Artykuł metodologiczny

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56948

⸱

4 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis Mainz, University Medical Center Mainz, 2Center for Cardiology, University Medical Center Mainz, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Streszczenie

Mikroskopia wideo przyżyciowego (IVM) naczyń krwionośnych jest uznaną metodą oceny aktywacji komórek odpornościowych oraz ich zdolności do odgrywania roli i przylegania do warstwy śródbłonka. Powszechnie stosuje się wizualizację krążących komórek poprzez wstrzyknięcie barwników fluorescencyjnych lub przeciwciał sprzężonych z fluoroforem. Alternatywnie można użyć fluorescencyjnych myszy reporterowych. Interakcje leukocytów, w szczególności monocytów lizozymu M+ (LysM+), ze ścianą naczynia odgrywają kluczową rolę w promowaniu dysfunkcji naczyń krwionośnych i nadciśnienia tętniczego. Przedstawiamy tutaj technikę wizualizacji i ilościowego oznaczania zwijania i adhezji leukocytów w tętnicach szyjnych w nadciśnieniu indukowanym angiotensyną II (AngII) u myszy za pomocą IVM.

Implantacja cewnika uszkadza ścianę naczyniową i prowadzi do zmienionych odpowiedzi krwinek. Porównaliśmy różne techniki wstrzykiwania i drogi podawania, aby uwidocznić leukocyty u myszy LysMCre + IRG + z powszechną ekspresją białka czerwonej fluorescencji i warunkową ekspresją białka zielonej fluorescencji w komórkach LysM +. Do badania aktywacji komórek LysM + użyliśmy myszy z infuzją AngII, u których zwijanie i adhezja leukocytów do śródbłonka jest zwiększona. Wstrzyknęliśmy pomarańczę akrydynową za pomocą cewnika szyjnego lub bezpośrednio przez żyłę ogonową i porównaliśmy ilość toczących się i przylegających komórek. Odkryliśmy, że implantacja cewnika szyjnego sama w sobie zwiększyła liczbę toczących się i przylegających komórek LysM + u myszy LysMCre + z pozorowaną infuzją w porównaniu z grupą kontrolną. Aktywacja ta została zwiększona u myszy z infuzją AngII. Co ciekawe, wstrzyknięcie pomarańczy akrydynowej bezpośrednio przez żyłę ogonową nie zwiększyło adhezji komórek LysM + ani nie wałęło się u myszy z pozorowaną infuzją. W ten sposób wykazaliśmy, jak ważne jest, aby transgeniczne myszy reporterowe wykazywały ekspresję białek fluorescencyjnych, aby nie zakłócać procesów in vivo podczas eksperymentów. Co więcej, wstrzyknięcie fluorescencyjnych znaczników do żyły ogonowej może być możliwą alternatywą dla iniekcji cewnika szyjnego.

Wprowadzenie

Nadciśnienie tętnicze zwiększa ryzyko chorób sercowo-naczyniowych i śmierci oraz sprzyja rozwojowi miażdżycy, choroby niedokrwiennej serca oraz tętniczej lub żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej1. Rozwój nadciśnienia tętniczego zależy od interakcji czynników środowiskowych, genetycznych, endokrynologicznych i hemodynamicznych. Obecnie uważa się, że odporność i związane z nią stany zapalne odgrywają ważną rolę w etiologii nadciśnienia tętniczego2.

Wśród komórek odpornościowych, limfocyty T, jak również monocyty i makrofagi okazały się przyczynowo zaangażowane w wywołane przez AngII zapalenie naczyń krwionośnych i nadciśnienie, częściowo związane z ich zdolnością do wyzwalania reaktywnych form tlenu3. Myszy z niedoborem czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów wykazywały zmniejszoną odpowiedź na AngII w odniesieniu do wzrostu ciśnienia krwi i zapalenia naczyń krwionośnych4. W poprzedniej pracy mogliśmy wykazać, że monocyty LysM+ napędzają dysfunkcję naczyń krwionośnych i stan zapalny w nadciśnieniu indukowanym przez AngII5. Niedawno opisaliśmy nowy szlak, w którym czynnik krzepnięcia XI współpracuje z płytkami krwi i ścianą naczynia w celu wywołania zapalenia naczyń zależnych od trombiny6. Obecna wiedza na temat roli układu odpornościowego w nadciśnieniu tętniczym została niedawno podsumowana i zrecenzowana przez Rodriguez-Iturbe i wsp. 7

