Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka mikrocząstek pochodzących z neutrofili do badań funkcjonalnych

DOI:

10.3791/56949

⸱

2 marca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowe protokoły są tutaj opisane do izolowania i charakteryzowania mikrocząsteczek pochodzących z neutrofili ludzkich i mysich. Protokoły te wykorzystują techniki ultrawirowania, cytometrii przepływowej i immunoblottingu do analizy zawartości mikrocząstek i mogą być wykorzystywane do badania roli mikrocząstek pochodzących z różnych typów komórek w funkcjonowaniu komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielojądrzaste mikrocząstki pochodzące z neutrofili (PMN)-MPs) to dwuwarstwowe, sferyczne mikropęcherzyki lipidowe o rozmiarach od 50 do 1 000 nm średnicy. MP są nowo rozwijającą się, ważną częścią maszynerii komunikacji i sygnalizacji między komórkami. Ze względu na ich rozmiar i charakter ich wydania, do niedawna istnienie MP było pomijane. Jednak dzięki ulepszonej technologii i metodom analitycznym wyłania się ich funkcja w zdrowiu i chorobie. Przedstawione tutaj protokoły mają na celu wyizolowanie i scharakteryzowanie PMN-MP za pomocą cytometrii przepływowej i immunoblottingu. Ponadto podano kilka przykładów wdrożeń. Te protokoły izolacji MP są szybkie, tanie i nie wymagają użycia drogich zestawów. Ponadto pozwalają one na znakowanie MP po izolacji, a także wstępne znakowanie komórek źródłowych przed uwolnieniem MP, przy użyciu specyficznego dla błony barwnika fluorescencyjnego do wizualizacji i analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metody te mają jednak kilka ograniczeń, w tym czystość PMN i MP oraz potrzebę stosowania wyrafinowanego oprzyrządowania analitycznego. Wysokiej klasy cytometr przepływowy jest potrzebny do niezawodnej analizy MP i zminimalizowania fałszywie dodatnich odczytów z powodu szumu lub autofluorescencji. Opisane protokoły mogą być wykorzystane do wyizolowania i zdefiniowania biogenezy MP oraz scharakteryzowania ich markerów i zmienności składu w różnych warunkach stymulujących. Niejednorodność wielkości można wykorzystać do zbadania, czy zawartość cząstek błonowych w porównaniu z egzosomami jest inna i czy pełnią one różne role w homeostazie tkanek. Wreszcie, po wyizolowaniu i scharakteryzowaniu MP, można zbadać ich funkcję w odpowiedziach komórkowych i różnych modelach chorób (w tym zaburzeniach zapalnych związanych z PMN, takich jak nieswoiste zapalenie jelit lub ostre uszkodzenie płuc).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio, "mikrocząsteczki/mikropęcherzyki" pochodzące z cytozolu komórkowego lub błony plazmatycznej stały się przedmiotem dużego zainteresowania naukowego, ponieważ pojawiające się dane sugerują, że te struktury, o średnicy od 50 do 1000 nm, mogą przenosić informacje biologiczne i służyć jako niekanoniczna metoda komunikacji komórkowej. MPP pochodzące z komórek odpornościowych, a w szczególności te wytwarzane przez wielojądrzaste neutrofile (PMN), są bardzo interesujące ze względu na ważną rolę PMN w obronie gospodarza1,2, inflammatory responses3, and wound-healing4. Co ciekawe, do tej pory liczne raporty wykazały zarówno prozapalne, jak i przeciwzapalne funkcje PMN-MPs5, co sugeruje potencjalną rolę MP w zależności od kontekstu, choroby, gatunku i narządu.

Opisane protokoły w tej komunikacji dostarczają opłacalnej, innowacyjnej i elastycznej metody badania funkcji MP w zdrowiu i chorobie. Mają zastosowanie do wielu organizmów modelowych, narządów i warunków stymulacji. Pozwalają one na identyfikację kilku typów MP i mogą być wykorzystane w przyszłości do zajęcia się ich funkcjami prozapalnymi i przeciwzapalnymi. Jako przykład, opisano poniżej, jak badać funkcję PMN-MP w gojeniu się ran nabłonkowych in vitro i in vivo. Przedstawiony protokół izolacji PMN pochodzących ze szpiku kostnego myszy został zaadaptowany z pewnymi modyfikacjami z wcześniej opisanej metody6.

