Artykuł metodologiczny

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56967

⸱

12 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry, University of Manchester, 2School of Engineering, University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering, University of Manchester, 4School of Science and Technology, Nottingham Trent University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.

Streszczenie

Mikroskopia z sondą skaningową umożliwiła stworzenie różnorodnych metod konstruktywnego ("addytywnego") wytwarzania cech w skali nanometrowej od góry do dołu. Historycznie rzecz biorąc, główną wadą litografii z sondą skanującą była z natury niska przepustowość systemów z pojedynczą sondą. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu matryc wielu sond, aby umożliwić zwiększenie przepustowości nanolitografii. Aby wdrożyć taką równoległą nanolitografię, niezbędne jest dokładne wyrównanie matryc sond z powierzchnią podłoża, tak aby wszystkie sondy stykały się z powierzchnią jednocześnie, gdy rozpoczyna się tworzenie wzoru litograficznego. Protokół ten opisuje wykorzystanie litografii pióra polimerowego do tworzenia cech w skali nanometrowej na obszarach o rozmiarach centymetrowych, ułatwione dzięki zastosowaniu algorytmu do szybkiego, dokładnego i automatycznego wyrównywania matryc sond. W tym przypadku nanolitografia tioli na podłożach złotych wykazuje generowanie cech o wysokiej jednorodności. Wzorce te są następnie funkcjonalizowane fibronektyną do wykorzystania w kontekście badań morfologii komórek skierowanych powierzchniowo.

Wprowadzenie

Postęp w nanotechnologii zależy od rozwoju technik zdolnych do wydajnego i niezawodnego wytwarzania nanoskalowych cech na powierzchniach. 1,2 Jednak generowanie takich cech na dużych obszarach (wiele cm2) niezawodnie i przy stosunkowo niskich kosztach jest nietrywialnym przedsięwzięciem. Większość istniejących technik, wywodzących się z przemysłu półprzewodników, opiera się na fotolitografii ablacyjnej do wytwarzania "twardych" materiałów. Ostatnio techniki litograficzne wywodzące się z mikroskopii z sondą skaningową (SPM) stały się wygodnym i wszechstronnym podejściem do szybkiego prototypowania projektów w nanoskali. 3 techniki oparte na SPM są w stanie wygodnie i szybko "zapisać" dowolny wzorzec zdefiniowany przez użytkownika. Najbardziej znaną z nich jest nanolitografia zanurzeniowa (DPN), zapoczątkowana przez Mirkina i wsp., 4, w której sonda skanująca jest używana jako "pióro" do przenoszenia molekularnego "atramentu" na powierzchnię, wytwarzając cechy w sposób analogiczny do pisania. W warunkach otoczenia, gdy sonda jest skanowana po powierzchni, cząsteczki "tuszu" są przenoszone na powierzchnię przez menisk wodny, który tworzy się między sondą a powierzchnią (Rysunek 1). DPN umożliwia zatem nanolitograficzne osadzanie szerokiej gamy materiałów, w tym materiałów "miękkich", takich jak polimery i biomolekuły. 5 Opisano również powiązane techniki wykorzystujące sondy wyposażone w kanały do dostarczania płynów, różnie określane jako 'nanopipety' i 'nano-pióra wieczne'. 6,7,8

Główną przeszkodą dla szerszego zastosowania litografii pochodzącej z SPM jest przepustowość, ponieważ wymaga zbyt dużo czasu, aby narysować obszary w skali centymetrowej za pomocą jednej sondy. Wczesne wysiłki mające na celu rozwiązanie tego problemu koncentrowały się na równoległości DPN opartych na wspornikach, przy czym zarówno "jednowymiarowe", jak i "dwuwymiarowe" (2D) matryce sond były zgłaszane do litografii obszarów o rozmiarach centymetrowych. 5,9 Jednak te tablice wspornikowe są produkowane przy użyciu stosunkowo skomplikowanych, wieloetapowych metod produkcji i są stosunkowo delikatne. Wynalezienie litografii pióra polimerowego (PPL) rozwiązało ten problem poprzez zastąpienie standardowych wsporników SPM układem 2D miękkich sond z elastomeru siloksanowego połączonych ze szkiełkiem szklanym. 10 Ta prosta konfiguracja sondy znacznie zmniejsza koszty i złożoność tworzenia wzorów na dużych obszarach, otwierając nanolitografię na szerszy zakres zastosowań. Ta bezwspornikowa architektura została również rozszerzona o litografię z miękką sprężyną z twardą końcówką, 11, która zapewnia hybrydę miękkiego podłoża elastomerowego z twardymi silikonowymi końcówkami, co zapewnia lepszą rozdzielczość w porównaniu z wzorami wykonanymi przy użyciu miękkich końcówek elastomerowych.

Kluczowym czynnikiem w realizacji tych technologii matryc 2D jest to, że układ sondy musi być dokładnie równoległy do podłoża powierzchniowego, tak aby podczas litografii wszystkie sondy stykały się z powierzchnią jednocześnie. Nawet niewielka niewspółosiowość może spowodować dużą różnicę w rozmiarze elementu z jednej strony macierzy na drugą, ponieważ niektóre sondy wejdą w kontakt z powierzchnią wcześniej podczas opadania matrycy, podczas gdy inne wejdą w kontakt później lub wcale. 12 Dokładne wyrównanie jest szczególnie ważne w przypadku PPL ze względu na odkształcalność miękkich sond elastomerowych, gdzie sondy stykające się wcześniej z powierzchnią zostaną ściśnięte, pozostawiając większy ślad na powierzchni.

Wczesne prace nad PPL wykorzystywały czysto wizualną inspekcję do kierowania procesem dopasowywania, używając kamery zamontowanej nad tablicą do obserwacji deformacji sond piramidalnych podczas ich kontaktu z powierzchnią. 10 Wyrównanie oceniano poprzez obserwację, która strona sondy jako pierwsza zetknęła się z powierzchnią, a następnie dostosowanie kąta i powtarzanie procedury w sposób iteracyjny, aż różnica w kontakcie po każdej stronie sondy stała się niezauważalna dla oka. Ponieważ ta procedura wyrównywania opiera się na subiektywnej kontroli wzrokowej przez operatora, odtwarzalność jest niska.

Następnie opracowano bardziej obiektywne podejście, polegające na czujniku siły zamontowanym pod podłożem w celu zmierzenia siły przyłożonej przy kontakcie sond z powierzchnią. 12 Wyrównanie zostało osiągnięte poprzez dostosowanie kątów nachylenia w celu maksymalizacji wywieranej siły, co wskazywało, że wszystkie sondy były jednocześnie w kontakcie. Metoda ta wykazała, że możliwe jest wyrównanie z dokładnością do 0,004° powierzchni równoległej. To "wyrównywanie siłowego sprzężenia zwrotnego" zostało teraz wdrożone do w pełni zautomatyzowanych systemów w dwóch niezależnych raportach. 13,14 Oba wykorzystują triadę czujników siły zamontowanych pod podłożem lub nad tablicą i mierzą siłę wywieraną przy kontakcie między matrycami sond a powierzchnią. Systemy te zapewniają wysoką precyzję, zgłaszając niewspółosiowość ≤0,001° w skali o długości 1 cm,14 lub ≤ 0,0003° ponad 1,4 cm.13 Te zautomatyzowane systemy wyrównywania zapewniają również znaczne oszczędności czasu operatora i całkowitego czasu potrzebnego na ukończenie procesu litografii.

