Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56921

⸱

15 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak stworzyć system hodowli enteroidów z noworodków myszy lub przedwcześnie urodzonych ludzi z jelita ludzkiego, a także skuteczną metodę pobierania mleka od myszy.

Streszczenie

Ludzkie enteroidy jelita cienkiego pochodzą z krypt i gdy są hodowane w niszy komórek macierzystych, zawierają wszystkie typy komórek nabłonkowych. Zdolność do tworzenia ludzkich enteroidalnych systemów hodowli ex vivo jest ważna dla modelowania patofizjologii jelit i badania konkretnych zaangażowanych reakcji komórkowych. W ostatnich latach enteroidy od myszy i ludzi są hodowane, pasażowane i odkładane do wykorzystania w przyszłości w kilku laboratoriach na całym świecie. Ta platforma enteroidalna może być wykorzystana do testowania efektów różnych zabiegów i leków oraz jaki wpływ wywiera się na różne typy komórek w jelicie. W tym miejscu przedstawiono protokół ustalania pierwotnych enteroidów jelita cienkiego pochodzących z komórek macierzystych pochodzących od nowonarodzonych myszy i przedwcześnie urodzonych w jelicie ludzkim. Co więcej, ten system hodowli enteroidów został wykorzystany do przetestowania wpływu mleka matki specyficznego dla danego gatunku. Mleko matki myszy można skutecznie uzyskać za pomocą zmodyfikowanego laktatora ludzkiego, a odciągnięte mleko myszy można następnie wykorzystać do dalszych eksperymentów badawczych. Wykazujemy teraz wpływ odciągniętego mleka matki myszy, człowieka i dawczyni na wzrost i proliferację enteroidów pochodzących od nowonarodzonych myszy lub wcześniaków ludzkiego jelita cienkiego.

Wprowadzenie

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest główną przyczyną zgonów z powodu chorób przewodu pokarmowego u wcześniaków, dotykając prawie 1 na 10 niemowląt urodzonych przed 29 tygodniem ciąży1,2,3. Połowa niemowląt z NEC przechodzi do najcięższej postaci, w której przeżywalność wynosi tylko 10 - 30%4,5. Szacuje się, że w Stanach Zjednoczonych na leczenie niemowląt NEC6,7 wydaje się na leczenie niemowląt za pomocą NECsup class="xref"7, jednak ani wskaźnik przeżywalności, ani terapia nie zmieniły się w ciągu ostatnich 30 lat. Patogeneza NEC charakteryzuje się uszkodzeniem jelit i upośledzonym gojeniem błony śluzowej8,9,10,11, jednak szlaki sygnałowe prowadzące do zaostrzenia odpowiedzi zapalnej i mechanizmy odwracania stanu zapalnego pozostają nie w pełni poznane.

Stwierdzono, że podawanie mleka matki jest jedyną strategią ochrony przed NEC u wcześniaków. Wcześniej wykazaliśmy, że mleko matki chroni przed rozwojem NEC poprzez hamowanie wrodzonego receptora immunologicznego toll-like receptor 4 (TLR4) w nabłonku jelitowym poprzez szlak sygnałowy receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)11. Suplementacja mleka matki eksperymentalną formułą NEC osłabiła odpowiedź zapalną obserwowaną w NEC, czego dowodem jest hamowanie apoptozy enterocytów i przywrócenie proliferacji enterocytów w sposób zależny od naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i EGFR11. W innym badaniu wykazano, że azotany, inny składnik mleka matki, przyczyniają się do jego ochronnego charakteru poprzez modulowanie perfuzji jelitowej, w porównaniu z mlekiem modyfikowanym dla niemowląt, w którym brakuje azotanów i mogą przyczyniać się do zwiększonej częstości występowania NEC u niemowląt karmionych mlekiem modyfikowanym12,13. Inne związki obecne w mleku matki, które, jak wykazano, biorą udział w ochronie przed NEC, to oligosacharydy mleka ludzkiego, L-arginina, glutamina i laktoferyna14,15,16,17,18,19. Te korzystne elementy mleka matki ujawniają konieczność jego stosowania w profilaktyce NEC, ale także podkreślają znaczenie badania mechanizmów, szlaków sygnałowych i efektów komórkowych zaangażowanych w sposób, w jaki mleko matki pośredniczy w ochronie przed NEC.