Ponieważ udział komórek odpornościowych w rozwoju nadciśnienia stał się oczywisty, konieczne stało się stworzenie modeli i technik do badania interakcji między naczyniem a komórkami odpornościowymi. Epifluorescencja IVM naczyń krwionośnych jest użytecznym narzędziem do obserwacji interakcji in vivo między krążącymi komórkami krwi a śródbłonkiem8,9,10. Dzięki tej technice wstrzyknięcie barwników interkalujących z DNA (takich jak oranż akrydynowy) może uwidocznić komórki jądrzaste (krążące, a także ze śródbłonka). Izolowane płytki krwi barwione ex vivo rodaminą-6G lub dichlorofluoresceiną (DCF) mogą być wstrzykiwane w celu uwidocznienia skrzepliny bogatopłytkowej w modelach uszkodzeń tętnic lub żylnych.

Zazwyczaj cewnik do żyły szyjnej jest używany do wstrzykiwania znaczników lub oznaczonych płytek krwi. Wiadomo, że zmiana śródbłonka i późniejsza aktywacja kaskady krzepnięcia mają wpływ na aktywację monocytów. Uszkodzenie śródbłonka natychmiast prowadzi do aktywacji płytek krwi przez cząsteczki macierzy podśródbłonkowej w celu uszczelnienia tkanki, co prowadzi do przyciągania i aktywacji monocytów11. Wręcz przeciwnie, wiadomo, że nienaruszony śródbłonek ma właściwości przeciwzakrzepowe (np. poprzez inhibitor szlaku czynnika tkankowego lub trombomodulinę)12 i bezpośrednie działanie hamujące na monocyty, np. poprzez wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających mikroRNAs13. Wiadomo, że monocyty wytwarzają czynnik tkankowy, zewnętrzny aktywator kaskady krzepnięcia i ekspresję receptorów aktywowanych proteazą (PAR), które mogą być aktywowane przez trombinę i uczestniczyć w aktywacji monocytów14,15. W związku z tym każda aktywacja płytek krwi lub kaskady krzepnięcia spowodowana uszkodzeniem naczyń może mieć nieoczekiwany wpływ na aktywację monocytów i zakłócać obserwowane zjawisko. Z pomocą transgenicznych myszy transgenicznych IRG LysM Cre, podwójnie fluorescencyjnej myszy reporterowej Cre (LysMCre+IRG+), proponujemy szczegółowe zbadanie wpływu iniekcji z cewnikiem i metod alternatywnych na komórki mielomonocytarne LysM + w mysim modelu nadciśnienia tętniczego16.

Protokół

Eksperymenty przeprowadzono na samcach myszy w wieku od 8 do 12 tygodni za zgodą komisji etyki ds. doświadczeń na zwierzętach z Nadrenii-Palatynatu (numer autoryzacji 23 177-07/G12-1-002 i 23 177-07/G15-1-051).

1. Znieczulenie myszy i przygotowanie do operacji

  1. Przed zabiegiem należy sprawdzić stan zdrowia i kondycję zwierząt. Przed zabiegiem należy monitorować zwierzęta raz dziennie przez 2-3 dni pod kątem ich ogólnego stanu (wygląd, postawa, spontaniczne zachowanie), a także masy ciała, spożycia pokarmu i wody.
  2. Przygotować główną mieszankę do znieczulenia z midazolamem (5 mg/kg masy ciała), medetomidyną (0,5 mg/kg masy ciała) i fentanylem (0,05 mg/kg masy ciała) do dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknąć 200 μl/30 g myszy w strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 26 G.
  3. Implantacja pompy osmotycznej i przygotowanie zwierząt do eksperymentów IVM odbywa się na polu operacyjnym z platformą rozgrzewającą o temperaturze 39 °C. Wysterylizuj wszystkie narzędzia w kąpieli dezynfekcyjnej i zdezynfekuj platformę grzewczą.
  4. Podczas zabiegów należy chronić oczy zwierzęcia maścią do oczu. Usuń sierść maszynkami do golenia przed implantacją pompy osmotycznej. Użyj kremu do depilacji i wacików do izolacji tętnic szyjnych i implantacji cewnika szyjnego w eksperymentach IVM. Zdezynfekować skórę zwierzęcia za pomocą dwóch środków do dezynfekcji skóry: jednego antyseptycznego i dezynfekującego zawierającego powidon, jodu i jednego środka antyseptycznego do skóry zawierającego oktenidynę w roztworze na bazie alkoholu.
  5. Przygotować główną mieszankę, aby zantagonizować znieczulenie ("mieszanina antysedanu") atipamezolem (0,05 mg/kg masy ciała) i flumazenilem (0,01 mg/kg masy ciała) i przygotować 200 μl/mysz w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą 26 G do wstrzyknięcia podskórnego (podskórnie).

