Method Article

Częściowe podwiązanie dróg żółciowych u myszy: kontrolowany model zlokalizowanej cholestazy obturacyjnej

DOI:

10.3791/56930

⸱

March 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Jichi Medical University, 2Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Pathology, University of Pittsburgh School of Medicine, 5Pittsburgh Liver Research Center, University of Pittsburgh, 6McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy częściowe podwiązanie dróg żółciowych jako chirurgiczny model uszkodzenia i regeneracji wątroby u gryzoni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U gryzoni, pełne podwiązanie dróg żółciowych (cBDL) wspólnego przewodu żółciowego jest uznaną techniką chirurgiczną do badania obturacyjnej cholestazy i proliferacji dróg żółciowych. Jednak długotrwałe eksperymenty mogą prowadzić do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności. W wybranych szczepach myszy z podstawową chorobą wątroby można dokonać znaczących porównań nawet przy podwiązaniu pojedynczego płata wątroby, co może zmniejszyć straty i wydatki zwierząt. Tutaj opisujemy częściowe podwiązanie dróg żółciowych (pBDL) u myszy, w którym podwiązany jest tylko lewy przewód żółciowy wątroby, powodując niedrożność dróg żółciowych w lewym płacie, ale nie w pozostałych płatach. Dzięki starannej technice mikrochirurgicznej eksperymenty z pBDL mogą być opłacalne, ponieważ niepodwiązany płat służy jako wewnętrzna kontrola dla podwiązanych płatów, gdy jest poddawany tym samym warunkom u tego samego zwierzęcia. W przeciwieństwie do cBDL, nie jest konieczna oddzielna grupa kontrolna obsługiwana pozorowo. pBDL jest bardzo przydatny do bezpośredniego porównywania miejscowych i ogólnoustrojowych skutków cholestazy i innych zatrzymanych składników żółci. pBDL może być również ponownie wykorzystany jako nowa metoda badania mechanizmów związanych z lekami i migracją komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chirurgiczne modele ostrego uszkodzenia i naprawy wątroby, takie jak częściowa hepatektomia lub podwiązanie przewodu żółciowego (cBDL), są używane od dziesięcioleci u gryzoni do badania regeneracji wątroby i patobiologii1,2. W cBDL wspólny przewód żółciowy (który odprowadza całą żółć wytwarzaną w wątrobie) jest podwiązany, co powoduje obturacyjną cholestazę, stan zapalny i zwłóknienie w ciągu pierwszych 2-3 tygodni po operacji, z ostateczną progresją do marskości wątroby3. Proliferacja dróg żółciowych, transdyferencjacja i indukcja rezydentnych komórek progenitorowych wątroby są również cechami cBDL4,5. Chociaż cBDL wyjaśnia specyficzne mechanizmy obturacyjnej cholangiopatii, które są dobrze scharakteryzowane z powtarzalnymi wynikami u myszy typu dzikiego i u szczepów z normalną wątrobą6,7,8, procedura może być technicznie wymagająca w niektórych transgenicznych mysich modelach chorób wątroby, wymagając większej liczby zwierząt niż oczekiwano ze względu na wyższą zachorowalność i śmiertelność z powodu niedrożności dróg żółciowych w czasie. Technika ta jest również korzystna w badaniu myszy transgenicznych z podstawową chorobą wątroby, które w przeciwnym razie mogłyby nie tolerować stresu związanego z długotrwałymi eksperymentami po cBDL.

pBDL może stanowić rozsądną alternatywę, która pomoże przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań. Wstępne badania pBDL na myszach typu dzikiego miały na celu rozróżnienie miejscowo działających i ogólnoustrojowych mediatorów stanu zapalnego9. W pBDL główne zbieganie dróg żółciowych prawej i lewej wątroby nad wspólnym przewodem żółciowym jest dokładnie uwidocznione we wnęce, a tylko lewy przewód żółciowy wątroby jest podwiązany w celu wytworzenia miejscowej obturacyjnej cholestazy. pBDL ma kilka zalet w stosunku do cBDL. W pBDL niezwiązany, prawy płat służy jako identycznie dopasowana kontrola wewnętrzna dla związanego lewego płata, poddawana tym samym skutkom ogólnoustrojowym, takim jak stan odżywienia lub czynniki krążące. Chociaż obecne były ogólnoustrojowe mediatory prozapalne, Osawa i wsp. zaobserwowali mniej zwłóknienia i martwicy w nieligowanych płatach, ale zwiększoną ekspresję komórek zapalnych i transformującego czynnika wzrostu-β w podwiązanym płacie9.

