Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka

20.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56985

⸱

18 października 2018

 ,  ,  , 
1Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University

W tym artykule

Podsumowanie

Myszy stanowią nieoceniony model in vivo do badania infekcji i chorób wywoływanych przez mikroorganizmy żołądkowo-jelitowe. W tym miejscu opisano metody stosowane do badania kolonizacji bakteryjnej i zmian histopatologicznych w mysich modelach choroby związanej z Helicobacter pylori.

Streszczenie

Helicobacter pylori to patogen żołądkowy, który występuje u połowy światowej populacji i jest istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u ludzi. Opracowano kilka mysich modeli zakażenia Helicobacter żołądka w celu zbadania molekularnych i komórkowych mechanizmów, za pomocą których bakterie H. pylori kolonizują żołądek ludzkiego gospodarza i powodują chorobę. W niniejszym artykule opisujemy protokoły mające na celu: 1) przygotowanie zawiesin bakteryjnych do zakażenia in vivo myszy przez zgłębnik dożołądkowy; 2) określić poziomy kolonizacji bakteryjnej w tkankach żołądka myszy za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i liczenia żywotnego; oraz 3) ocenić zmiany patologiczne za pomocą histologii. Aby ustalić zakażenie Helicobacteru myszy, zwierzęta wolne od specyficznych patogenów (SPF) są najpierw inokulowane zawiesinami (zawierającymi ≥105 jednostek tworzących kolonie, CFU) kolonizujących myszy szczepów Helicobacter pylori lub innych żołądkowych Helicobacter spp. od zwierząt, takich jak Helicobacter felis. W odpowiednich punktach czasowych po zakażeniu żołądki są wycinane i cięte strzałkowo na dwa równe fragmenty tkanki, z których każdy składa się z antrum i obszarów ciała. Jeden z tych fragmentów jest następnie wykorzystywany do liczenia żywotnych lub ekstrakcji DNA, podczas gdy drugi jest poddawany obróbce histologicznej. Kolonizacja bakteryjna i zmiany histopatologiczne w żołądku mogą być oceniane rutynowo w skrawkach tkanki żołądka barwionych barwnikami Warthin-Starry, Giemsa lub Hematoksylina i Eozyna (H&E), w zależności od przypadku. Dodatkowe analizy immunologiczne można również przeprowadzić za pomocą immunohistochemii lub immunofluorescencji na wycinkach tkanki żołądka myszy. Opisane poniżej protokoły zostały specjalnie zaprojektowane, aby umożliwić ocenę u myszy patologii żołądka przypominających te w chorobach H. pylori związanych z ludźmi, w tym zapaleniu, zaniku gruczołów i tworzeniu się pęcherzyków limfatycznych. Przygotowanie inokulum i protokoły dongastric gaveline mogą być również dostosowane do badania patogenezy innych jelitowych patogenów ludzkich, które kolonizują myszy, takich jak Salmonella Typhimurium lub Citrobacter rodentium.

Wprowadzenie

Helicobacter pylori to spiralny, Gram-ujemny, ludzki patogen żołądka, obecny we wszystkich populacjach na całym świecie, z wskaźnikami infekcji w krajach rozwijających się szacowanymi na rzędu 80%1. Chociaż większość osób zakażonych H. pylori przechodzi chorobę bezobjawowo, u niektórych rozwijają się poważniejsze choroby, od wrzodów trawiennych po raka żołądka2. Nowotwory związane z H. pylori charakteryzują się głównie złośliwymi zmianami w komórkach nabłonka (GEC) lub tworzeniem pozawęzłowych tkanek limfatycznych w żołądku, co prowadzi odpowiednio do gruczolakoraka żołądka lub chłoniaka tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową (MALT). H. pylori jest wysoce przystosowany do przetrwania w surowej niszy ekologicznej żołądka ze względu na obecność różnych czynników wirulencji i mechanizmów ułatwiających jego przyleganie, wzrost i metabolizm w tej niszy. W szczególności zjadliwe szczepy H. pylori posiadają 40 kb cag Wyspę Patogenicity (cagPAI), która koduje około 30 genów wymaganych do produkcji systemu wydzielania typu 4 (T4SS)3,4. CagSzczepy H. pylori PAI-dodatnie są związane z indukcją wyższych poziomów przewlekłego stanu zapalnego u gospodarza, który został uznany za niezbędny prekursor gruczolakoraka żołądka5.

