Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

14.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56947

⸱

26 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1UGSF – Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, CNRS, UMR 8576, Université de Lille

W tym artykule

Podsumowanie

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Streszczenie

Lignina jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych biopolimerów na świecie i głównym składnikiem biomasy lignocelulozowej. Ten fenolowy polimer odgrywa istotną rolę strukturalną i ochronną w rozwoju i życiu roślin wyższych. Choć skomplikowane mechanizmy regulujące procesy zdrewnienia in vivo silnie wpływają na waloryzację przemysłową wielu produktów pochodzenia roślinnego, przed środowiskiem naukowym jeszcze długa droga do ich rozszyfrowania. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół podwójnego znakowania umożliwia badania bioobrazowe aktywnie zdrewniałych stref tkanek roślinnych, w prostym, trzyetapowym procesie pracy. Pierwszy etap polega na metabolicznym włączeniu dwóch niezależnych reporterów chemicznych, substytutów dwóch natywnych monolignolów, które dają początek jednostkom H i G ligniny. Po włączeniu do rosnących polimerów ligniny, każdy reporter jest następnie specjalnie znakowany własną sondą fluorescencyjną za pomocą sekwencyjnej kombinacji bioortogonalnych reakcji kliknięcia SPAAC/CuAAC. W połączeniu z autofluorescencją ligniny, podejście to prowadzi do wygenerowania trójkolorowych map lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i dostarcza precyzyjnych informacji przestrzennych na temat obecności lub braku aktywnej maszynerii lignifikacyjnej w skali tkanek roślinnych, komórek i różnych warstw ściany komórkowej.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad strategia reporterów chemicznych wyłoniła się jako potężna dwuetapowa metodologia badania dynamiki i funkcji biomolekuł niezakodowanych genetycznie.1,2,3 W tej strategii syntetyczny analog interesującej biomolekuły z niewielką modyfikacją – reporterem chemicznym – jest najpierw metabolizowany przez żywy organizm, a następnie sonda chemiczna (np. fluorofor do obrazowania w konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej) jest kowalencyjnie łączona z wbudowanym reporterem za pomocą bioortogonalnej chemii klik. Sonda musi reagować szybko i specyficznie z wprowadzoną modyfikacją chemiczną, pozostając jednocześnie obojętną wobec wszelkich biomolekuł obecnych w żywym systemie. Pod wieloma względami metoda ta pokonuje ograniczenia powszechnych technik biokoniugacji dzięki zastosowaniu wysoce specyficznych ligacji chemii klik, co stwarza możliwość śledzenia metabolitów lub biomakrocząsteczek, które wcześniej były niedostępne w żywych systemach4,5,6.

Pomimo szybko rosnącej popularności tej potężnej metody w komórkach bakteryjnych i zwierzęcych, doniesienia opisujące jej zastosowanie w biologii roślin są zaskakująco nieliczne i rzadkie7,8,9,10,11,12. Byliśmy szczególnie zainteresowani zastosowaniem tej strategii u roślin w celu zbadania powstawania ligniny, jednego z najpowszechniejszych biopolimerów na planecie i głównego składnika biomasy lignocelulozowej.13,14 Lignina jest polimerem fenolowym, który odgrywa kluczową rolę strukturalną i ochronną w rozwoju oraz życiu roślin wyższych.

Składa się on zazwyczaj z trzech jednostek 4-hydroksyfenylopropanoidowych: H (p-hydroksyfenylowej), G (guajacylu) i S (syringylu), pochodzących odpowiednio z trzech „monolignoli” (alkoholi p-kumarylowego, koniferylowego i sinapillowego), które są syntetyzowane w cytoplazmie komórki poprzez szlak fenylopropanoidowy (Rycina 1). Po transporcie do ściany komórkowej monolignole są utleniane do rodników przez peroksydazy lub lakkazy, po czym ulegają czysto chemicznym reakcjom sprzęgania rodnikowego, prowadząc do polimeryzacji w polimery ligniny; proces ten nazywa się lignifikacją.15,16 Chociaż ligniny mają silny wpływ na przemysłową waloryzację wielu produktów pochodzenia roślinnego, społeczność naukowa wciąż ma przed sobą długą drogę do rozszyfrowania złożonych mechanizmów regulujących lignifikację.

Schemat biosyntezy ligniny: od fenyloalaniny do monolignoli, enzymy lakkazy, peroksydazy, ściana komórkowa.
Rysunek 1: Proces lignifikacji w komórkach roślinnych. Monolignole są biosyntetyzowane z fenyloalaniny w cytosolu. Po transporcie do ściany komórkowej monolignole są utleniane do rodników przez peroksydazy lub lakkazy, po czym ulegają czysto chemicznym reakcjom sprzęgania rodnikowego, polimeryzując do polimerów ligniny; proces ten nazywa się lignifikacją. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Choć doniesienia o wykorzystaniu reakcji bioortogonalnych do analizy glikanów są liczne,2,3,17 przykłady ich zastosowania w odniesieniu do innych typów biomolekuł są nieliczne. Wykorzystanie chemii bioortogonalnej do obrazowania ligniny zostało niedawno zainicjowane przez Tobimatsua et al.8 u Arabidopsis thaliana, aby dostarczyć informacji o włączaniu substytutów alkoholu koniferylowego do polimeru ligniny, w którym tworzą one jednostki G,8,9 wykazując tym samym dowód koncepcji, że strategie reporterów chemicznych są stosowalne w tym kontekście. Zastosowanie CuAAC zostało zilustrowane kilka miesięcy później przez Bukowskiego et al przy użyciu innego pochodnego alkoholu koniferylowego.9 Jednakże lignina zawiera również jednostki H i S, a głębsze zrozumienie procesu lignifikacji wymaga większej wiedzy na temat tego, jak wszystkie monolignole są włączane do polimeru oraz jakie czynniki mogą kontrolować jego skład. Nowe postępy w tej dziedzinie zależą obecnie od opracowania wydajnych metodologii pozwalających na jednoczesne śledzenie wielu reporterów chemicznych w systemach żywych. Mimo że w ostatnich latach kilka artykułów na temat glikanów położyło pod to podwaliny18,19,20,21,22, podejścia do podwójnego znakowania pozostają głównym wyzwaniem w chemii bioortogonalnej. Jeśli opracowanie powtarzalnego protokołu pojedynczego znakowania metodą click jest trudne, to podejścia do podwójnego znakowania, które wymagają tandemowej optymalizacji dwóch wzajemnie kompatybilnych reakcji bioortogonalnych dla dwóch oddzielnych reporterów chemicznych, są jeszcze trudniejsze. Nieliczne przykłady, które pioniersko podejdywały do tego aspektu, wykorzystywały kombinację cykloaddycji azydku z alkinem promowanej naprężeniem (SPAAC) oraz reakcji alkenu z tetrazyną w ramach odwróconego zapotrzebowania elektronowego w reakcji Dielsa-Aldera (DAinv) do badania glikanów w komórkach zwierzęcych. Uznaliśmy jednak, że bioortogonalność reakcji DAinv może nie być zagwarantowana w tym zastosowaniu ze względu na cechy strukturalne ligniny (która składa się z bogatych w elektrony podstawionych monomerów typu cynamylowego, mogących reagować z ubogimi w elektrony dienami, takimi jak sondy tetrazynowe stosowane w reakcjach DAinv), co może prowadzić do niespecyficznego znakowania. Dodatkowo reakcja DAinv wymaga uchwytów chemicznych, które są trudne do uzyskania syntetycznie, a ponadto są objętościowe i lipofilowe, co zwiększa prawdopodobieństwo, że szybkość wbudowywania, transport i/lub lokalizacja reportera chemicznego in vivo mogą zostać zaburzone. Ponieważ uznaliśmy, że ten ostatni aspekt jest szczególnie istotny w przypadku zastosowania chemii click do badania lignifikacji, wybraliśmy inny kierunek i opracowaliśmy Bioorthogonal Ligation Imaging Sequential Strategy (BLISS), wykorzystując kombinację cykloaddycji azydku z alkinem promowanej naprężeniem (SPAAC) oraz cykloaddycji azydku z alkinem katalizowanej miedzią (CuAAC) in vivo.23

