Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

DOI:

10.3791/56947

⸱

26 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1UGSF – Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, CNRS, UMR 8576, Université de Lille

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lignina jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych biopolimerów na świecie i głównym składnikiem biomasy lignocelulozowej. Ten fenolowy polimer odgrywa istotną rolę strukturalną i ochronną w rozwoju i życiu roślin wyższych. Choć skomplikowane mechanizmy regulujące procesy zdrewnienia in vivo silnie wpływają na waloryzację przemysłową wielu produktów pochodzenia roślinnego, przed środowiskiem naukowym jeszcze długa droga do ich rozszyfrowania. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół podwójnego znakowania umożliwia badania bioobrazowe aktywnie zdrewniałych stref tkanek roślinnych, w prostym, trzyetapowym procesie pracy. Pierwszy etap polega na metabolicznym włączeniu dwóch niezależnych reporterów chemicznych, substytutów dwóch natywnych monolignolów, które dają początek jednostkom H i G ligniny. Po włączeniu do rosnących polimerów ligniny, każdy reporter jest następnie specjalnie znakowany własną sondą fluorescencyjną za pomocą sekwencyjnej kombinacji bioortogonalnych reakcji kliknięcia SPAAC/CuAAC. W połączeniu z autofluorescencją ligniny, podejście to prowadzi do wygenerowania trójkolorowych map lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej i dostarcza precyzyjnych informacji przestrzennych na temat obecności lub braku aktywnej maszynerii lignifikacyjnej w skali tkanek roślinnych, komórek i różnych warstw ściany komórkowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dwóch dekad, strategia reporterów chemicznych stała się potężną dwuetapową metodologią do badania dynamiki i funkcji niekodowanych genetycznie biomolekuł. 1,2,3 W tej strategii syntetyczny analog interesującej nas biomolekuły z niewielką modulacją – chemiczny reporter – jest najpierw metabolizowany przez żywy organizm, a następnie sonda chemiczna (np. fluorofor do obrazowania fluorescencyjnego mikroskopii konfokalnej) jest kowalencyjnie łączona z włączonym reporterem za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć. Sonda musi reagować szybko i specyficznie z wprowadzoną modyfikacją chemiczną, będąc jednocześnie obojętna na wszelkie biomolekuły obecne w żywym systemie. Pod wieloma względami metoda ta pokonuje ograniczenia popularnych technik biokoniugacji poprzez zastosowanie wysoce specyficznych ligacji chemicznych typu click, zapewniając w ten sposób możliwość śledzenia metabolitów lub biomakrocząsteczek, które wcześniej były niedostępne w żywych systemach4,5,6.

Pomimo szybko rosnącej popularności tej potężnej metody w komórkach bakteryjnych i zwierzęcych, raporty opisujące jej zastosowanie w biologii roślin są zaskakująco nieliczne7,8,9,10,11,12. Byliśmy szczególnie zainteresowani zastosowaniem tej strategii w roślinach do badania powstawania ligniny, jednego z najbardziej rozpowszechnionych biopolimerów na naszej planecie i głównego składnika biomasy lignocelulozowej. 13,14 Lignina jest fenolowym polimerem, który odgrywa istotną rolę strukturalną i ochronną w rozwoju i życiu roślin wyższych.

Zazwyczaj składa się z trzech ugrupowań 4-hydroksyfenylopropanoidowych: jednostek H (p-hydroksyfenylu), G (gwajakylu) i S (syringyl) pochodzących odpowiednio z trzech 'monolignolów' (alkoholi p-kumaryl, koniferylowy i sinapylowy), które są syntetyzowane przez szlak fenylopropanoidowy w cytoplazmie komórki (Rysunek 1). Po wyeksportowaniu do ściany komórkowej monolignole są utleniane do rodników przez peroksydazy lub lakkazy, po czym przechodzą czysto chemiczne reakcje sprzęgania rodników w celu polimeryzacji do polimerów ligniny, w procesie zwanym lignifikacją. 15,16 Chociaż ligniny silnie wpływają na przemysłową waloryzację wielu produktów pochodzenia roślinnego, społeczność naukowa wciąż ma przed sobą długą drogę, aby rozszyfrować skomplikowane mechanizmy regulujące lignifikację.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Proces lignifikacji w komórkach roślinnych. Monolignole są biosyntetyzowane z fenyloalaniny w cytozolu. Po wyeksportowaniu do ściany komórkowej monolignole są utleniane do rodników przez peroksydazy lub lakkazy, po czym przechodzą czysto chemiczne reakcje sprzęgania rodników w celu polimeryzacji do polimerów ligniny, w procesie zwanym lignifikacją. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chociaż raporty na temat wykorzystania reakcji bioortogonalnych do analizy glikanów są liczne,2,3,17 przykładów ich zastosowania do innych typów biomolekuł jest mniej. Wykorzystanie chemii bioortogonalnej do celów bioobrazowania ligniny zostało dopiero niedawno zapoczątkowane przez Tobimatsu i wsp.8 w Arabidopsis thaliana w celu dostarczenia informacji o włączeniu substytutów alkoholu koniferylowego do polimeru ligniny, gdzie tworzy on jednostki G,8,9 demonstrując w ten sposób dowód na słuszność koncepcji, że chemiczne strategie reporterowe mają zastosowanie w tym kontekście. Stosowanie CuAAC zostało również zilustrowane przy użyciu innej pochodnej alkoholu igielowego kilka miesięcy później przez Bukowskiego i wsp. 9 Jednak lignina zawiera również jednostki H i S, a głębsze zrozumienie procesu lignifikacji wymaga większej wiedzy na temat tego, w jaki sposób wszystkie monolignole są włączane do polimeru i jakie czynniki mogą kontrolować jego skład. Nowe postępy w tej dziedzinie zależą obecnie od opracowania skutecznych metodologii śledzenia wielu reporterów chemicznych jednocześnie w żywych organizmach. Mimo że w ostatnich latach powstało kilka artykułów na temat glikanów18,19,20,21,22, podejścia do podwójnego znakowania pozostają głównym wyzwaniem w chemii bioortogonalnej. Jeśli trudno jest opracować powtarzalny protokół pojedynczego znakowania, to podejścia do podwójnego etykietowania, które wymagają optymalizacji w tandemie dwóch wzajemnie kompatybilnych reakcji bioortogonalnych na dwóch oddzielnych reporterach chemicznych, są jeszcze trudniejsze. W kilku przykładach, które zapoczątkowały ten aspekt, wykorzystano kombinację promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC) i reakcji odwróconego elektronicznego zapotrzebowania alken-tetrazyna Dielsa-Aldera (DAinv) w celu zbadania glikanów w komórkach zwierzęcych. Uznaliśmy jednak, że bioortogonalność reakcji DAinv może nie być gwarantowana w tym zastosowaniu ze względu na cechy strukturalne ligniny (która składa się z bogatych w elektrony podstawionych monomerów typu cynamylowego, które mogą reagować z dienami ubogimi w elektrony, takimi jak sondy tetrazynowe stosowane w reakcjach DAinv) i że może to generować niespecyficzne znakowanie. Ponadto reakcjainv DA wymaga uchwytów chemicznych, które są syntetycznie trudno dostępne, a także są nieporęczne i lipofilowe, co zwiększa prawdopodobieństwo, że może to mieć wpływ na szybkość włączania, transportu i/lub lokalizacji reportera chemicznego in vivo. Ponieważ uznaliśmy, że ten ostatni aspekt jest szczególnie istotny w przypadku podejścia opartego na chemii kliknięć do badania lignizacji, wybraliśmy inny kierunek i opracowaliśmy strategię sekwencyjnego obrazowania bioortogonalnego ligacji (BLISS) przy użyciu kombinacji cykloaddycji azydowo-alkinowej promowanej szczepem (SPAAC) i katalizowanej miedzią cykloaddycji azydowo-alkinowej (CuAAC) in vivo.23