Modele zwierzęce in vivo, szczególnie myszy, dostarczyły wielu informacji, umożliwiając badaczom zbadanie względnego wpływu czynników gospodarza, bakterii i środowiska na infekcję H. pylori i wynik choroby6. Badania wykazały wcześniej, że przedłużające się zakażenie H. pylori u myszy na tle genetycznym C57BL/6 powoduje rozwój przewlekłego zapalenia żołądka i atrofii gruczołów, które są cechami charakterystycznymi infekcji H. pylori7. Ponadto wykazano, że zakażenie pokrewnym gatunkiem bakterii kotów/psów, H. felis, indukuje tworzenie MALT u myszy z podobną patologią i progresją choroby, jak obserwowano w ludzkim chłoniaku MALT8,9. Najczęściej stosowanym izolatem H. pylori w badaniach kolonizacji myszy jest szczep "Sydney Strain 1" (SS1) sup class<="xref">10, który jest cagPAI+, ale ma niefunkcjonalny T4SS (T4SS−)11. Inne szeroko stosowane szczepy to H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 i X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. W przypadku zakażeń H. felis zwykle stosuje się szczep CS1 ("Cat Spiral 1", cagPAI-/T4SS−) 14.

Niniejszym udostępniamy protokół opisujący przygotowanie inokuli Helicobacter do infekcji in vivo, procedurę wewnątrzżołądkowego głębnika myszy, a także metody przetwarzania tkanek do badania zmian histopatologicznych w żołądku. W szczególności w artykule skupimy się na metodach histologicznych stosowanych do wizualizacji kolonizacji bakteryjnej i oceny zmian histopatologicznych, w tym tworzenia MALT, w błonie śluzowej żołądka zakażonych myszy. Niektóre z opisanych tutaj metod mogą być zaadaptowane do badania innych patogenów jelitowych, takich jak S. Typhimurium lub C. rodentium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost i przygotowanie inokulacji bakteryjnej

  1. Rozmrozić zapasy glicerolu H. pylori lub H. felis15 od -80 °C i subkulturę na płytkach z agarem z krwią końską (HBA) zawierających: Blood Agar Base No.2 (patrz Tabela Materiałów); zmodyfikowany "Skirrow's antibiotic selective supplement" (składający się z wankomycyny, 10 μg/ml; polimyksyna B, 25 ng/ml; trimetoprim, 5 μg/ml; amfoterycyna B, 2,5 μg/ml); i 5–10% (v/v) krwi końskiej 15,16. Bakterie dobrze rozwijają się w warunkach mikrotlenowych w słoikach beztlenowych o pojemności 2,5 lub 3,5 litra zawierających odpowiednie pakiety gazowe (patrz tabela materiałów), w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Szczepy H. pylori uprawiane w tych warunkach muszą być subhodowane po 1–1,5 dniu inkubacji, podczas gdy w przypadku H. felis zazwyczaj wymagane są co najmniej 2 dni inkubacji. Odpowiednie podłoża do hodowli i przechowywania zostały szczegółowo opisane wcześniej15.
  2. Przygotować inokulum bakteryjne do zakażenia myszy z kultur wczesnej i środkowej fazy logarytmicznej. Delikatnie zbierz bakterie z płytek agarowych, zalewając każdą płytkę 1-2 ml bulionu z naparu z serca (BHI). Odessać zawiesiny z płytek za pomocą pipet Pasteura.
    1. Alternatywnie, przygotuj inokulum z bakterii Helicobacter, które zostały rozmnożone w bulionie BHI przez 16–18 h15. W takim przypadku bakterie należy zbierać przez wirowanie na niskiej prędkości przy 2 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Oceń żywotność i ruchliwość bakterii, badając preparaty do montażu na mokro pod mikroskopią kontrastu fazowego (obiektyw 100X). Przygotuj mokre mocowania, ponownie zawieszając pętlę bakterii w kropli bulionu BHI o objętości 10–20 μl na szklanym szkiełku mikroskopowym. W przypadku H. felis, która jest znacznie większą bakterią niż H. pylori, należy użyć hemocytometru, aby dokładnie policzyć liczbę żywotnych bakterii. Potwierdź czystość hodowli, wykonując barwienie metodą Grama.
    UWAGA: Inokula H. pylori należy stosować tylko wtedy, gdy większość bakterii ma kształt pałeczki lub spirali (morfologia może się różnić w zależności od szczepu). Szczepionka H. felis powinna zawierać przede wszystkim bakterie o spiralnym kształcie. Nie używaj inokulantu, jeśli większość bakterii ma morfologię kokoidalną, ponieważ te formy nie są żywotne i nie wywołają infekcji u myszy.
  4. Oszacuj liczbę bakterii w inokulum, licząc pod mikroskopią z kontrastem fazowym przybliżoną liczbę bakterii na pole (obiektyw 100X) i korzystając z następującego przewodnika: 1 bakteria na pole = około 106 jednostek tworzących kolonie (CFU) Helicobacter/ml; 10 bakterii na pole = około 10,7 jtk/ml; 100 bakterii na pole = około 10,8 jtk/ml, itd.
    1. W przypadku korzystania z hemocytometru należy obliczyć jtk/ml według następującego wzoru:
      CFU/ml = (średnia liczba bakterii w polu 4 x 4) x (współczynnik rozcieńczenia) x (10:4).
  5. Dostosuj gęstość komórek bakteryjnych inokulum do około 107–108 jtk/ml przez rozcieńczenie w bulionie BHI, jeśli to konieczne.
    1. Aby zapewnić maksymalną żywotność bakterii, należy jak najszybciej po przygotowaniu użyć inokulantu do zgłębnika żołądkowego.
    2. Gęstość i żywotność komórek H. pylori należy zawsze potwierdzać, przeprowadzając żywotne liczenie inokuli natychmiast po procedurze zgłębnika (patrz poniżej). Nie zawsze jest to możliwe w przypadku H. felis, ponieważ zwykle nie tworzy izolowanych kolonii na pożywkach hodowlanych. Liczba żywotnych bakterii Helicobacterw inokulach nie może być określona za pomocą samego pomiaru gęstości optycznej (A600), ponieważ metoda ta nie rozróżnia bakterii żywotnych (tj. pałeczek / spiralnych / spiralnych) i nieżywotnych (tj. kokoidalnych).
    3. Wartości gęstości optycznej należy stosować do szacowania liczby żywotnych bakterii H. pylori w inokulach, ale w tym przypadku najpierw konieczne jest wygenerowanie krzywej wzrostu. W tym celu wartości A600 w kulturach H. pylori są monitorowane w czasie i bezpośrednio korelowane z liczbą żywotnych bakterii, określaną przez liczenie płytek.
      UWAGA: Dogodną metodą wykonywania takich oznaczeń krzywej wzrostu jest hodowla bakterii w płynnym podłożu (sekcja 1.2), przy użyciu standardowych płaskodennych kolb do hodowli tkankowych umieszczonych w inkubatorze o stężeniu 10% CO2 . Liczby CFU, określone na podstawie podwielokrotności kultur otrzymywanych co 4–6 godzin przez 2–3 dni, są następnie porównywane z odpowiadającymi im wartościami A60017. Co ważne, dla każdego szczepu H. pylori należy wygenerować krzywe wzrostu, ponieważ mogą one rosnąć w różnym tempie, a ponadto nie wszystkie szczepy dobrze rosną w 10% CO2 .