Te dwie reakcje są w rzeczywistości dwoma głównymi bioortogonalnymi reakcjami typu click stosowanymi do tej pory, a w szczególności w kilku niedawno opublikowanych przykładach obrazowania ligniny.8,9 Nasza strategia podwójnego znakowania umożliwia zastosowanie grupy azydowej w jednym reporterze monolignolu i alkinu końcowego w drugim; są to dwie grupy funkcyjne, które i) nie reagują ze strukturami istotnymi biologicznie oraz ii) mają bardzo niewielki rozmiar (Rysunek 2). W rezultacie wpływ tych syntetycznych modyfikacji na właściwości fizykochemiczne badanej biomolekuły jest zminimalizowany, co ogranicza możliwe rozbieżności między nienaturalnymi a naturalnymi substratami monolignoli pod względem szybkości transportu i metabolizacji podczas etapu wbudowania metabolicznego. Chociaż połączenie SPAAC i CuAAC wydaje się na pierwszy rzut oka bardzo intuicyjne, z naszej wiedzy jest to dopiero drugi przykład podwójnego znakowania z wykorzystaniem tej strategii i pierwsze zastosowanie w strukturach innych niż glikany.12,23

Proces znakowania polimeru ligniny z wykorzystaniem SPAAC i CuAAC; konfiguracja obrazowania mikroskopią konfokalną.
Rycina 2: Strategia podwójnego znakowania BLISS. Reportery chemiczne HAZ i GALK są analogami znakowanymi natywnych monolignoli H i G. Są one najpierw włączane w rosnące polimery ligniny w ścianach komórkowych poprzez podawanie egzogenne (krok 1). Następnie fluorescencyjne sondy funkcjonalizowane cyklooktynem i azotkiem są sekwencyjnie łączone z włączonymi reporterami za pomocą bioortogonalnej chemii klik: reakcja SPAAC (krok 2) jest wysoce specyficzna dla jednostek HAZ, po której następuje reakcja CuAAC (krok 3) specyficzna dla jednostek GALK (krok 3), co umożliwia specyficzną lokalizację obu reporterów niezależnie w tej samej próbce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W pierwszej kolejności zaprojektowaliśmy i zwalidowaliśmy reporter monolignolu znakowanego azydkiem HAZ (zamiennik) p-alkohol kumarylowy i prekursor jednostek H ligniny), a następnie opracowano strategię podwójnego znakowania BLISS, w której jest on stosowany w połączeniu z wcześniej opisanym znakowaniem alkinyą GALK,9 (substytut alkoholu koniferylowego i prekursor jednostek G ligniny). W tym powtarzalnym protokole, opracowanym i przetestowanym na lnie, gatunku rośliny o dużym znaczeniu gospodarczym, podwójna metaboliczna inkorporacja HAZ i GALK do ligniny uzyskuje się w pierwszej kolejności, przed sekwencyjnym znakowaniem SPAAC/CuAAC. Tutaj znakowane HAZ jednostki są najpierw wyraźnie oznakowane poprzez ligacja SPAAC fluoroforu funkcjonalizowanego cyklooktynem, a następnie ligacja drugiej sondy fluorescencyjnej za pośrednictwem CuAAC na znaczniku GALK jednostki. Metodę tę zastosowano do zbadania dynamiki procesów lignifikacji w ścianach komórkowych roślin i można ją wykorzystać in vivo do przekrojów poprzecznych łodyg, żywych łodyg, jak również siewek różnych gatunków roślin.

Protokół

UWAGA: Płynne i stałe podłoża 1/2 MS muszą być przygotowane wcześniej, jak opisano w Tabeli Uzupełniającej 1.

1. Kultura roślin

  1. Uprawa 2-miesięcznych roślin lnu
    1. Wysiewaj nasiona lnu (Linum usitatissimum L.) w plastikowych doniczkach za pomocą kompostu doniczkowego.
    2. Uprawiać len w komorach wzrostowych w temperaturze 22 °C z fotoperiodem 16 godzin/8 godzin dzień/noc.
    3. Wyposaż rośliny w podparcie pionowe po 1 miesiącu i rosną do 2 miesiąca życia.
  2. Uprawa 2-tygodniowych sadzonek lnu
    1. Zawiń 12 nasion lnu w kawałek gazy serowej i przymocuj gumką, aby utworzyć wiązkę.
      UWAGA: Kolejne kroki należy wykonać w sterylnych warunkach pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
    2. Umieść wiązkę nasion w uprzednio autoklawowalnej szklanej butelce o pojemności 250 ml.
    3. Dodaj 70 ml 70% EtOH do butelki i delikatnie mieszaj przez 1 minutę.
    4. Ostrożnie usunąć EtOH przez dekantację, pozostawiając wiązkę w butelce.
    5. Dodaj 100 ml 2% podchlorynu sodu i delikatnie mieszaj przez 10 minut.
    6. Usunąć roztwór podchlorynu sodu przez dekantację, pozostawiając wiązkę w butelce.
    7. Powtórz kroki 1.2.5-1.2.6.
    8. Dodaj 100 ml sterylnej ultraczystej wody i mieszaj przez 1 minutę.
    9. Powtórzyć krok 1.2.8 3 razy, zwiększając czas płukania dla każdego płukania (5, 10 i 15 min).
    10. Ciepłe stałe podłoże 1/2 MS, wlać do sterylnego pudełka z kulturami roślinnymi na wysokość 2 cm i pozostawić do ostygnięcia do zestalenia.
    11. Delikatnie umieść każde nasiono na stałym podłożu za pomocą sterylnych kleszczy.
    12. Zamknij sterylne pudełko.
    13. Przenieść pudełko do komory wzrostowej w temperaturze 22 °C z fotoperiodem 16 godzin/8 godzin dzień/noc i uprawiać sadzonki lnu przez 2 tygodnie.