Te dwie reakcje są rzeczywiście dwoma głównymi bioortogonalnymi reakcjami kliknięcia, które były używane do tej pory, a dokładniej w kilku przykładach obrazowania ligniny, które zostały ostatnio opublikowane. 8,9 Nasza strategia podwójnego etykietowania umożliwia użycie ugrupowania azydkowego na jednym reporterze monolignolu i końcowego alkinu na drugim, dwóch uchwytach chemicznych, które są i) niereaktywne w stosunku do biologicznie istotnych struktur i ii) bardzo małe (Rysunek 2). W rezultacie, wpływ tych syntetycznych modyfikacji na właściwości fizykochemiczne badanej biomolekuły jest zminimalizowany, zmniejszając w ten sposób możliwe rozbieżności między nienaturalnymi i naturalnymi substratami monolignolu pod względem szybkości transportu i metabolizowania na etapie inkorporacji metabolicznej. Chociaż połączenie SPAAC i CuAAC na pierwszy rzut oka wydaje się bardzo intuicyjne, to według naszej wiedzy jest to dopiero drugi przykład podwójnego znakowania przy użyciu tej strategii i pierwsze zastosowanie na strukturach innych niż glikany. 12,23

figure-introduction-2
Rysunek 2: Strategia podwójnego etykietowania BLISS. Reportery chemiczne H, AZ i GALK są oznaczone jako analogi natywnych monolignoli H i G. Są one najpierw włączane do rosnących polimerów ligniny ścian komórkowych poprzez żywienie egzogenne (etap 1). Sondy fluorescencyjne funkcjonalizowane cyklooktyną i azydkiem są następnie sekwencyjnie ligowane do włączonych reporterów za pomocą bioortogonalnej chemii kliknięć: reakcja SPAAC (etap 2) jest wysoce specyficzna dla jednostek HAZ, a po niej następuje reakcja CuAAC (krok 3), która jest specyficzna dla jednostek GALK (krok 3), umożliwiając w ten sposób specyficzną lokalizację obu reporterów niezależnie w tej samej próbce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Najpierw zaprojektowaliśmy i zweryfikowaliśmy znakowany azydkiem reporter monolignolu HAZ (substytut alkoholu p-kumarylowego i prekursor jednostek ligniny H), a następnie opracowaliśmy strategię podwójnego znakowania BLISS, w której jest ona używana w połączeniu z wcześniej opisanym znacznikiem alkinowym GALK,9 (substytut alkoholu koniferylowego i prekursor jednostek ligniny G). W tym powtarzalnym protokole opracowanym i przetestowanym na lnie, gatunku rośliny o znaczeniu gospodarczym, podwójne włączenie metaboliczne HAZ i GALK do ligniny jest po raz pierwszy osiągane przed sekwencyjnym znakowaniem SPAAC/CuAAC. W tym przypadku oznakowane jednostki HAZ są najpierw specjalnie znakowane przez ligację SPAAC fluoroforu funkcjonalizowanego cyklooktyną, a następnie ligację za pośrednictwem CuAAC drugiej sondy fluorescencyjnej na oznaczonych jednostkach G ALK. Metoda ta została wykorzystana do zbadania dynamiki procesów zdrewnienia w ścianach komórkowych roślin i może być stosowana in vivo do przekrojów poprzecznych łodyg, żywych łodyg, a także siewek różnych gatunków roślin.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Płynne i stałe podłoża 1/2 MS muszą być przygotowane wcześniej, jak opisano w Tabeli Uzupełniającej 1.

1. Kultura roślin

  1. Uprawa 2-miesięcznych roślin lnu
    1. Wysiewaj nasiona lnu (Linum usitatissimum L.) w plastikowych doniczkach za pomocą kompostu doniczkowego.
    2. Uprawiać len w komorach wzrostowych w temperaturze 22 °C z fotoperiodem 16 godzin/8 godzin dzień/noc.
    3. Wyposaż rośliny w podparcie pionowe po 1 miesiącu i rosną do 2 miesiąca życia.
  2. Uprawa 2-tygodniowych sadzonek lnu
    1. Zawiń 12 nasion lnu w kawałek gazy serowej i przymocuj gumką, aby utworzyć wiązkę.
      UWAGA: Kolejne kroki należy wykonać w sterylnych warunkach pod wyciągiem z przepływem laminarnym.
    2. Umieść wiązkę nasion w uprzednio autoklawowalnej szklanej butelce o pojemności 250 ml.
    3. Dodaj 70 ml 70% EtOH do butelki i delikatnie mieszaj przez 1 minutę.
    4. Ostrożnie usunąć EtOH przez dekantację, pozostawiając wiązkę w butelce.
    5. Dodaj 100 ml 2% podchlorynu sodu i delikatnie mieszaj przez 10 minut.
    6. Usunąć roztwór podchlorynu sodu przez dekantację, pozostawiając wiązkę w butelce.
    7. Powtórz kroki 1.2.5-1.2.6.
    8. Dodaj 100 ml sterylnej ultraczystej wody i mieszaj przez 1 minutę.
    9. Powtórzyć krok 1.2.8 3 razy, zwiększając czas płukania dla każdego płukania (5, 10 i 15 min).
    10. Ciepłe stałe podłoże 1/2 MS, wlać do sterylnego pudełka z kulturami roślinnymi na wysokość 2 cm i pozostawić do ostygnięcia do zestalenia.
    11. Delikatnie umieść każde nasiono na stałym podłożu za pomocą sterylnych kleszczy.
    12. Zamknij sterylne pudełko.
    13. Przenieść pudełko do komory wzrostowej w temperaturze 22 °C z fotoperiodem 16 godzin/8 godzin dzień/noc i uprawiać sadzonki lnu przez 2 tygodnie.