2. Przygotowanie i implantacja pompy osmotycznej

UWAGA: Podskórna infuzja AngII za pomocą pomp osmotycznych została szczegółowo opisana przez Lu et al.17

  1. Przygotować AngII, rozpuszczając liofilizowany proszek w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i dostosować stężenie do masy ciała zwierzęcia i szybkości podawania przez pompę. Rozpuszczony AngII należy przechowywać w plastikowych probówkach (nie używać szklanych probówek).
  2. Napełnij pompy roztworem AngII, aby dostarczyć 1 mg/(kg·d) przez 7 dni. Po przygotowaniu pompki należy przechowywać w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przez minimum 4-6 godzin w temperaturze 37 °C.
  3. Przetestuj pełne znieczulenie myszy po wstrzyknięciu mieszanki znieczulającej z odruchami tylnej stopy i umieść ją na ciepłym polu operacyjnym. Indukcja znieczulenia trwa 10-15 minut i działa lepiej, jeśli zwierzęta są umieszczone w ciemnym otoczeniu.
  4. Ogol dolną część pleców myszy i zdezynfekuj ją alkoholowym środkiem antyseptycznym do skóry.
  5. Wykonaj 1 cm nacięcie prostopadłe do kręgosłupa za pomocą nożyczek. Utworzyć kieszeń na pompę za pomocą hemostatu cieśniny i włożyć pompę (najpierw moderator przepływu). Kieszeń musi umożliwiać swobodny ruch pompy bez nacisku na ranę.
  6. Zamknij ranę szwami, a nie klipsami, aby ograniczyć stan zapalny, a następnie zdezynfekuj skórę środkiem antyseptycznym.
  7. Zantagonizować znieczulenie przez wstrzyknięcie s.c. 200 μl mieszanki antysedanu i przywrócić mysz do klatki.
  8. Analgezję pooperacyjną należy przeprowadzić buprenorfiną (0,075 mg/kg s.c.) jednorazowo po operacji i na żądanie, w zależności od zachowania zwierzęcia.