Jednym z głównych zastosowań wysokowydajnego wytwarzania powierzchni możliwego przez tę technologię jest generowanie substratów do hodowli komórkowych. Obecnie wiadomo, że fenotypem komórki można manipulować poprzez kontrolowanie początkowej interakcji między komórkami a cechami powierzchni, i że można to poprawić w nanoskali. 15 W szczególności, metody litografii sondą skaningową okazały się łatwą metodą do wytwarzania różnych nanofabrykowanych powierzchni dla takich eksperymentów z hodowlą komórkową. 16 Na przykład, powierzchnie prezentujące nanoskalowe wzory samoorganizujących się monowarstw i białek macierzy zewnątrzkomórkowej szablonowych przez PPL i DPN zostały wykorzystane do zbadania potencjału materiałów nanomodyfikowanych w indukowanym materiałem różnicowaniu komórek macierzystych. 17

Ten protokół opisuje wykorzystanie zmodyfikowanego systemu mikroskopu sił atomowych (AFM), który umożliwia wykonywanie PPL na dużym obszarze. Szczegółowo opisujemy wykrywanie siły za pomocą wielu czujników siły jako sposobu określania kontaktu sonda-powierzchnia, wraz z algorytmem, który automatyzuje iteracyjny proces ustawiania. Opisano późniejszą funkcjonalizację tych wzorców za pomocą białka macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyny i hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC), jako demonstrację powierzchni wytwarzanych przez PPL stosowanych do hodowli komórkowych.

Protokół

1. Produkcja tablicy piór PPL

  1. Aby przygotować mieszaninę kopolimerów polidimetylosiloksanu (PDMS):
    1. Dodać 10 μl roztworu kompleksu platyny(0)-1,3-diwinylo-1,1,3,3-tetrametylodiloksanu i 172 μl 1,3,5,7-tetrametylo-1,3,5,7-tetrawinylocyklotetrasiloksanu do 250 g (7–8 % w/w winylometylosiloksanu)-dimetylosiloksanu. Składniki te należy dokładnie mieszać w mieszalniku obrotowym przez 7 dni, aby zapewnić jednorodne wymieszanie.
      UWAGA: platyna(0)-1,3-diwinylo-1,1,3,3-tetrametylodiloksan jest toksyczna. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tym rozwiązaniem. Podczas obchodzenia się z substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
    2. Dodać 0,5 g kopolimeru (25–35 % m/m metylohydrosiloksanu)-dimetylosiloksanu do porcji 1,7 g mieszaniny z etapu 1.1.1 w łódce wagowej i dokładnie wymieszać szpatułką.
    3. Odgazowanie tej mieszaniny poprzez przeniesienie jej do eksykatora próżniowego i wystawienie mieszaniny na działanie niskiego ciśnienia (200 mTorr, 0,3 mBar) przez 20 minut, aż wszystkie pęcherzyki gazu rozproszą się.
  2. Umieść szkiełko o wymiarach 13 x 13 mm w plastikowej zakręcanej fiolce wypełnionej 20 ml 2-propanolu, a następnie umieść fiolkę w łaźni ultradźwiękowej na 10 minut, aby usunąć wszelkie duże zanieczyszczenia. Umyj szkiełka, zanurzając je w świeżym 2-propanolu (100 ml) i wysusz pod strumieniem azotu.
  3. Umieść silikonowy master18 na szalce Petriego o średnicy 4 cm i dodaj wystarczającą ilość odgazowanej mieszaniny prepolimerów PDMS (z kroku 1.1), aż do całkowitego przykrycia. Zazwyczaj do wzorca 20 x 20 mm wymagane jest 100 μl. Umieść wzorzec z mieszaniną prepolimerów w eksykatorze próżniowym. Odgazowywać polimer przez kolejne 5 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki gazu powstałe podczas przenoszenia mieszaniny. Obróbkę plazmową szkiełka podstawowe metodąO2 (krok 1.4 poniżej) należy przeprowadzić podczas odgazowywania.
  4. Potraktuj szklane kwadraty plazmąO2 (600 mTorr) o maksymalnej mocy RF przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne i wytworzyć jednolitą warstwę tlenku na szkle w celu przylegania elastomeru. 19 Natychmiast w następnym kroku użyj preparatów poddanych działaniu plazmy.
  5. Ostrożnie umieść kwadratowe szkiełko szkiełkowe (z kroku 1.4) na prepolimerze na urządzeniu wzorcowym (od kroku 1.3) stroną oczyszczoną plazmowo skierowaną w dół. Delikatnie dociśnij szklany szkiełko do silikonowego wzorca, aby usunąć uwięzione powietrze i upewnić się, że między wzorcem a szkiełkiem znajduje się jednolita warstwa PDMS.
  6. Umieść umieszczoną macierz PDMS od góry na szalce Petriego z krzemowym wzorcem na dole (tj. tyłem szkiełka skierowanego do góry) i umieść naczynie w piekarniku w temperaturze 70−80 °C na 24−48 godzin, aby termicznie utwardzić PDMS.
  7. Wyjmij utwardzoną matrycę z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia na 15 minut, a następnie za pomocą żyletki ostrożnie usuń nadmiar PDMS z tyłu i boków szkiełka i użyj strumienia suchego azotu, aby zdmuchnąć wszelkie luźne zanieczyszczenia PDMS.
    Uwaga: Uważaj, aby nie zarysować silikonowego wzorca żyletką, ponieważ może to uszkodzić powłokę zapobiegającą przywieraniu.
  8. Wciśnij żyletkę w róg matrycy na głębokość 1 mm i ostrożnie podważ matrycę od mistrza. Wykonaj tę czynność w jednej ciągłej czynności podnoszenia; Nie pozwól, aby tablice spadły z powrotem na wzorzec.
  9. Ostrożnie odetnij i zeskrob 0,5 mm PDMS na krawędziach matrycy za pomocą żyletki. Użyj strumienia suchego azotu, aby zdmuchnąć wszelkie luźne zanieczyszczenia PDMS.
    Uwaga: Łatwiejsze może być wykonanie tego kroku przycinania pod stereoskopem lub szkłem powiększającym. Uważaj, aby nie zarysować silikonowego wzorca żyletką, ponieważ może to uszkodzić powłokę zapobiegającą przywieraniu.