2. Metaboliczna inkorporacja reporterów chemicznych

UWAGA: Poniżej przedstawiono trzy modele eksperymentalne: i) metaboliczne znakowanie przekrojów poprzecznych łodyg, ii) całe łodygi i iii) siewki roślin. Każdy protokół jest przedstawiany dla jednej kontrpróby biologicznej, a ilości mogą być dostosowane do liczby wymaganych kontrprób biologicznych. Roztwory monolignolu przygotowuje się z roztworów podstawowych, które są sporządzane zgodnie z opisem w tabeli 2 przed doświadczeniem. Roztwory podstawowe mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C. Proporcje HAZ:GALK lub H:G można dostosować tak, aby pasowały do wszystkich niestandardowych projektów eksperymentalnych.

  1. Chemiczne wbudowywanie reportera w 2-miesięczne przekroje łodyg lnu
    1. Przygotować 300 μl chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    2. Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do jednego dołka na 48-dołkowej płytce za pomocą mikropipety.
    3. Przygotować 300 μl roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    4. Zwirować roztwór H/G i przenieść go do drugiego dołka na tej samej 48-dołkowej płytce.
    5. Odetnij łodygę 2-miesięcznej rośliny lnu na wysokości 10 cm nad poziomem gleby za pomocą nowej żyletki.
    6. Delikatnie przygotuj 50 odręcznych przekrojów poprzecznych łodygi za pomocą żyletki (o grubości około 150-250 μm).
    7. Natychmiast umieść przekroje w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS w szkiełku zegarkowym.
    8. Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem HAZ/GALK.
    9. Powtórzyć krok 2.1.8 dla studzienki wypełnionej roztworem H/G (jako kontrola ujemna).
    10. Powtórzyć krok 2.1.8 dla trzeciej studzienki wypełnionej 300 μl pożywki 1/2 MS (jako kontrola tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów mikroskopii konfokalnej).
    11. Inkubować płytkę w ciągłym świetle w komorze wzrostowej w temperaturze 20 °C przez 20 godzin.
    12. Usunąć roztwór monolignolu z każdej studzienki za pomocą mikropipety.
    13. Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).
  2. Chemiczne włączenie reportera do 2-miesięcznych całych łodyg lnu
    1. Przygotować 5 ml chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    2. Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm za pomocą pipety.
    3. Przygotować 5 ml roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    4. Zmieszaj roztwór H/G i przenieś go do szklanej probówki o wysokości 20 cm.
    5. Przygotować trzecią szklaną probówkę zawierającą 5 ml pożywki 1/2 MS (jako kontrolę tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów z mikroskopii konfokalnej).
    6. Odetnij łodygę 2-miesięcznej rośliny lnu na wysokości 10 cm nad poziomem gleby za pomocą nowej żyletki. Wyrzuć system korzeniowy i dolną część łodygi i przejdź do następnego kroku z górną częścią łodygi rośliny.
    7. Zanurzyć podstawę całego odciętego trzpienia w probówce zawierającej roztwór HAZ/GALK. Umieść łodygę w roztworze inkubacyjnym natychmiast po usunięciu systemu korzeniowego, aby zapobiec jej wysuszeniu.
      UWAGA: Jeśli metoda jest stosowana do młodszych/starszych roślin i/lub innych gatunków, objętość roztworów monolignolu musi być dostosowana do wielkości/wieku rośliny i średnicy jej łodygi.
    8. Przymocuj trzpień do pionowego wspornika, aby utrzymać go prosto.
    9. Uszczelnij szklaną rurkę parafilmem, aby uniknąć parowania roztworu.
    10. Powtórzyć kroki 2.2.6-2.2.9 dla ujemnej próbki kontrolnej z roztworem H/G.
    11. Powtórzyć czynności 2.2.6-2.2.9 dla próbki kontrolnej tła fluorescencyjnego zawierającej pożywkę 1/2 MS.
    12. Inkubuj każdą łodygę przez 20 godzin w ciągłym świetle za pomocą światła neonowego.
    13. Po 20 godzinach od inkorporacji metabolicznej usunąć łodygę inkubowaną w roztworze HAZ/GALK i przepłukać ją 1/2 MS pożywki.
    14. Odetnij i wyrzuć dolny 1 cm łodygi za pomocą żyletki, a następnie przygotuj cylinder o wysokości 1 cm od podstawy pozostałej łodygi.
    15. Ostrożnie przygotuj 20 odręcznych przekrojów poprzecznych (o grubości około 150-250 μm) z tego cylindra i natychmiast umieść je w szkiełku zegarkowym wypełnionym 1/2 MS medium.
    16. Umieścić 500 μl pożywki 1/2 MS w jednym dołku na 48-dołkowej płytce.
    17. Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem 1/2 MS.
    18. Powtórzyć kroki 2.2.13-2.2.17 dla łodygi kontroli ujemnej inkubowanej z roztworem H/G.
    19. Powtórzyć kroki 2.2.13-2.2.17 dla kontrolnej łodygi kontrolnej tła fluorescencji inkubowanej z pożywką 1/2 MS.
    20. Ostrożnie usuń roztwór z każdej studzienki za pomocą mikropipety.
    21. Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).
  3. Chemiczny reporter do 2-tygodniowych sadzonek lnu
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w sterylnych warunkach.
    1. Przygotować 2 ml chemicznego roztworu reporterowego zawierającego 10 μM GALK i 10 μM HAZ w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    2. Zmieszać roztwór HAZ/GALK i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm za pomocą pipety.
    3. Przygotować 2 ml roztworu kontroli ujemnej zawierającego 10 μM G i 10 μM H w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS.
    4. Zmieszać roztwór H/G i przenieść go do szklanej probówki o wysokości 20 cm.
    5. Przygotować trzecią szklaną probówkę o wysokości 20 cm zawierającą 2 ml pożywki 1/2 MS (jako kontrolę tła w celu dostosowania linii podstawowej fluorescencji podczas późniejszego przetwarzania danych obrazów mikroskopii konfokalnej).
    6. Delikatnie usuń 2-tygodniową sadzonkę lnu z twardego podłoża o stężeniu 1/2 MS za pomocą długiej pęsety (sekcja 1.2. powyżej).
    7. Delikatnie przenieś sadzonkę do probówki zawierającej roztwór HAZ/GALK, upewniając się, że jej korzenie są zanurzone w roztworze.
    8. Zamknij szklaną rurkę plastikową nakrętką, aby uniknąć parowania.
    9. Powtórzyć kroki 2.3.6-2.3.8 dla probówki kontroli ujemnej z roztworem H/G.
    10. Powtórzyć kroki 2.3.6-2.3.8 dla probówki kontrolnej tła fluorescencyjnego zawierającej pożywkę 1/2 MS.
    11. Każdą sadzonkę inkubować w ciągłym świetle w komorze wzrostowej przez 20 godzin w temperaturze 20 °C.
    12. Sadzonkę inkubowaną w roztworze HAZ/GALK delikatnie wyjąć i przepłukać 1/2 MS pożywki.
    13. Delikatnie przygotuj 20 odręcznych przekrojów (o grubości około 150-250 μm) hipokotylu.
    14. Umieścić 500 μl pożywki 1/2 MS w jednym dołku na 48-dołkowej płytce.
    15. Sprawdź wzrokowo i wybierz nienaruszone całe przekroje i losowo rozprowadź 10 z nich w studzience wypełnionej roztworem 1/2 MS.
    16. Powtórzyć kroki 2.3.12-2.3.15 dla sadzonki kontroli ujemnej inkubowanej z roztworem H/G.
    17. Powtórzyć kroki 2.3.12-2.3.15 dla kontrolnej sadzonki fluorescencji tła inkubowanej z pożywką 1/2 MS.
    18. Ostrożnie usuń roztwór z każdej studzienki za pomocą mikropipety.
    19. Dodać 500 μl pożywki o stężeniu 1/2 MS do każdej studzienki, delikatnie mieszać przez 10 minut i usunąć roztwór płuczący za pomocą mikropipety. Powtórz 4 razy i natychmiast przejdź do etykietowania BLISS (sekcja 3).