W celu dalszego badania właściwości ochronnych mleka matki w mysim modelu NEC, opracowaliśmy nową, łatwą w użyciu technikę, dzięki której mleko matki myszy może być pobierane ze znieczulonej matki za pomocą elektrycznego laktatora ludzkiego11,12. Ta strategia pozyskiwania mleka matki myszy jest korzystna nie tylko dlatego, że laktatory są łatwo dostępne i skuteczne w pozyskiwaniu mleka matki, ale także dlatego, że metoda ta pozwala na analizę mleka matki specyficzną dla danego gatunku. W rezultacie możemy porównać wpływ mleka matki myszy z odciągniętym mlekiem matki, a także pasteryzowanym mlekiem dawczyni z banku mleka w modelach specyficznych dla gatunku. Technika ta pozwala na badanie składników mleka matki w odniesieniu do ich wkładu w profilaktykę NEC. Inni badacze opracowali metody ekstrakcji mleka matki, jednak techniki te są ręczne i zazwyczaj wymagają więcej niż jednego członka laboratorium20,21,22. Tutaj przedstawiono prostą technikę, którą można wykorzystać, modyfikując ludzki laktator elektryczny w celu pobrania mleka od myszy. Technikę tę można również zastosować do innych gatunków.

Aby odpowiednio zbadać szlaki sygnałowe związane z NEC, potrzebne są systemy modelowe, które ocenią wszystkie typy komórek, o których wiadomo, że są dotknięte procesem chorobowym. W tym miejscu omawiamy jeden z takich układów modelowych - enteroidy - i ich powstanie z mysiego i ludzkiego jelita cienkiego. Ludzkie enteroidy jelitowe (HIEs) są szczególnie obiecujące, ponieważ oferują innowacyjny, genetycznie zróżnicowany model człowieka ex vivo, który pomaga w badaniu procesów patofizjologicznych zachodzących w przewodzie pokarmowym23. Stwierdzono, że enteroidy są hodowane długoterminowo i mogą być zamrażane do późniejszego wykorzystania23, i w przeciwieństwie do ludzkich organoidów jelitowych (HIO), których kultury są rozwijane z indukowalnych pluripotencjalnych komórek macierzystych, enteroidy są generowane z komórek macierzystych w izolowanych kryptach jelitowych24. Enteroidy wymagają mniej konserwacji, mogą być szybko zainfekowane25 i można je łatwo ustalić, ponieważ krypty jelitowe są bardziej zróżnicowane niż HIOs23. W związku z tym HIE oferują wiele zalet w porównaniu z istniejącymi technikami, ponieważ mogą być rozwijane tak, aby wykazywały specyficzne dla regionu właściwości składowe i funkcjonalne ludzkiego nabłonka przewodu pokarmowego23. Stosowanie enteroidów jest bardzo skutecznym wyborem, gdy potrzebny jest ludzki model jelita, z zachowaniem ograniczeń specyficznych dla regionu i łatwością użycia. Tutaj demonstrujemy technikę izolowania i utrzymywania pierwotnych enteroidów jelita cienkiego pochodzących z komórek macierzystych od myszy i wcześniaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis (Protokół 20160187) lub Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu (Protokół 14103918). Jelito cienkie ludzkiego płodu w okresie krótszym niż 24 tygodnie ciąży uzyskano zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Pittsburghu dotyczącymi pobierania tkanek anatomicznych po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (protokół PRO14100537) z Banku Tkanek Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Pittsburghu za pośrednictwem uczciwego systemu brokerskiego. Zanonimizowane mleko matki lub pasteryzowane mleko matki od dawczyni uzyskano po uzyskaniu zgody Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Izolacja krypty i tworzenie enteroidów od nowonarodzonych myszy lub przedwcześnie urodzonych ludzkich jelit cienkich