Ponadto, protokoły opisane w tym badaniu pozwalają na wykrywanie i charakteryzację specyficznych markerów, które można znaleźć na PMN-MP za pomocą dwóch uzupełniających się metod: Western blot i cytometrii przepływowej. Odkryliśmy, że immunoblotting MP przy użyciu standardowych protokołów5 jest łatwy i niezawodny, jednak ostatnie postępy w czułości przyrządów do cytometrii przepływowej i poprawiony stosunek szumu do sygnału pozwalają teraz na dalszą analizę MP przy użyciu tej metody. Opisane protokoły w tym badaniu uwzględniają najnowsze osiągnięcia i zalecenia z oryginalnych artykułów naukowych, w tym modyfikacje prędkości i czasu wirowania, dodanie warunków filtrowania próbek i zamrażania/przechowywania7,8, oraz jak zredukować "szum tła", poprawić granicę wykrywalności PMN-MP i rozróżnić różne rozmiary MP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Northwestern IACUC. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi. W przypadku ludzi oddających krew przedstawiano i podpisywano świadomą zgodę; Ponadto wszyscy ludzie biorący udział w tym badaniu byli traktowani zgodnie z instytucjonalnymi i federalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka.

UWAGA: Kroki protokołu są wymienione w następujących podsekcjach: (i) Izolacja komórek szpiku kostnego myszy; (ii) izolacja PMN z mysiego szpiku kostnego; (iii) izolacja PMN z krwi ludzkiej; (iv) Izolacja MP od supernatantów PMN (przez ultrawirowanie); (v) Charakterystyka MP za pomocą Western Blotting; (vi) Charakterystyka MP za pomocą cytometrii przepływowej; (viii) Zastosowanie izolowanych parlamentarzystów do badania gojenia się ran

1. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy

  1. Rozwarstwienie kości udowej i piszczelowej od tylnych nóg myszy
    1. Przygotuj pudełko do eutanazji (np. puste pudełko na końcówki o pojemności 1 ml) do inhalacji znieczulenia. Dodaj kilka kropli 100% izofluranu na sterylną szmatkę przyklejoną do wewnętrznej strony plastikowego wieczka. Zgodnie z nowymi wytycznymi IACUC, zwierzęta nie powinny mieć bezpośredniego kontaktu z izofluranem, dlatego umieść uchwyt na końcówkę między myszą a gazą zawierającą izofluran.
      UWAGA: Izofluran jest silnym wziewnym środkiem znieczulającym i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością wewnątrz okapu wyciągowego.
    2. Eutanazja myszy zgodnie z zaleceniami IACUC. Umieść mysz w pudełku do eutanazji opisanym w kroku 1.1.1 na 1–5 minut, aż przestanie oddychać. Upewnij się, że zwierzę umrze, wykonując zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Podnieś skórę brzucha za pomocą pęsety ze stali nierdzewnej, zakrzywionej 12 cm, 0,17 mm x 0,1 mm i przetnij skórę w połowie odległości między kończynami górnymi i dolnymi. Oderwij skórę od tego miejsca do najbardziej dystalnej części ciała myszy, w tym kończyn dolnych. Za pomocą prostych nożyczek preparacyjnych o długości 10 cm usuń mięśnie z tylnych nóg i zwichnij staw biodrowy, pozostawiając nienaruszoną głowę kości udowej.
    4. Użyj nożyczek, aby wypreparować mięśnie od kości udowej i piszczelowej i oddzielić kość udową od piszczelowej. Upewnij się, że końce kości pozostają nienaruszone, ponieważ zawierają znaczne ilości szpiku kostnego.
    5. Usuń całe pozostałe mięso, zwijając kości w ręcznik papierowy. Umieść czyste kości na szalce Petriego zawierającej pożywkę wolną od surowicy (SFM, tj. zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle's Biological (DMEM) bez surowicy i antybiotyków).
    6. Opłucz kości w 70% etanolu, a następnie w SFM.
    7. Przygotuj 50 ml SFM w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Załaduj 10 ml SFM do strzykawki o pojemności 10 ml i podłącz ją do igły o średnicy 25 i 5/8 cala.
    8. Przytnij koniec kości nożyczkami, aż będzie widoczny otwór do szpiku kostnego (czerwonawy kolor).
    9. Przepłukać komórki szpiku kostnego do nowej probówki o pojemności 50 ml. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 26 i 5/8 cala z około 3 ml / kość SFM. Po zakończeniu płukania ponownie zawiesić komórki w probówce przez pipetowanie (użyć jednorazowych plastikowych końcówek o pojemności 1 ml) w celu rozbicia agregatów komórkowych.