2. Przygotowanie macierzy i montaż podłoża

  1. Wygeneruj hydrofilową powierzchnię na matrycy sondy przez obróbkę plazmowąO2:
    1. Umieść matrycę pisaków PPL na szalce Petriego w komorze plazmowej, a następnie zastosuj próżnię do 600 mTorr. Włącz generator plazmy (ustawienie maksymalne) na 30 s.
    2. Zwolnij próżnię, wyjmij matrycę i sprawdź jej hydrofilowość, upuszczając 20 μl wody dejonizowanej na matrycę i obserwując, czy woda równomiernie rozprzestrzenia się po powierzchni. Jeśli tak się nie stanie, należy poddać matrycę drugiej rundzie obróbki osoczem. Następnie należy dokładnie wysuszyć matrycę strumieniem suchego azotu gazowego.
  2. Za pomocą dwustronnej taśmy węglowej przymocuj matrycę do środka uchwytu sondy. Zamontuj uchwyt sondy na uchwycie kinematycznym AFM (Rysunek 2).
  3. Aby załadować tablicę PPL kwasem 16-merkaptoheksadekanowym (MHA) ("farbowanie"):
    1. Przygotować 1 mM roztwór kwasu 16-merkaptoheksadekanowego (MHA), rozpuszczając 8,6 mg w 30 ml etanolu w probówce i umieszczając go w łaźni ultradźwiękowej na 10 minut, aby całkowicie rozpuścić związek.
      UWAGA: Kwas 16-merkaptoheksadekanowy jest toksyczny. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tym rozwiązaniem. Podczas obchodzenia się z substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
    2. Za pomocą mikropipety nanieść 20 μl kropli roztworu MHA na matrycę. Nie należy dopuszczać do kontaktu końcówek pipet z matrycami. Pozwól mu rozprzestrzenić się po całym układzie, a następnie pozwól etanolowi odparować w warunkach otoczenia.
      UWAGA: Tablicę PPL można alternatywnie nanieść tuszem po wykonaniu wyrównania. 10
  4. Po wyschnięciu roztworu MHA zamontuj uchwyt sondy z matrycą PPL na AFM.

3. Przygotowanie podłoży złotych dla PPL.

  1. Złote podłoża można zakupić lub wytworzyć we własnym zakresie metodą osadzania termicznego lub wiązką elektronów i są one zbudowane z warstwy adhezyjnej tytanu o długości 2 nm, a następnie 20 nm złota na płytce szklanej lub krzemowej. 18
  2. W razie potrzeby oczyścić podłoża za pomocą plazmy tlenowej, stosując parametry opisane w kroku 1.4.
  3. Umieść złoty substrat na środku stolika na próbki AFM i zabezpiecz taśmą klejącą wokół granic podłoża (Rysunek 2). Ustaw stolik na odpowiedniej wysokości, zgodnie z instrukcją obsługi producenta, za pomocą sterownika osi z.

4. Automatyczne wyrównanie tablicy piór

  1. Otwórz i uruchom stage program konfiguracyjny kontrolera (SetupNSF.exe) na komputerze, aby zresetować ("zero") wszystkie osie i kąty do wstępnie skalibrowanego punktu zerowego, a następnie użyj konsoli kontrolera osi stage x/y, aby przesunąć podłoże do żądanego wyrównania/miejsca drukowania. Aby uzyskać optymalne wyniki, podłoże należy umieścić w pobliżu środka stolika, między czujnikami siły stolika.
    UWAGA: W niektórych modelach komputerów sygnał USB kontrolera osi x/y może zakłócać sygnał z kontrolera osi z. W takim przypadku odłącz USB kontrolera osi x/y po wykonaniu tego kroku. Następnie należy go ponownie podłączyć po procedurze wyrównywania (krok 4.7).
  2. Przełącz dźwignię zwalniającą stage, aby zwolnić sample stage i aktywuj triadę czujników siły, jak wskazano w instrukcjach producenta AFM. Pozwól, aby czujniki siły osiągnęły równowagę przez co najmniej 15 minut. Aby uzyskać optymalne rezultaty, odczekaj 30-50 minut.
  3. Zwiększ wysokość osi z, aby zbliżyć matrycę do podłoża, obserwując wzrokowo układ sondy i powierzchnię.
    UWAGA: Im bliżej powierzchni znajduje się matryca, tym mniej iteracji jest wymaganych do procesu wyrównania, co pozwala zaoszczędzić czas.
  4. Otwórz/uruchom program Automatyczne wyrównywanie (Auto Alignment v16.exe) i wprowadź do niego odpowiednie parametry wyrównania.
    1. Wprowadź żądaną wartość parametru "Krok kąta", zwykle 0,15°. Ten parametr jest kątem odsunięcia od kąta "optymalnego" dla każdej osi, która jest określana przez program. Ustaw ten parametr w zakresie od 0,1 do 0,2°, ponieważ kąty mniejsze niż ten zakres nie powodują wyraźnie wykrywalnej różnicy sił przy zbliżaniu się sond do powierzchni.
      UWAGA: Oprogramowanie akceptuje wartości w milistopniach (tj. 1 x 10-3 °). Na przykład dla 0,15° użytkownicy powinni wprowadzić "150".
    2. Wprowadzanie żądanej wartości parametru kroku zgrubnego, zwykle 0,6 μm. Ten parametr jest rozmiarem kroku osi z używanym przez stolik, gdy zbliża się do sond w początkowym zgrubnym ustawieniu. Ustaw ten parametr w zakresie od 0,2 do 1 μm. Większe rozmiary stopni skracają czas potrzebny na proces osiowania, ale zmniejszają dokładność osiowania i zwiększają zużycie sond.
      UWAGA: Oprogramowanie akceptuje wartości stopni zgrubnych w mikrometrach. Na przykład dla 0,6 μm użytkownicy powinni wprowadzić "0,6".
    3. Wprowadź żądaną wartość parametru "Fine Step", zwykle 0,2 μm. Ten parametr jest rozmiarem kroku osi z używanym do precyzyjnej regulacji optymalnego wyrównania. W przypadku większości zastosowań należy ustawić ten parametr w zakresie od 0,1 do 0,4 μm. Większe rozmiary kroków wartości skracają czas potrzebny na proces wyrównywania, ale obniżają jakość wyrównania.
      UWAGA: Oprogramowanie akceptuje wartości drobnych kroków w mikrometrach. Na przykład dla 0,2 μm użytkownicy powinni wprowadzić wartość "0,2".
    4. Skonfiguruj "Ścieżkę do pliku Excel" i dołącz niezmodyfikowaną kopię dostarczonego pliku szablonu arkusza kalkulacyjnego, używając ikony "folderu", przechodząc do lokalizacji pliku i naciskając "OK". Ten plik zawiera nieprzetworzone i obliczone dane, które są używane do określenia optymalnych kątów nachylenia stołu montażowego.
  5. Otwórz/uruchom oprogramowanie sterujące AFM. Przejdź do komponentu spektroskopowego tego programu, klikając przycisk "spektroskopia" (zgodnie z instrukcjami producenta) i ustaw oś z głowicy skanującej AFM tak, aby oscylowała o 10 μm przez 100 ms, z czasem przerwy 250 ms, a następnie cofnęła się o 10 μm przez 100 ms z czasem pauzy 250 ms (Rysunek 3).
  6. Gdy głowica AFM oscyluje, kliknij przycisk "start" w oprogramowaniu do osiowania, aby rozpocząć automatyczny proces osiowania. Gdy program jest uruchomiony, zapisuje i odczytuje dane w pliku opisanym w kroku 4.4.4.
    UWAGA: Wyrównanie trwa od 30 minut do 3 godzin, w zależności od początkowej pozycji stage ustawionej w kroku 4.3 i konfiguracji oprogramowania, która została wprowadzona w kroku 4.4.
    UWAGA: Stage konsole kontrolera są nadal aktywne podczas procesu wyrównywania - nie używaj ich podczas procesu wyrównywania, ponieważ będzie to przeszkadzać w osiowaniu.
  7. Po zakończeniu wyrównywania zaświeci się zielona lampka kontrolna "Wyrównanie zakończone" w oprogramowaniu do wyrównywania (od kroku 4.4). W takim przypadku kliknij przycisk "STOP" w interfejsie użytkownika, aby zakończyć proces wyrównywania.
  8. Sprawdź wykresy w pliku szablonu arkusza kalkulacyjnego pod kątem korelacji między zarejestrowanymi punktami danych a dopasowaniem linii wygenerowanym przez oprogramowanie. Zobacz reprezentatywne wyniki, aby zapoznać się z przykładami dobrej korelacji, z typowymi wartościami R2 wynoszącymi > 0,99. Jeśli wyrównanie się nie powiedzie, wymień matrycę sondy na nowo przygotowaną matrycę (krok 2) i powtórz wyrównanie (krok 4.4).
  9. Przesuń stolik w górę na osi z za pomocą konsoli kontrolera stage dla tej osi. Stolik należy przesuwać w krokach co 500 nm, aż będzie można zaobserwować kontakt z górną kamerą view AFM. Kontakt między matrycą a podłożem można zaobserwować jako "białą kropkę" o wysokim kontraście na wierzchołku poszczególnych piramid sondy.
  10. W tym momencie kliknij przycisk "stop" w oprogramowaniu sterującym AFM, aby zatrzymać program spektroskopii od kroku 4.5. Spowoduje to cofnięcie matrycy o 10 μm, pozostawiając w ten sposób 10 μm możliwego wydłużenia osi z. Sprawdź obraz z kamery AFM z widokiem z góry, aby upewnić się, że sondy nie stykają się z podłożem.

