientific5067
Stożkowe adaptery rurSeton ScientificPN 4230
SW32Ti wirnik wahliwo-kubełkowyBeckman Coulter369650
15 ml stożkowe probówki wirówkoweCorning430791
50 ml stożkowe probówki wirówkoweCorning430291
Płytki 96-dołkowe o wysokim poziomie wiązaniaCorning3366
150 mm Naczynia do hodowli komórkowych z TC z siatką 20 mmCorning353025
100 mm Naczynie hodowlane TCCorning430167
0,22 μ Jednostka filtrująca M, 1LCorning430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Pipety do hodowli tkankowych, 5 mlCorning4487
Pipety do hodowli tkankowych, 10 mlCorning4488
Pipety do hodowli tkankowych, 25 mlCorning4489
Hemacytometr z szkiełkami nakrywkowymiCole-ParmerUX-79001-00
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do hodowli komórkowych
Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK 293T)ATCCCRL-3216
Komórki293FTThermo Fisher ScientificR70007
DMEM, podłoże o wysokiej zawartości glukozyGibco11965
Hyklon kosmicznego surowicy cielęcejSH30087.04
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100XSigma AldrichA5955-100ML
Pirogronian soduSigma AldrichS8636-100ML
Aminokwas endogenny (NEAA)HyklonSH30087.04
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-085
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Trypsin-EDTA 0,05%Gibco25300054
BES (Kwas N, N-bis (2-hydroksyetylo)-2-amino-etanosulfonowy)SigmaAldrichB9879 - BES
ŻelatynaSigma AldrichG1800-100G
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
p24 odczynniki ELISA
Monoklonalne przeciwciało anty-p24NIH AIDS Research and Reference Reagent Program3537
Standardy HIV-1NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Poliklonalne przeciwciało królika anty-p24NIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP451T
Kozia peroksydaza przeciw królikowi chrzanowi IgGSigma Aldrich12-348Stężenie robocze 1:1500
Normalna surowica mysie, sterylna, 500mLEquitech-BioSM30-0500
Surowica kozia, sterylna, 10mLSigmaG9023Stężenie robocze 1:1000
Substrat peroksydazy TMBKPL5120-0076Stężenie robocze 1:10 000
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plasmids
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
pRSV-RevAddgene12253
lentiCRISPR v2Addgene52961
NazwaCompany Numer katalogowyKomentarze
Enzymy restrykcyjne
BsrGINew England BiolabsR0575S
BsmBINew England BiolabsR0580S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINowa Anglia BiolabsR0142S
PacINowa Anglia BiolabsR0547S
SphINowa Anglia BiolabsR0182S

Bibliografia

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146(2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987(2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968(2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27(2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Knockout genu CRISPR Cas9produkcja wektora wirusowegooczyszczanie przez ultrawirowanieseparacja w gradiencie sacharozytest ELISA dla p24transdukcja HEK 293Tkwantyfikacja miana wirusatransfekcja fosforanem wapniakoncentracja cz stek wirusowych
Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.