2. Izolacja PMN od mysiego szpiku kostnego

  1. Liza krwinek czerwonych
    1. Pobrany szpik kostny osadzać przez odwirowywanie w temperaturze 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml 0,2% NaCl na około 20-30 sekund, aby zlizować frakcję erytrocytów. Nie należy przekraczać 30 sekund, ponieważ spowoduje to lizę PMN. Dodaj 20 ml 1,6% NaCl, aby przywrócić osmolalność.
      UWAGA: Ten krok może prowadzić do bardzo małej aktywacji PMN.
    3. Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować jak w kroku 2.1.1 powyżej. Usunąć supernatant.
    4. Przystąpić do izolowania PMN przez wirowanie w gradiacji gęstości.
  2. Izolacja neutrofili metodą wirowania w gradicycie gęstości
    1. Przed użyciem ciepłe roztwory polisacharozy i ditrizoinianu sodu o gęstości 1,119 g/ml i 1,077 g/ml (patrz tabela materiałów) do temperatury pokojowej (RT).
    2. Przygotować gradienty polisacharozy i ditrizoinu sodu na świeżo, bezpośrednio przed zastosowaniem komórek szpiku kostnego, powoli nakładając 3 ml roztworu o gęstości 1,077 g/ml na 3 ml roztworu o gęstości 1,119 g/ml w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Przygotowanie roztworu gradientowego ze zbyt dużym wyprzedzeniem spowoduje wymieszanie warstw oraz słabą czystość i odzysk neutrofili
      3. .
    3. Zawiesić osad komórek szpiku kostnego w 1 ml lodowatego PBS i nałożyć powstałą zawiesinę komórek na gradient polisacharozy i ditrizoinu sodu (powoli, aby uniknąć mieszania się warstw).
    4. Wirować przez 30 minut przy 850 x g w temperaturze 25 °C w temperaturze pokojowej, bez hamulca. Odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej w celu skutecznego oddzielenia neutrofili od innych komórek obecnych w szpiku kostnym. Ustaw wirówkę na powolne zwalnianie, aby umożliwić efektywne uformowanie gradientu i utrzymanie go po etapie wirowania.
    5. Wizualnie zlokalizuj warstwę komórek jednojądrzastych na granicy PBS i roztworu o gęstości 1,077 g / ml (górna warstwa). Usunąć tę warstwę i resztę roztworu gęstości, nie naruszając pasma PMN.
    6. Zebrać całą warstwę PMN i część leżącego pod nią roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu 1,119 g/ml do probówek o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej.
      UWAGA: Czystość wyizolowanych PMN będzie zależała od całkowitego usunięcia górnej warstwy.
    7. Na wierzch probówek napełnić przefiltrowanym PBS (przefiltrowanym przez filtr o wielkości porów 0,1 μm) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
    8. Przemyć granulowane PMN 2 ml PBS, stosując warunki wirowania, jak w kroku 2.2.7.
    9. Zawiesić ponownie w 1 ml przefiltrowanego PBS i policzyć wyizolowane PMN za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Dla tej metody izolacji uzyskana czystość PMN wynosi ~ 85-90%, co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Pozostałe frakcje zanieczyszczające składają się głównie z limfocytów jednojądrzastych.
  3. Stymulacja PMN w celu wywołania uwalniania MP
    UWAGA: PMN mogą być stymulowane do uwalniania MP za pomocą różnych warunków aktywujących, w tym N-formylo-l-metionylo-leucylo-l-fenyloalaniny (fMLF), octanu forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA) lub interferonu gamma (IFNγ). Co ważne, przed symulacją PMN powinny być przez cały czas trzymane na lodzie.
    1. Granulki PMN (300 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawiesić w przefiltrowanym 0,1 μm roztworze soli Hanka (HBSS), zawierającym wybrany środek stymulujący. W celu uzyskania optymalnej stymulacji należy stosować 100 μl roztworu stymulacyjnego na 10 milionów PMN przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C w probówkach o pojemności 15 ml.
      UWAGA: W naszych poprzednich pracach z powodzeniem zastosowano następujące stężenia aktywatorów: fMLF (0,5-1 μM dla człowieka i 2-5 μM dla mysich PMN), PMA (200 nM) i IFNγ (100 ng/ml). Jeśli pożądane jest uwolnienie wstępnie znakowanych MP, inkubować niestymulowane PMN (1-5 x 106) z N-(2-aminoetylo)maleimidem-FITC (patrz tabela materiałów) (1 μM w 100 μL HBSS, 15 min, 37 °C). Wykonaj kroki 2.3.1-2.3.3.
    2. Wirować w temperaturze 850 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć PMN i przenieść bezkomórkowe supernatanty do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    3. W przypadku izolacji MP od supernatantów bezkomórkowych przejdź do kroku 4.2.