2. Metaboliczna inkorporacja reporterów chemicznych

UWAGA: Poniżej przedstawiono trzy modele eksperymentalne: i) metaboliczne znakowanie przekrojów poprzecznych łodyg, ii) całe łodygi i iii) siewki roślin. Każdy protokół jest przedstawiany dla jednej kontrpróby biologicznej, a ilości mogą być dostosowane do liczby wymaganych kontrprób biologicznych. Roztwory monolignolu przygotowuje się z roztworów podstawowych, które są sporządzane zgodnie z opisem w tabeli 2 przed doświadczeniem. Roztwory podstawowe mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C. Proporcje HAZ:GALK lub H:G można dostosować tak, aby pasowały do wszystkich niestandardowych projektów eksperymentalnych.

  1. Chemiczne wbudowywanie reportera w 2-miesięczne przekroje łodyg lnu
    1. Przygotować 300 μl chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    2. Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do jednego dołka na 48-dołkowej płytce za pomocą mikropipety.
    3. Przygotować 300 μl roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    4. Zwirować roztwór H/G i przenieść go do drugiego dołka na tej samej 48-dołkowej płytce.
    5. Odetnij łodygę 2-miesięcznej rośliny lnu na wysokości 10 cm nad poziomem gleby za pomocą nowej żyletki.
    6. Delikatnie przygotuj 50 odręcznych przekrojów poprzecznych łodygi za pomocą żyletki (o grubości około 150-250 μm).
    7. Natychmiast umieść przekroje w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS w szkiełku zegarkowym.
    8. Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem HAZ/GALK.
    9. Powtórzyć krok 2.1.8 dla studzienki wypełnionej roztworem H/G (jako kontrola ujemna).
    10. Powtórzyć krok 2.1.8 dla trzeciej studzienki wypełnionej 300 μl pożywki 1/2 MS (jako kontrola tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów mikroskopii konfokalnej).
    11. Inkubować płytkę w ciągłym świetle w komorze wzrostowej w temperaturze 20 °C przez 20 godzin.
    12. Usunąć roztwór monolignolu z każdej studzienki za pomocą mikropipety.
    13. Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).
  2. Chemiczne włączenie reportera do 2-miesięcznych całych łodyg lnu
    1. Przygotować 5 ml chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    2. Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm za pomocą pipety.
    3. Przygotować 5 ml roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    4. Zmieszaj roztwór H/G i przenieś go do szklanej probówki o wysokości 20 cm.
    5. Przygotować trzecią szklaną probówkę zawierającą 5 ml pożywki 1/2 MS (jako kontrolę tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów z mikroskopii konfokalnej).
    6. Odetnij łodygę 2-miesięcznej rośliny lnu na wysokości 10 cm nad poziomem gleby za pomocą nowej żyletki. Wyrzuć system korzeniowy i dolną część łodygi i przejdź do następnego kroku z górną częścią łodygi rośliny.
    7. Zanurzyć podstawę całego odciętego trzpienia w probówce zawierającej roztwór HAZ/GALK. Umieść łodygę w roztworze inkubacyjnym natychmiast po usunięciu systemu korzeniowego, aby zapobiec jej wysuszeniu.
      UWAGA: Jeśli metoda jest stosowana do młodszych/starszych roślin i/lub innych gatunków, objętość roztworów monolignolu musi być dostosowana do wielkości/wieku rośliny i średnicy jej łodygi.
    8. Przymocuj trzpień do pionowego wspornika, aby utrzymać go prosto.
    9. Uszczelnij szklaną rurkę parafilmem, aby uniknąć parowania roztworu.
    10. Powtórzyć kroki 2.2.6-2.2.9 dla ujemnej próbki kontrolnej z roztworem H/G.
    11. Powtórzyć czynności 2.2.6-2.2.9 dla próbki kontrolnej tła fluorescencyjnego zawierającej pożywkę 1/2 MS.
    12. Inkubuj każdą łodygę przez 20 godzin w ciągłym świetle za pomocą światła neonowego.
    13. Po 20 godzinach od inkorporacji metabolicznej usunąć łodygę inkubowaną w roztworze HAZ/GALK i przepłukać ją 1/2 MS pożywki.
    14. Odetnij i wyrzuć dolny 1 cm łodygi za pomocą żyletki, a następnie przygotuj cylinder o wysokości 1 cm od podstawy pozostałej łodygi.
    15. Ostrożnie przygotuj 20 odręcznych przekrojów poprzecznych (o grubości około 150-250 μm) z tego cylindra i natychmiast umieść je w szkiełku zegarkowym wypełnionym 1/2 MS medium.
    16. Umieścić 500 μl pożywki 1/2 MS w jednym dołku na 48-dołkowej płytce.
    17. Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem 1/2 MS.
    18. Powtórzyć kroki 2.2.13-2.2.17 dla łodygi kontroli ujemnej inkubowanej z roztworem H/G.
    19. Powtórzyć kroki 2.2.13-2.2.17 dla kontrolnej łodygi kontrolnej tła fluorescencji inkubowanej z pożywką 1/2 MS.
    20. Ostrożnie usuń roztwór z każdej studzienki za pomocą mikropipety.
    21. Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).
  3. Chemiczny reporter do 2-tygodniowych sadzonek lnu
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w sterylnych warunkach.
    1. Przygotować 2 ml chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    2. Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm za pomocą pipety.
    3. Przygotować 2 ml roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    4. Zmieszać roztwór H/G i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm.
    5. Przygotować trzecią szklaną probówkę o wysokości 20 cm zawierającą 2 ml pożywki 1/2 MS (jako kontrolę tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów mikroskopii konfokalnej).
    6. Delikatnie usuń 2-tygodniową sadzonkę lnu z twardego podłoża o stężeniu 1/2 MS za pomocą długiej pęsety (sekcja 1.2. powyżej).
    7. Delikatnie przenieś sadzonkę do probówki zawierającej roztwór HAZ/GALK, upewniając się, że jej korzenie są zanurzone w roztworze.
    8. Zamknij szklaną rurkę plastikową nakrętką, aby uniknąć parowania.
    9. Powtórzyć kroki 2.3.6-2.3.8 dla probówki kontroli ujemnej z roztworem H/G.
    10. Powtórzyć kroki 2.3.6-2.3.8 dla probówki kontrolnej tła fluorescencyjnego zawierającej pożywkę 1/2 MS.
    11. Każdą sadzonkę inkubować w ciągłym świetle w komorze wzrostowej przez 20 godzin w temperaturze 20 °C.
    12. Sadzonkę inkubowaną w roztworze HAZ/GALK delikatnie wyjąć i przepłukać 1/2 MS pożywki.
    13. Delikatnie przygotuj 20 odręcznych przekrojów (o grubości około 150-250 μm) hipokotylu.
    14. Umieścić 500 μl pożywki 1/2 MS w jednym dołku na 48-dołkowej płytce.
    15. Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem 1/2 MS.
    16. Powtórzyć kroki 2.3.12-2.3.15 dla sadzonki kontroli ujemnej inkubowanej z roztworem H/G.
    17. Powtórzyć kroki 2.3.12-2.3.15 dla kontrolnej sadzonki fluorescencji tła inkubowanej z pożywką 1/2 MS.
    18. Ostrożnie usuń roztwór z każdej studzienki za pomocą mikropipety.
    19. Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).

