Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56952

⸱

14 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute, The University of Queensland, 2VIB Centre for Brain and Disease Research, KU Leuven Department of Neurosciences, Leuven Institute for Neurodegenerative Disease (LIND), 3Queensland Brain Institute, The University of Queensland

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

Streszczenie

Coraz większa liczba technik mikroskopii super-rozdzielczej pomaga odkryć mechanizmy rządzące światem komórkowym w nanoskali. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek nabiera rozpędu, ponieważ zapewnia wyjątkowy dostęp do wizualizacji pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy technikę, którą opracowaliśmy w celu przeprowadzenia mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej fotoaktywowaną śledzeniem pojedynczych cząstek (sptPALM) u larw Drosophila. Komunikacja synaptyczna opiera się na kluczowych białkach presynaptycznych, które działają poprzez dokowanie, torowanie i promowanie fuzji pęcherzyków zawierających neuroprzekaźniki z błoną plazmatyczną. Szereg interakcji białko-białko i białko-lipid ściśle reguluje te procesy, a zatem białka presynaptyczne wykazują zmiany w mobilności związane z każdym z tych kluczowych zdarzeń. Zbadanie, w jaki sposób ruchliwość tych białek koreluje z ich funkcją fizjologiczną u nienaruszonego żywego zwierzęcia, jest niezbędne do zrozumienia ich dokładnego mechanizmu działania. Ekstrakcja ruchliwości białek w wysokiej rozdzielczości in vivo wymaga pokonania ograniczeń, takich jak przezroczystość optyczna, dostępność i głębokość penetracji. Opisujemy, w jaki sposób fotokonwertowalne białka fluorescencyjne oznaczone białkiem presynaptycznym Syntaxin-1A mogą być wizualizowane przez lekkie ukośne oświetlenie i śledzone na końcu nerwu ruchowego lub wzdłuż aksonu neuronu ruchowego trzeciej larwy Drosophila.

Wprowadzenie

Komunikacja neuronalna opiera się na uwalnianiu neuroprzekaźników, które następuje poprzez regulowane fuzję pęcherzyków synaptycznych zawierających neuroprzekaźniki z błoną plazmatyczną1. Ten proces nazywa się egzocytozą2,3,4,5,6 jest bardzo dynamiczny i może być regulowany w górę lub w dół w zależności od wahań szybkości stymulacji7. Białka biorące udział w tych procesach podlegają ruchom Browna, a zatem wykazują nanoskopową organizację zdolną do podtrzymywania szeregu działań wiążących, które leżą u podstaw tych funkcji fizjologicznych. Białka błony plazmatycznej są bardzo dynamiczne, co pozwala na boczne uwięzienie cząsteczek w nanoklastrach na błonie plazmatycznej7,8,9,10,11,12. W związku z tym badanie ruchliwości tych białek pomaga wyjaśnić ich sposób działania8. Białka synaptyczne, takie jak rozpuszczalne receptory białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE), na przykład Syntaksynana-1A, są obecnie znane z wykazywania szybkiej mobilności bocznej, a także bocznego pułapkowania w nanoklastrach, które mogą służyć jako magazyny molekularne i miejsca fuzji pęcherzyków9,13,14,15.

Niedawny rozwój fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych, takich jak monomeric (m)Eos16,17 i Kaede18, umożliwił nanoskopową rozdzielczość białek błony plazmatycznej neuronów dzięki zastosowaniu takich metod jak mikroskopia lokalizacji aktywowana fotoaktywem (PALM) i stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)14,15,19. Odkrycia te umożliwiły prowadzenie badań nad mobilnością i nanoklastrowaniem białek biologicznych w hodowanych żywych komórkach i neuronach. Niedawno przeprowadzono badania mające na celu wyjaśnienie (w podobnie wysokiej rozdzielczości) dynamiki i organizacji tych białek błonowych w neuronach żywych, nienaruszonych organizmów, takich jak Mus musculus, Caenorhabditis elegans i Drosophila melanogaster14,20,21,22.