3. Implantacja cewnika szyjnego i przygotowanie tętnic szyjnych

  1. Przetestuj pełne znieczulenie myszy po wstrzyknięciu mieszanki znieczulającej z tylnymi odruchami pokarmowymi i umieść znieczulone zwierzę w pozycji grzbietowej na płytce operacyjnej o temperaturze 39 °C z sondą doodbytniczą w celu utrzymania temperatury i nałóż maść na oczy, aby chronić je podczas zabiegu.
  2. Usuń włoski na szyi za pomocą kremu do depilacji. Za pomocą bawełnianego wacika rozprowadź i wcieraj krem przez 2 minuty, aż włoski zaczną wypadać. Po dodatkowych 2 minutach usuń krem i włoski szpatułką i zdezynfekuj skórę alkoholowym środkiem antyseptycznym do skóry.
  3. Wykonaj operację pod mikroskopem stereoskopowym. Wykonaj nacięcie w skórze o długości 1-1,5 cm wzdłuż szyi, 1 cm obok tchawicy. Następnie wykonaj dwa inne nacięcia prostopadle do obu końców pierwszych nacięć.
  4. Ostrożnie usuń tkanki przylegające do skóry i usuń kawałek skóry pokrywający lewą żyłę szyjną i tchawicę.
  5. Ostrożnie odizoluj śliniankę przyuszną; gruczoły podjęzykowe i podszczękowe od strefy zainteresowania za pomocą 2 zakrzywionych kleszczy. Nie przecinaj ani nie uszkadzaj gruczołów, ułóż je tak, aby umożliwić najlepszy dostęp do żyły szyjnej i tętnic szyjnych.
  6. Aby wyizolować żyłę szyjną, użyj cienkich kleszczy i powoli otwieraj i zamykaj ją, aby delikatnie uwolnić naczynie z otaczającej tkanki. Gdy żyła jest całkowicie czysta, umieść kleszcze pod naczyniem i umieść pod nim dwa szwy 7-0 o długości 10 cm każdy.
  7. Zamknij szew proksymalnie do głowy dwoma węzłami. Na drugim szwie przygotuj jeden węzeł, ale go nie zamykaj.
  8. Jedną ręką trzymać cewnik (o średnicy wewnętrznej 0,28 mm, średnicy zewnętrznej 0,61 mm) wypełniony sterylnym roztworem soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C, a drugą ręką wykonać małe nacięcie w naczyniu cienkimi nożyczkami lub zakrzywioną igłą 26 G. Następnie włóż cewnik do żyły szyjnej i zamknij węzeł dwa razy. Zamknij szew proksymalny do głowy nad cewnikiem, aby zapewnić całkowite unieruchomienie.
  9. Aby wyizolować i przygotować tętnice szyjne, wypreparuj obszar pokrywający tchawicę za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków.
  10. Gdy tętnice szyjne są wolne od otaczających tkanek, usuń nerw błędny (wygląda jak biała linia przylegająca do tętnicy szyjnej) z naczynia (ale nie przecinaj go). Cienkie kleszcze można zamykać i powoli otwierać, aby delikatnie zmobilizować nerw.
  11. Gdy obie tętnice są całkowicie czyste, umieść kleszcze pod pierwszą tętnicą szyjną i umieść mały plastikowy kawałek o szerokości 3 mm x długości 2,5 cm pod naczyniem. Bardzo ważne jest, aby nie rozciągać nadmiernie naczynia i sprawdzić, czy po umieszczeniu uchwytu naczynia występuje przepływ krwi. Umieść drugą tętnicę nad uchwytem naczynia. Jeśli mysz nie zostanie umieszczona bezpośrednio pod mikroskopem, umieść gruczoły z powrotem nad tchawicą i nałóż sterylną sól fizjologiczną o temperaturze 37 °C, aby uniknąć wysuszenia strefy.

4. Ocena toczących się i przylegających leukocytów/komórek LysM+ za pomocą IVM

  1. Przygotować oranż akrydynowy z roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml przechowywanego w temperaturze -20 °C i rozcieńczyć go w stosunku 1:4 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (stężenie końcowe 0,5 mg/ml) w strzykawce o pojemności 1 ml. Chronić strzykawkę przed światłem i użyć 200 μl na jedną mysz.
    1. Przetestuj różne warunki: (1) Wstrzyknięcie pomarańczy akrydynowej za pomocą cewnika szyjnego; (2) Wstrzyknięcie oranżu akrydynowego bezpośrednio do żyły bocznej ogona (w tym stanie nie wszczepiono cewnika szyjnego); (3) Pomiar bez oranżu akrydynowego przy użyciu fluorescencji myszy LysMCre + IRG + (tutaj ponownie nie wszczepiono cewnika szyjnego).
  2. Po umieszczeniu cewnika i wyizolowaniu dwóch tętnic szyjnych umieść mysz pod mikroskopem. Wykonuj pomiary za pomocą szybkiego, szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu kondensatora dalekiego zasięgu i obiektywu 10X (NA 0,3) zanurzonego w wodzie z monochromatorem, rozdzielaczem wiązki i kamerą urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym. Wykonuj akwizycję i analizę obrazów za pomocą systemu obrazowania w czasie rzeczywistym.
  3. Ustaw ostrość obiektywu mikroskopu na środku tętnicy szyjnej na powierzchni śródbłonka. Powoli wstrzyknąć 50 μl oranżu akrydynowego (0,5 mg/ml) (należy wziąć pod uwagę martwą objętość cewnika przy pierwszym wstrzyknięciu). Ustaw oprogramowanie tak, aby zapisywało 100 obrazów z czasem naświetlania 120 milisekund na obraz.
  4. Dla każdego filmu nagraj cztery filmy na tętnicę szyjną (lewą i prawą) w różnych miejscach tętnicy. Jeśli sygnał fluorescencji zmniejszy się, wstrzyknij kolejne 50 μl pomarańczy akrydynowej.
  5. Po nagraniu wszystkich filmów poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  6. Ustaw prędkość wideo na 10 obrazów na sekundę i określ ilościowo toczące się i przylegające komórki w prostokącie o wymiarach 200 μm x 250 μm umieszczonym w środku naczynia dla każdego filmu. Policz komórki toczące się i przylegające; Komórki przylegające definiuje się jako komórki, które nie poruszają się ani nie odłączają od śródbłonka w ciągu 10 sekund. Aby uprościć kwantyfikację, usuń kanał z czerwoną fluorescencją i używaj tylko zielonej fluorescencji do liczenia toczących się i przylegających komórek.
  7. W przypadku eksperymentów z użyciem oranżu akrydynowego należy ręcznie wykonać próg fluorescencji w celu usunięcia tła wytwarzanego przez komórki śródbłonka.