Ostatnio pBDL został przedefiniowany do badania wpływu zatrzymanej żółci na miąższ wątroby10. Wykorzystując to samo zwierzę do kontroli wewnętrznej (nieligowana "pozorowana") i grup eksperymentalnych, pBDL skutecznie zmniejsza o połowę liczbę zwierząt potrzebnych na eksperyment, co z kolei jest bardziej opłacalne. Myszy znacznie lepiej tolerują działanie pBDL, dzięki czemu idealny eksperyment czasowy (≥2 tygodnie) można osiągnąć w podwiązanym płacie. Co najważniejsze, pBDL może rozróżniać bezpośrednie wewnątrzwątrobowe skutki obturacyjnej cholestazy i zatrzymane składniki żółciowe w podwiązanym płacie w porównaniu z niepodwiązanym płatem kontrolnym. Ogólnie rzecz biorąc, pBDL jest atrakcyjną metodą badania specyficznych dla płatów skutków miejscowej cholestazy w wątrobie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Podstawowe techniki i typowe procedury

  1. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie cały sprzęt mikrochirurgiczny.
  2. Aby uniknąć zabicia myszy przez znieczulenie, dokładnie sprawdź jej wzorzec oddychania.
  3. Dotykaj narządów i jelit tak rzadko, jak to możliwe, aby uniknąć uszkodzenia narządów i spowodowania krwawienia. Dociśnij miejsca krwawienia wilgotnymi wacikami lub gąbkami z gazy.
  4. Używaj mokrych bawełnianych wacików do delikatnej manipulacji narządami. Mokre, włókninowe gąbki z gazy są używane w dwóch rozmiarach, 3,5 × 3,5 cm oraz 6,0 × 6,0 cm. Użyj mniejszej, aby cofnąć całą wątrobę. Użyj większego, aby owinąć jelito cienkie i grube.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Użyj samców myszy c57 / b6 w wieku 8-12 tygodni (gdy masa ciała wynosi około 20-35 g) do częściowego podwiązania dróg żółciowych.
  2. Pozwól myszom na swobodny dostęp do wody i pożywienia do czasu indukcji znieczulenia.