3. Podwójne znakowanie fluorescencyjne próbek o przekroju poprzecznym roślin przez SPAAC i CuAAC

UWAGA: Protokół etykietowania BLISS jest identyczny dla wszystkich 3 modeli eksperymentalnych (sekcja 2).

  1. Znakowanie cykloaddycji azydowo-alkinowej promowanej szczepem (SPAAC)
    1. Przygotować 1 ml roztworu SPAAC zawierającego 5 μM DBCO-PEG4-5/6-karboksyrodaminy 110 w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS. Zwiruj roztwór i trzymaj go w ciemności.
    2. Po końcowych etapach przemywania w protokole inkorporacji metabolicznej [2.1.13, 2.2.21 lub 2.3.19 w zależności od wybranego schematu doświadczalnego], usunąć pożywkę 1/2 MS i dodać 300 μl roztworu SPAAC do dołka za pomocą mikropipety.
    3. Osłoń 48-dołkową płytkę przed światłem, przykrywając ją folią aluminiową lub umieszczając w pudełku.
    4. Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.
  2. Znakowanie cykloaddycji azydowo-alkinowej katalizowanej miedzią (CuAAC)
    1. Umyj każdą studzienkę 4 razy, jak opisano w kroku 2.1.13, trzymając płytkę w ciemności.
    2. Przygotować 1 ml roztworu CuAAC zawierającego 2,5 mM askorbinianu sodu, 0,5 mMCuSO4 i 5 μM 3-azydku 5-TAMRA-PEG w płynnym sterylnym podłożu 1/2 MS. Zmieszaj roztwór i trzymaj go w ciemności.
      UWAGA: Ten roztwór CuAAC musi być świeżo przygotowany przed użyciem i nie może być przechowywany dłużej niż kilka dni w temperaturze 4 °C.
    3. Usunąć 1/2 MS pożywki z każdej studzienki i bezpośrednio dodać 300 μl roztworu CuAAC do studzienki za pomocą mikropipety.
    4. Delikatnie mieszaj płytkę na wytrząsarce mechanicznej przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze otoczenia.
    5. Usunąć roztwór CuAAC za pomocą mikropipety.
    6. Za pomocą mikropipety dodaj 500 μl 1/2 MS, mieszaj w ciemności przez 10 minut, a następnie usuń roztwór myjący. Powtórz dwa razy.
    7. Dodać 500 μl roztworu MeOH/woda o proporcji 7:3, mieszać w ciemności przez 1 godzinę, a następnie usunąć roztwór
      UWAGA: Metanol jest toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu i jest oznaczony jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Jego utylizacja wymaga zainstalowania dygestoriów i rękawic chemicznych.
    8. Dodaj 500 μl 1/2 MS, mieszaj w ciemności przez 10 minut, a następnie usuń roztwór. Powtórz 4 razy.

4. Montaż próbek na szkiełkach mikroskopowych

  1. Umieść 5 kropli podłoża montażowego na szklanym szkiełku mikroskopowym.
  2. Ostrożnie umieść każdy przekrój oznaczony HAZ/GALK na szkiełku.
  3. Nałóż lakier do paznokci po dwóch przeciwnych stronach szkiełka.
  4. Przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
  5. Usuń nadmiar podłoża montażowego za pomocą ręcznika papierowego.
  6. Uszczelnij próbkę lakierem do paznokci ze wszystkich 4 stron. Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (około 30 min).
  7. Powtórzyć kroki 4.1-4.6 dla przekrojów H/G kontroli ujemnej.
  8. Powtórz kroki 4.1-4.6 dla przekrojów kontrolnych tła fluorescencyjnego.
  9. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu obserwacji pod mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA: Przygotowane preparaty można przechowywać od kilku tygodni do kilku miesięcy w zależności od jakości preparatu. Jeżeli po przechowywaniu ma być dokonana nowa obserwacja, należy upewnić się, że próbki nie wyschły.