5. Litografia piór polimerowych (PPL)

  1. Przejdź do komponentu litografii w oprogramowaniu sterującym, klikając przycisk "litografia" w oprogramowaniu sterującym. Wybierz tryb pracy modulacji z i zaimportuj obraz rastrowy (bitmapowy) lub wektorowy, który będzie używany jako wzór litograficzny. W celu wygenerowania cech pokazanych w reprezentatywnych wynikach należy użyć bitmapy składającej się z 20 x 20 czarnych pikseli (patrz materiał uzupełniający), odpowiadającej litografii siatki 20 x 20 punktów na sondę na tablicy PPL.
  2. Wprowadź parametry litografii w oknie "Import grafiki pikselowej" w oprogramowaniu kontrolera AFM.
    1. Skonfiguruj "Rozmiar" wzoru, który ma zostać wygenerowany, np. 40 μm długości i szerokości. Te parametry wskazują szerokość i długość, na jaką zostanie przeskalowany obraz w bitmapie. Aby wygenerować elementy pokazane w reprezentatywnych wynikach, należy użyć szerokości i długości 40 μm w obu wymiarach.
    2. Ustaw "Początek" wzoru, który ma zostać wygenerowany, na 25 μm zarówno na osi x, jak i y. Parametry te określają środek obrazu względem środka osi x/y AFM. Ustaw te parametry, aby uniknąć obszaru powierzchni, w którym sondy stykały się podczas procesu wyrównywania.
    3. Ustaw "Parametry" drukowania. Wartości te określają, w jaki sposób sondy mają być wysuwane (tj. stykać się z powierzchnią) w odpowiedzi na każdy piksel na obrazie bitmapowym.
      1. Wybierz z menu rozwijanego "Modulacja Abs Z Pos" i "Uprość do" dwóch warstw. Ten tryb instruuje AFM, aby rozszerzył sondy o odległość bezwzględną określoną tylko przez dwa wyniki, pola "(0)" lub "Biały (1)".
      2. Ustaw wartości w polach "(0)" i "Biały (1)" odpowiednio na 5 i -5 μm. Wartości te określają odległość, na jaką sondy powinny być przesunięte w odpowiedzi na lub biały piksel na obrazie bitmapowym i są zwykle ustawiane w zakresie od 3 do 5 μm dla "Czarnego" (tj. przedłuż sondy w dół o tę odległość w stosunku do punktu zerowego tej osi) i od -3 do -5 μm dla "Białego" (tj. Wycofać sondy w górę o 3 do 5 μm w stosunku do punktu zerowego).
        UWAGA: Te reprezentatywne odległości zakładają, że wydłużenie o 5 μm powoduje kontakt sond z powierzchnią, a tym samym wygenerowanie cechy, podczas gdy wycofanie o 5 μm podnosi sondy z powierzchni, powodując brak kontaktu. Wydłużenie Z wpływa na rozmiar elementu poprzez określenie zakresu kontaktu sondy z powierzchnią, większe wydłużenia powodują, że sondy są wciskane głębiej w powierzchnię, co skutkuje większymi elementami. 10
      3. Kliknij przycisk "OK", aby wprowadzić te ustawienia i zamknąć okno.
  3. Wprowadź "czas pauzy" w oknie litografii oprogramowania sterującego AFM, zwykle 1 s. To ustawienie określa czas, przez jaki sondy pozostają w rozszerzonej pozycji "czarnej", która jest zwykle ustawiana w zakresie od 0,1 do 10 s.
    UWAGA: Dłuższe czasy pauzy skutkują większymi rozmiarami obiektów ze względu na większą ilość MHA transportowaną na powierzchnię złota. Więcej szczegółów na temat kontrolowania rozmiaru generowanych obiektów można znaleźć w innych raportach. 20
  4. Przygotuj obudowę kontroli atmosfery.
    1. Opuść komorę izolacji atmosferycznej na AFM i otwórz/uruchom dostarczone przez producenta oprogramowanie do kontroli atmosfery (MHG_control.exe).
    2. Wprowadź te wartości do oprogramowania, aby ustawić oprogramowanie do kontroli atmosfery tak, aby utrzymywało wilgotność względną 45%, temperaturę 25 °C i "natężenie przepływu" wymiany atmosfery wynoszące 500 ml. Kliknij "Użyj", aby wprowadzić ustawienia. Moduł kontroli atmosfery zacznie wtedy pompować nawilżone powietrze do komory.
      UWAGA: Wyższe poziomy wilgotności skutkują większymi rozmiarami elementów ze względu na tworzenie się większego menisku wodnego generowanego między układami piór a powierzchnią. 21 Ta wartość jest zazwyczaj ustawiana między 40 a 60%. Natężenie przepływu jest zwykle ustawiane w zakresie od 300 do 500 ml. Większe przepływy pozwalają na szybsze osiągnięcie pożądanego poziomu wilgotności, ale są mniej dokładne. Reprezentatywne wyniki wykorzystują natężenie przepływu 500 ml do początkowego wytwarzania wilgoci i zmniejsza się do 300 ml po osiągnięciu pożądanej wilgotności, aby utrzymać dokładny i stabilny poziom podczas litografii.
  5. Po uzyskaniu żądanej wilgotności rozpocznij sekwencję litograficzną, naciskając przycisk "start" w interfejsie oprogramowania.
  6. Po zakończeniu litografii należy użyć konsoli kontrolera stopnia osi z, aby odsunąć podłoże od matrycy, cofając stolik o 500 μm. Następnie wyjmij komorę izolacji atmosferycznej z jej mocowania.
  7. Przełącz dźwignię zwalniającą stage, aby zablokować sample stage i dezaktywować czujniki siły, zgodnie z instrukcjami producenta AFM, a następnie usuń podłoże ze stolika.