3. Izolacja PMN od ludzkiej krwi

  1. Rekrutacja zdrowych ochotników do pobrania krwi zgodnie z wytycznymi Institutional IRB.
    1. Pobrać krew z przedramienia zdrowego ochotnika do dostępnych w handlu probówek zawierających cytrynian sodu o pojemności 5 ml (patrz tabela materiałów).
    2. Pobrać pipetą 5 ml roztworu dekstranu i diatrizoinianu sodu (o gęstości 1,113 g/ml, patrz tabela materiałów) do sterylnych probówek o pojemności 15 ml i powoli nałożyć na nie 5 ml świeżo wyizolowanej ludzkiej krwi obwodowej.
    3. Wirować probówki przez 50 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej (25 °C) z niskim przyspieszeniem i bez hamulca.
    4. Pod koniec wirowania usunąć osocze i komórki jednojądrzaste (górna warstwa) za pomocą sterylnej plastikowej pipety ssącej.
    5. Przenieś dolną warstwę (PMN) do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    6. Dodaj równą objętość 0,45% NaCl do PMN (dobrze i delikatnie wymieszaj, obracając probówkę).
    7. Wirować przez 10 minut przy 400 x g w temperaturze 25 °C.
  2. Liza krwinek czerwonych
    1. Dodaj 10 ml lodowatej, sterylnej wody do granulowanych komórek przez 45 sekund, a następnie 10 ml lodowato zimnego sterylnego 1,8% NaCl, aby przywrócić osmolalność.
      UWAGA: Wszystkie poniższe kroki w celu izolacji PMN należy wykonać na lodzie, aby uniknąć aktywacji PMN i przedwczesnego uwolnienia PMN. Sam etap lizy powoduje niewielką, ale nieistotną aktywację PMN, jednak jest niezbędny do wyizolowania czystej populacji PMN do testów funkcjonalnych.
    2. Odwirowywać komórki przez 10 minut przy 250 x g w temperaturze 4 °C z łagodnym zwalnianiem.
    3. Powtórz kroki 3.2.1 i 3.2.2.
    4. Zawiesić PMN w 5 ml lodowatego HBSS bez wapnia i magnezu. Policz całkowitą liczbę żywych komórek (użyj hemocytometru i barwienia żywotności w rozcieńczeniu 1:2, patrz Tabela materiałów) przed stymulacją.
      UWAGA: Wyizolowane PMN powinny być używane do stymulacji lub innych eksperymentów w ciągu 2 godzin od izolacji, aby uniknąć zmian funkcjonalnych i komórkowych oraz śmierci komórki.