Badanie dynamiki i organizacji białka in vivo wymaga nie tylko użycia niedawno opracowanych narzędzi do obrazowania w superrozdzielczości (takich jak PALM, STORM i fotokonwertowalne fluorofory), ale także umiejętności pokonywania przeszkód, takich jak dostępność białka i głębokość penetracji lasera obrazującego. Obrazowanie białek wewnątrzkomórkowych u nienaruszonego zwierzęcia jest z natury trudne, podobnie jak obrazowanie białek na strukturach osadzonych głęboko w żywych tkankach nienaruszonego zwierzęcia, takich jak hipokamp nienaruszonej myszy. W związku z tym białka znajdujące się na powierzchni tkanki lub w jej pobliżu są łatwiejsze do zobrazowania. Kolejną trudnością związaną z obrazowaniem in vivo jest zapewnienie odtwarzalności u wszystkich zwierząt. Ponieważ anatomia może się różnić w zależności od próbki, wybór struktury z łatwością replikacji w różnych nienaruszonych próbkach zwierzęcych może również okazać się wyzwaniem. Wykorzystanie stereotypowych struktur, takich jak synapsy, pomaga w przezwyciężeniu niektórych z tych trudności.

Ostatnie badania obrazowały ruchliwość białek u zwierząt z optycznie przezroczystym naskórkiem, takich jak Caenorhabditis elegans22, podczas gdy inne badania obrazowały organizację białek na powierzchni tkanki/narządu, na przykład obrazowanie aktyny w neuronach korowych przez czaszkę żywej myszy21. W niektórych przypadkach stosowano środki znieczulające, aby utrzymać zwierzę w bezruchu; Jednak specyficzne środki znieczulające mogą niekorzystnie wpływać na białko będące przedmiotem zainteresowania. W związku z tym należy zbadać alternatywne sposoby unieruchomienia zwierząt podczas obrazowania in vivo, aby zminimalizować błędy.

Kolejnym zastrzeżeniem do obrazowania w super rozdzielczości in vivo jest to, że lasery używane do oświetlania interesujących białek mogą niekorzystnie wpływać na otaczającą tkankę, dlatego zaleca się utrzymywanie intensywności wzbudzenia na jak najniższym poziomie. Oświetlenie otaczającej tkanki przez laser ma również tendencję do zwiększania sygnału tła. Zastosowanie niskiej intensywności wzbudzenia pomaga zredukować tło, z zastrzeżeniem, że może to również prowadzić do spadku wydajności fotonów białek fluorescencyjnych. Odejmowanie tła podczas analizy może być wykorzystane jako alternatywny sposób redukcji sygnału tła przed analizą obrazu.

Drosophila stanowi idealny organizm do obrazowania in vivo, ponieważ dostarcza dobrze znanych narzędzi genetycznych do badania specyficznych funkcji białek. System sekwencji aktywującej (UAS)-Gal4 umożliwia czasową i przestrzenną ekspresję białek, a zatem może być używany do manipulowania neurotranskawactwem23, dzięki czemu stymulacja termogenetyczna za pomocą podrodziny A1 (dTRPA1) za pomocą subrodziny A1 (sref) 24 lub stymulacja optogenetyczna za pomocą CsChrimson25 może być połączona z obrazowaniem14. Przezwyciężyliśmy wiele komplikacji związanych z wykonywaniem obrazowania pojedynczych cząsteczek in vivo w tym systemie, a teraz opisujemy, w jaki sposób można przeprowadzić śledzenie pojedynczych cząstek u larw Drosophila melanogaster w trzecim stadium

rozwojowym.