5. Akwizycja obrazu za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

  1. Włącz wszystkie niezbędne jednostki systemu mikroskopii konfokalnej we właściwej kolejności, zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wybierz żądany obiektyw z maksymalną aperturą numeryczną i dostosowanymi długościami fal wzbudzenia i emisji (np. obj. 60x, N.A. 1.2. Kanał autofluorescencyjny: λex 405 nm, λem 450 nm /25; Kanał SPAAC HAZ: Λex 488 nm, λem 525 nm /25; Kanał CuAAC GALK: Λex 561 nm, λem 595 nm /25 ; tryb sekwencyjny).
  3. Wybierz żądane parametry generowania obrazów w oprogramowaniu (wymagane 12- lub 16-bitowe, rozmiar piksela dostosowany do kryterium Nyquista).
  4. Umieścić szkiełko HAZ/GALK na stoliku mikroskopu i umieścić próbkę pod soczewką obiektywu.
  5. Obserwuj i znajdź żądany obszar tkanki roślinnej.
  6. Uzyskaj wysokiej jakości obrazy konfokalne podwójnie znakowanej próbki HAZ/GALK.
    1. Wybierz najbardziej fluorescencyjną płaszczyznę na osi Z.
    2. Dostosuj wzmocnienie, przesunięcie i moc lasera, aby uzyskać optymalny rozkład sygnału w całym zakresie poziomów szarości dla każdego kanału (autofluorescencja, HAZ i GALK). Te same parametry muszą być stosowane w odniesieniu do wszystkich kolejnych przejęć.
    3. Uruchom pobieranie wybranego obrazu i zapisz plik. Powtórzyć te czynności dla każdego odpowiedniego obszaru próbki.
      UWAGA: W razie potrzeby można również nabyć rekonstrukcje 3D Z-stack
      4. .
  7. Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj obrazy nieoznakowanej próbki inkubowanej tylko w 1/2 MS w celu określenia poziomu autofluorescencji (kontrola tła fluorescencji, jak opisano w sekcji 2).
  8. Korzystając z tych samych ustawień, uzyskaj obrazy dla próbek kontroli ujemnej inkubowanych z natywnymi monolignolami H/G w celu określenia niespecyficznej adhezji fluoroforu do próbki.
  9. Zastosuj obróbkę danych do uzyskanych obrazów, aby odjąć sygnały autofluorescencji tła zarówno na obrazach kontroli ujemnej H/G, jak i obrazach HAZ/GALK.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionego protokołu BLISS, obejmującego syntetyczne analogi monolignolu i bioortogonalną chemię kliknięć, możliwe jest zobrazowanie dynamiki procesu lignifikacji w żywych roślinach. W przeciwieństwie do uznanych technik wizualizacji ligniny (takich jak barwienie histochemiczne, immunolokalizacja lub autofluorescencja), ten protokół "podwójnego kliknięcia" koncentruje się wyłącznie na ligninie wytwarzanej de novo podczas etapu inkorporacji metabolicznej i odróżnia ją od wcześniej istniejącej ligniny w próbce za pomocą trójkanałowego obrazowania komórkowego za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 3). Jednostki HAZ są wykrywane za pomocą długości fal wzbudzenia i emisji DBCO-PEG4-5/6-karboksyrodaminy 110, która jest specjalnie klikana na funkcje azydkowe włączonych cząsteczek HAZ podczas kroku SPAAC (λex 501 nm / λem 526 nm, kanał zielony), podczas gdy GALK-jednostki są podobnie wykrywane na charakterystycznych długościach fal sondy azidefluor 545, która jest specjalnie klikana na wbudowane końcowe znaczniki alkinowe GALK podczas kroku CuAAC (λex 546 nm /λem 565 nm, kanał czerwony); Trzeci kanał odpowiada istniejącej wcześniej ligninie, która jest wykrywana za pomocą jej wewnętrznej autofluorescencji przy 405 nm (kanał niebieski). Podejście to prowadzi do wygenerowania trójkolorowych map lokalizacji ligniny w ścianach komórkowych roślin, które dostarczają precyzyjnych informacji przestrzennych na temat obecności lub braku aktywnej maszynerii lignifikacji między różnymi tkankami narządu (Rysunek 3A), między różnymi typami komórek w tej samej tkance (Rysunek 3B-C) i w różnych warstwach ścian tej samej komórki (Rysunek 3D). Innymi słowy, metodologia ta pozwala nam wyróżnić i specyficznie zlokalizować "aktywne" miejsca lignifikacji (kanały HAZ i GALK) poprzez odróżnienie ich od stref, w których lignina powstała na wcześniejszym etapie rozwoju rośliny (kanał autofluorescencyjny). Ponadto czułość tej techniki jest znacznie zwiększona w porównaniu z autofluorescencją i można wykryć znacznie mniejsze ilości świeżo zsyntetyzowanej ligniny (Rysunek 3B).

figure-results-1
Rycina 3: Obrazowanie wbudowanych reporterów chemicznych monolignolu w łodygach lnu. (A) Połowa ręcznie wykonanego przekroju poprzecznego łodygi lnu, zrekonstruowany obraz. (B) Zbliżenie na pierwsze warstwy różnicującego się ksylemu. Lewy panel: autofluorescencja ligniny (niebieski, 405 nm), panel środkowy: połączone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji HAZ (zielony, 526 nm), prawy panel: połączone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji GALK (czerwony, 565 nm). Strzałka wskazuje pierwszą znakowaną ścianę komórkową z kambium, ilustrując zwiększoną czułość BLISS w porównaniu z autofluorescencją. (C) Znakowanie w różnych typach komórek ksylemu wtórnego i (D) zbliżenie na wtórne komórki ksylemu ilustrujące różnice w znakowaniu w różnych warstwach tej samej ściany komórkowej. Lewy panel: połączone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji HAZ (zielony, 526 nm), panel środkowy: połączone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski) i fluorescencji GALK (czerwony, 565 nm), prawy panel: połączone kanały autofluorescencji ligniny (niebieski), HAZ (zielony) i GALK (czerwony) fluorescencyjny. Wspólna lokalizacja H,AZ i GALK jest przedstawiona w kolorze żółtym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Chemiczne strategie reporterskie, takie jak metoda BLISS przedstawiona tutaj lub procedury pojedynczego znakowania opublikowane wcześniej przez Tobimatsu et al.8 może zatem pozwolić na znacznie dokładniejsze badanie niż wcześniej dostępne metody, takie jak barwienie immunochemiczne lub histochemiczne, a jednocześnie jest bardzo proste do wdrożenia. Na przykład, Rysunek 4 ilustruje, że intensywność sygnału dla inkorporacji HAZ/GALK w tracheidach/naczyniach włóknistych (FT) wtórnego ksylemu lnu jest bardzo wysoka w pierwszych kilku ścianach komórkowych kambium, ale stopniowo maleje w starszych komórkach. Profil ten jest przeciwny do profilu autofluorescencji i wskazuje, że maksymalne zdrewnienie jest bardzo szybko osiągane w pierwszych dwóch do trzech warstwach komórek FT od kambium. W przeciwieństwie do tego, komórki promieniste (R) wydają się kontynuować lignifikację do znacznie późniejszych etapów swojego rozwoju, ponieważ inkorporacja HAZ / GALK jest znacznie bardziej stała w ścianach wszystkich komórek od kambium do rdzenia. Nie jest zaskakujące, że typy komórek FT i R wykazują kontrastową dynamikę lignifikacji, ponieważ te typy komórek mają różne role biologiczne z powiązanymi różnicami w ich programie rozwojowym. FT są rzeczywiście wydłużonymi rurkami, które szybko dojrzewają i umierają, pozostawiając martwe puste komórki o grubych zdrewniałych ściankach, które odgrywają istotną rolę zarówno w mechanicznym podparciu, jak i pionowym transporcie wody i minerałów, podczas gdy wąskie rzędy komórek R, które tworzą promienie ksylemu, są żywe w swoim dojrzałym i funkcjonalnym stanie bez grubych zdrewniałych ścian.