  1. Przygotowanie podłoża
    UWAGA: Pożywkę należy przygotować w kapturze dzień przed izolacją krypty.
    1. Przygotować 1,11 l pożywki hodowlanej. Zacznij od 1 l zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle's Substrate (DMEM) z 4,5 g/l glukozy i L-glutaminą i dodaj 110 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (końcowe stężenie 10%), 11 ml penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie 1%) i 1,1 ml sterylnej insuliny (końcowe stężenie 0,1%).
    2. Przygotuj 500 ml mieszaniny PBS z antybiotykiem. Zacznij od 500 ml 1x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS) z 10% FBS i dodaj 5 ml gentamycyny (stężenie końcowe 1%), 1 ml amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%) i 5 ml penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%).
    3. Przygotuj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #1. Najpierw przygotuj 30 ml pożywki hodowlanej. Dodać 600 μl 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (stężenie końcowe 10 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%).
    4. Przygotuj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #2. Najpierw przygotuj 30 ml pożywki hodowlanej. Dodać 300 μl 0,5 M EDTA (stężenie końcowe 5 mM), 300 μl gentamycyny (stężenie końcowe 1%) i 60 μl amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%).
    5. Przygotować 50 ml pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu. Odmierz 33,4 ml 1x Advanced DMEM/F-12 i dodaj 10 ml FBS (stężenie końcowe 20%).
      1. Dodać 500 μL penicyliny-streptomycyny (stężenie końcowe 1%), 500 μL L-glutaminy (stężenie końcowe 1%), 500 μL gentamycyny (stężenie końcowe 1%), 100 μL amfoterycyny B (stężenie końcowe 0,2%), 2,5 μL 1 M kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowego (HEPES) (stężenie końcowe 0,05 mM), 500 μL 100 mM N-acetylocysteiny (stężenie końcowe 1 mM), 500 μL 100x suplement N-2, 1 ml 50x suplement bez serum (np. B-27) bez witaminy A i 500 μl 1 mM 100x Y-27632.
    6. Przygotować 1 ml pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu. Najpierw przygotuj 1 ml pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu. Dodać 2,5 μl 40 μg/ml Wnt3a (stężenie końcowe 100 ng/mL), 1 μl 100 μg/mL Noggin (stężenie końcowe 100 ng/mL), 2 μl 250 μg/ml R-Spondyny (stężenie końcowe 500 ng/mL) i 0,5 μL 100 μg/mL EGF (stężenie końcowe 50 ng/mL).
  2. Izolacja krypty
    1. Rozpuszczony ekstrakt z błony podstawnej (patrz Tabela materiałów) umieść na lodzie do rozmrożenia przed rozpoczęciem.
      UWAGA: Utrzymuj membranę podstawną na lodzie, w przeciwnym razie ulegnie polimeryzacji.
    2. Zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt dla myszy w wieku powyżej 14 dni, należy poddać myszy eutanazji dwiema metodami, z których druga to procedura fizyczna mająca na celu zapewnienie śmierci.
      UWAGA: W przypadku myszy poniżej 14 dnia życia dekapitacja jest standardową procedurą przy użyciu nożyczek.
    3. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, przez skórę i otrzewną, na całej długości brzucha. Wyciąć jelito cienkie od żołądka do jelita ślepego nożyczkami i usunąć krezkę kleszczami.
      UWAGA: Dwutygodniowe młode myszy płci męskiej i żeńskiej C57BL/6J, każde o wadze 5,5 - 7 g, wykorzystano do izolacji krypty. Do izolacji krypty można użyć myszy w dowolnym wieku i rozmiarze.
    4. Aby przygotować świeżo pobrane jelito cienkie do izolacji krypty, ustaw jelito prosto i przetnij jelito wzdłuż na całej jego długości za pomocą nożyczek.
      UWAGA: Jelito myszy i człowieka można przygotować podobnie.
    5. Oczyść stolec z jelita, delikatnie potrząsając jelitem w przód iw tył na szalce Petriego wypełnionej mieszanką antybiotyków PBS za pomocą kleszczy.
    6. Dodaj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #1 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pokrój jelito na kawałki o długości 0,5 cm bezpośrednio do probówki. Umieść rurkę w wiaderku na lód i delikatnie mieszaj na wytrząsarce na najniższych obrotach przez 15 minut.