3. Podwójne znakowanie fluorescencyjne próbek o przekroju poprzecznym roślin przez SPAAC i CuAAC

UWAGA: Protokół etykietowania BLISS jest identyczny dla wszystkich 3 modeli eksperymentalnych (sekcja 2).

  1. Znakowanie cykloaddycji azydowo-alkinowej promowanej szczepem (SPAAC)
    1. Przygotować 1 ml roztworu SPAAC zawierającego 5 μM DBCO-PEG4-5/6-karboksyrodaminy 110 w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS. Zwiruj roztwór i trzymaj go w ciemności.
    2. Po końcowych etapach przemywania w protokole inkorporacji metabolicznej [2.1.13, 2.2.21 lub 2.3.19 w zależności od wybranego schematu doświadczalnego], usunąć pożywkę 1/2 MS i dodać 300 μl roztworu SPAAC do dołka za pomocą mikropipety.
    3. Osłoń 48-dołkową płytkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową lub umieszczając w pudełku.
    4. Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.
  2. Znakowanie cykloaddycji azydowo-alkinowej katalizowanej miedzią (CuAAC)
    1. Umyj każdą studzienkę 4 razy, jak opisano w kroku 2.1.13, trzymając płytkę w ciemności.
    2. Przygotować 1 ml roztworu CuAAC zawierającego 2,5 mM askorbinianu sodu, 0,5 mMCuSO4 i 5 μM 3-azydku 5-TAMRA-PEG w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS. Zmieszaj roztwór i trzymaj go w ciemności.
      UWAGA: Ten roztwór CuAAC musi być świeżo przygotowany przed użyciem i nie może być przechowywany dłużej niż kilka dni w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć 1/2 MS pożywki z każdej studzienki i bezpośrednio dodać 300 μl roztworu CuAAC do studzienki za pomocą mikropipety.
    4. Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.
    5. Usunąć roztwór CuAAC za pomocą mikropipety.
    6. Za pomocą mikropipety dodaj 500 μl 1/2 MS, mieszaj w ciemności przez 10 minut, a następnie usuń roztwór myjący. Powtórz dwa razy.
    7. Dodać 500 μl roztworu MeOH/woda o proporcji 7:3, mieszać w ciemności przez 1 godzinę, a następnie usunąć roztwór
      UWAGA: Metanol jest toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu i jest oznaczony jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Jego utylizacja wymaga zainstalowania dygestoriów i rękawic chemicznych.
    8. Dodaj 500 μl 1/2 MS, mieszaj w ciemności przez 10 minut, a następnie usuń roztwór. Powtórz 4 razy.

4. Montaż próbek na szkiełkach mikroskopowych

  1. Umieść 5 kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym.
  2. Ostrożnie umieść każdy przekrój oznaczony HAZ/GALK na szkiełku.
  3. Nałóż lakier do paznokci po dwóch przeciwnych stronach szkiełka.
  4. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
  5. Usuń nadmiar podłoża montażowego za pomocą ręcznika papierowego.
  6. Uszczelnij próbkę lakierem do paznokci ze wszystkich 4 stron. Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (około 30 min).
  7. Powtórzyć kroki 4.1-4.6 dla przekrojów H/G kontroli ujemnej.
  8. Powtórz kroki 4.1-4.6 dla przekrojów kontrolnych tła fluorescencyjnego.
  9. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu obserwacji pod mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA: Przygotowane preparaty można przechowywać od kilku tygodni do kilku miesięcy w zależności od jakości preparatu. Jeżeli po przechowywaniu ma być dokonana nowa obserwacja, należy upewnić się, że próbki nie wyschły.