3. Operacja częściowego podwiązania przewodu żółciowego

  1. Znieczulij mysz, umieszczając zwierzę w komorze indukcyjnej z mieszanką 1,5-2,0% izofluranu i 1 l/min tlenu. Uważnie monitoruj zwierzę, obserwując częstość oddechów. Gdy częstość oddechów zwierzęcia wynosi jeden oddech na sekundę, mysz jest dobrze znieczulona. Ponieważ odruch wycofania kończyn przednich zanika szybciej, uszczypnij również stopę kończyny tylnej, aby potwierdzić całkowity brak odruchu wycofania. Oczy należy smarować okulistycznym środkiem smarującym, aby zapobiec owrzodzeniom rogówki. Należy pamiętać, że pierwszą dawkę leku przeciwbólowego można podać przed operacją, aby zapobiec stymulacji receptorów bólu.
  2. Ogol ścianę brzucha maszynką do strzyżenia włosów i umieść mysz na stole operacyjnym pod mikroskopem operacyjnym. Przymocuj wszystkie kończyny do stołu za pomocą taśmy. Stosować inhalację izofluranu, aby utrzymać mysz w znieczuleniu ogólnym.
    1. Wyreguluj parownik izofluranu i użyj 2,0-3,0% izofluranu do indukcji.
  3. Za pomocą sterylnych wacików należy najpierw zdezynfekować ścianę brzucha 0,3-0,5 ml jodu powidonu stosowanego miejscowo, a następnie 70% etanolu. Zwierzę należy przykryć sterylnym serwetem.
  4. Wykonaj długie nacięcie brzucha w linii środkowej od mieczyka mieczykowatego do łonowego za pomocą nożyczek i kleszczy Adson. Po wykonaniu nacięcia brzusznego zmniejsz izofluran do 0,8-1,0% w celu podtrzymania.
  5. Odsłoń jamę brzuszną za pomocą mikroretraktora. Przytrzymaj mieczykowatą zębiad kleszczami komarów i cofnij się w kierunku głowy myszy. Zamocuj kleszczyki do komarów za pomocą miękkiej gliny.
  6. Wkraplać 1-2 ml podgrzanego (37 °C) wysterylizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do jamy brzusznej, aby uniknąć uszkodzenia narządów jamy brzusznej. Przytrzymaj jelito cienkie mokrymi wacikami i delikatnie cofnij je w kierunku głowy myszy. Przetnij więzadła między jelitem cienkim a zaotrzewną, aby uniknąć uszkodzenia jelita cienkiego (Rysunek 1A).
  7. Owiń jelito cienkie i grube mokrą, włókninową gąbką z gazy. Umieść je po ogonowej stronie jamy brzusznej. Jelita owinięte sterylną gazą można umieścić na sterylnie udrapowanym polu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  8. Delikatnie cofnij całą wątrobę w kierunku mieczykowatej kości za pomocą małej mokrej gąbki z włókniny, aby odsłonić wnękę wątroby i więzadło wątrobowo-dwunastnicze (Ryc. 1B).
  9. Sprawdź, aby potwierdzić anatomię wnęki wątroby. Wspólny przewód żółciowy znajduje się po brzusznej stronie żyły wrotnej. Potwierdź lokalizacje prawego i lewego wątrobowego przewodu żółciowego, które spływają do głównego zbiegu dróg żółciowych we wnęce wątroby.
  10. Zidentyfikuj lewy przewód żółciowy wątroby, który odprowadza lewy płat, i otocz go nylonowym szwem 10-0 za pomocą strony igły do szycia (Rysunek 2A). Unikaj uszkodzenia żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i powierzchni wątroby.
  11. Podwiązywać lewy przewód żółciowy nylonem 10-0. (Rysunek 2B).
  12. Umieść jelito cienkie i grube w tej samej pozycji, co przed operacją, używając mokrych wacików.
  13. Upewnij się, że nie ma skrętu jelit i krwawienia z jamy brzusznej, a następnie zamknij mięsień i skórę w dwóch warstwach za pomocą vicrylu 4-0. Do zamknięcia skóry użyto szwu plecionego (Vicryl), ale preferowany jest monofilament, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo infekcji.
    UWAGA: Zamknij powięź przez ciągły szew od mieczyka mieczykowatego do kości łonowej i zamknij skórę przez ciągły szew od łona do mieczykowatego.
  14. Przerwij znieczulenie po zamknięciu nacięcia.