6. Wizualizacja wzoru

  1. Wzory można wizualizować za pomocą jednej z następujących metod: sondy skanującej siły bocznej, mikroskopii lub trawienia chemicznego.
  2. Zeskanuj wzorzystą powierzchnię na AFM w trybie siły bocznej przy użyciu wspornika w trybie kontaktu, aby nieniszcząco zbadać elementy.
    UWAGA: Mikroskopia sił bocznych może być stosowana jako nieniszcząca metoda oglądania cech wytwarzanych przez litografię piórem polimerowym; Jednak przy użyciu tej metody można uwidocznić tylko stosunkowo niewielki obszar (zwykle 100 x 100 μm).
  3. Ponieważ zdeponowany MHA może działać jako odporność na wytrawianie, wytrawianie chemiczne może być stosowane do usuwania złota z obszarów niewzorzystych. Powstałe w ten sposób obszary bez siatki można następnie uwidocznić za pomocą mikroskopii optycznej, co oznacza, że można od razu obejrzeć duży obszar. 18
    UWAGA: Substraty, które są wytrawiane w ten sposób, nie mogą być następnie używane do kolejnych eksperymentów z hodowlami komórkowymi opisanych poniżej.
    1. Oddzielnie przygotować roztwory wodne 40 mM tiomocznika, 27 mM azotanu żelaza(III) i 100 mM kwasu solnego. Przygotuj wytrawiacz, mieszając 5 ml każdego z tych trzech roztworów. Świeżo wymieszać przed każdym użyciem. 22
      UWAGA: tiomocznik, azotan żelaza(III) i kwas solny są toksyczne. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tym rozwiązaniem. Podczas obchodzenia się z substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
    2. Przenieś wzorzyste podłoże na szalkę Petriego i odpipetuj odpowiednią ilość roztworu wytrawiającego do naczynia, aby pokryć powierzchnię podłoża (zwykle 10 ml). Trzymaj podłoże zanurzone przez 4-5 minut, aby wytrawić 15 nm złota (w przybliżeniu z prędkością 3 nm/min).
    3. Po zakończeniu trawienia usunąć podłoże i dokładnie spłukać wodą i osuszyć strumieniem azotu.
      UWAGA: Zakończenie procesu trawienia zależy od uzyskanej grubości powierzchni złota (krok 3.1) w powiązaniu z określoną szybkością trawienia (krok 6.2.2).
    4. Sprawdź wytrawione złote cechy pod mikroskopią optyczną w jasnym polu. Pozostałe złote elementy, które pozostały, powinny być zgodne ze wzorem, który został wydrukowany (z kroku 5.2). Jeśli cała powierzchnia wydaje się jednorodna, oznacza to, że pozostała znaczna ilość złota i etap trawienia (następujący po kroku 6.2.2) należy powtarzać przez 1-2 minuty.

7. Funkcjonalizacja wzorca za pomocą fibronektyny

  1. Zanurzyć wzorzyste podłoża w roztworze 1 mM (11-merkaptoundecylo)heksa(glikolu etylenowego) w etanolu na 1 godzinę. Podłoże przemyć trzykrotnie etanolem i dokładnie wysuszyć pod strumieniem azotu. Ten krok pasywuje niewzorzyste złote obszary.
    UWAGA: (11-merkaptoundecyl)heksa(glikol etylenowy) jest toksyczny. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tym rozwiązaniem. Podczas obchodzenia się z substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
  2. Zanurzyć podłoża w 10 mM roztworze wodnym Co(NO3)2 na 5 minut. Następnie usunąć podłoża z roztworu, przemyć trzykrotnie ultraczystą wodą i wysuszyć pod strumieniem suchego azotu.
    UWAGA: Co(NO3)2 jest toksyczny. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tym rozwiązaniem. Podczas obchodzenia się z substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
  3. Zanurzyć substrat w roztworze fibronektyny o stężeniu 50 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Przemyć podłoże trzykrotnie PBS, a następnie wysuszyć podłoże pod strumieniem suchego azotu.
    UWAGA: Fibronektyna jest związana z obszarami funkcjonalizowanymi przez MHA poprzez chelatację Co(II) przez końcowe grupy kwasu karboksylowego na MHA. Fibronektyna następnie wiąże się z Co(II) poprzez swoją domenę wiążącą kolagen. 23
  4. W razie potrzeby uwidocznij związaną powierzchniowo fibronektynę, oznaczając ją przeciwciałami fluorescencyjnymi:
    1. Nałożyć na powierzchnię 2 ml roztworu 1:100 niesprzężonego króliczego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko fibronektynie w 5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Odessać supernatant i przemyć trzykrotnie PBS.
    2. Zanurzyć substrat w 2 ml roztworu fluorescencyjnie sprzężonego drugorzędowego przeciwciała anty-królika (w rozcieńczeniu określonym przez producenta, 2 krople/ml) w 5% (w/v) BSA w PBS, przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Odessać supernatant i przemyć trzykrotnie PBS.
    3. Zapisać obrazy cech z mikroskopii epifluorescencyjnej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta, z filtrem wzbudzającym ustawionym na 594 nm.