5. Akwizycja obrazu za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

  1. Włącz wszystkie niezbędne jednostki systemu mikroskopii konfokalnej we właściwej kolejności, zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wybierz żądany obiektyw z maksymalną aperturą numeryczną i dostosowanymi długościami fal wzbudzenia i emisji (np. obj. 60x, N.A. 1.2. Kanał autofluorescencyjny: λex 405 nm, λem 450 nm /25; Kanał SPAAC HAZ: Λex 488 nm, λem 525 nm /25; Kanał CuAAC GALK: Λex 561 nm, λem 595 nm /25 ; tryb sekwencyjny).
  3. Wybierz żądane parametry generowania obrazów w oprogramowaniu (wymagane 12- lub 16-bitowe, rozmiar piksela dostosowany do kryterium Nyquista).
  4. Umieścić szkiełko HAZ/GALK na stoliku mikroskopu i umieścić próbkę pod soczewką obiektywu.
  5. Obserwuj i znajdź żądany obszar tkanki roślinnej.
  6. Uzyskaj wysokiej jakości obrazy konfokalne podwójnie znakowanej próbki HAZ/GALK.
    1. Wybierz najbardziej fluorescencyjną płaszczyznę na osi Z.
    2. Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera, aby uzyskać optymalny rozkład sygnału w całym zakresie poziomów szarości dla każdego kanału (autofluorescencja, HAZ i GALK). Te same parametry muszą być stosowane w odniesieniu do wszystkich kolejnych przejęć.
    3. Uruchom pobieranie wybranego obrazu i zapisz plik. Powtórzyć te czynności dla każdego odpowiedniego obszaru próbki.
      UWAGA: W razie potrzeby można również nabyć rekonstrukcje 3D Z-stack
      4. .
  7. Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj obrazy nieoznakowanej próbki inkubowanej tylko w 1/2 MS w celu określenia poziomu autofluorescencji (kontrola tła fluorescencji, jak opisano w sekcji 2).
  8. Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj obrazy dla próbek kontroli ujemnej inkubowanych z natywnymi monolignolami H/G w celu określenia niespecyficznej adhezji fluoroforu do próbki.
  9. Zastosuj obróbkę danych do uzyskanych obrazów, aby odjąć sygnały autofluorescencji tła zarówno na obrazach kontroli ujemnej H/G, jak i obrazach HAZ/GALK.

Wyniki

Dzięki zastosowaniu przedstawionego protokołu BLISS, wykorzystującego syntetyczne analogi monolignoli oraz bioortogonalną chemię klik, możliwe jest wizualizowanie dynamiki procesu lignifikacji w żywych roślinach. W przeciwieństwie do utrwalonych technik wizualizacji ligniny (takich jak barwienie histochemiczne, immunolokalizacja czy autofluorescencja), ten protokół „podwójnego kliknięcia” ukierunkowuje się wyłącznie na ligninę produkowaną de novo podczas etapu inkorporacji metabolicznej i odróżnia ją od ligniny istniejącej wcześniej w próbce za pomocą trójkanałowego obrazowania komórkowego w konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 3). Jednostki HAZ są wykrywane przy użyciu długości fal wzbudzenia i emisji DBCO-PEG4-5/6-karboksyrodaminy 110, która jest specyficznie przyłączana za pomocą reakcji klik do funkcji azydkowych inkorporowanych cząsteczek HAZ podczas etapu SPAAC (λex 501 nm /λem 526 nm, kanał zielony), natomiast jednostki GALK są analogicznie wykrywane przy charakterystycznych długościach fal sondy azidefluor 545, która jest specyficznie przyłączana do inkorporowanych znaczników terminalnego alkinu GALK podczas etapu CuAAC (λex 546 nm /λem 565 nm, kanał czerwony); trzeci kanał odpowiada ligninie istniejącej wcześniej, która jest wykrywana za pomocą jej wewnętrznej autofluorescencji przy 405 nm (kanał niebieski). Podejście to prowadzi do wygenerowania trójkolorowych map lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin, które dostarczają precyzyjnych informacji przestrzennych na temat obecności lub braku aktywnego aparatu lignifikacyjnego pomiędzy różnymi tkankami organu (Rysunek 3A), pomiędzy różnymi typami komórek w obrębie tej samej tkanki (Rysunek 3B-C) oraz w różnych warstwach ściany tej samej komórki (Rysunek 3D). Innymi słowy, metodologia ta pozwala na wyróżnienie i specyficzną lokalizację „aktywnych” miejsc lignifikacji (kanały HAZ i GALK) poprzez odróżnienie ich od stref, w których lignina została utworzona na wcześniejszym etapie rozwoju rośliny (kanał autofluorescencji). Dodatkowo, czułość tej techniki jest znacznie zwiększona w porównaniu z autofluorescencją, co pozwala na wykrycie znacznie mniejszych ilości świeżo zsyntetyzowanej ligniny (Rysunek 3B).

Mikroskopia przekroju poprzecznego tkanki roślinnej; obrazowanie fluorescencyjne; analiza struktury komórkowej; schemat.
Rysunek 3: Obrazowanie wbudowanych chemicznych reporterów monolignoli w łodygach lnu. (A) Połowa wykonanego ręcznie przekroju poprzecznego łodygi lnu, obraz zrekonstruowany. (B) Zbliżenie pierwszych warstw różnicującego się ksjlemu. Panel lewyautofluorescencja ligniny (niebieska, 405 nm), środkowy panelnałożone obrazy autofluorescencji ligniny (niebieski) i HAZ kanały fluorescencji (zielony, 526 nm), prawy panelnałożone obrazy autofluorescencji ligniny (niebieski) i GALK kanały fluorescencji (czerwony, 565 nm). Strzałka wskazuje pierwszą oznakowaną ścianę komórkową od kambium, co ilustruje zwiększoną czułość metody BLISS w porównaniu z autofluorescencją. (C) znakowanie w różnych typach komórek drewna wtórnego i (D) zbliżenie na komórki wtórnego ksylemu, ilustrujące różnice w znakowaniu w różnych warstwach tej samej ściany komórkowej. Panel lewynałożone obrazy autofluorescencji ligniny (niebieski) i HAZ kanały fluorescencji (zielony, 526 nm), środkowy panelnałożone obrazy autofluorescencji ligniny (niebieski) i GALK kanały fluorescencji (czerwony, 565 nm), prawy panelnałożona autofluorescencja ligniny (niebieska), HAZ (zielony) i GALK kanały fluorescencji (czerwonej). HAZ oraz GALK kolokalizacja jest przedstawiona w kolorze żółtym. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Strategie reporterów chemicznych, takie jak przedstawiona tutaj metoda BLISS lub procedury znakowania pojedynczego opublikowane wcześniej przez Tobimatsu et al.8, pozwalają zatem na znacznie dokładniejsze badania niż metody dostępne wcześniej, takie jak barwienia immunochemiczne lub histochemiczne, pozostając jednocześnie bardzo prostymi w implementacji. Na przykład Rysunek 4 ilustruje, że intensywność sygnału wbudowania HAZ/GALK w tracheidy/naczynia włókniste (FT) ksylemu wtórnego lnu jest bardzo wysoka w pierwszych kilku ścianach komórkowych od kambium, ale stopniowo maleje w starszych komórkach. Profil ten jest przeciwny do profilu autofluorescencji i wskazuje, że maksymalne zdrewnienie jest bardzo szybko osiągane w pierwszych dwóch do trzech warstwach komórek FT od kambium. W przeciwieństwie do nich, komórki promieni (R) zdają się kontynuować proces lignifikacji do znacznie późniejszych etapów rozwoju, ponieważ wbudowanie HAZ/GALK jest znacznie bardziej stałe w ścianach wszystkich komórek od kambium aż po rdzeń. Nie jest zaskakujące, że typy komórek FT i R wykazują kontrastową dynamikę lignifikacji, ponieważ typy te pełnią różne role biologiczne, z czego wynikają różnice w ich programie rozwojowym. FT są rzeczywiście wydłużonymi rurkami, które dojrzewają i szybko obumierają, pozostawiając martwe, puste komórki o grubych zdrewniałych ścianach, które odgrywają kluczową rolę zarówno w podparciu mechanicznym, jak i w pionowym transporcie wody i minerałów, podczas gdy wąskie rzędy komórek R tworzące promienie ksylemu pozostają żywe w swoim dojrzałym i funkcjonalnym stanie, nie posiadając grubych zdrewniałych ścian.