Wyniki

Tętnice szyjne myszy LysMCre+IRG+ poddanych infuzji AngII obserwowano za pomocą IVM. Pomarańcz akrydynowy wstrzyknięto przez cewnik żylny. Naszym celem było określenie proporcji komórek LysM+ w kontakcie ze ścianą naczyniową w stosunku do wszystkich jądrowych komórek krążących (które również mogły oddziaływać z naczyniem, ponieważ rozróżnienie typu komórek oddziałujących z naczyniem pozostawało kwestią otwartą w naszej poprzedniej pracy). W stanie wyjściowym obecność cewnika żylnego powoduje adhezję komórek LysM+ (Rycyna 2A, D). Po wstrzyknięciu pomarańczu akrydynowego te same komórki wykazywały fluorescencję, ale fluorescencyjne były również komórki śródbłonka (Rycyna 2B, E). Po redukcji tła w celu ograniczenia fluorescencji związanej ze śródbłonkiem, dane wskazują, że wszystkie przylegające komórki jądrowe to komórki LysM+ (Rycyna 2C, F); wyniki te pozostają aktualne po infuzji AngII, co potwierdza nasze poprzednie wyniki i wykazuje, że model LysMCre+IRG+ jest odpowiednim modelem do obserwacji wpływu AngII na aktywację komórek LysM+.

Oceniliśmy rolę dróg podania pomarańczowej akrydyny w aktywacji komórek LysM+ po infuzji AngII u myszy LysMCre+IRG+. Po tygodniu infuzji AngII oddziaływania leukocytów z śródbłonkiem w tętnicach szyjnych myszy LysMCre+IRG+ zostały obrazowane i zwizualizowane za pomocą IVM z wstrzyknięciem pomarańczowej akrydyny przez cewnik szyjny lub żyłę ogonową, bądź bez wstrzykiwania. Bez zastosowania cewnika lub iniekcji, toczenie się komórek LysM+ było znacznie zwiększone po infuzji AngII w porównaniu z myszami nieleczonymi, a adhezja wykazała wzrost (Rycina 3). Wstrzyknięcie pomarańczowej akrydyny przez cewnik szyjny zwiększyło adhezję i toczenie w myszach leczonych AngII w większym stopniu niż u myszy bez cewnika (Rycina 3). Wstrzyknięcie pomarańczowej akrydyny do żyły ogonowej prowadzi do podobnej adhezji i toczenia w porównaniu z myszami, które nie otrzymały iniekcji pomarańczowej akrydyny (Rycina 3).