2. Zgłębnik śródżołądkowy myszy z Helicobacter

UWAGA: Ta metoda podawania do żołądka może być stosowana do innych gatunków bakterii, które kolonizują jelita, np. S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.

  1. Użyj 6-8-tygodniowych, wolnych od specyficznych patogenów (SPF) i wolnych od Helicobacter samców lub samic myszy. Do eksperymentów z zakażeniem H. pylori lub H. felis należy wykorzystać zwierzęta z tłem genetycznym C57BL/6. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy myszy typu dzikiego (WT) i genetycznie zmodyfikowane C57BL / 6 pozbawione kluczowego wrodzonego receptora odpornościowego (określane jako zwierzęta knock-out lub KO).
    Uwaga: Myszy na innych podłożach genetycznych mogą być również wykorzystywane do infekcji Helicobacter, jednak na poziom kolonizacji i nasilenie choroby może mieć wpływ typ tła żywiciela18,19.
  2. Odessać inokulum bakteryjne (krok 1.5) do jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml i zastąpić dostarczone igły igłami o rozmiarze 23, na które przymocowane są jednorazowe cewniki polietylenowe (długość, 6–8 cm; średnica wewnętrzna, 0,58 mm). Przymocuj cewniki do igieł, nakładając małe paski folii z tworzywa sztucznego (patrz Tabela materiałów). Alternatywnie wymień zespół igły/cewnika na sterylne plastikowe rurki do karmienia (rozmiar 20 x 38 mm).
  3. Fizycznie krępuj myszy mocnym uściskiem karku i ogona.
    UWAGA: Zabieg ten można wykonać bez znieczulenia lub alternatywnie z użyciem wziewnego środka znieczulającego, takiego jak metoksyfluran lub izofluran15.
  4. Wprowadź cewnik do środka otwartej szczęki i poprowadź w kierunku doogonowym w kierunku przełyku. Przedłuż szyję myszy, aby umożliwić łatwy dostęp do żołądka przez przełyk (i z dala od tchawicy), aż większość lub całość cewnika przestanie być widoczna i wyczuwalny będzie opór, odpowiadający podstawie żołądka. Dostarczyć określoną porcję, zwykle 100 μl na inokulację (Rysunek 1).
    UWAGA: Myszy powinny być karmione ≥ 105 CFU, aby zapewnić optymalną kolonizację i patologię choroby.
  5. Myszy trzymane w pomieszczeniach dla zwierząt z filtrem SPF na czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Ciężką patologię i gruczolakoraka u myszy WT C57BL/6 obserwuje się dopiero po około 24 miesiącach od infekcji20. Jednak efekt ten może być przyspieszony u niektórych zwierząt modyfikowanych genetycznie lub u myszy z innym pochodzeniem genetycznym.
  6. Po zakończeniu procedury zgłębnika należy wykonać modyfikację techniki Milesa i Misry, aby określić liczbę żywotnych bakterii H. pylori podawanych myszom. W tym celu inokulum jest seryjnie rozcieńczane (od 10−1 do 10−5) w BHI przy użyciu metody opisanej szczegółowo wcześniej15.
    UWAGA: W celu zapewnienia izolacji pojedynczych kolonii, płytki HBA należy przed użyciem podgrzać i wysuszyć w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 10–15 minut.