Protokół

1. Projekt transgenicznej Drosophila eksprymującej białka oznaczone mEos2

  1. Wybierz białko, które ma zostać oznaczone białkiem mEos2. Aby zwiększyć wskaźnik powodzenia obrazowania, wybierz białka z domeną transbłonową w błonie komórkowej neuronów14 (np. Syntaksyna-1A), białka na pęcherzykach synaptycznych lub autofagosomach26,27 (np. Synaptobrevin-2) lub białka cytozolowe o ścisłej interakcji z białkami błony komórkowej neuronów (np. Munc18-1).
  2. Skonstruuj transgeny kodujące białko znakowane mEos2 (Rysunek 1). Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu dla białka i mEos2.
    UWAGA: Sekwencja kodująca mEos2 może być amplifikowana z plazmidu pmEos2-N1, który jest przeznaczony do fuzji z C-końcem białka będącego przedmiotem zainteresowania. Klonowanie można na przykład przeprowadzić przez rekombinację in vivo u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu wektora pFL44S-attB-MCS-w+ vector14,28, alternatywnie można zastosować inne metody klonowania, takie jak Gibson assembly protocol29.
    1. Linearyzuj wektor za pomocą BamHI i XbaI i przekształć się w komórki drożdży ura3-, razem z fragmentami PCR kodującymi mEos2 i interesujące białko. Wstrzyknij zarodki Drosophila za pomocą konstruktu, aby wygenerować transgeniczną linię much30.
  3. Hodować transgeniczne kultury much na standardowym pożywce z drożdży i melasy lub innym odpowiednim substytucie zawartym w plastikowych fiolkach. Aby zapewnić zdrowe i dość duże batony synaptyczne31, unikaj nadmiernego stłoczenia much w fiolkach i przerzucaj muchy na nowe fiolki po każdym dniu składania jaj; Dzięki temu larwy trzeciego stadium rozwojowego są dobrze odżywione i osiągają odpowiedni rozmiar, zanim zaczną wędrować po podłożu. Wyhoduj muchę transgeniczną w temperaturze pokojowej (25 °C).
    UWAGA: Większe bulwony synaptyczne mają tendencję do wytwarzania większej ilości białek wizualizowanych podczas obrazowania.

2. Sekcja larwy trzeciego stadium rozwojowego

  1. Wykonać cylindryczną lub półcylindryczną podstawę z polidimetylosiloksanu (PDMS) o średnicy ≤20 mm i wysokości ≤20 mm za pomocą odpowiedniego zestawu elastomerów silikonowych (Rysunek 2A). Zmieszać elastomer silikonowy z utwardzaczem silikonowym w stosunku 10:1.
    1. Mieszaninę dokładnie mieszać przez 5 minut. Wlej mieszaninę do formy z podanymi powyżej ściemniaczami. Pozostaw do stwardnienia w piekarniku w temperaturze 100 °C przez 45 minut. Baza PDMS posłuży jako podstawa, na której zostanie przeprowadzona sekcja. Upewnij się, że podstawa PDMS pasuje do studzienki naczynia hodowlanego ze szklanym dnem.
  2. Wybierz wędrującą larwę w trzecim stadium rozwojowym ze ścianki fiolki. Użyj optycznego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 4,5, aby uwidocznić larwę umieszczoną na cylindrycznej podstawie PDMS stroną grzbietową do góry.
  3. Użyj zakrzywionej i skośnej pęsety, aby przykleić drobne szpilki na głowie nad haczykami ustnymi, między dwoma rozciągającymi się przednimi przetchlinkami oraz na ogonie nad odbytem, między dwiema tylnymi przetchlinkami. Na unieruchomioną larwę dodać 40 μl pożywki dla owadów Schneidera o temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Roztwory podobne do hemolifów (HL3 lub HL6) mogą być również używane zamiast roztworu Schneidera32,33.
  4. Zapewnić dostęp przez grzbietową stronę ściany ciała brzusznego larwy za pomocą maleńkiej szpilki do nacięcia w linii środkowej ściany.
  5. Użyj nożyczek sprężynowych, aby rozciąć ścianę ciała od miejsca nacięcia. Przeciąć wzdłuż linii środkowej w kierunku przednio-tylnym34.
  6. Użyj cienkich kleszczy i wiosennych nożyczek, aby wypatroszyć larwę: usuń narządy wewnętrzne, w tym gruczoły ślinowe, tchawicę i jelita. Umyj larwę dwukrotnie pożywką dla owadów Schneidera.
  7. Za pomocą cienkich kleszczyków przytrzymaj dwie klapki ścianki korpusu, delikatnie je rozciągnij i wbij po dwie drobne szpilki z każdej strony. W ten sposób powinien powstać preparat w kształcie sześciokąta (Rysunek 2A).
  8. Odłącz mózg od brzusznego rdzenia nerwowego za pomocą nożyczek sprężynowych, aby zmniejszyć możliwość ruchu mięśni podczas obrazowania; służy to również do przytrzymania preparatu płasko przy naczyniu do obrazowania. Użyj zakrzywionej pęsety, aby wepchnąć wszystkie sześć maleńkich szpilek do podstawy PDMS.
    UWAGA: Tylko niewielka część szpilek powinna być osadzona w ścianie brzucha.
  9. Aby potwierdzić, że larwa przeżyła procedurę preparacji, należy lekko szturchnąć brzuszny rdzeń nerwowy, co powinno wywołać perystaltyczny skurcz ściany brzucha larwy.

3. Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząstek przy lekko ukośnym oświetleniu

  1. Odwróć wypreparowaną podstawę larwy-PDMS na naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem. Napełnij naczynie obrazowania 2 ml pożywki Schneidera o temperaturze pokojowej (Rysunek 2B).
  2. Zlokalizuj neurony ruchowe w drugim i trzecim segmencie z synapsami na mięśniach brzucha 6 i 735 za pomocą obiektywu zanurzeniowego w wodzie 63x/1,2 NA na fluorescencyjnym mikroskopie fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF).
  3. Użyj okularów mikroskopu, aby zlokalizować wypreparowaną larwę; zidentyfikuj mięsień 6 za pomocą oświetlenia jasnego pola.
  4. Użyj oprogramowania do akwizycji mikroskopu (patrz tabela materiałów) w konfiguracji TIRF; przesuń kąt kamery kolimatora do 1°, aby zwiększyć głębokość penetracji, w przeciwnym razie wyjdź poza kąt krytyczny TIRF, aby uzyskać ukośne oświetlenie.
  5. Włącz laser 488 nm, aby wyświetlić mEos2 na zielono. Użyj niskiej mocy lasera (mniej niż 5% z 22.8 mW), aby uniknąć wybielania zielonej fluorescencji. Zlokalizuj połączenia nerwowo-mięśniowe (które wyglądają jak koraliki na sznurku) i uzyskaj obraz TIRF o niskiej rozdzielczości.
  6. Jednocześnie włącz laser 405 nm (fotokonwertuje mEos2 z gatunków zielonych na czerwone) i laser 561 nm (obraz fotokonwertowanego czerwonego mEos2), aby stochastycznie zlokalizować pojedyncze białka fluorescencyjne mEos2.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie lasera o niskiej mocy 405 nm (0,005 do 0,9% z 4,78 mW), ponieważ pozwala to na uzyskanie stosunkowo stałego współczynnika fotokonwersji podczas akwizycji filmu. Należy użyć od 50 do 75% lasera o długości fali 561 nm (20,1 mW), ponieważ jest to wystarczające do uzyskania fluorescencji z czerwonych form mEos2 bez negatywnego wpływu na morfologię tkanki mięśniowej otaczającej połączenie nerwowo-mięśniowe.
  7. Dla każdego łańcucha połączeń nerwowo-mięśniowych uzyskaj szereg czasowy składający się z 15 000 klatek lub więcej przy 33 Hz. Zapisz format as.czi, aby zachować towarzyszące metadane do ewentualnego odniesienia.
  8. Użyj ImageJ, aby przekonwertować pliki filmowe ".czi" na pliki ".tiff".
  9. Analizuj pozyskane filmy za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego do śledzenia pojedynczych cząsteczek11,14,36, takiego jak TrackMate on FIJI/ImageJ37 (patrz Tabela materiałów). Lokalizuje współrzędne "x" i "y" każdej lokalizacji za pomocą dopasowania gaussowskiego funkcji rozrzutu punktów intensywności (PSF).
    Uwaga: Rozwiązywanie problemów: Jeśli zielona fluorescencja nie zostanie zaobserwowana lub jest zbyt przyciemniona w połączeniu nerwowo-mięśniowym po ekspozycji na laser 488 nm, należy na krótko włączyć lasery fotokonwertujące i obrazujące (405 nm i 561 nm), ponieważ pomaga to w wytwarzaniu większej ilości czerwonych form mEos2. Następnie przełącz się z powrotem na laser 488 nm i zrób zdjęcie TIRF.