Schemat modelu mysiego z infuzją angiotensyny II wraz z izolacją tętnic szyjnych do obserwacji i kwantyfikacji komórek.
Rysunek 1. Schemat infuzji angiotensyny II oraz oceny toczenia i adhezji komórek LysM+ u myszy. Myszy LysMCre+IRG+ otrzymywały infuzję AngII przez 7 dni, a następnie dokonano kwantyfikacji przylegających oraz toczących się komórek LysM+ w obrębie tętnic szyjnych, z wstrzyknięciem pomarańczowej akrydyny poprzez cewnik żylny szyjny lub wstrzyknięciem dożylnie do ogona, bądź bez takiego podania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; aktywność komórkowa, analiza optyczna, porównanie widm, skala 100 μm.
Rysunek 2. Ocena adhezji i toczenia się komórek LysM+ w tętnicach szyjnych myszy LysMCre+IRG+ . Adhezja komórek LysM+ u myszy LysMCre+IRG+ przed (A, D) i po (B, E) wstrzyknięciu akrydyny przez cewnik żyły szyjnej. Zarejestrowano fluorescencję czerwoną i zieloną; widoczne były komórki LysM+ (na zielono) i komórki mięśni gładkich (na czerwono). Po wstrzyknięciu pomarańczowej akrydyny widoczne są również w kolorze zielonym komórki śródbłonka, jednak usunięcie fluorescencji tła pozwala na wizualizację wyłącznie krążących komórek jądrzastych (C, F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe równowagi statycznej, obrazy mikroskopowe; wpływ wstrzyknięcia pomarańczowej akrydyny na adhezję komórek, infuzja AngII.
Rycina 3. Ocena dróg podania barwników fluorescencyjnych u myszy LysMCre+IRG+ poddawanych infuzji angiotensyny II. Ilościowe określenie toczących się (A) i przylegających (B) komórek LysM+ u zwierząt w grupie operowanej pozornie (sham) lub poddawanych infuzji AngII, z wstrzyknięciem pomarańczowej akrydyny przez cewnik żyły szyjnej lub wstrzyknięciem do żyły ogonowej, bądź bez wstrzyknięcia. Reprezentatywne zdjęcia dla różnych warunków (C). Wyniki przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. Zastosowano analizę 2-way ANOVA oraz test post hoc Bonferroniego, n = 3-12/grupy; *p < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Wcześniej wykazano, że monocyty LysM+ są zaangażowane w rozwój nadciśnienia5. Tutaj pokazujemy, że komórki odpornościowe LysM + zwijają się i przylegają do warstwy śródbłonka w odpowiedzi na infuzję AngII. Odkrycie to uzyskano przy użyciu myszy LysMCre + IRG + z naszych poprzednich badań badających rolę komórek odpornościowych w nadciśnieniu in vivo poprzez wizualizację leukocytów po wstrzyknięciu oranżu akrydynowego 6,10. W związku z tym rozróżnienie typów komórek przylegających do śródbłonka nie było możliwe.

IVM jest bardzo przydatnym narzędziem do badań naczyniowych i obserwacji in vivo komórek bezpośrednio w układzie naczyniowym, ale wpływ wstrzykiwania barwników za pomocą chirurgicznie wprowadzonego cewnika w kontekście zapalnym nadciśnienia pozostaje nieznany. Aby ocenić potencjalny efekt wstrzyknięcia cewnika i oranżu akrydynowego, wykorzystaliśmy myszy LysMCre+IRG+ . Wlew AngII zwiększał liczbę toczących się komórek LysM+ do śródbłonka. Wprowadzenie cewnika do żyły szyjnej wzmocniło efekt, a u myszy z infuzją AngII wyposażonych w cewnik wykryto więcej toczących się i przylegających leukocytów w porównaniu z myszami bez implantów cewnika. Wskazuje to, że implantacja cewnika do tętnicy szyjnej powoduje ogólnoustrojową reakcję zapalną w kontekście gojenia się ran, która nakłada się na reakcję immunologiczną obserwowaną w nadciśnieniutętniczym 18. Ponadto, ze względu na bliskość żyły szyjnej do tętnicy szyjnej, mogła wystąpić dodatkowa aktywacja immunologiczna poprzez wpływ na żyłę szyjną. Ponieważ efekt ten nie występował, gdy iniekcja była wykonywana bezpośrednio do żyły ogonowej, możemy założyć, że efekt nie był spowodowany barwnikiem, ale procedurą wprowadzania cewnika. Wykazaliśmy tutaj, jak ważne jest, aby transgeniczne myszy reporterowe wykazywały ekspresję białek fluorescencyjnych, aby nie zakłócać procesów in vivo podczas eksperymentów. Co więcej, wstrzyknięcie fluorescencyjnych znaczników do żyły ogonowej może być możliwą alternatywą dla iniekcji cewnika szyjnego.