4. Izolacja MP od aktywowanych supernatantów PMN

UWAGA: Podobny protokół jest używany do izolacji MP od mysich i ludzkich PMN.

  1. Granulki PMN (300 x g, 5 min, 4 °C) i ponownie zawiesić w przefiltrowanym roztworze HBSS o stężeniu 0,1 μm, zawierającym wybrany środek stymulujący (na przykład 1 μM fMLF, patrz uwaga: 2.3.1). W celu uzyskania optymalnej stymulacji należy stosować 100 μl roztworu stymulacyjnego na 10 milionów PMN przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C w probówkach o pojemności 15 ml.
  2. Po stymulacji odwirować aktywowane PMN przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przenieść bezkomórkowe supernatanty do nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  3. Odwirować supernatant oczyszczony z PMN w temperaturze 13 000 x g, 10 min, 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i przenieść oczyszczony supernatant do nowej probówki do ultrawirówki.
  4. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 x g, w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty przed przechowywaniem MP. W razie potrzeby granulowane MP należy przechowywać w ultrawirówkach z uszczelnioną parafiną w temperaturze -80 °C do czasu wykorzystania w eksperymentach.

5. Badanie PMN-MP za pomocą Western Blotting

  1. Dodać 1% bufor SDS (50-200 μL o 100 mM Tris pH: 7,4) do osadu MPs (od kroku 4.4), przenieść do nowych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i gotować lizowane MP przez 5 min.
    UWAGA: Liczba MP i objętość buforu do lizy muszą być dostosowane i zoptymalizowane dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania.
  2. Załadować równe ilości PMN-MP na linię do bufora załadowczego zawierającego 10% β-merkapto-etanolu.
    UWAGA: Naszą metodą ładujemy MP, które zostały wyizolowane z tej samej liczby stymulowanych PMN.
    1. Oddzielić lizaty za pomocą SDS-PAGE na 10% żelu poliakrylamidowym (użyć 50-100 V przez 1-1,5 h) i przenieść całkowite białka na membrany nitrocelulozowe zgodnie z opisem9.
  3. Błony blokowe na 1 godzinę z 5% mlekiem beztłuszczowym w 0,05% soli fizjologicznej buforowanej Tween-20 Tris i inkubować z odpowiednim pierwotnym (przez noc w temperaturze 4 °C), a następnie z drugorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z HRP.
  4. Wizualizację pasm poprzez dodanie roztworu chemoluminescencji do membrany i naświetlenie filmu rentgenowskiego wewnątrz kasety odpornej na światło (1-24 godziny).

6. Badanie PMN-MP za pomocą cytometrii przepływowej

  1. W przypadku barwienia przeciwciał należy odpowiednio rozcieńczyć przeciwciała w buforze FACS (PBS z 0,1 mM EDTA, 0,1% azydkiem sodu). Zawiesić granulowane PMN-MP (pochodzące z 1-3 x 106 PMN/warunek) w 100 μl roztworu przeciwciał.
    1. W przypadku barwienia na obecność załącznika V, ponownie zawiesić granulowane PMN-MP w buforze załącznika V zawierającym 5 μl aneksyny V sprzężonej z FITC. W przypadku jednoczesnego barwienia z przeciwciałami, dodać pożądane przeciwciała (na przykład patrz Tabela materiałów) bezpośrednio do roztworu Aneksyny V. Dodać fluorescencyjny barwnik lipidowy, N-(2-aminoetylo)maleimid (patrz tabela materiałów), o stężeniu 1 μM w 100 μl buforu FACS w celu oznaczenia i identyfikacji MPs.
  2. Inkubować MPS w roztworze barwiącym przez co najmniej 20 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przemyć MP przez ultrawirowanie (1 h w temperaturze 100 000 x g, w temperaturze 4 °C); odrzucić supernatant.
  4. Zawiesić ponownie w buforze FACS i uruchomić próbki na wyznaczonym cytometrze przepływowym wyposażonym w zmodernizowaną jednostkę elektroniczną w celu zwiększenia czułości (patrz tabela materiałów).