4. Lokalizacja pojedynczej cząsteczki u stałych larw

  1. Aby zmierzyć wielkość nanoklastra białkowego za pomocą PALM, zastąp pożywkę dla owadów Schneidera po rozbiorze utrwalaczem - 4% paraformaldehydem rozcieńczonym w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Wysiaduj larwę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń szpilki do rozwarstwiania i umieść utrwaloną larwę w 1,7 ml przezroczystej probówce wirówkowej z zatrzaskowym zatrzaskiem.
  4. Wypreparuj i napraw tyle innych larw, ile potrzeba, a następnie umyj je trzy razy PBS.
  5. Zastąp PBS buforem blokowym (roztwór PBS, 0,1% Triton X-100 i 3% normalnej surowicy koziej).
  6. Przemyć larwy trzykrotnie PBS, a następnie inkubować z niezbędnym przeciwciałem pierwszorzędowym (rozcieńczonym w roztworze buforu blokowego).
  7. Inkubować przez noc w temperaturze 4 oC.
  8. Przemyć larwy trzykrotnie PBS, a następnie inkubować z niezbędnym przeciwciałem drugorzędowym (rozcieńczonym w roztworze buforu blokowego).
  9. Umyj larwy trzykrotnie PBS, przymocuj larwę z powrotem do podstawy PDMS i zobrazuj zgodnie z wcześniejszym opisem dla śledzenia pojedynczych cząsteczek.

Wyniki

Zgodnie z powyższym protokołem wygenerowano transgeniczne muchy Drosophilamelanogaster Syntaxin-1A-mEos2 (Rycina 1). Transgeniczne larwy Drosophila trzeciego stadium rozwojowego poddano sekcji na cylindrycznej podstawie z PDMS (Rycina 2A-F). W celu wizualizacji pojedynczych cząsteczek Syntaxin-1A zastosowano technikę PALM przy użyciu mikroskopu TIRF z lekko ukośnym oświetleniem laserowym14.

Pojedyncze cząsteczki Syntaxin-1A śledzono w presynaptycznych zakończeniach nerwów ruchowych w mięśniu 6 drugiego segmentu brzusznego. Zieloną fluorescencję mEos2 można było wykryć, co pokazuje obraz o niskiej rozdzielczości Syntaxin-1A-mEos2 w butonach typu 1b przy pobudzeniu laserem 488 nm (Rycina 3A). W eksperymentach obrazowania głębokość obrazowania dla laserów pobudzających 405 nm i 561 nm wynosiła odpowiednio 133,5 nm i 165,6 nm. Obraz w kanale zielonym uzyskano jako średnią z 16 pojedynczych klatek. Obraz ten posłużył do wyznaczenia obszaru zainteresowania (ROI), aby ograniczyć analizę lokalizacji w filmie z fotokonwersją wyłącznie do presynaptycznych zakończeń nerwów ruchowych.

Analiza uzyskanych filmów z fotokonwersyjnego sptPALM pozwoliła na wygenerowanie map super-rozdzielczych intensywności, współczynnika dyfuzji oraz trajektorii (Rycina 3A). Mobilność Syntaxin-1A-mEos2 została dodatkowo ilościowo określona poprzez analizę średniego kwadratu przemieszczenia (MSD) poszczególnych trajektorii (Rycina 3B). Porównania statystyczne można przeprowadzić, wykorzystując pole pod krzywą MSD (Rycina 3B). Dalsza analiza mobilności pozwala na wyznaczenie rozkładu współczynnika dyfuzji dla Syntaxin-1A-mEos2, co można ocenić statystycznie poprzez porównanie populacji mobilnych i niemobilnych (Rycina 3C).

