Tutaj prezentujemy protokół opisujący prosty model pomostowania krążeniowo-oddechowego bez transfuzji lub środków inotropowych u szczura. Model ten pozwala na badanie długoterminowych wielonarządowych następstw krążenia pozaustrojowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Regeneracyjny model krążenia pozaustrojowego bez transfuzji lub środków inotropowych u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Krążenie pozaustrojowe (CPB) jest niezbędne w chirurgii sercowo-naczyniowej. Pomimo radykalnego udoskonalenia techniki i urządzeń CPB, powikłania wielonarządowe związane z przedłużonym CPB nadal pogarszają wyniki operacji sercowo-naczyniowych i mogą pogorszyć zachorowalność i śmiertelność pooperacyjną. Modele zwierzęce podsumowujące kliniczne zastosowanie CPB umożliwiają wyjaśnienie procesów patofizjologicznych zachodzących podczas CPB i ułatwiają badania przedkliniczne w celu opracowania strategii chroniących przed tymi powikłaniami. Modele CPB u szczurów są korzystne ze względu na ich większą opłacalność, wygodne procesy eksperymentalne, liczne metody testowania na poziomie genetycznym lub białkowym oraz spójność genetyczną. Mogą być wykorzystywane do badania aktywacji układu odpornościowego i syntezy cytokin prozapalnych, aktywacji komplementarnej i produkcji wolnych rodników tlenowych. Modele szczurów zostały udoskonalone i stopniowo zajęły miejsce modeli dużych zwierząt. W tym miejscu opisujemy prosty model CPB bez transfuzji i/lub środków inotropowych u szczura. Ten model odzyskiwania pozwala na badanie długoterminowych wielonarządowych następstw CPB.
Wprowadzenie
W 1953 roku dr John H. Gibbon Jr. z powodzeniem przeprowadził pierwszą operację kardiochirurgiczną przy użyciu CPB1, a następnie stała się ona niezbędną metodą w chirurgii sercowo-naczyniowej. Chociaż techniki i urządzenia zostały radykalnie udoskonalone, powikłania wielonarządowe związane z CPB nadal wpływają negatywnie na wyniki operacji sercowo-naczyniowych i mogą wpływać na zachorowalność i śmiertelność pooperacyjną2. Uszkodzenie narządów związane z CPB jest spowodowane aktywacją układu odpornościowego i syntezą cytokin prozapalnych, aktywacją komplementu i produkcją wolnych rodników tlenowych2. Jego patofizjologia nie została jednak w pełni wyjaśniona.
Modele zwierzęce podsumowujące kliniczne zastosowanie CPB umożliwiają wyjaśnienie procesów patofizjologicznych w trakcie i po CPB; może to ułatwić badania przedkliniczne w opracowywaniu strategii unikania tych powikłań. Ponieważ Popovic i wsp. po raz pierwszy zgłoszono model CPB dla szczurów w 1967 roku3, modele CPB dla szczurów zostały udoskonalone i stopniowo zajęły miejsce modeli dużych zwierząt ze względu na większą opłacalność, wygodne procesy eksperymentalne i mnóstwo metod testowania poziomów genetycznych i białkowych. Ponadto wsobne szczury mogą być genetycznie identyczne, co zmniejsza możliwe błędy biologiczne.
Fabre et al. jako pierwsi stworzyli model odzyskiwania, który pozwolił na badanie długoterminowych wielonarządowych następstw CPB4. Zaletami tego prostego modelu przeżycia są elastyczność (przepływ i czas trwania CPB), stabilny stan życiowy i odtwarzalność w ogólnoustrojowym zapaleniu. Modele CPB u szczurów stały się kluczowe dla badania strategii terapeutycznych, które mają na celu zapobieganie urazom wielonarządowym podczas CPB5, a ostatnio opracowano różne modele do symulacji sytuacji klinicznych podczas CPB. De Lange i wsp. Opracował model zatrzymania krążenia, który może być wykorzystany do scharakteryzowania reakcji enzymatycznych, genetycznych i histologicznych związanych z uszkodzeniem mięśnia sercowego7. Peters i wsp. zaaranżowany zawał mięśnia sercowego i kontrolowana reperfuzja przy użyciu zminiaturyzowanego modelu CPB do analizy dysfunkcji serca poprzez ogniskowe niedokrwienie i uszkodzenie reperfuzyjne8. Jungwirth i wsp. po raz pierwszy opracowano model głębokiego hipotermicznego zatrzymania krążenia (DHCA), który może wyjaśnić globalne uszkodzenie niedokrwienia i reperfuzji przez DHCA oraz wspiera potencjalne strategie neuroprotekcyjne6. Badania z użyciem DHCA badają wpływ hipotermii, reperfuzji i/lub zdarzeń sygnalizacyjnych wywołanych hemolizą9. Głęboka hipotermia może wpływać na aktywację i inaktywację różnych enzymów i szlaków, a mechanizmy pozostają nieznane10. Z drugiej strony, modele zatrzymania krążenia lub modele niedokrwienia serca muszą być używane do badania niedokrwienia i reperfuzyjnego uszkodzenia serca. Te różne modele CPB u szczurów, które w dużym stopniu podsumowują ludzki CPB, mogą ujawnić patologiczne procesy związane z CPB i pomóc złagodzić powikłania związane z CPB.