7. Aplikacje dla izolowanych PMN-MP do badania funkcji PMN w gojeniu się ran

  1. Podawanie in vivo PMN-MP na rany jelita grubego
    1. Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Potwierdź znieczulenie za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i dostosuj w razie potrzeby.
    2. Umieść mysz na brzuchu i za pomocą 28-centymetrowych kleszczy do biopsji i endoskopu wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości (takiej jak endoskop weterynaryjny do użytku u małych zwierząt, patrz tabela materiałów), wygeneruj 3-5 powierzchownych ran wzdłuż grzbietowej strony okrężnicy. Po zakończeniu ranienia myszy należy umieścić w klatce umieszczonej na macie o kontrolowanej temperaturze (37 °C) do czasu wyzdrowienia.
    3. Znieczulij myszy (jak w kroku 7.1.1). Użyj endoskopu, aby uzyskać obrazy zadanych ran 24 godziny (dzień 1) po zranieniu. Pozwól myszom dojść do siebie, jak w kroku 7.1.2.
    4. W tym samym czasie (24 godziny po zranieniu) podawać mysie PMN-MP pochodzące z 2 x 106 PMN w 100 μL HBSS+ bezpośrednio do każdego miejsca rany za pomocą systemu mikroiniekcyjnego opartego na kolonoskopii (użyj igły 29 G)9. Trzy dni później (4 dzień po zranieniu) znieczulij myszy (jak w kroku 7.1.1) i użyj endoskopu, aby ponownie uzyskać obrazy gojących się ran. Pozwól myszom dojść do siebie, jak w kroku 7.1.2.
    5. Korzystając z preferowanego oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów), nakreśl widoczne obszary rany na uzyskanych obrazach, zmierz obszar tej samej rany w 1. i 4. dniu po zranieniu i oblicz procent zamknięcia rany.
  2. Gojenie się ran ludzkich komórek nabłonkowych in vitro
    1. Policz Caco-2 BBe lub T84, ludzkie komórki nabłonka jelitowego za pomocą hemocytometru i wysiewaj 5 x 105 komórek / studzienkę na 24-dołkowych płytkach hodowlanych. Inkubować komórki w standardowej komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Caco-2 BBe lub T84 osiągają konfluencję w ciągu 48 h9. Do hodowli komórek nabłonkowych należy użyć DMEM i DMEM-F12 (50:50) z suplementami, jak opisano wcześniej9.
    2. Generuj mechaniczne rany po zadrapaniach w monowarstwie za pomocą końcówki pipety i niskiego ssania, jak opisano wcześniej4,9. Obrazy obszarów rany należy uzyskać natychmiast po zadrapaniu za pomocą mikroskopu interferencji różnicowej z odwróconym kontrastem fazowym (używać obiektywów 5X lub 10X), który ma być używany jako punkt odniesienia czas = 0.
    3. Dodać MP (pochodzące z 2-4 X 106 PMN) do porysowanych i zranionych monowarstw komórek nabłonka i inkubować przez dodatkowe 24 godziny (48 godzin po zranieniu, w temperaturze 37 °C z 5% CO2 ). W tym czasie ponownie utrwal obrazy ran po zadrapaniach.
    4. Użyj preferowanego oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów), aby zmierzyć obszary ran w t = 0 i t = 48 godzin. Oblicz procent zamknięcia rany, określając różnicę w powierzchni rany w wybranych punktach czasowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływowa MP, które zostały wyizolowane z ludzkich i mysich PMN, jest pokazana w Rysunek 1. Niejednorodność wielkości PMN-MP można ocenić przez porównanie ze znanymi rozmiarami koralików, jak pokazano na Rysunek 1A, B dla ludzkich MP. Należy zauważyć, że nie zaobserwowano znaczących różnic w różnorodności wielkości między myszimi a ludzkimi MP. Podobnie, za pomocą cytometri...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły izolacji i charakterystyki MP pochodzących z PMN opisano w niniejszym komunikacie. Aby procedura zakończyła się sukcesem, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów krytycznych. Po pierwsze, PMN muszą zostać wyizolowane świeże i wykorzystane w eksperymentach w ciągu 2 godzin od izolacji, aby zapobiec spontanicznej aktywacji i degranulacji. Całe obchodzenie się z PMN podczas izolacji i aż do momentu stymulacji musi odbywać się na lodzie, aby zapobiec aktywacji i przedwczesnemu uwolnieniu MP