Schemat mapy plazmidu; pFL44S z elementami genetycznymi i miejscami restrykcyjnymi BamHI, XbaI do klonowania.
Rysunek 1: Generowanie konstruktów z tagiem mEos2. Wektor pFL44S-attB-MCS-w+ jest linearyzowany za pomocą BamHI i XbaI. Fragmenty uzyskane metodą nakładającej się reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), kodujące odpowiednio białko docelowe (POI) oraz mEos2, mogą zostać sklonowane na przykład poprzez rekombinację in vivo w komórkach drożdży ura3- lub za pomocą metody Gibson assembly. Należy zauważyć, że w celu wygenerowania transgenu Syntaxin-1A-mEos2, sklonowaliśmy konstrukt flankowany endogennymi sekwencjami promotora i terminatora Syntaxin-1A. Powstały konstrukt można następnie wstrzyknąć do embrionów Drosophila, aby stworzyć transgeniczną linię much wyrażającą białko docelowe (POI) połączone z mEos2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu mikroskopii TIRF do obrazowania larwy w żelu PDMS z zastosowaniem technik oświetlenia skośnego.
Rycina 2: Drosophila – sekcja larwy i oświetlenie skośne. (A) Schemat przedstawiający sekcję larwy Drosophila przeprowadzoną na półcylindrycznej podstawie z PDMS. Larwa z usuniętą kutykulą została przymocowana do żelu PDMS za pomocą szpilek minutien. (B-C) Preparat larwa-PDMS umieszczono w szalce hodowlanej z szklanym dnem zawierającej pożywkę Schneidera dla owadów. Do wizualizacji Syntaxin-1A-mEos2 w zakończeniach nerwów ruchowych wykorzystano mikroskop TIRF w konfiguracji oświetlenia lekko skośnego. (D-F) Półcylindryczna podstawa z PDMS z wysekowaną larwą Drosophila. Preparat larwa-PDMS umieszczono w szalce do obrazowania wypełnionej pożywką Schneidera, a larwę obrazowano za pomocą mikroskopu PALM o superrozdzielczości. Pasek skali, 10 mm. (Rycina została zmodyfikowana na podstawie 14). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat śledzenia pojedynczych cząsteczek, analiza intensywności, dyfuzji i trajektorii Sx1A-mEos2.
Rycina 3: In vivo śledzenie Syntaxin-1A-mEos2 w presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego. (A) Obraz TIRF o niskiej rozdzielczości przedstawiający Syntaxin-1A-mEos2 w zakończeniu nerwu ruchowego typu 1b. Analiza filmów z fotokonwersją obrazowanych z częstotliwością 33 Hz pozwoliła na wygenerowanie map super-rozdzielczych intensywności, współczynników dyfuzji i trajektorii metodą sptPALM. Przez okres akwizycji filmu obejmujący 16 000 klatek obrazowano 5 309 poszczególnych trajektorii. Pasek skali, 3 μm. (B-C) Średnie kwadratowe przesunięcie (MSD) Syntaxin-1A-mEos2 wykreślono dla 6 różnych zakończeń nerwów ruchowych; do ilościowego określenia poziomu mobilności wykorzystano pole pod krzywą MSD (AUC). Rozkład współczynnika dyfuzji ujawnia mobilne i niemobilne populacje Syntaxin-1A, które można określić ilościowo jako wzajemne stosunki; średnio uzyskano ~2 400 trajektorii na zakończenie nerwu ruchowego (n = 3 larwy). Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten opisuje śledzenie pojedynczych cząsteczek białek znakowanych mEos2 w połączeniu nerwowo-mięśniowym larwy trzeciego stadium rozwojowego Drosophila. Aby uniknąć nadmiernej ekspresji białka transgenicznego, ekspresja Syntaksyny-1A-mEos2 była napędzana przez endogenny promotor Syntaksyny-1A. Badania nad ruchliwością białek synaptycznych ograniczały się głównie do badań in vitro hodowanych komórek i neuronów korowych 9,11,12,13. To, czy białka te wykazują podobne sygnatury ruchliwości u żywego zwierzęcia, jest w dużej mierze nieznane. Aby zobrazować ruchliwość pojedynczego białka in vivo, należy pokonać ograniczenia, takie jak przezroczystość optyczna, dostępność i głębokość penetracji. Analizując preparat larwalny i wizualizując połączenia nerwowo-mięśniowe osadzone na powierzchni mięśnia, unikamy kwestii optycznej przezroczystości i dostępności. Próby zobrazowania ruchliwości pojedynczych cząsteczek w normalnej konfiguracji TIRF okazały się nieskuteczne. Jednak zastosowanie lekko ukośnego oświetlenia pozwala na zwiększenie głębokości penetracji lasera wzbudzenia. Co więcej, drobne szpilki używane do unieruchamiania larwy pomogły uniknąć ewentualnego niekorzystnego wpływu stosowania środka znieczulającego na ruchliwość białek. Możliwe jest użycie obiektywów o większym powiększeniu, takich jak obiektywy zanurzeniowe z olejkiem 100x, do wizualizacji pojedynczych cząsteczek in vivo. Jednak zwiększone powiększenie może zwiększyć występowanie dryftów nieostrych. Ponadto z powodzeniem użyliśmy lasera o niższej intensywności (~30%) 561 nm do obrazowania pojedynczych cząsteczek na zakończeniach nerwów ruchowych. W celu użycia niższej mocy lasera mogą być wymagane dodatkowe testy.