3. Pobieranie tkanek od myszy po eksperymencie

  1. Eutanazja myszy przez wdychanie dwutlenku węgla lub zwichnięcie szyjki macicy, zgodnie z odpowiednią komisją etyczną ds. eksperymentów na zwierzętach.
  2. Otwórz jamę brzuszną i wytnij żołądek za pomocą cienkich, zakrzywionych nożyczek.
    UWAGA: Surowice można również pobrać przez nakłucie serca, aby pomóc w badaniu odpowiedzi ogólnoustrojowych na zakażenie Helicobacter. Ponadto zbiór śledziony i węzłów chłonnych przyżołądkowych jest przydatny w badaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych.
  3. Przeciąć żołądek wzdłuż większej krzywizny i usunąć resztki jedzenia, delikatnie myjąc w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówkach o pojemności 50 ml.
  4. Ponownie umyć żołądek w sterylnym PBS, a następnie zarejestrować mokrą masę za pomocą wytarowanej plastikowej szalki Petriego o średnicy 6 cm.
  5. Spłaszcz żołądek i rozetnij strzałkowo na dwa równe fragmenty tkanki, z których każdy zawiera: antrum, ciało i niegruczołowe obszary przedbrzucha (Ryc. 2). Usuń obszar niegruczołowy i zważ po połowie każdego żołądka przed dodaniem do 1 ml sterylnego BHI (do liczenia żywotnego) lub szybkiego zamrożenia w ciekłym azocie (do ekstrakcji DNA/RNA).
    Uwaga: Probówki zawierające tkankę w BHI muszą być przechowywane na lodzie do czasu, gdy będą gotowe do przetworzenia. Zamrożone tkanki żołądka mogą być również używane do ekstrakcji RNA lub białek odpowiednio do qPCR (ilościowego PCR) lub analiz western blot.
  6. Dodaj drugą połówkę żołądka do 15 ml probówki zawierającej 10% formaliny. Zanurz tkanki w 10% formalinie na 10 sekund, a następnie spłaszcz do górnej strony probówek. Pozwól tkankom się utrwalić przed ponownym zanurzeniem w 10% roztworze formaliny na co najmniej 24 godziny < / > UWAGA: Tkanki mogą pozostawać w 10% formalinie przez wiele tygodni przed przetworzeniem do badania histologicznego. Długotrwałe przechowywanie tkanki może jednak wpływać na jej architekturę i/lub antygenowość, co skutkuje nieoptymalnymi wynikami w dalszych analizach.