4. Leczenie pooperacyjne i obserwacja

  1. Tuż po operacji należy uszczypnąć skórę grzbietową myszy i wstrzyknąć podskórnie Buprenex (0,1 mg/kg) i Cefazolin (100 mg/kg), a następnie wstrzyknięcie Buprenex co 12 godzin przez 3 dni i Cefazolin co 24 godziny przez 3 dni11,12,13. Należy pamiętać, że pierwsza dawka leku przeciwbólowego może być podana przed operacją, aby zapobiec stymulacji receptorów bólu. Cefazolina i inne antybiotyki okołooperacyjne są konieczne tylko dla zwierząt z obniżoną odpornością, takich jak te stosowane w badaniach transplantacyjnych.
    UWAGA: Jeśli operacja zakończy się sukcesem, mysz zwykle wraca do zdrowia w ciągu 30 minut. Aktywność myszy będzie prawie taka sama jak przed operacją.
  2. Codziennie sprawdzaj myszy pod kątem oznak niepokoju.
    1. Złóż myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu ogólnym, aby uzyskać próbki wątroby i innych tkanek w określonych punktach czasowych (tj. 7, 14, 21 dni) po pBDL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla tego typowego eksperymentu, pBDL został przeprowadzony na potrójnych transgenicznych myszach PiZ, które rekapitulują ludzką chorobę wątroby stwierdzoną w niedoborze alfa-1 antytrypsyny (A1AT). Mysz PiZ wykazuje nadekspresję transgenu składającego się z wielu fragmentów genomu DNA, które zawierają regiony kodujące zmutowanego ludzkiego genu A1AT i promotora, wraz z intronami i ~2 kilozasadami regionów flankujących w górę i w dół14,15...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż cBDL jest najczęstszą techniką eksperymentalną w przypadku cholestazy obturacyjnej, może stanowić wiele wyzwań u gryzoni. W zależności od liczby dni pooperacyjnych wymaganych do osiągnięcia punktu końcowego, zwierzęta mogą doświadczać znacznej zachorowalności i śmiertelności w miarę upływu czasu. Stopień uszkodzenia tkanki i martwicy dróg żółciowych jest dodatkowo zaostrzony podczas pracy z niektórymi transgenicznymi mysimi modelami choroby wątroby, które wykazują nieprawidłową miąższ wątroby i jej funkcję na poc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Khan dziękuje za wsparcie grantowe od NIH/NICHD K12HD052892, Fundacji Alpha-1, Fundacji Hillmana oraz Centrum Badań nad Wątrobą w Pittsburghu. Dr Michalopoulos dziękuje za wsparcie ze strony NIH/NIDDK P01DK096990. Doceniamy doskonałą i hojną pomoc techniczną Anne Orr. Jesteśmy również wdzięczni dr Davidowi A. Gellerowi za zapewnienie dostępu do laboratorium mikrochirurgii transplantacji i gryzoni.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop-Leica Wild M650, 6– 40 i razy; powiększenieLeica Microsystemsn/a
Tec 3 parownik lejkowy z lejkiem do napełnianiaznieczulenia ogólnego niedotyczy
Stevens Nożyczki do tenotomiiDokładne chirurgiczne i Scientific Instruments CorporationASSI.9193
Kleszcze AdsonNarzędzia do precyzyjnej nauki11006-12
Komary klasyczne delikatne kleszcze hemostatyczneCodman30-4472
Mikro-zwijaczMurdock; Roboz Instrument chirurgicznyRS-6550
Gąbki z włókniny z gazyFisherband870-PC-DBL
Puritan 6 " Mały wacik bawełniany z drewnianą rączkąPuritan Medical Products Company868-WCS
Kleszcze Dumont SS - Końcówki standardowe/Proste/Inox/13,5 cmNarzędzia do nauki11203-23
Kleszcze Dumont SS - Końcówki standardowe/kątowe 45°/Inox/13,5cmNarzędzia do nauki11203-25
Nożyczki sprężynowe Vannas - 3mm Krawędź tnącaNarzędzia do nauki precyzyjnej15000-00
Uchwyt mikroigłowyAesculap Instrumenty chirurgiczneFD231R
Micro AROSuture, sterylny szew nylonowy 10-0, 70 µ m, Punkty TAPAROSurgical Instruments CorporationT4A10N07
4-0 VicrylEthiconJ662H
5-ml StrzykawkaBD309646
Naczynie do hodowli tkankowych Falcon, 60 i razy; 15 mmCorning353002
Isoflurane, Farmakopea Stanów Zjednoczonych (USP) płyn do inhalacji, 250 mlPiramal HealthcareNDC 66794-017-25
Buprenex do wstrzykiwań (chlorowodorek buprenorfiny)Reckitt Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-0757-1
Cefazolina do wstrzykiwań, USPAPP PharmaceuticalsNDC 63323-238-61
Roztwór do peelingu PVP (powidon– Jod 7,5%)MedlineNDC 12496-0757-1
70% EtanolDecon Labs2716
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem bez wapnia i magnezuLONZA17-516F
Sirius RedSigma365548
HematolxylinFisher (Richard-Allan Scientific)22-050-111 (7211)
EosinAnatech (Fisher)832 (NC9686037)
FormalinFisherSF100-20
Usługi precyzyjnej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver - Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
  2. Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
  3. Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
  4. Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
  5. Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  6. Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
  7. Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
  8. Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438(2015).
  9. Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
  10. Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
  11. Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378(1973).
  12. Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
  13. Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
  14. Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
  15. Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
  16. Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
  17. Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
  18. Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
  19. Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
  20. Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. Madame Curie Bioscience Database. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2013).
  21. Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
  22. Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874(2017).
  23. Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
  24. Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
  25. Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Partial Bile Duct LigationBile Duct LigationObstructive CholestasisHepatic Bile DuctLiver RegenerationSurgical TechniqueMouse ModelLiver InjuryBile Duct ProliferationLocalized Obstruction

Related Articles