figure-results-2
Rycina 4: Specyficzna dla komórki inkorporacja reporterowa monolignolu w ksylemie lnu. Widok z mikroskopii konfokalnej w jasnym polu (A) części odręcznego przekroju poprzecznego łodygi lnu. Różowe (komórki miąższu promieniowego, R) i żółte (komórki tchawicy włókien, FT) wskazują wektory rozciągające się od strefy kambialnej w kierunku rdzenia i skanowane pod kątem autofluorescencji ligniny przy 405 nm (B), fluorescencji HAZ przy 526 nm (C) i fluorescencji GALK przy 565 nm (D). (E) Widok wtórnego ksylemu. Lewy panel: połączone kanały fluorescencji ligniny (niebieski), HAZ (zielony) i GALK (czerwony). Wspólna lokalizacja H,AZ i GALK jest przedstawiona w kolorze żółtym. Prawy panel: schematyczna ilustracja wtórnej struktury ksylemu w łodydze lnu. V, naczynie; FT, tchawica włóknista; R, komórka miąższu promieniowego. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Lion et al.23 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponadto, użycie dwóch odrębnych reporterów chemicznych odpowiadających jednostkom H i G z dwiema reakcjami bioortogonalnymi w protokole BLISS pozwala na uzyskanie bardziej ilościowych wyników. Strategie znakowania multipleksowego, takie jak BLISS, mogą dostarczyć dodatkowych informacji na temat kontroli proporcji inkorporacji monolignolu w różnych warunkach i mogą przyczynić się do rozszyfrowania nieuchwytnego procesu lignifikacji. Jeśli względna zawartość procentowa monolignoli H, G i S w ligninach jest rzeczywiście bardzo zmienna w zależności od gatunku, tkanki, wieku lub warunków środowiskowych rośliny, skomplikowane mechanizmy regulujące ten skład nadal nie są w pełni zrozumiałe. Technologia podwójnego znakowania stanowi potężny sposób badania niektórych parametrów regulujących skład ligniny. Na przykład zmiana stosunku HAZ:GALK za pomocą BLISS pozwoliła nam wykazać, że skład ligniny w wtórnych tkankach ksylemu jest bezpośrednio zależny od dostępności monolignolu w ścianach komórkowych, a nie od swoistości peroksydazy/lakkazy (Rysunek 5).

figure-results-3
Rysunek 5: Wpływ inkubacji odcinków łodygi lnu o różnych proporcjach procentowych HAZ i GALK. Współczynniki HAZ:GALK% są podane powyżej każdej kolumny liczb. Góra: połączone kanały HAZ i GALK. U dołu: histogramy wskazujące średnią intensywność fluorescencji HAZ i GALK dla różnych % stosunków. Wartości są wyrażone jako średnia intensywności fluorescencji na poziomach szarości ± SD. Podziałka = 100 μm. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Liona i wsp.23 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Len jest uprawiany ze względu na włókna łykowe (BF), które są używane do produkcji tekstyliów, luksusowych papierów lub przyjaznych dla środowiska materiałów kompozytowych. Ważnym aspektem ich waloryzacji przemysłowej jest to, że zawierają bardzo niski poziom ligniny w ścianach komórkowych, które charakteryzują się niezwykle grubą warstwą wtórną S2/G19,24. BLISS może uwidocznić różnice w dynamice zdrewnienia między różnymi warstwami tej samej ściany komórkowej. Rysunek 6A pokazuje, że inkorporacja reporterowa HAZ i GALK jest ograniczona do rogów komórek i środkowej blaszki/pierwotnej ściany komórkowej niektórych, ale nie wszystkich włókien łykowych. Całkowity brak zdrewnienia w grubej warstwie wtórnej ściany komórkowej włókna łykowego, nawet gdy reportery chemiczne monolignolu są dostarczane egzogennie, ujawnia, że ich stan hipolignifikacji wynika z braku środowiska molekularnego odpowiedniego do utleniania za pośrednictwem enzymatyki i włączania monolignoli do rosnącego łańcucha polimerowego, i że nie jest to spowodowane tylko regulacją transkrypcji genów biosyntezy monolignolu, jak wcześniej informowano25. Obserwacja ta dobrze koreluje również z faktem, że geny peroksydazy lnu są regulowane w górę w zewnętrznych tkankach macierzystych mutanta lnu lbf1, który posiada zdrewniałe włókna łykowe26.