4. Potwierdzenie kolonizacji bakteryjnej w żołądku po zakażeniu

  1. Żywotne liczenie H. pylori w żołądku
    1. Uzupełnij sterylne płytki HBA dodatkowymi antybiotykami (200 μg/ml bacytracyny i 10 μg/ml kwasu naladiksynowego) przed wykonaniem liczenia kolonii z zakażonych żołądków myszy16.
    2. Homogenizować skrawki żołądka ręcznie, używając autoklawowalnych mikrotłuczków polipropylenowych lub za pomocą mechanicznego przyrządu do dysocjacji (patrz Tabela materiałów).
    3. Przygotować podwójne seryjne rozcieńczenia (10−1 do 10−2) powstałych homogenatów żołądkowych w sterylnym BHI.
      UWAGA: Decyzję o rozcieńczeniach należy podjąć na podstawie typowych ładunków bakteryjnych uzyskanych dla danego szczepu H. pylori stosowanego do zakażenia, a także czasu trwania infekcji. Można również stosować próbki nierozcieńczone.
    4. Podziel wstępnie wysuszone płytki HBA (patrz uwaga powyżej) na trzy lub cztery segmenty. Korzystając z adaptacji techniki Milesa i Misry, dodaj 10–100 ml każdego rozcieńczenia na segment płytki agarowej i rozprowadź za pomocą sterylnych plastikowych pętli15.
    5. Pozostaw talerze do wyschnięcia, a następnie umieść je w pozycji odwróconej (pokrywką do dołu) w słoikach z gazem beztlenowym. Aby utrzymać wilgotność w słoikach, dołącz szalkę Petriego zawierającą wodę.
    6. Inkubować słoiki w temperaturze 37 °C, aż utworzą się kolonie (zwykle 4–7 dni).
    7. Wylicz segment(y) zawierający od 10 do 100 izolowanych kolonii.
      UWAGA: Kolonie H. pylori i wzrost H. felis na płytkach można odróżnić od innych członków mysiej mikrobioty żołądka za pomocą standardowych testów ureazy, katalazy i oksydazy. H. pylori i H. felis są dodatnie we wszystkich trzech testach.
    8. Obliczyć miano bakteryjne jako (jtk/g tkanki), stosując następujący wzór:
      [(Średnia liczba zliczonych kolonii) × (współczynnik rozcieńczenia) x (objętość platerowana)]/(masa żołądka).
  2. Wykrywanie zakażenia H. felis w tkankach żołądka za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
    1. Wyodrębnij DNA z żołądków myszy przy użyciu standardowych protokołów izolacji DNA lub dostępnego na rynku zestawu.
    2. Oznaczyć stężenie DNA w próbkach za pomocą fluorometrycznej techniki ilościowej (patrz tabela materiałów).
    3. Ustaw reakcje PCR ukierunkowane na 325-par zasad (bp) fragment genu B H. felis ureaza B (ureB)21. Każda reakcja powinna zawierać: 100 ng genomowego DNA; po 1 mM spłonek do przodu (5'-AAA, ATC, CAC, GAA, GAC, GG-3') i do tyłu (5'-CTT, TTA, TCC, AAG, TGG, TGG, CAC ACC-3'); 200 mM dNTP; 0,5 jednostki polimerazy Taq i odpowiednie ilości wody wolnej od i nukleaz.
      UWAGA: Ta para oligonukleotydów została zaprojektowana do rozpoznawania i wiązania się z sekwencjami homologicznymi zarówno w genach H. pylori, jak i H. felis ureB, ale po poddaniu ich poniższym warunkom PCR, a nie tym, które są obecne w genach moczowych jelita Helicobacter spp.
    4. Przeprowadzić amplifikację PCR przy użyciu następującego profilu termicznego: ogrzewanie w temperaturze 94 °C przez 5 minut, a następnie 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 61 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę, przed utrzymaniem w temperaturze 20 °C.
    5. Uruchom produkty PCR na 2% żelu agarozowym przez 30 minut przy napięciu 100 V.