Jednym z krytycznych etapów zabiegu jest infuzja AngII. Pomiar ciśnienia krwi za pomocą mankietu ogonowego może być wykonany w celu kontrolowania skuteczności dostarczania AngII przez pompę. Ciśnienie krwi powinno wzrosnąć po 2-3 dniach infuzji. Aby ograniczyć stan zapalny, który mógłby wpływać na aktywację komórek LysM+ , zamknięcie nacięcia, w którym wszczepiona jest pompa, powinno być wykonane za pomocą szwów zamiast klipsów. Należy zwrócić uwagę na jedno ograniczenie dotyczące iniekcji do żyły ogonowej: aby uzyskać jak najlepsze dane, zwykle wykonuje się 4 filmy dla każdej tętnicy szyjnej. Jeśli sygnał fluorescencyjny zmniejszy się, wstrzykuje się 50 μl oranżu akrydynowego, ale w przypadku iniekcji ogonowej trudniej jest wykonać kilka wstrzyknięć i utrzymać stabilne tętnice szyjne pod obiektywem mikroskopu. Czas obecności cewnika w żyle szyjnej może również modulować aktywację komórek odpornościowych, ponieważ wpływa na aktywację krzepnięcia w osoczu bogatopłytkowym przygotowanym 4 godziny po implantacji cewnika19. Ten aspekt implantacji cewnika wymaga dalszych badań.

Wreszcie, nawet jeśli doceniamy wpływ implantacji cewnika szyjnego na aktywację komórek LysM+ po infuzji AngII, nie możemy w pełni oszacować roli preparatu, usunięcia skóry i izolacji tętnic szyjnych na potencjalną aktywację komórek LysM+ . Wnioskujemy, że zaleca się stosowanie fluorescencyjnych myszy reporterowych, takich jak mysz LysMCre + IRG+ , aby uniknąć zakłócenia integralności naczyń podczas przygotowania zwierząt do obrazowania in vivo .

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF 01EO1003 i BMBF 01EO1503).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MidazolamRatiopharm GmbHMieszanka anestezjologiczna
MedetomidinePfizer Deutschland GmbHMieszanka anestezjologiczna
FentanylJanssen-Cilag GmbHMieszanka anestezjologiczna
AlzaneZoetisAntisedan mix
FlumazenilHikma pharmaAntisedan mix
BraunolB Braun
OctenidermSchü lke
Pompy osmotyczneAlzet1007DImplantacja pompy osmotycznej
Angiotensyna IISigma-AldrichImplantacja pompy osmotycznej
7-0 szew prolenowyEthiconImplantacja pompy osmotycznej
Pomarańcz akrydynowaSigma-Aldrich
Smiths Medical Deutschland GmbHŚrednica wewnętrzna, 0,28 mm; średnica zewnętrzna, 0,61 mm
MikroskopfluorescencyjnyOlympus
Rozdzielacz wiązkiFotometriaCMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager
ObiektywOlympusUMPLFLN10XZanurzenie w wodzie z monochromatorem
Aparat fotograficznyHamamatsu PhotonicsORCA-R2
Akwizycja i analiza obrazu oprogramowanieOlympusRealtime Imaging System eXcellence RT
MyszyThe Jackson LaboratoryJax 008705B6. Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
MyszyJackson LaboratoryJax 004781LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )
Cewnik BX51WI

Bibliografia

  1. Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
  2. Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
  3. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
  4. De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
  5. Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
  6. Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
  7. Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. Role of the Immune System in Hypertension. Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).
  8. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
  9. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  10. Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
  11. Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
  12. Hinsbergh, V. W. Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
  13. Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
  14. Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
  15. Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
  16. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  17. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. , (2015).
  18. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23(2011).
  19. Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. , (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adhezja leukocyt wintravitalna wideomikroskopianadci nienie indukowane angiotensyn IImyszy LysM GFPcewnik ylny szyjnywstrzykni cie do y y ogonowejakrydyna pomara czowaobrazowanie t tnicy szyjnejkwantyfikacja kom rek fluorescencyjnych

Powiązane artykuły