    7. Gdy tkanki znajdują się na wytrząsarce, uzyskaj 24- lub 48-dołkowe płytki do wyhodowania krypt, jeśli enteroidy mają być używane do izolacji RNA, DNA lub białka. Użyj 8-dołkowych szkiełek komorowych do hodowli krypt, jeśli enteroidy mają być używane do obrazowania konfokalnego całego wierzchowca.
    8. W kapturze dodaj 15 μl membrany podstawnej na dno każdej studzienki płytki 24- lub 48-dołkowej. W przypadku korzystania ze szkiełek komorowych dodaj 9 μl membrany podstawnej na dno każdej komory.
      UWAGA: W razie potrzeby dostosuj objętość membrany podstawnej w zależności od rozmiaru płyty.
    9. Szybko rozprowadź membranę podstawną za pomocą końcówki pipety, tak aby membrana podstawna utworzyła cienką warstwę na dnie studni. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację błony podstawnej.
      UWAGA: Krypty nie przyczepią się, jeśli membrana podstawna nie jest cienką warstwą lub jeśli membrana podstawna zawiera pęcherzyki powietrza.
    10. Po 15 minutach na wytrząsarce przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm. Odrzuć przepływ.
    11. Dodaj 30 ml pożywki do rozbijania komórek #2 do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wyjmij chusteczkę z sitka i dodaj do probówki.
    12. Umieść rurkę w wiaderku na lód i delikatnie mieszaj na wytrząsarce na najniższych obrotach przez 15 minut.
    13. Po 15 minutach na wytrząsarce przefiltruj tkankę przez sitko o średnicy 100 μm. Utrzymuj przepływ na tym etapie, na wypadek, gdyby wydajność była niska w późniejszych krokach.
      UWAGA: Wszystkie rurki przepływające muszą być utrzymywane na lodzie.
    14. Dodaj 15 ml DMEM z 4,5 g/l glukozy i L-glutaminą do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wyjmij chusteczkę z sitka i dodaj do probówki. Energicznie potrząsaj rurką ręcznie przez 10 s. Przefiltrować przez sitko o średnicy 100 μm i zebrać przez nie przepływ. Powtarzaj, aż przepływ nie będzie zawierał żadnych cząstek stałych.
    15. W kapturze przefiltruj przepływ z poprzedniego etapu do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 ml za pomocą filtrów siatkowych 70 μm do tkanek myszy lub filtrów 100 μm do tkanek ludzkich.
      UWAGA: Miej dodatkowe sitka w trybie gotowości i wlewaj powoli, ponieważ sitka zapchają się zanieczyszczeniami.
    16. Odwirować probówkę o sile 200 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C i umieścić bezpośrednio w pojemniku na lód w okapie. Usunąć supernatant pipetą, nie naruszając osadu. Ponownie zawiesić osad z całkowitą pożądaną ilością pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu.
      UWAGA: Wzbogacone krypty to "piaszczysta" warstwa granulki. Każda studzienka wymaga 250 μl pożywki do hodowli krypt bez czynników wzrostu.
  3. Zakładanie enteroidów
    1. Umieść mieszaninę mediów kryptowych bezpośrednio na membranie podstawnej.
    2. Sprawdź krypty pod mikroskopem, aby upewnić się, że proces izolacji się powiódł.
      UWAGA: Pożądane są komórki i kulki komórek. W każdym dołku znajduje się około 100 pojedynczych krypt.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, aby krypty mogły przylgnąć do błony podstawnej.
      UWAGA: Ta inkubacja odbywa się z pożywkami Crypt Culture bez czynników wzrostu.
    4. Powoli usuń nośnik i nadmiar krypt, których nie udało się podłączyć za pomocą pipety P-200.
      UWAGA: Nie naruszaj membrany podstawnej, ponieważ przymocowane krypty mogą się przemieścić.
    5. Powoli dodawaj 250 μl pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu do każdej studzienki.
      UWAGA: W przypadku płytek 24-, 48-dołkowych lub szkiełek komorowych wystarczy 250 μl pożywki do hodowli krypt z czynnikami wzrostu.
    6. Wymieniaj pożywkę co 2 dni na świeże podłoża do hodowli krypt z czynnikami wzrostu na 5 dni przed zabiegami, aby umożliwić optymalne przywiązanie i wzrost.