figure-results-4
Rysunek 6: BLISS uwypukla różnice w podstrukturze ściany komórkowej lub warstwie. (A) Lewy panel: obraz w jasnym polu przedstawiający przekrój łodygi lnu. Okrąg oznacza wiązkę włókien. Prawy panel: zbliżenie na włókna łykowe. Połączone kanały H,AZ i GALK (z jasnym polem i bez) pokazujące, że zdrewnienie jest ograniczone do rogów komórek (figure-results-5) i środkowej blaszki/pierwotnej ściany komórkowej niektórych włókien łykowych. BF, błonnik łykowy; Par, komórka miąższowa; M, blaszka środkowa; P, pierwotna ściana komórkowa; S1, pierwsza warstwa wtórnej ściany komórkowej; S2/G, warstwa wtórna/galaretowata warstwa wtórnej ściany komórkowej. (B) Wycinek 2D i rekonstrukcja 3D konfokalnego zbliżenia stosu Z obszaru endodermy korzenia lnu. Pas Caspara (figure-results-6) wyświetla tylko autofluorescencję i nie zawiera H,AZ ani GALK. Powiązany fluorogram wykazuje antykorelację GALK/HAZ: wysoka zielona fluorescencja jest związana z niskim sygnałem czerwonym (kora) i odwrotnie (endoderma). Perycykl (P), endoderma (E), kora mózgowa (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wreszcie, ta dwukolorowa metodologia może również dostarczyć cennych informacji na temat "stanu zdrewnienia" podstruktur ściany komórkowej na różnych etapach rozwoju oraz w organach roślinnych innych niż łodyga. Na przykład endoderma korzeni lnu charakteryzuje się istnieniem pasma Caspara w promieniowych i poprzecznych ścianach komórkowych we wczesnych stadiach rozwoju. Ten pas hydrofobowego biopolimeru, wykonany z suberyny i/lub ligniny, zapobiega biernemu przedostawaniu się wody i substancji rozpuszczonych przez korzeń przez apoplast i zmusza je do przejścia przez błonę plazmatyczną drogą symplastyczną, przyczyniając się w ten sposób do selektywnego wchłaniania przez korzenie roślin. Po zastosowaniu do korzeni lnu nasza strategia wykazała, że HAZ i GALK są włączone w styczne ściany komórek endodermalnych, a także w części ścian promieniowych, w których nie ma pasma Caspara (Rysunek 6B). Jednak całkowity brak włączenia reportera monolignolu w samym paśmie Caspara wskazuje, że jest on dojrzały na tym etapie rozwoju, podczas gdy inne ściany są nadal miejscem dalszego osadzania się biopolimeru. Zrekonstruowany widok 3D stosu z wyraźnie wydobywa na światło dzienne pasmo Caspara. Co ciekawe, ściany niektórych komórek korowych przylegających do endodermy również okazały się zdolne do preferencyjnego włączania HAZ (wskazując tym samym na obecność ligniny/suberyny w korze korzenia lnu), ale nie GALK. Analiza kolokalizacji wykazała antykorelację między HAZ i GALK, co sugeruje istnienie specyficznej dla komórki struktury ścian / maszynerii enzymatycznej w tych dwóch sąsiednich typach komórek.

Tabela uzupełniająca 1: Przygotowanie stałego 1/2 MS Medium Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Przygotowanie roztworów podstawowych do raportowania chemicznego Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wcześniej wspomniano, protokół podwójnego znakowania BLISS przedstawiony w tym artykule jest jednym z pierwszych przykładów kombinacji SPAAC/CuAAC in vivo 12,23. Każdy krok został dokładnie zoptymalizowany i zwalidowany, a bardzo ważne jest, aby przestrzegana była kolejność, w jakiej sekwencyjnie wykonywane są dwie reakcje znakowania chemicznego (tj. najpierw SPAAC, a następnie CuAAC). Wszystkie kontrole krzyżowe wykazały, że każdy etap etykietowania jest specyficzny, gdy stosowany jest protokół BLISS23 : przeprowadzenie etapu SPAAC najpierw prowadzi do wysoce chemoselektywnego znakowania funkcji azydku HAZ przez fluorofor funkcjonalizowany cyklooktyną poprzez [3+2] reakcję cykloaddycji z szybką kinetyką. Po oznaczeniu jednostek HAZ można przeprowadzić etap CuAAC wymagający katalizowanej miedzią (I) aktywacji końcowych alkinów GALK w celu wytworzenia wiązań triazolowych w reakcji z sondą azydkowo-fluorową 545. W przeciwieństwie do tego, odwrotna kolejność (tj. najpierw CuAAC, a następnie SPAAC) nie powinna być stosowana, ponieważ prowadzi to do sprzężenia krzyżowego jednostek GALK i HAZ, które konkuruje z ligacją fluoroforową i indukuje dramatyczną utratę sygnału. Ważne jest również, aby podkreślić konieczność stosowania pośrednich etapów prania, aby uniknąć niespecyficznych zabrudzeń.

Wykazaliśmy, że nasza metoda może być stosowana do różnych projektów eksperymentów biologicznych. Protokół znakowania BLISS został po raz pierwszy zastosowany do odręcznych przekrojów łodyg lnu (o grubości około 150-250 μm), które zostały wcześniej pocięte i inkubowane z monolignolami gotowymi do kliknięcia. Chociaż ten projekt ma tę zaletę, że minimalizuje potrzebne ilości reportera chemicznego (w miarę zmniejszania objętości inkubacji) i ułatwia produkcję kontrprób statystycznych, nie jest, ściśle mówiąc, systemem in vivo , a w niektórych przypadkach może nie odzwierciedlać wszystkich aspektów rzeczywistej dynamiki lignifikacji czasoprzestrzennej. W drugim projekcie eksperymentalnym dostosowaliśmy protokół BLISS do metody, która była wcześniej stosowana do badania wprowadzania znakowanych radioaktywnie monolignoli do sosny i miłorzębu27. W tym podejściu korzenie i łodyga rośliny są fizycznie oddzielone, a podstawa całej łodygi jest inkubowana w roztworze monolignolu w sposób, który można nazwać podejściem "wazon na kwiaty". Po pozostawieniu łodyg w pożądanym czasie (inkubacji) wycina się przekroje i wykonuje protokół BLISS. Pozwoliło nam to wykazać (i), że zmodyfikowane monolignole są transportowane przez żywą łodygę i są włączane do rosnących polimerów ligniny w ścianach komórkowych oraz (ii) że wzór lokalizacji był zasadniczo identyczny z podejściem opartym na przekroju poprzecznym. Ten rodzaj eksperymentu ma tę zaletę, że jest przeprowadzany w podejściu real living plant / live cell, co pozwala na dłuższe eksperymenty i bardziej dogłębne badania, ale wymaga większych ilości reportera chemicznego. Wreszcie, protokół BLISS został również wykorzystany w przypadku sadzonek roślin lnu, reprezentujących prawdziwy model żywej rośliny, w którym reportery chemiczne muszą zostać wchłonięte przez korzenie, zanim zostaną przetransportowane w górę łodygi. Chociaż model ten ma wyraźną zaletę polegającą na tym, że można go stosować na żywych roślinach, w praktyce ogranicza się on do młodych siewek i nie nadaje się do badania dynamiki zdrewnienia w starszych roślinach ze względów praktycznych (długi czas inkubacji, zwiększona ilość reporterów chemicznych). Niemniej jednak te trzy projekty eksperymentów są komplementarne i wszystkie mają swoje plusy i minusy w odniesieniu do aspektów praktycznych i znaczenia biologicznego, w zależności od rodzaju pytania biologicznego, na które należy odpowiedzieć.