5. Analizy histologiczne wycinków żołądka myszy zakażonych Helicobacter

  1. Przetwarzanie tkanek żołądka
    1. Usuń tkanki żołądka z formaliny i umieść na czystych szalkach Petriego.
    2. Pokrój tkanki żołądka skalpelem na kilka podłużnych pasków o równej wielkości (każdy o grubości 2-3 mm) i umieść w oznaczonych kasetach do zatapiania zawierających piankową wyściółkę.
    3. Napraw tkanki żołądka, umieszczając kasety do zatapiania w słoiku wypełnionym 80% etanolem.
      UWAGA: Żołądki mogą być przetwarzane natychmiast lub przechowywane do 1-2 dni przed przejściem do następnego kroku.
    4. Przetwarzaj żołądki na automatycznym procesorze tkanek, zaprogramowanym z następującymi ustawieniami:
      Odwodnienie: 70% etanol - 1 cykl, 20 min; 90% etanol - 1 cykl, 20 min; 100% etanol - 2 cykle po 20 min + 1 cykl, 40 min + 1 cykl, 1 godz.
      Oczyszczanie: ksylen – 2 cykle po 30 min + 1 cykl, 45 min.
      Impregnacja: wosk parafinowy w temp. 60 °C - 1 cykl, 45 min + 1 cykl, 1 h + 1 cykl, 1,25 h.
    5. Wyjmij przetworzone próbki z maszyny i przechowuj w temperaturze pokojowej w celu zatopienia parafiny.
  2. Parafinowe osadzanie przetworzonych tkanek żołądka
    1. Umieść formy bazowe ze stali nierdzewnej na stoliku jednostki zatapiającej, aby ogrzać podstawy form.
      UWAGA: Maszyna do zatapiania powinna być ustawiona na 60 °C, aby zapewnić wydajne zatapianie parafiny.
    2. Umieść woskowane kasety zawierające próbki w ciepłej kąpieli woskowej/gorącej płycie jednostki zatapiania, aż wosk całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Zaleca się, aby próbka została osadzona wkrótce po rozpuszczeniu wosku. Dzięki temu nie dochodzi do stwardnienia tkanek.
    3. Napełnij połowę form ze stali nierdzewnej woskiem parafinowym. Za pomocą ciepłych kleszczy usuń paski tkanki żołądka z kaset i delikatnie przepchnij paski żołądkowe przez parafinę do podstawy foremek. Ostrożnie ustaw paski tkanek pod kątem prostym do podstawy foremek, tak aby ich pokrojone końce były skierowane do góry.
      UWAGA: Poniższe czynności należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć stwardnienia i oddzielenia warstw parafiny w osadzonych blokach. Właściwa orientacja tkanek żołądka ma kluczowe znaczenie dla dalszych analiz.
    4. Umieść formy na zimnej płycie jednostki zatapiającej, aby zamocować próbki na miejscu i w razie potrzeby ponownie zorientować tkanki.
      UWAGA: Jeśli tkanki zostaną usunięte, a parafina zacznie twardnieć, umieść formy z powrotem na gorącej płycie, aby stopić wosk i ponownie zatopić tkanki w formach.
    5. Umieść połowę oznaczonych kaset do zatapiania (które były używane do przetwarzania tkanek) na wierzchu foremek i delikatnie wypełnij ciepłym woskiem. Nie dopuścić do przelania się parafiny.
    6. Delikatnie umieść foremki na zimnej płycie i pozostaw do ostygnięcia.
    7. Gdy parafina całkowicie stwardnieje, oddziel osadzone bloki od form. Nadmiar wosku parafinowego oczyścić z krawędzi kasety za pomocą płyty grzejnej (ustawionej powyżej 80 °C) lub skrobaka. Bloki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu wykonania cięcia.
  3. Cięcie tkanek
    1. Schłodzić bloki tkanek zatopione w parafinie na lodzie i podgrzać łaźnię wodną wypełnioną ultraczystą wodą do 40–45 °C.
    2. Zamocuj ostrze w uchwycie mikrotomu i ustaw kąt przyłożenia w zakresie 1–5°, aby zapobiec kontaktowi między powierzchnią bloku a fasetą noża, przed włożeniem bloków parafinowych.
      UWAGA: Upewnij się, że bloki są wolne od nadmiaru parafiny uzyskanej z zatapiania, ponieważ może to utrudnić dopasowanie bloku.
    3. Ustaw ostrze tak, aby cięło prosto w poprzek bloku. Delikatnie wytnij 2–3 cienkie sekcje, aby zapewnić prawidłowe ułożenie bloku.
    4. Bloki przycinania o grubości około 10–30 mm. Ten krok zapewnia, że maksymalna powierzchnia każdego paska tkanki zostanie wycięta.
    5. Wytnij odcinki o grubości 10 μm i odrzuć te, które zawierają spowodowane przycinaniem.
    6. Ostrożnie podnieś skrawki za pomocą pęsety i zanurz je w łaźni wodnej w celu spłaszczenia. Użyj pęsety, aby oddzielić każdą sekcję.