8. Hodowla komórkowa na powierzchniach nanoprefabrykowanych

  1. Przygotować zawiesinę dobrze scharakteryzowanych hMSC, które znajdują się między 4. a 6. pasażem. 24
    1. Zawiesić zlewającą się kolbę komórek przez jednokrotne przepłukanie 10 ml PBS, zdysocjować przylegające komórki, dodając 5 ml trypsyny/EDTA do kolby do hodowli tkankowych T75 i inkubować kolbę w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C uzupełnionej 5% CO2 przez okres do 5 minut, aż 90% komórek zostanie oderwanych od powierzchni.
    2. Następnie dodać 6 ml świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) do kolby i krótko przepłukać kolbę z dodatkiem pożywki. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 400 g w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3 ml świeżej pożywki hodowlanej.
    4. Policz gęstość komórek za pomocą hemocytometru25 i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 2 x 104 komórek/ml poprzez dodanie odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej.
  2. Wysiewaj komórki na podłożach o gęstości 104 komórek/cm2.
    1. Pociąć podłoże na 1 x 1cm2 za pomocą rysika diamentowego i umieścić je w studzience na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
    2. Pobrać pipetą 2 ml zawiesiny komórkowej w pożywce hodowlanej (z etapu 8.1.4) do studzienki i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Po wzroście komórek na wzorcach przeanalizuj zakres przyczepiania i rozprzestrzeniania się komórek za pomocą immunofluorescencji:
    1. Usuń media i umyj podłoża raz za pomocą PBS. Utrwalić komórki 2 ml roztworu 4% paraformaldehydu w PBS (podgrzanym do 37 °C) przez 20 minut w dygestorium i przemyć trzykrotnie PBS.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tym rozwiązaniem. Podczas obchodzenia się z substancją chemiczną należy nosić sprzęt ochronny.
    2. Przepuszczać komórki 2 ml roztworu 0,5% detergentu (patrz tabela materiałów) w PBS przez 15 minut, a następnie przemyć trzykrotnie PBS.
    3. Zanurzyć substrat w 2 ml roztworu niesprzężonego pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko fibronektynie królika w rozcieńczeniu 1:100 z 5% (w/v) BSA w PBS i inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin, a następnie przemyć trzykrotnie 0,1% (v/v) Tween 20 w PBS (PBST).
    4. Następnie zanurzyć substrat w 2 ml roztworu fluorescencyjnie sprzężonego drugorzędowego przeciwciała anty-królika (rozcieńczonego 5% (w/v) BSA w PBS w rozcieńczeniu określonym przez producenta, 2 krople/ml), przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przemyć trzykrotnie 0,1% PBST.
    5. Aby oznaczyć filamenty aktynowe, zanurzyć 2 ml fluorescencyjnie sprzężonej falloidyny w rozcieńczeniu 1:250 w PBS, przykryć folią aluminiową i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, a następnie przemyć trzykrotnie PBS.
    6. Jednocześnie wybarwić jądra komórkowe i zamontować podłoże, nakładając kroplę podłoża montażowego zawierającego DAPI i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Wizualizacja komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta, z filtrami wzbudzenia 365 nm dla jąder (DAPI), 488 nm dla F-aktyny i 594 nm dla fibronektyny.

Wyniki

Aby sprawdzić, czy automatyczne wyrównanie zakończyło się sukcesem, przeanalizowano wykresy sporządzone na podstawie danych z wyrównania (znajdujących się w arkuszu z kroku 4.8). W przypadku pomyślnego procesu wyrównania oba wykresy, odpowiadające kątom nachylenia stolika z próbką wzdłuż osi θ i φ, wykazywały serię rosnących i malejących punktów danych. Na każdym z wykresów dwa dopasowania liniowe punktów danych wskazywały wyraźnie zdefiniowany „szczyt” przecięcia, oznaczający maksymalne wysunięcie w osi z oraz odpowiadający mu kąt, pod którym osiągnięto wyrównanie (Rycina 4A i 4B). Proces ten powtarza się czterokrotnie (tzn. dwukrotnie dla każdej osi) i nanosi jako zestaw czterech współrzędnych. Przecięcie każdej pary współrzędnych wskazuje zatem ogólne kąty optymalne (Rycina 4C).13 W przypadkach, gdy wyrównanie nie powiodło się, można zaobserwować, że odpowiadające im wykresy kątów θ i φ nie dają dopasowań liniowych dobrej jakości lub nie przecinają się (Rycina 5). Takie nieudane wyrównania wynikają zazwyczaj z niewłaściwego przycięcia matryc lub ich nieprawidłowego montażu w uchwycie sondy (kroki 1.7, 1.8 i 2.2). W takich sytuacjach matryce utylizowano, przygotowano i zamontowano nowe (kroki 1 i 2), a następnie powtórzono proces wyrównania (krok 4).

Po pomyślnym dopasowaniu i litografii z użyciem MHA za pomocą PPL, wzorowane podłoża złote obrazowano przy użyciu mikroskopii sił bocznych, aby sprawdzić, czy doszło do depozycji. Przeprowadzono również badanie większego obszaru nadrukowanych powierzchni za pomocą mikroskopii optycznej podłoży po trawieniu złota niechronionego przez zdeponowany tiol (Rycina 6 oraz Rycina 7). Jednakże wytrawione wzory nie mogą być wykorzystane do dalszej funkcjonalizacji i powinny służyć jedynie do potwierdzenia wzorowania na reprezentatywnych próbkach z partii podłoży powierzchniowych. Jeśli wytrawione wzory wykazują puste obszary odpowiadające poszczególnym piórom (Rycina 8), wynik ten wskazuje, że wytworzenie macierzy sond nie powiodło się i że niektóre sondy są uszkodzone lub brakujące. Ta niejednorodność sond może wynikać z użycia starej matrycy, w której powłoka perfluorowana uległa zużyciu (krok 1.3), co prowadzi do oderwania niektórych sond podczas oddzielania macierzy od matrycy. W takich przypadkach należy użyć nowej matrycy. Wynik ten może być również spowodowany obecnością pęcherzyków powietrza uwięzionych między szklaną podstawką a matrycą (krok 1.5) lub tym, że macierz sond nie została czysto oddzielona od matrycy po utwardzaniu (krok 1.8).

Wykonano również obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej hMSC inkubowanych na powierzchniach funkcjonalizowanych fibronektyną (Rysunek 9). Ogólnie wszystkie podłoża pozostały stabilne w środowisku hodowli in vitro, a komórki przylgnęły i dostosowały swoją morfologię do wydrukowanych wzorów w przypadku mniejszych, odizolowanych macierzy struktur o wymiarach 20 x 20.