Protokół ten jest odpowiedni do wizualizacji ruchliwości białek synaptycznych w pobliżu błony komórkowej neuronów. Korzystając z tego podejścia, ruchliwość białka SNARE - Syntaksyny-1A i białka związanego z autofagosomem Atg18a - została z powodzeniem zobrazowana in vivo 14,26. Można również badać ruchliwość białek na aksonach neuronów ruchowych27. Jednak badanie ruchliwości białek w mózgu lub brzusznym rdzeniu nerwowym może okazać się trudne do oceny ze względu na wysoki sygnał tła wytwarzany przez leżącą poniżej tkankę; Ponadto wizualizacja ruchliwości białek na tej samej strukturze mózgu będzie wymagała fluorescencyjnego znakowania struktury mózgu (w celu zapewnienia powtarzalności) i konieczne będzie zastosowanie obrazowania za pomocą dwóch kamer.

Obecne metody dostępne w mikroskopii superrozdzielczej u Drosophila są w większości ograniczone do obrazowania zarodków, a nie bardziej rozwiniętej larwy trzeciego stadium rozwojowego38,39. Główny problem z tymi protokołami polega na tym, że dają one niską liczbę trajektorii w obrazowanym obszarze, a tym samym uniemożliwiają dogłębną analizę stanów mobilności22,40. Nasz protokół śledzenia pojedynczych cząsteczek in vivo ma zdolność generowania dużej liczby trajektorii, dlatego może być stosowany w innych modelach zwierzęcych, takich jak Caenorhabiditis elegans i danio pręgowany. Rzeczywiście, każdy łańcuch NMJ wygenerował ~2,400 trajektorii, dzięki czemu nadaje się do analizy różnych stanów ruchomych i przejść między tymi stanami14,27. Ponadto wiele strategii obrazowania pojedynczych cząsteczek in vivo opiera się na użyciu środków znieczulających w celu unieruchomienia zwierząt20,22, co może zmienić funkcję fizjologiczną, w ramach której odbywa się obrazowanie. Tutaj zoptymalizowaliśmy protokół "bez znieczulenia", aby unieruchomić larwy za pomocą maleńkich szpilek.