    7. Zebrać skrawki z łaźni wodnej i umieścić na naładowanych szkiełkach podstawowych (patrz Tabela Materiałów).
    8. Szkiełka należy przechowywać w pozycji pionowej na stojaku na szkiełka i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Suche sekcje przez noc.
    9. Skrawki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony do późniejszych analiz.
  4. Barwienie tkanek żołądka hematoksyliną i eozyną (H&E)
    1. Odwoskuj szkiełka za pomocą 3 płukań ksylenu przez 5 minut każde, a następnie 3 prania w 100% etanolu, po 3 minuty każde. Upewnij się, że na każdym etapie używane są świeże roztwory.
    2. Płucz szkiełka w wodzie z kranu przez 30–60 s.
    3. Usuń nadmiar wody, delikatnie stukając w spód szkiełek o ręcznik papierowy. Barwienie przefiltrowaną hematoksyliną przez 3 min. Upewnij się, że sekcje są wystarczająco pokryte roztworem.
    4. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu, aż woda będzie czysta.
    5. Zanurz zjeżdżalnie w wodzie Scott's Tap na 8–10 sekund. Nie wystawiaj szkiełek na działanie roztworu dłużej niż 10 sekund, ponieważ spowoduje to ciemniejsze i intensywniejsze plamy. Barwienie skrawków można oglądać pod mikroskopem. Skuteczne barwienie na tym etapie spowoduje uzyskanie koloru "baby blue".
      UWAGA: Przygotuj wodę Scott's Tap, rozpuszczając 2 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 20 g siarczanu magnezu (MgSO4) w 1 l wody destylowanej.
    6. Płucz szkiełka w wodzie z kranu przez 30–60 s.
    7. Usuń nadmiar wody zgodnie z opisem w kroku 3, a następnie zacej z przefiltrowaną 1% wodną Eozyną przez 3 minuty.
    8. Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu, aż woda będzie czysta.
      UWAGA: Zabarwienie można ocenić za pomocą mikroskopu świetlnego. Jeśli barwienie jest zbyt ciemne, szkiełka można odwodnić w 100% etanolu przez czas dłuższy niż określony. Jeśli wymagane jest ciemniejsze barwienie, szkiełka można barwić Eozyną przez 1–2 minuty dłużej, przed przejściem do kolejnych kroków.
    9. Odwodnić szkiełka za pomocą 3 płukań 100% etanolu przez 30 s każde, a następnie 3 prania ksylenu przez 2 minuty każde. Upewnij się, że na każdym etapie używane są świeże roztwory.
    10. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego. Dodaj kroplę podłoża montażowego na środku czystego szkiełka nakrywkowego przed delikatnym umieszczeniem szkiełka na wierzchu sekcjami skierowanymi w dół.
      UWAGA: Nie suszyć szkiełek przed zsunięciem okładki.
    11. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Szkiełka można również suszyć w dygestorium, aby przyspieszyć czas schnięcia.
  5. Giemsa Barwienie tkanek żołądka
    1. Odwoskuj szkiełka za pomocą 2 płukań histolenu przez 5 minut każde, następnie 2 płukania 100% etanolem przez 3 minuty każde, a następnie końcowe płukanie w 70% etanolu przez 3 minuty. Upewnij się, że do każdego prania używane są świeże roztwory.
    2. Płucz szkiełka w wodzie z kranu przez 30–60 s.
    3. Przygotuj roztwór Giemsa, mieszając 20% barwnika Giemsa z 80% wodą destylowaną. Szkiełka bejcowe z roztworem Giemsa przez 1 h.
    4. Umieść szkiełka w 100 ml wody destylowanej zawierającej 3-4 krople kwasu octowego na 2-3 s.
      UWAGA: Roztwór należy dobrze wymieszać przed użyciem. Na tym etapie slajdy powinny mieć bladoniebieski kolor.
    5. Myj szkiełka w 96% etanolu przez 30 s.
    6. Myć szkiełka w 3 kąpielach izopropanolu przez 2 minuty każda, a następnie w 3 kąpielach histolenu przez 2 minuty każda. Do każdego prania używaj świeżego izopropanolu i histolenu.
    7. Szkiełka nakrywkowe z medium montażowym, jak opisano wcześniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje technikę gavage'u doustnego w celu wywołania zakażenia wewnątrzżołądkowego H. pylori lub H. felis w mysich modelach zwierzęcych (Rycina 1). Po eutanazji żołądki są usuwane, ważone i dzielone na 2 równe połowy obejmujące antrum, trzon oraz obszary niegruczołowe tkanek żołądka (Rycina 2). Przed przystąpieniem do jakichkolwiek analiz usuwa się obszar niegruczołowy.