2. Kolekcja mleka matki myszy

  1. Matkę laktacyjną C57BL/6J należy oddzielić od jej młodych w wieku 7 - 12 dni od jej szczeniąt na 6 godzin przed udojem.
  2. Znieczulić matkę laktacyjną izofluranem przez stożek nosowy i podać podskórnie wstrzyknięcie oksytocyny w stężeniu 0,15 j.m./kg masy ciała. Odczekaj 3 minuty przed przystąpieniem do procedury doju.
  3. Przed zabiegiem udojowym oczyść strzyki 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
  4. Pobieraj mleko ze smoczków pojedynczo za pomocą elektrycznego laktatora z silikonową rurką o rozmiarze pasującym do smoczków myszy w probówce o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Laktatory optymalne mają dwa ustawienia, jedno dla prędkości i jedno dla ssania. Najlepiej zacząć od najniższych ustawień każdego z nich i powoli zwiększać, aż mleko zostanie wyekstrahowane. Idealnie, całkowita wydajność wyniesie ~ 500 μL - 1 ml mleka matki myszy na matkę karmiącą.
  5. Natychmiast przelać mleko matki i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania.
  6. Leczyć enteroidy w dniu 5 dawką 50 μl/ml mleka matki myszy na ml pożywki Crypt Culture z czynnikami wzrostu przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.

3. Barwienie całego wierzchowca enteroidów

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotuj 16 ml 1x PBS na 8 dołków.
    2. Przygotować 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS na 8 dołków.
    3. Przygotuj 2 ml 0,1% Triton X-100 w 1x PBS na 8 dołków.
    4. Przygotuj 24 ml PBS Tween (PBST to 0,1% Tween 20 w 1x PBS) na 8 dołków.
    5. Przygotuj 2 ml 10% normalnej surowicy osła (NDS) w 0,1% PBST (10% NDS/PBST) na 8 dołków.
    6. Przygotować 4 ml 1% NDS w 0,1% PBST (1% NDS/PBST) na 8 dołków.
  2. Barwienie Dzień 1
    1. Odessać leki i przemyć enteroidy PBS. Dodać 250 μl 4% PFA na studzienkę. Umieścić na rotatorze na 1 - 2 godziny w temperaturze 4 °C. Usunąć 4% PFA za pomocą pipety.
    2. Przemyć 4 razy 250 μL/studzienkę 1x PBS. Umieścić na rotatorze na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: W razie potrzeby możliwe jest przechowywanie płytki przez 1 - 2 dni w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 250 μl/basenik 0,1% Triton X-100. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć 0,1% Triton X-100 za pomocą pipety.
    4. Przemyć 4 razy 250 μL/studzienkę 1x PBS. Umieść na rotatorze na 15 minut w temperaturze RT.
    5. Dodać 250 μl/basenik 10% NDS/PBST. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 10% NDS/PBST za pomocą pipety.
    6. Dodać 250 μl/basenik przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczonego w stosunku 1/250 w 1% NDS/PBST i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Optymalne rozcieńczenie przeciwciał różni się w zależności od producenta.
  3. Barwienie Dzień 2
    1. Myć co najmniej 5 razy przez 4 - 5 godzin 250 μl/studzienkę PBST. Umieszczać na rotatorze w temperaturze 4 °C między każdym praniem.
    2. Dodać 250 μl / basenik przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczonego 1/1,000 w 1% NDS/PBST. Zawinąć płytkę w folię i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Barwienie Dzień 3
    1. Dodać 250 μl/studzienkę barwienia jądrowego 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 15 minut
      UWAGA: Trzymaj płytę w ciemności.
    2. Przemyć 6 razy 250 μl/studzienkę PBST. Umieścić na rotatorze na 10 minut w temperaturze 4 °C między każdym praniem.
    3. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku komory z nośnikiem montażowym.
    4. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X i równomiernie renderuj je w edytorze grafiki rastrowej (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszej kolejności postanowiliśmy zbadać, czy odciągnięte ludzkie mleko matki lub pasteryzowane mleko matki od dawczyni wpływa na enteroidy jelita cienkiego. Rzeczywiście, ludzkie mleko matki oraz mleko matki od dawczyni zwiększyły wzrost enteroidów pochodzących od noworodków myszy (Ryc. 1A) oraz od przedwcześnie urodzonych ludzi (Ryc. 1B).