Potencjalnym zastosowaniem tego protokołu może być wizualizacja ruchliwości białek w trzech wymiarach. Najnowsze postępy w mikroskopii superrozdzielczej umożliwiają wizualizację ruchliwości białek in vitro w wymiarach "x", "y" i "z"41,42. Nasza obecna metoda nie uwzględnia ruchliwości białek w osi "z". Jednak zakończenie nerwu ruchowego Drosophila jest strukturą sferyczną, a cennym podejściem w przyszłości będzie ilościowe określenie ruchliwości białek w trójwymiarowej objętości43. Obrazowanie w wymiarze z jest możliwe przy użyciu soczewki astygmatycznej. Alternatywnie, w trybie TIRF 44,45, rozdzielczość z jest również zwiększona. Jednak w naszych eksperymentach użyliśmy lekko ukośnego oświetlenia do wizualizacji pojedynczych cząsteczek syntaksyny1A-mEos2 bez soczewki astygmatycznej.

Podsumowując, dostępność zarówno transgenicznego stada muszek Drosophila wykazujących ekspresję białek oznaczonych białkiem fotokonwertowalnym, bazy PDMS do preparacji larwy transgenicznej, jak i mikroskopu TIRF wyposażonego w możliwość zmiany kąta padania światła są najważniejszymi narzędziami potrzebnymi do wizualizacji pojedynczych białek zgodnie z opisem w niniejszym protokole.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Jean-Baptiste Sibarita i Danielowi Choquet (IINS, CNRS/University of Bordeaux) za ich życzliwe wsparcie przy analizie pojedynczych molekuł. Szczególnie dziękujemy Nickowi Valmasowi i Jessice Mcgaw (QBI, University of Queensland) za pomoc w nagraniu wideo, podkładaniu głosu, a także projektowaniu graficznym postaci. Prace te były wspierane przez Australian Research Council (AR) Discovery Project (DP170100125 do F.A.M.), Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 do F.A.M.), Future Fellowship (FT100100725 do B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 do F.A.M.) oraz grant NHMRC Project (APP1103923 do B.V.S.). F.A.M. jest starszym pracownikiem naukowym NHMRC (ONT1060075).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PDMS (zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184)Dow Corning Corporation000000000001064291
Naczynie hodowlane ze szklanym dnemIn Vitro ScientificD29-20-1.5-N
Optyczny mikroskop stereoskopowyOlympusSZ51
Zakrzywiona pęseta (styl 5/45)Mikroskopia elektronowa Sciences0208-5AC-PO
Szpilki minutien (0,1 mm)Fine Science Tools26002-10
Owad Schneidera MediumSigma, nauki biologiczneS0146
Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do nauki precyzyjnej15000-00
Drobne kleszcze (Dumont #5)Narzędzia do nauki11254-20
Mikroskop ELYRA PS.1ZeissPS.1
PBS)Lonza17-515Q
Paraformaldehyd (16%)Mikroskopia elektronowa Sciences15710
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Normalna surowica koziaSigma-AldrichG9023
Maxyclear Probówka do mikrowirówki snaplock (1,7 ml)AxygenMCT-175-C
Zen BlackCarl Zeiss, 2012
Oprogramowanie MetamorphUrządzenia molekularne7.7.8PALM Tracer Plugin
Szczepw1118; HA-Sx1A-mEos2
o nauce Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Oprogramowanie do akwizycji muchy

Bibliografia

  1. Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
  2. Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297(2015).
  3. Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153(2013).
  4. Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
  5. Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
  6. Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
  7. Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  8. Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
  9. Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914(2014).
  10. Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89(2015).
  11. Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
  12. Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
  13. Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
  14. Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660(2017).
  15. Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
  16. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  17. Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
  18. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  19. Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
  20. Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
  21. Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
  22. Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974(2014).
  23. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  25. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  26. Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
  27. Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
  28. Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457(2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  31. Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
  32. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  33. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
  34. Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846(2012).
  35. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  36. Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  37. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  38. Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
  39. Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
  40. Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
  41. Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
  42. Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874(2015).
  43. Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101(2014).
  44. Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
  45. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Larwy Drosophilapresynaptyczne zako czenie nerwowetechnika sptPALMfluorofory fotokonwertowalnemikroskopia TIRFbia ko syntaksyna 1Az cze nerwowo mi nioweanaliza wsp czynnika dyfuzjiledzenie pojedynczych cz steczek
In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.