Nasz protokół, opracowany w celu badania dynamiki zdrewnienia lnu, jest wysoce elastyczny, nie tylko pod względem projektu eksperymentu biologicznego, ale także pod względem jego zastosowania do innych gatunków roślin i organów/tkanek. Na przykład, BLISS można łatwo przenieść do rodzajów Arabidopsis lub Populus, które są bardziej podatne na badania z mutantami knock-out lub knock-down dla różnych genów. Zasadniczo, badania podwójnego znakowania z naszym podejściem można również rozszerzyć na inne biomolekuły przy użyciu dwóch odrębnych zmodyfikowanych prekursorów polimerów roślinnej ściany komórkowej - w tym wszystkich trzech głównych monolignoli lub ich prekursorów metabolicznych, a także różnych monosacharydów, które tworzą matrycę polisacharydową. Od samego początku chemia bioortogonalna została opracowana głównie w celu badania glikanów/polisacharydów za pomocą metabolicznej inżynierii oligosacharydowej (MOE)4,5,17,28, ale zaskakująco do tej pory było bardzo niewiele zastosowań w biologii roślin 7,8,9,10,11,12 . Jeśli chodzi o kompatybilność reakcji, badanie ligniny było rzeczywiście złożonym przypadkiem do rozwiązania, ponieważ oba reportery chemiczne są włączone do tego samego siatkowanego polimeru. Możliwość tworzenia się nieznakowanych usieciowań HAZ-G ALK była głównym problemem do pokonania ze względu na przestrzenną bliskość jednostek GALK i HAZ w strukturze 3D ligniny23, ograniczenie, które może nie występować, jeśli dwa reportery chemiczne nie są włączone do tego samego typu biopolimeru lub w tym samym regionie przestrzennym dowolnej komórki.

W szerszym zakresie metodologia BLISS może być zasadniczo zastosowana do dowolnego badania obrazowania fluorescencyjnego w dwóch kolorach na modelach bakteryjnych lub zwierzęcych przy użyciu dwóch odrębnych reporterów chemicznych opatrzonych odpowiednio znacznikiem azydkowym i końcowym alkinem.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Federacji Badawczej FRABio i platformie obrazowania TisBio (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblages Biomoléculaires) za zapewnienie środowiska technicznego sprzyjającego realizacji tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(E)-4-(3-(2-(2-(2-(2-azydoetoksy)etoksy)etoksy)prop-1-en-1-ylo)fenol (HAZ)Syntetyzowany jak w Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroksy-3-propargyloksycynamylowy alkohol (GALK)Zsyntetyzowane jak w Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% podchloryn
20 cm wysoka szklana rurka
250 ml Schott szklana butelka
48-dołkowa
/6-TAMRA-PEG3-AzideJena BioscienceCLK-AZ109-1
Folia
Gaza
Kompost zawierający glinę
Alkohol igolinowy (G)Sigma AldrichMFCD00002922
Siarczan miedzi (II) pentahydrat
DBCO-PEG4-5/6-Karboksyrodamina 110Jena BioscienceCLK-A127-1
Milli-Q Ultraczysta woda
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Nasiona lnu (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G&handel; Średni mikroskop elektronowy do montażu szkiełeknaukowych17984-25
Szkiełko
Szkiełko mikroskopowe szklane Komora
wzrostowaCLF-Plant KlimatyzacjaDla 2-tygodniowych upraw roślin
Komora wzrostowaAngelantoni Nauki przyrodniczeDla 2-miesięcznych upraw roślin
Purpurowa roślina pudełkohodowlane Dla 2-tygodniowej kultury sadzonek
MetanolToxic (SGH02, SGH06, SGH08), pracuj w rękawiczkach pod kapturem
Mikropipeta
Lakier
Mikroskop konfokalny Nikon A1RWytrząsarka
orbitalna
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H)CarbosynthFC145653
Plastikowa nasadka
Plastikowa pipeta
Plastikowy garnekDo uprawy roślin w wieku 2 miesięcy
Żyletka
Gumowa opaska
Askorbinian
Sterylny zacisk
Pionowe wsparcie
Vortex
Odczynniki do cieczy i ciał stałych ½ MS średni
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4,7H2O
CaCl 2.2H2O
MnSO4. H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO< sub>4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Tiamina.HCl
Pirydoksyna.HCl
Glicyna
Kwas
Myo-inozytol
Sacharoza
MES hydrat
Agar
sodu 5aluminiowaserowanakrywkowedo paznokcisodunikotynowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grammel, M., Hang, H. C. Chemical reporters for biological discovery. Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).
  2. Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. Chemistry in living systems. Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).
  4. Chang, P. V., et al. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).
  5. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  6. Mbua, N. E., et al. Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).
  7. Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).
  8. Tobimatsu, Y., et al. A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification. Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).
  9. Bukowski, N., et al. Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls. Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).
  10. Pandey, J. L., et al. A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls. PLOS ONE. 10 (4), e0121334(2015).
  11. Pandey, J. L., et al. Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems. Front Plant Sci. 7, (2016).
  12. Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).
  13. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).
  14. Weng, J. -K., Chapple, C. The origin and evolution of lignin biosynthesis. New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).
  15. Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification. Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).
  16. Rinaldi, R., et al. Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis. Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).
  17. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines. Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).
  18. Feng, L., et al. Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans. J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).
  19. Dumont, M., et al. Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid. Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).
  20. Niederwieser, A., et al. Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry. Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).
  21. Späte, A. -K., et al. Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering. Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).
  22. Späte, A. -K., et al. Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter. Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).
  23. Lion, C., et al. BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants. Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).
  24. del Río, J. C., et al. Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives. J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).
  25. Huis, R., et al. Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems. Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).
  26. Chantreau, M., et al. Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition. The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).
  27. Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora. Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).
  28. Noel, M., et al. Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human β-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins. Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wizualizacja ligninyreakcje bioortogonalnemikroskopia konfokalnaciany kom rkowe ro lininkorporacja metabolicznasondy fluorescencyjneSPAAC CuAAC

Powiązane artykuły