Struktura tkanki roślinnej, obrazy mikroskopowe, wykresy danych ze strefy kambialnej, analiza ksylemu i floemu.
Rycina 4: Inkorporacja reporterów monolignoli specyficznych dla komórek w ksylemie lnu. Widok z konfokalnej mikroskopii w polu jasnym (A) fragmentu przekroju poprzecznego łodygi lnu wykonanego ręcznie. Różowe (komórki miąższu promieni, R) i żółte (komórki tracheid włókien, FT) strzałki wskazują wektory biegnące od strefy kambialnej w kierunku rdzenia, które zostały przeskanowane pod kątem autofluorescencji ligniny przy 405 nm (B), fluorescencji HAZ przy 526 nm (C) oraz fluorescencji GALK przy 565 nm (D). (E) Widok ksylemu wtórnego. Panel lewy: połączone kanały fluorescencji autofluorescencji ligniny (niebieski), HAZ (zielony) i GALK (czerwony). Kolokalizacja HAZ i GALK jest przedstawiona na żółto. Panel prawy: schematyczna ilustracja struktury ksylemu wtórnego w łodydze lnu. V, naczynie; FT, tracheida włókien; R, komórka miąższu promieni. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lion et al.23 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Ponadto zastosowanie dwóch różnych reporterów chemicznych odpowiadających jednostkom H i G wraz z dwiema reakcjami bioortogonalnymi w protokole BLISS pozwala na uzyskanie bardziej ilościowych wyników. Strategie znakowania multipleksowego, takie jak BLISS, mogą dostarczyć dodatkowych informacji na temat kontroli stosunków wbudowy monolignoli w różnych warunkach i mogą przyczynić się do rozszyfrowania nieuchwytnego procesu lignifikacji. Jeśli względne zawartości procentowe monolignoli H, G i S w ligninach są rzeczywiście bardzo zmienne w zależności od gatunku, tkanki, wieku lub warunków środowiskowych rośliny, to zawiłe mechanizmy regulujące ten skład nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Technologia podwójnego znakowania stanowi potężne narzędzie do badania niektórych parametrów regulujących skład ligniny. Na przykład zmiana stosunku HAZ:GALK w metodzie BLISS pozwoliła nam wykazać, że skład ligniny w tkankach ksylemu wtórnego zależy bezpośrednio od dostępności monolignoli w obrębie ścian komórkowych, a nie od specyficzności peroksydazy/lakazy (Rysunek 5).

Porównanie intensywności fluorescencji; obrazy mikroskopowe i wykres słupkowy; analiza stosunku G-ALK do H-AZ.
Rycina 5: Efekt inkubacji przekrojów łodygi lnu z różnymi stosunkami procentowymi HAZ i GALK. Stosunki procentowe HAZ:GALK są podane nad każdą kolumną obrazów. Góra: połączone kanały HAZ i GALK. Dół: histogramy wskazujące średnią intensywność fluorescencji HAZ i GALK dla różnych stosunków procentowych. Wartości wyrażone jako średnia ze średniej intensywności fluorescencji w poziomach szarości ± SD. Pasek skali = 100 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lion et al.23 Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Len jest uprawiany dla jego włókien łykowych (BF), które są wykorzystywane do produkcji tekstyliów, papierów luksusowych lub ekologicznych materiałów kompozytowych. Ważnym aspektem ich waloryzacji przemysłowej jest fakt, że zawierają one bardzo niskie poziomy ligniny w ścianach komórkowych, które charakteryzują się niezwykle grubą wtórną warstwą S2/G19,24. BLISS pozwala uwydatnić różnice w dynamice lignifikacji pomiędzy różnymi warstwami tej samej ściany komórkowej. Rycina 6A pokazuje, że wbudowywanie reporterów HAZ i GALK ogranicza się do naroży komórek oraz lamelli środkowej/pierwotnej ściany komórkowej niektórych, lecz nie wszystkich włókien łykowych. Całkowity brak lignifikacji w grubiej warstwie wtórnej ściany komórkowej włókna łykowego, nawet przy egzogennym dostarczeniu chemicznych reporterów monolignoli, ujawnia, że ich stan hipolignifikowany wynika z braku środowiska molekularnego odpowiedniego dla enzymatycznie zapośredniczonego utleniania i wbudowywania monolignoli w rosnący łańcuch polimeru, a nie wynika jedynie z regulacji transkrypcyjnej genów biosyntezy monolignoli, jak zgłaszano wcześniej25. Obserwacja ta koreluje również z faktem, że geny peroksydazy lnu są upregulowane w zewnętrznych tkankach łodygi chemicznego mutanta lnu lbf1, który posiada z lignifikowanymi włókna łykowe26.