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnego konfliktu interesów w związku z niniejszym komunikatem

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną dr Suchitry Swaminathan, która prowadzi rdzeń cytometrii przepływowej Northwestern Feinberg School of Medicine. Finansowanie zostało zapewnione przez (NIH) DK101675.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMCorning10-041-CV
Płodowa surowica bydlęca (inaktywowana termicznie)Atlanta BiologicsS11150
Penicylina/Streptomycyna (10 000 jednostek penicyliny / 10 000 mg / ml paciorkowca)GIBCO15140
0,5 M EDTAFisherBP2482
Chlorek soduSigmaS9888Sterylny i przefiltrowany przez 0,1 Filtr mikronowy
Sterylny filtrowany Histopaque 1077Sigma10771
Sterylny filtrowany Histopaque 1119Sigma11191Gęstość 1,119 g/ml.  Roztwór polisacharozy i  diatryzoan sodu. Doprowadzić do temperatury pokojowej
sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezuCellgro210-40-CV
Alkohol etylowy (200 proof)Decon labs2701
HBBSCorning21-022-CV
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%SigmaT8154  SIGMARozcieńczony 1:2 do liczenia żywotności komórek
IsofluraneAbbot50033
Anty-ludzki CD11b-APC sprzężonyBiolegend301350Klon ICRD44 (Końcowe stężenie: 1 &mikro; g/mL)
BODIPY FLInvitrogenB10250N-(2-aminoetylo)maleimid 
Annexin V Binding BufferBiolegend422201
Koraliki kalibracyjne do cytometrii przepływowejBioCytex7803
FITC Aneksyna VBiolegend640906
PolymorphprepAxis-Shield PoC ASDiatrizoinian/Dekstran sodu 500, gęstość 1,113 g/
ml C57BL/6 myszyWirówka Jackson Labs
15 ml probówkiCorning430053
probówki wirówkowe 50 mlBD Falcon352070
Pipety serologiczne 25 mlPipety229225B
Pipety serologiczne 10 mlCelltreat229210B
Pipety serologiczne 5 mlCelltreat229205B
Pipety Pasteura BD Falcon357575
25 G x 5/8 cala Igły (precyzyjne igły ślizgowe)BD305122
100 µ m Sitka komórkoweCelltreat229485
Probówki próżnioweBD367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)BD(SORP)
Wirówka kubełkowa wahadłowaThermoFisher Scientific75007210
UltrawirówkaBeckman(L8-80 M)
MikrowirówkaThermoFisher Scientific  VV-17703-15 (Fresco 17)
Wirówka kubełkowa wahadłowaThermoFisher Scientific  75004503 (Megafuge 40R)
Kleszcze do biopsji, 28 cmStorz27071zj
Software
Image J NationalInstitute of HealthOpen source 
serologiczne Celltreat

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
  2. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
  3. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  4. Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
  5. Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
  6. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
  7. Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
  8. Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
  9. Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
  10. Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
  11. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
  12. Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neutrophil MicroparticlesMicroparticle IsolationFlow CytometryImmunoblottingDensity Gradient CentrifugationUltracentrifugationCell Debris RemovalFluorescent LabelingWound Healing AssayInflammatory Markers

Powiązane artykuły