Elastomerowy zestaw sond do tworzenia menisku wodnego; schemat przedstawiający zestaw sond i podłoża.
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie litografii za pomocą polimerowych piór, pokazujące transport tuszu molekularnego poprzez menisk wodny na końcówce sondy. (A) Widok z boku i (B) widok z góry zestawu polimerowych piór wskazują, że gdy zestaw sond i podłoże powierzchniowe są w pełni wyrównane, wszystkie sondy stykają się z powierzchnią jednocześnie, co prowadzi do zrównoleglenia procesu litografii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu AFM z matrycą polimerowych piór, uchwytem sondy i 5-osiową platformą pochylną do nanofabrykacji.
Rycina 2. Schemat układu do litografii polimerowym piórem. (A) Powiększony widok boczny układu eksperymentalnego, w którym przygotowana matryca sond jest przymocowana do uchwytu sondy i zamontowana w skanerze AFM. Podłoże umieszczone jest na platformie, pod którą znajdują się trzy czujniki siły. (B) Przedstawienie zmontowanej aparatury, pokazujące głowicę skanującą AFM względem platformy z próbką. (C) Widok od dołu pokazujący położenie czujników siły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres czas-przemieszczenie, 10μm, spadek/wzrost 0,1s, statyczny schemat procesu, użytek edukacyjny.
Rysunek 3. Schematyczne przedstawienie programu spektroskopowego dla procedury wyrównania. Skaner AFM jest ustawiony tak, aby przesuwać sondy w kierunku próbki o odległość 10 µm w czasie 100 ms, utrzymywać je w tej pozycji przez 250 ms, a następnie wycofać o 10 µm w czasie 100 ms i utrzymać w pozycji wycofanej przez 250 ms. Ruch ten jest powtarzany przez cały proces wyrównania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza równowagi statycznej; wykresy pozycji kątowej; punkty przecięcia; pozycje zmierzone a dopasowane.
Rycina 4. Wykresy ilustrujące prawidłowe wyrównanie. Wykresy pozycji z w funkcji kątów nachylenia (A) θ oraz (B) φ dla prawidłowego wyrównania, gdzie ● oznacza wartości zmierzone, a + oznacza najlepsze dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów. (C) Wykres dopasowanych kątów φ w funkcji θ z czterema punktami, w których osiągnięto maksymalną pozycję z. Zaznaczony punkt przecięcia to końcowy optymalny kąt nachylenia dla obu osi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres przedstawiający analizę przecięcia pozycji z w stosunku do kąta z wartościami R², danymi pomiarowymi i dopasowanymi.
Rycina 5. Wykresy ilustrujące nieudaną kalibrację osiowości. Wykresy pozycji z w funkcji kątów nachylenia (A) θ oraz (B) φ dla nieudanej kalibracji, gdzie ● oznacza wartości rzeczywiste pomiarowe, a + oznacza najlepsze dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów. (C) Wykres dopasowanych kątów φ w funkcji θ z czterema punktami, w których osiągnięto maksymalną pozycję z. Nie zaobserwowano wyraźnych optimów ani punktu przecięcia, w związku z czym nie udało się wyznaczyć optymalnych kątów kalibracji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikrografia optyczna okresowych nanowzorów; wstawka przedstawia większe powiększenie; metoda nanofabrykacji.
Rycina 6. Ilustracyjne obrazy z mikroskopii optycznej i mikroskopii sił atomowych złotych podłoży, na których naniesiono wzory z MHA za pomocą wyrównanych macierzy PPL, a następnie poddano je trawieniu. (A) i (B) to sekwencyjnie powiększone obrazy z mikroskopii optycznej wytrawionych wzorów; (C) to obraz topografii AFM pojedynczej siatki wzorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy nanostrukturyzacji, przedstawiający powtarzające się wzory kotów przy różnych powiększeniach.
Rycina 7. Ilustracyjne obrazy z mikroskopii optycznej podłoży złota, które zostały ustrukturyzowane MHA za pomocą wyrównanych macierzy PPL, a następnie trawione. (A) i (B) to sekwencyjnie powiększone obrazy z mikroskopii optycznej wytrawionych wzorów, a (C) to obraz o mniejszym powiększeniu, ukazujący jednorodne wzory na dużym obszarze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat powierzchni mikrostruktury z trawioną laserowo siatką, skala 5 µm, wskazane wysunięcie osi z.
Rysunek 8. Ilustracyjny obraz mikroskopii optycznej podłoża złota, które zostało nierównomiernie wzorowane za pomocą MHA, a następnie trawione. Zamierzone wzory (pokazane na wstawce) stanowiły powtarzające się siatki złożone z 20 linii kropek rozmieszczonych w 20 liniach, przy czym co dwie linie wysunięcie osi z zwiększano o 1 µm (w zakresie od 5 do -5 µm). Widać, że w niektórych obszarach nie powstały żadne wzory ze względu na brak sond w tych lokalizacjach. W obszarach, w których powstały tylko dwie linie kropek, wynik ten wskazuje, że sonda jest obecna, ale nie ma tej samej wysokości co sondy w pełni sprawne, więc osadza materiał tylko wtedy, gdy macierz jest wysunięta na pełną odległość osi z. Na tym obrazie kontrast został celowo zmieniony, aby umożliwić obserwację obszarów częściowo nadrukowanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia komórkowa, obrazowanie fluorescencyjne, analiza mitozy, matryca wielokomórkowa, skala 20μm-50μm.
Rycina 9. Obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej hMSC hodowanych na matrycach fibronektyny uformowanych za pomocą PPL. (A) i (B) to obrazy w dużym powiększeniu przedstawiające pojedyncze komórki. (C) pokazuje przykładowy wzór matrycy fibronektyny bez przylegającej komórki, a (D) to obraz w szerokim polu komórek hodowanych w układzie siatki (na wstawce przedstawiono również schemat nadrukowanego wzoru). Komórki są barwione w celu wykazania fibronektyny (czerwony), F-aktyny (zielony) i jąder komórkowych (niebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten służy do zapewnienia użytkownikom wygodnej metodologii szybkiego przeprowadzania wzorców nanolitograficznych o wysokiej jednorodności i kontrolowanym rozmiarze elementu na dużych (cm2) obszarach. Podłoża zawierające te wielkopowierzchniowe nanowzorce mogą być następnie dalej opracowywane pod kątem różnych zastosowań. Jednym z głównych zastosowań tej technologii jest wytwarzanie nanowytwarzanych powierzchni do badań interakcji komórka-powierzchnia. Niniejszy raport przedstawia kilka ilustracyjnych przykładów hodowli komórkowych na tych materiałach, demonstrując kontrolę morfologii hMSC za pomocą nanoprefabrykowanych substratów.

Kluczowym czynnikiem umożliwiającym ten protokół jest automatyzacja procedury dopasowywania (krok 4), która umożliwia wysoce jednorodne i wysokowydajne wytwarzanie cech na powierzchniach, aż do rozdzielczości w skali nano, co umożliwia szybki obrót eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Litografia pióra polimerowego przeprowadzona przy użyciu tego algorytmu wyrównywania jest w stanie wygenerować cechy w nanoskali w ciągu około 30 minut. Powtarzalność i dokładność automatycznego wyrównywania, a tym samym jednorodność cech wzoru, jest jednak krytycznie zależna od jakości wytwarzanych układów sond (kroki 1 i 2). Wszelkie wady w ich przygotowaniu, które skutkują, uszkodzonymi lub brakującymi sondami; takie jak uwięzione pęcherzyki powietrza (krok 1.5) lub niewłaściwe oddzielenie sond od urządzenia głównego (krok 1.8) mogą skutkować niedokładnym wyrównaniem i niską jakością litografii.

Ta zgłoszona metoda ma wspólne ograniczenie z innymi metodami wyrównywania, które opierają się na siłowym sprzężeniu zwrotnym. Dokładne określenie, kiedy sondy stykają się z powierzchnią, jest ograniczone przez konieczność uwzględnienia drgań tła spowodowanych środowiskiem otoczenia i ruchem stolika na próbkę. Ogólnie rzecz biorąc, czujniki mają czułość na siłę w reżimie μN (w tym przypadku 2 μN), ale algorytm wyrównywania jest zaprojektowany tak, aby rejestrować tylko siłę co najmniej 490 μN jako ostateczny kontakt między sondami a powierzchnią, aby uniknąć "fałszywych alarmów" wynikających z szumu tła. 13 W związku z tym metoda ta ma tendencję do wytwarzania dużych cech (1-2 μm), ponieważ sondy muszą wydłużyć dużą odległość na osi z (z wynikającą z tego większą siłą), aby zarejestrować kontakt. W celu kompensacji można uzyskać mniejsze elementy, zmniejszając odległość osi z przebytą na etapie litografii (np. wprowadzenie ustawienia "" w kroku 5.2.3.2 jako 3 μm zamiast 5 μm).