Schemat mikroskopowy przedstawiający anatomię komórki roślinnej, z wyróżnieniem analizy struktury miąższu i epidermy.
Rycina 6: BLISS wyróżnia różnice specyficzne dla warstw lub substruktury ściany komórkowej. (A) Panel lewy: obraz w polu jasnym przekroju łodygi lnu. Okrąg wskazuje pęczek włókien. Panel prawy: zbliżenie na włókna łyka. Połączone kanały HAZ i GALK (z polem jasnym i bez niego) pokazują, że lignifikacja jest ograniczona do naroży komórek (Koncepcja równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, ΣFy=0, przedstawiona na schemacie do celów edukacyjnych.) oraz blaszki środkowej/pierwotnej ściany komórkowej niektórych włókien łyka. BF, włókno łyka; Par, komórka miąższu; M, blaszka środkowa; P, pierwotna ściana komórkowa; S1, pierwsza warstwa wtórnej ściany komórkowej; S2/G, warstwa wtórna/warstwa żelatynowa wtórnej ściany komórkowej. (B) Przekrój 2D i rekonstrukcja 3D powiększenia stosu z-stack z konfokalnego obrazowania regionu endodermy korzenia lnu. Pasek Caspary'ego (Koncepcja równowagi statycznej z równaniami ΣFx=0, ΣFy=0, przedstawiona na schemacie do celów edukacyjnych.) wykazuje jedynie autofluorescencję i nie wbudowuje HAZ ani GALK. Powiązany fluorogram wykazuje antykorelację GALK/HAZ: wysoka fluorescencja zielona wiąże się z niskim sygnałem czerwonym (kora) i odwrotnie (endoderma). Perycykl (P), Endoderma (E), Kora (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wreszcie, ta dwukolorowa metodologia może dostarczyć cennych informacji na temat „stanu lignifikacji” podstruktur ścian komórkowych na różnych etapach rozwoju oraz w organach roślinnych innych niż łodyga. Na przykład endodermis korzeni lnu charakteryzuje się obecnością pasma Caspary’ego w radialnych i poprzecznych ścianach komórkowych podczas wczesnych etapów rozwoju. To pasmo hydrofobowego biopolimeru, składające się z suberyny i/lub ligniny, zapobiega pasywnemu przenikaniu wody i substancji rozpuszczonych pobranych przez korzeń poprzez apoplast i wymusza ich przejście przez błonę plazmatyczną drogą symplastyczną, przyczyniając się tym samym do selektywnych zdolności pobierania substancji przez korzenie roślin. W przypadku zastosowania naszej strategii do korzeni lnu wykazano, że HAZ i GALK są wbudowywane w ściany styczne komórek endodermis oraz w części ścian radialnych, w których pasmo Caspary’ego nie występuje (Ryc. 6B). Jednak całkowity brak wbudowania reporterów monolignoli w samym paśmie Caspary’ego wskazuje, że jest ono dojrzałe na tym etapie rozwoju, podczas gdy pozostałe ściany wciąż są miejscem dalszego odkładania biopolimeru. Zrekonstruowany widok 3D stosu obrazów (z-stack) wyraźnie uwidacznia pasmo Caspary’ego. Co ciekawe, ściany niektórych komórek kory sąsiadujących z endodermis również okazały się zdolne do preferencyjnego wbudowywania HAZ (co wskazuje na obecność ligniny/suberyny w korze korzenia lnu), ale nie GALK. Analiza kolokalizacji wykazała antykorelację między HAZ a GALK, co sugeruje istnienie specyficznej dla komórek struktury ścian/mechanizmów enzymatycznych w tych dwóch sąsiadujących typach komórek.

Tabela uzupełniająca 1: Przygotowanie stałej pożywki ½ MS Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela pomocnicza 2: Przygotowanie roztworów zapasowych reporterów chemicznych Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Jak wcześniej wspomniano, protokół podwójnego znakowania BLISS przedstawiony w tym artykule jest jednym z pierwszych przykładów kombinacji SPAAC/CuAAC in vivo 12,23. Każdy krok został dokładnie zoptymalizowany i zwalidowany, a bardzo ważne jest, aby przestrzegana była kolejność, w jakiej sekwencyjnie wykonywane są dwie reakcje znakowania chemicznego (tj. najpierw SPAAC, a następnie CuAAC). Wszystkie kontrole krzyżowe wykazały, że każdy etap etykietowania jest specyficzny, gdy stosowany jest protokół BLISS23 : przeprowadzenie etapu SPAAC najpierw prowadzi do wysoce chemoselektywnego znakowania funkcji azydku HAZ przez fluorofor funkcjonalizowany cyklooktyną poprzez [3+2] reakcję cykloaddycji z szybką kinetyką. Po oznaczeniu jednostek HAZ można przeprowadzić etap CuAAC wymagający katalizowanej miedzią (I) aktywacji końcowych alkinów GALK w celu wytworzenia wiązań triazolowych w reakcji z sondą azydkowo-fluorową 545. W przeciwieństwie do tego, odwrotna kolejność (tj. najpierw CuAAC, a następnie SPAAC) nie powinna być stosowana, ponieważ prowadzi to do sprzężenia krzyżowego jednostek GALK i HAZ, które konkuruje z ligacją fluoroforową i indukuje dramatyczną utratę sygnału. Ważne jest również, aby podkreślić konieczność stosowania pośrednich etapów prania, aby uniknąć niespecyficznych zabrudzeń.

Wykazaliśmy, że nasza metoda może być stosowana do różnych projektów eksperymentów biologicznych. Protokół znakowania BLISS został po raz pierwszy zastosowany do odręcznych przekrojów łodyg lnu (o grubości około 150-250 μm), które zostały wcześniej pocięte i inkubowane z monolignolami gotowymi do kliknięcia. Chociaż ten projekt ma tę zaletę, że minimalizuje potrzebne ilości reportera chemicznego (w miarę zmniejszania objętości inkubacji) i ułatwia produkcję kontrprób statystycznych, nie jest, ściśle mówiąc, systemem in vivo , a w niektórych przypadkach może nie odzwierciedlać wszystkich aspektów rzeczywistej dynamiki lignifikacji czasoprzestrzennej. W drugim projekcie eksperymentalnym dostosowaliśmy protokół BLISS do metody, która była wcześniej stosowana do badania wprowadzania znakowanych radioaktywnie monolignoli do sosny i miłorzębu27. W tym podejściu korzenie i łodyga rośliny są fizycznie oddzielone, a podstawa całej łodygi jest inkubowana w roztworze monolignolu w sposób, który można nazwać podejściem "wazon na kwiaty". Po pozostawieniu łodyg w pożądanym czasie (inkubacji) wycina się przekroje i wykonuje protokół BLISS. Pozwoliło nam to wykazać (i), że zmodyfikowane monolignole są transportowane przez żywą łodygę i są włączane do rosnących polimerów ligniny w ścianach komórkowych oraz (ii) że wzór lokalizacji był zasadniczo identyczny z podejściem opartym na przekroju poprzecznym. Ten rodzaj eksperymentu ma tę zaletę, że jest przeprowadzany w podejściu real living plant / live cell, co pozwala na dłuższe eksperymenty i bardziej dogłębne badania, ale wymaga większych ilości reportera chemicznego. Wreszcie, protokół BLISS został również wykorzystany w przypadku sadzonek roślin lnu, reprezentujących prawdziwy model żywej rośliny, w którym reportery chemiczne muszą zostać wchłonięte przez korzenie, zanim zostaną przetransportowane w górę łodygi. Chociaż model ten ma wyraźną zaletę polegającą na tym, że można go stosować na żywych roślinach, w praktyce ogranicza się on do młodych siewek i nie nadaje się do badania dynamiki zdrewnienia w starszych roślinach ze względów praktycznych (długi czas inkubacji, zwiększona ilość reporterów chemicznych). Niemniej jednak te trzy projekty eksperymentów są komplementarne i wszystkie mają swoje plusy i minusy w odniesieniu do aspektów praktycznych i znaczenia biologicznego, w zależności od rodzaju pytania biologicznego, na które należy odpowiedzieć.