Pomyślną kolonizację zwierzą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje zastosowanie mysiego modelu in vivo w przypadku zakażenia Helicobacter . Krytycznymi etapami procedury są: 1) przygotowanie inokuli Helicobacter zawierającej żywe i ruchliwe bakterie; 2) dostarczenie myszi odpowiedniej ilości bakterii przez zgłębnik żołądkowy; 3) wykrywanie infekcji bakteryjnej poprzez zliczanie kolonii i/lub PCR; oraz 4) przetwarzanie tkanek żołądka w celu umożliwienia oceny histopatologii w zakażonych żołądkach. Dalsze sugestie dotyczące modyfikacji, rozw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Pani A. De Paoli i Pani Georgie Wray-McCann za pomoc techniczną. Autorzy potwierdzają korzystanie z udogodnień i pomocy technicznej Monash Histology Platform, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University. Laboratorium jest finansowane przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) dla RLF (APP1079930, APP1107930). RLF jest wspierany przez Senior Research Fellowship od NHMRC (APP1079904). KD i MC są wspierane przez stypendia dla absolwentów Monash. KD jest również wspierany przez Centrum Odporności Wrodzonej i Chorób Zakaźnych, Hudson Institute of Medical Research, podczas gdy MC ma międzynarodowe stypendium podyplomowe na Wydziale Medycyny, Pielęgniarstwa i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Monash. Badania w Hudson Institute of Medical Research są wspierane przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki bakteriologiczne
Oxoid Blood Agar Base No.2Thermo Fischer ScientificCM0271BRozpuścić w deinonizowanej wodzie przed sterylizacją Premium Defibrynowana
krew końskaAustralijskie etyczne środki biologicznePDHB100
Bulion naparowy z mózgu Bacto Brain BDBioscience237500Rozpuścić w wodzie deinonizowanej przed sterylizacją
Pakiety gazowe CampyGenThermo Fischer ScientificCN0035A/CN0025A
Odczynniki histologiczne
Formalin, neutralnie buforowane, 10%Sigma AldrichHT501128
Alkohol absolutny, 100% denaturatChemSupplyAL048-20L-P
Izopropanol (2-propanol)Merck100995
Ksylen (bez siarki)ChemSupplyXT003-20L
Mayer's HaematoxylinAmber ScientificMH-1LFiltr przed użyciem
Eozyna, Barwnik wodnyAmber ScientificEOCA-1LFiltr przed użyciem
Wright-Giemsa Stain, modyfikowanySigma AldrichWG80-2.5LRozcieńczyć przed użyciem (20% Giemsa, 80% woda dejonizowana)
HistoleneGrale Scientific11031/5
DPX podłoże montażoweVWR1.00579.0500
Odczynniki do biologii molekularnej
Qubit dsDNA BR Assay KitThermo Fischer ScientificQ32850
OligonukleotydySigma AldrichTemperatura wyżarzania ureB starterów użytych w tym badaniu wynosi 61 ° C
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM8291Zestaw zawiera 10x bufor PCR i chlorek magnezu
dNTPBiolineBIO-39028Rozcieńczyć do 10 mM w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz przed użyciem
Agaroza klasy cząsteczkowejBiolineBIO-41025
Wodorowęglan soduUnivar (Ajax Fine Chemicals)A475-500G
Magnez Siarczan HeptahydratChem-SupplyMA048-500G
Antybiotyki
VancomycinSigma AldrichV2002-1GRozpuścić w wodzie dejonizowanej
Polimyksyna BSigma AldrichP4932-5MURozpuścić w wodzie dejonizowanej
Trimetoprim (≥ 98% HPLC)Sigma AldrichT7883Rozpuszcza się w 100% (absolutnym)
AmfoterycynaAmresco (Astral Scientific)E437-100MGRozpuszcza się w wodzie dejonizowanej
Bacytracyna z Bacillus licheniformisSigma AldrichB0125Rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej
Kwas naladiksowySigma AldrichN8878Rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej
Inne odczynniki
Methoxyfluran (Pentrhox)Medical Developments InternationalNie dotyczy
Wosk parafinowyParaplast Plus, Leica Biosystems39601006
Sprzęt i wyroby z tworzyw sztucznych
Oxoid Słoiki anaeroboweThermo Fischer ScientificHP0011/HP0031
Pipety Pasteura COPANUsługi Interpath200CS01
Eppendorf 5810RZbieraj granulki bakteryjne przez wirowanie przy 2,200 obr./min przez 10 minut przy 4 stopniach; C
23 g precyzyjna igła ślizgowaBD Bioscience301805
Parafilm MBemis, VWRPM996
Rurki polietylenowe o drobnych otworach PortexSmiths Medical800/100/200
Plastikowe cewniki do karmieniaInstech  LaboratoriaFTP20-30
1 ml tuberkulina luer slip jednorazowe strzykawkiBD Bioscience302100
Mikrotłuczek Eppendorf do probówek 1,2 - 2 mlSigma AldrichZ317314Autoklawowalne tłuczki polipropylenowe używane do homogenizacji
żołądka GentleMACs DisocjatorMiltenyi Biotec130-093-235Użyj wstępnie ustawionych programów gentleMACS dla tkanki żołądka myszy
Rurki M (pomarańczowa nasadka)Miltenyi Biotec30-093-236
Fluorometr kubitowyThermo Fischer ScientificQ33216
Sterylna plastikowa pętlaLabServLBSLP7202
Zimna płyta, system osadzania Leica EG1160Leica BiosystemsNie dotyczy
Tissue-Tek Base Mold System, Base Mold 38 x 25 x 6Sakura, Alphen aan den Rijn4124
Tissue-Tek III Uni-Casette SystemSakura, Alphen aan den Rijn4170
Microtome, Leica RM2235Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus Szkiełkapodstawowe Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific4951PLUS4
etanolu Wirówka

Bibliografia

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396(2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Helicobacter pylorizaka enie o dkazg bnik do o zkowykolonizacja bakteryjnaopracowanie histologiczneliczenie ywych kom rekreakcja a cuchowa polimerazybarwienie metod Warthina Starry egowolne od okre lonych patogen w
Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.