Niemniej jednak, nawet przy tym ograniczeniu, algorytm automatyzacji jest w stanie zająć się krytycznym aspektem stosowania metod litografii z równoległą sondą skanującą, ponieważ wyrównanie było wcześniej najbardziej czasochłonnym i nieprecyzyjnym krokiem we wdrażaniu tych technik. Ta automatyzacja przesuwa teraz etap ograniczania szybkości procesu produkcyjnego z wyrównania na sam zapis litograficzny. Chociaż protokół ten demonstruje zastosowanie tej procedury dostosowawczej do PPL, ramy te mogą być stosowane do wielu technik SPL, takich jak lipid-DPN26 i litografia wspomagana matrycą27 , a także do potencjalnych przyszłych systemów sond katalitycznych. 28

Oświadczenia

Algorytm i oprogramowanie wyrównania zostały opracowane przez Uniwersytet w Manchesterze i są jego własnością. Jest on dostępny do pobrania pod adresem http://www.click2go.umip.com/.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z różnych źródeł, w tym z Brytyjskiej Rady ds. Badań nad Inżynierią i Naukami Fizycznymi (nr ref. grantu. EP/K011685/1, EP/K024485/1) oraz stypendium podyplomowe dla JH; Leverhulme Trust (RPG-2014-292); Fundusz Instytucjonalnego Wsparcia Strategicznego Wellcome Trust (105610/Z/14/Z); British Council (216196834); oraz Uniwersytetowi w Manchesterze za Instytut Badawczy Uniwersytetu w Manchesterze (fundusz zalewania pompy UMRI) oraz Prezydenckie Stypendium Doktoranckie dla SW. Podziękowania za pomoc techniczną ze strony dr Andreasa Lieba (Nanosurf AG) są również wyrażane wdzięcznością.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
FlexAFM zamontowany na 5-osiowym napędzie silnikowym (XYZΘ Φ) stolik translacyjny i goniometrycznyOprogramowanieP40008
NanoSurfC3000
Długopis do grawerowaniaSigma-AldrichZ225568
Środek do czyszczenia plazmyHarrick plazmaPDC-32G-2
PlazmaHarrickPDC-FMG-2
Ekonomiczna pompa serwisowa suchego tlenuPlazma HarrickPDC-OPE-2
Rotator rurowyEksykatorSB3
Thermo Fisher Scientific5311-0250
System oczyszczania wody Milli-QMerck MilliporeZRXQ015WW
proUmidMHG32
Proline Plus Pipeta 100-1000 i mikro; LSartorius728070
Silicon mastersNIL Technologycustom-made
Pionowy mikroskop fluorescencyjny migawkowyOlympusBX51
Obiektywy mikroskopoweOlympus 10x i 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Pionowy mikroskop jasnego polaLeicaDM 2500M
UltrasonografUltrawave Sp. z o.o.U95
Arkusz kalkulacyjny do rejestrowania i analizowania wyników automatycznego wyrównywaniaMicrosoft Excel
Reodczynnik
2-propanolSigma-Aldrich34863ŁATWOPALNY
mikroskop Sildes, przezroczysty, mielonyThermo Fisher Scientific451000
(7– 8% kopolimer winylometylosiloksanu)-dimetylosiloksanu, zakończony trimetylosiloksanem, zakończony trimetylosiloksanemGelestVDT-731
1,3,5,7-tetrametylo-1,3,5,7-tetrawinylocyklotetrasiloksanGelest SIT7900.0
Roztwór kompleksu platyny(0)-1,3-diwinylo-1,1,3,3-tetrametylodiloksanuSigma-Aldrich479527SZKODLIWY, TOKSYCZNY
(25– 35% kopolimer metylohydrosiloksanu)-dimetylosiloksanu, zakończony trimetylosiloksanemGelestHMS-301
Łódź wagowa 100 mlNaukowe materiały laboratoryjneBALI828
Pipeta PasteuraAppleton WoodsKS230
Szalka PetriegoSARSTEDT82.1473
ŻyletkaThermo Fisher ScientificST10-031T
Samoprzylepna taśma węglowaAgar scientificAGG3939
Kwas 16-merkaptoheksadekanowySigma-Aldrich448303-1GSZKODLIWY, TOKSYCZNY
EtanolSigma-Aldrich34852ŁATWOPALNY
Szkiełko mikroskopowe pokryte złotemSigma-Aldrich643203Po otwarciu złoto pozostanie reaktywne z tiolami przez co najmniej 1 miesiąc
TiomocznikSigma-AldrichT8656SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Azotan żelaza(III) niewodnySigma-Aldrich529303SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Kwas solnySigma-Aldrich84415SZKODLIWY, TOKSYCZNY
(11-Merkaptoundecylo)heksa(glikol etylenowy)Sigma-Aldrich675105SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Fibronektyna z ludzkiego osoczaSigma-AldrichF0895
Azotan kobaltu(II) sześciowodnySigma-Aldrich203106SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichD8537
MSCGM Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystychLonza UKPT-3001
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzysteLonza UKPT-2501
Trypsina-EDTASigma-AldrichT4174
Wirówka Heraeus Multifuge X1Thermo Fisher Scientific75004210
Probówki wirówkowe CELLSTARGreiner Bio-One188261
ParaformaldehydFisher ScientificP/0840/53SZKODLIWY, TOKSYCZNY
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Triton X-100Sigma-AldrichT8787"Detergent" w rękopisie
VECTASHIELD Środek montażowy zapobiegający blaknięciu z wektorem DAPI LaboratoriaH-1200
Królicze przeciwciało antyfibronektynoweAbcamab2413
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Drugorzędowe, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificR37117
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA3912
12-dołkowa płytkaThermo Fisher Scientific10253041
Tkanka T75 kolbahodowlana Thermo Fisher Scientific10790113
wspornikowaBudgetSensorContAl-G
sterujące AFM NanoSurf próżniowy Stuart Modułowy generator wilgotności

Bibliografia

  1. Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501(2010).
  2. Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
  3. Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
  4. Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. "Dip-Pen" Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
  5. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
  6. Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
  7. Kim, K. -H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
  8. Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
  9. Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
  10. Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
  11. Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
  12. Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. "Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
  13. Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
  14. Noh, H., et al. "Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
  15. Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
  16. Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
  17. Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
  18. Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
  19. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
  20. Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
  21. Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography". Phys. Rev. Lett. 88, 156104(2002).
  22. Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
  23. Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
  24. Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
  25. Davey, M. R., Anthony, P. Plant Cell Culture: Essential Methods. , John Wiley & Sons. 153-172 (2010).
  26. Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
  27. Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
  28. Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Litografia za pomoc pisaka polimerowegooprogramowanie steruj ce AFMwzorcowanie pod o a z otegofunkcjonalizacja fibronektynmezenchymalne kom rki macierzystereplikacja macierzy bia kowej
Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.