Nasz protokół, opracowany w celu badania dynamiki zdrewnienia lnu, jest wysoce elastyczny, nie tylko pod względem projektu eksperymentu biologicznego, ale także pod względem jego zastosowania do innych gatunków roślin i organów/tkanek. Na przykład, BLISS można łatwo przenieść do rodzajów Arabidopsis lub Populus, które są bardziej podatne na badania z mutantami knock-out lub knock-down dla różnych genów. Zasadniczo, badania podwójnego znakowania z naszym podejściem można również rozszerzyć na inne biomolekuły przy użyciu dwóch odrębnych zmodyfikowanych prekursorów polimerów roślinnej ściany komórkowej - w tym wszystkich trzech głównych monolignoli lub ich prekursorów metabolicznych, a także różnych monosacharydów, które tworzą matrycę polisacharydową. Od samego początku chemia bioortogonalna została opracowana głównie w celu badania glikanów/polisacharydów za pomocą metabolicznej inżynierii oligosacharydowej (MOE)4,5,17,28, ale zaskakująco do tej pory było bardzo niewiele zastosowań w biologii roślin 7,8,9,10,11,12 . Jeśli chodzi o kompatybilność reakcji, badanie ligniny było rzeczywiście złożonym przypadkiem do rozwiązania, ponieważ oba reportery chemiczne są włączone do tego samego siatkowanego polimeru. Możliwość tworzenia się nieznakowanych usieciowań HAZ-G ALK była głównym problemem do pokonania ze względu na przestrzenną bliskość jednostek GALK i HAZ w strukturze 3D ligniny23, ograniczenie, które może nie występować, jeśli dwa reportery chemiczne nie są włączone do tego samego typu biopolimeru lub w tym samym regionie przestrzennym dowolnej komórki.

W szerszym zakresie metodologia BLISS może być zasadniczo zastosowana do dowolnego badania obrazowania fluorescencyjnego w dwóch kolorach na modelach bakteryjnych lub zwierzęcych przy użyciu dwóch odrębnych reporterów chemicznych opatrzonych odpowiednio znacznikiem azydkowym i końcowym alkinem.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Federacji Badawczej FRABio i platformie obrazowania TisBio (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblages Biomoléculaires) za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(E)-4-(3-(2-(2-(2-(2-azydoetoksy)etoksy)etoksy)prop-1-en-1-ylo)fenol (HAZ)Syntetyzowany jak w Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroksy-3-propargyloksycynamylowy alkohol (GALK)Zsyntetyzowane jak w Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% podchloryn
20 cm wysoka szklana rurka
250 ml Schott szklana butelka
48-dołkowa
/6-TAMRA-PEG3-AzideJena BioscienceCLK-AZ109-1
Folia
Gaza
Kompost zawierający glinę
Alkohol igolinowy (G)Sigma AldrichMFCD00002922
Siarczan miedzi (II) pentahydrat
DBCO-PEG4-5/6-Karboksyrodamina 110Jena BioscienceCLK-A127-1
Milli-Q Ultraczysta woda
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Nasiona lnu (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G&handel; Średni mikroskop elektronowy do montażu szkiełeknaukowych17984-25
Szkiełko
Szkiełko mikroskopowe szklane Komora
wzrostowaCLF-Plant KlimatyzacjaDla 2-tygodniowych upraw roślin
Komora wzrostowaAngelantoni Nauki przyrodniczeDla 2-miesięcznych upraw roślin
Purpurowa roślina pudełkohodowlane Dla 2-tygodniowej kultury sadzonek
MetanolToxic (SGH02, SGH06, SGH08), pracuj w rękawiczkach pod kapturem
Mikropipeta
Lakier
Mikroskop konfokalny Nikon A1RWytrząsarka
orbitalna
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)CarbosynthFC145653
Plastikowa nasadka
Plastikowa pipeta
Plastikowy garnekDo uprawy roślin w wieku 2 miesięcy
Żyletka
Gumowa opaska
Askorbinian
Sterylny zacisk
Pionowe wsparcie
Vortex
Odczynniki do cieczy i ciał stałych ½ MS średni
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4,7H2O
CaCl 2.2H2O
MnSO4. H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO< sub>4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Tiamina.HCl
Pirydoksyna.HCl
Glicyna
Kwas
Myo-inozytol
Sacharoza
MES hydrat
Agar
sodu 5aluminiowaserowanakrywkowedo paznokcisodunikotynowy

Bibliografia

  1. Grammel, M., Hang, H. C. Chemical reporters for biological discovery. Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).
  2. Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. Chemistry in living systems. Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).
  4. Chang, P. V., et al. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).
  5. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  6. Mbua, N. E., et al. Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).
  7. Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).
  8. Tobimatsu, Y., et al. A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification. Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).
  9. Bukowski, N., et al. Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls. Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).
  10. Pandey, J. L., et al. A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls. PLOS ONE. 10 (4), e0121334(2015).
  11. Pandey, J. L., et al. Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems. Front Plant Sci. 7, (2016).
  12. Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).
  13. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).
  14. Weng, J. -K., Chapple, C. The origin and evolution of lignin biosynthesis. New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).
  15. Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification. Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).
  16. Rinaldi, R., et al. Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis. Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).
  17. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).
  18. Feng, L., et al. Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans. J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).
  19. Dumont, M., et al. Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid. Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).
  20. Niederwieser, A., et al. Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry. Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).
  21. Späte, A. -K., et al. Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering. Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).
  22. Späte, A. -K., et al. Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter. Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).
  23. Lion, C., et al. BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants. Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).
  24. del Río, J. C., et al. Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives. J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).
  25. Huis, R., et al. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems. Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).
  26. Chantreau, M., et al. Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition. The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).
  27. Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora. Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).
  28. Noel, M., et al. Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins. Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wizualizacja ligninyreakcje bioortogonalnemikroskopia konfokalnaciany kom rkowe ro lininkorporacja metabolicznasondy fluorescencyjneSPAAC CuAAC
Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.