Ponieważ ludzkie mleko ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nabłonek jelitowy składa się z wielu podtypów komórkowych, które są odpowiedzialne za zapewnienie obrony gospodarza przed patogenami, utrzymanie integralności bariery jelitowej i mogą zostać naruszone w patogenezie kilku chorób. Podczas gdy modele zwierzęce mogą podsumować niektóre aspekty choroby, model ex vivo enteroidów pochodzących z jelita cienkiego myszy i ludzi stanowi platformę do testowania efektów różnych metod leczenia. Znaczenie modelu enteroidalnego pozwala naukowcom hodować i różnicować jelitowe ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

MG jest wspierane przez granty K08DK101608 i R03DK111473 z National Institutes of Health, March of Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital oraz Department of Pediatrics at Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL jest wspierany przez R01DK104946 (PI: Silverman), Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 4,5 g/l glukozy i L-glutaminąLonza12-604F
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140-079
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Humulin N (Insulina)Eli Lilly And Company0002-8315
1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( DPBS)Sigma-AldrichD8537
GentamycynaGibco15750-060
Amfoterycyna BGibco15290-026
0,5 M Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 8,0Invitrogen15575-020
1x Zaawansowany DMEM/F-12Invitrogen12634-028
200 mM L-GlutaminaGibco25030-081
1 M Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)Sigma-AldrichH3537
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165
100x Suplement N-2Gibco17502-048
50x B-27 Suplement Minus Witamina AGibco08-0085SA
100x Inhibitor ROCK Y-27632, DichlorowodorekSigma-AldrichY0503
Rekombinowane białko myszy Wnt3a R& D Systems1324-WN
Mysz mysia NogginPeproTech250-38
Mysz rekombinowana R-Spondin 1R& D Systems3474-RS
Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeproTech315-09
Matrigel Growth Factor Zredukowana matryca błony podstawnejCorning356231
35 x 10 mm Hodowla komórkowaSzalka Petriego Eppendorf0030700112
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejEppendorf0030722116
48-dołkowa komórka Płytka hodowlanaEppendorf0030723112
8-dołkowy system szkiełek komorowych Nunc Lab-Tek IIThermo Scientific154534
50 mL Rurka stożkowaCorning352070
100 μ M Sterylne sitko komórkoweFisher Scientific22-363-549
70 μ M Sterylne sitko komórkoweFisher Scientific22-363-548
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,2Invitrogen20012-027
16% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15710
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Normalny osioł Surowica (NDS)Sigma-AldrichD9663
4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)mikroskopu InvitrogenD1306
Fisher Scientific12-544-D
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 XLeica MicrosystemsNie
Photoshop CS6Adobe SystemsNie dotyczy
18 G 1,5-calowa igłaBecton Dickinson305196
IsofluraneSigma-Aldrich792632
OxytocinSigma-AldrichO3251
Ludzki podwójny laktator elektrycznyLansinoh044677530163
5 ml Probówka z okrągłym dnemCorning352058
Gumowe korkiFrey Scientific560761
Przeciwciało Ki67AbcamAB15580
Ludzki starter Mki67 F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Zintegrowanetechnologie DNANie dotyczy
Szkło pokrywowe dotyczy

Bibliografia

  1. Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
  2. Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
  3. Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
  4. Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
  5. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
  6. Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
  7. Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
  8. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  9. Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
  10. Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
  11. Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
  12. Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  13. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  14. Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
  15. Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
  16. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  17. Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
  18. Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
  19. Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
  20. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  21. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
  24. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  25. Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
  26. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura enteroid wwp yw mleka kobiecegoizolacja jelita mysiegoizolacja kryptpolimeryzacja b ony podstawnejbarwienie immunofluorescencyjnepozyskiwanie mleka kobiecegoenteroidy noworodka myszytraktowanie mlekiem kobiecym
Mleko matki wspomaga wzrost enteroidów: model proliferacji komórek ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.