Ten protokół demonstruje prosty model CPB bez transfuzji lub środków inotropowych u szczura. Model ten pozwala na badanie długoterminowych wielonarządowych następstw CPB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przed eksperymentem, wszystkie szczury powinny mieć tydzień na aklimatyzację. Wszystkie zabiegi chirurgiczne na zwierzętach powinny być przeprowadzane zgodnie z Przewodnikiem opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowaniem (www.nap.edu/catalog/5140.html) lub innymi odpowiednimi wytycznymi etycznymi. Przed przystąpieniem do dalszych czynności protokoły powinny zostać zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt w odpowiedniej instytucji. Wszystkie kolejne zabiegi muszą być wykonywane w warunkach aseptycznych.
1. Przygotowanie obwodu CPB
Uwaga: Nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary i czysty płaszcz lub jednorazowy fartuch.
- Konfiguracja obwodu CPB
- Połącz rurki z polichlorku winylu ze zbiornikiem żylnym, wstępnie zaprojektowanym dla obwodu CPB, i zmodyfikowanym natleniaczem membranowym noworodka, jak pokazano na Rysunek 1. Upewnij się, że wszystkie połączenia są szczelne i nie przecieka woda.
- Ustawić obwód CPB do urządzenia pompy rolkowej zgodnie z protokołami producenta.
- Trzymaj pompę rolkową na stole o regulowanej wysokości i wyreguluj wysokość stołu do 10 cm poniżej stołu doświadczalnego.
- Gruntowanie obwodu CPB
- Zmieszać 12 ml roztworu skrobi hydroksyetylowej z 0,1 ml heparyny i 0,5 ml 7% roztworu wodorowęglanu sodu w celu zalania obwodu CPB.
- Zalać obwód 11 ml roztworu zalewającego, delikatnie obracając wałek pompy. Włóż igłę odpowietrzającą o rozmiarze 18 do zbiornika, aby odpowietrzyć powietrze.
- Uderz kilka razy w natleniacz membranowy, aby odpowietrzyć, przechylając natleniacz. Powietrze musi być całkowicie zasłonięte, aby uniknąć zatoru powietrznego i niedostatecznego natlenienia. Podczas zalewania obwodu podgrzej obwód za pomocą elektrycznej lampy grzewczej umieszczonej na zbiorniku.
2. Procedura przed CPB
UWAGA: Pole operacyjne i urządzenia powinny być zdezynfekowane 70% alkoholem lub czwartorzędowym związkiem amoniowym przed użyciem.
- Znieczulenie i otoczenie zwierząt
- Znieczulij szczura za pomocą 3,0% inhalacji powietrza z domieszką izofluranu w waporyzatorze. Umieść szczura na stanowisku roboczym i zaintubuj kaniulę o rozmiarze 16 do tchawicy. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji zwierząt dotyczącymi dawkowania i częstotliwości stosowania środka przeciwbólowego (np.
buprenorfina 0,005 mg/kg s.c.)
UWAGA: Szczury muszą być w głębokim znieczuleniu i tracić odruchy. Oddech powinien być rytmiczny, ale nie powinien być zatrzymany. - Przenieś szczura na stół operacyjny wyposażony w elektryczną poduszkę grzewczą. Rozpocznij wentylację mechaniczną od 8 ml/kg objętości oddechowej, częstości oddechów 70 cykli/min i 30% wdychanej frakcji tlenu monitorowanej przez czujnik tlenu.
- Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1,5-2,0% izofluranu i dodatkowego podawania ketaminy/ksylazyny na początku CPB.
- Monitoruj temperaturę w odbycie za pomocą sondy doodbytniczej. Utrzymuj normotermiczną temperaturę ciała na poziomie 37 °C, regulując temperaturę poduszki grzewczej i umieszczając obwód nad lampą grzewczą.
- Ustaw szczura w pozycji leżącej na plecach i rozciągnij cztery kończyny, mocując igłami. Monitoruj tętno, ustawiając igłę elektrody EKG na obustronnym ramieniu i lewym brzuchu. Umieść wilgotną gazę lub nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
- Znieczulij szczura za pomocą 3,0% inhalacji powietrza z domieszką izofluranu w waporyzatorze. Umieść szczura na stanowisku roboczym i zaintubuj kaniulę o rozmiarze 16 do tchawicy. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji zwierząt dotyczącymi dawkowania i częstotliwości stosowania środka przeciwbólowego (np.
- Kaniulacja
- Po zdezynfekowaniu powierzchni całego ciała przez spryskanieprzez rozpylenie 70 % etanolu lub innego roztworu antyseptycznego, ogolić włosy maszynką do golenia w obustronnej okolicy pachwinowej i prawej okolicy szyjki macicy. Przed wykonaniem nacięcia skóry należy zastosować środki miejscowo znieczulające (takie jak lidokaina). UWAGA: Alternatywnie zamiast sprayu do całego ciała zawierającego 70% etanol można zastosować chirurgiczny peeling miejsca nacięcia, aby uniknąć spadku temperatury ciała.
- Naciąć skórę (około 5 mm) w obustronnych okolicach pachwinowych i prawej okolicy szyjnej nożyczkami i tępo wyciąć tkanki, aby odsłonić prawą główną tętnicę udową. Ostrożnie oddziel tętnicę od żyły i nerwu w pobliżu. Podwiązać na końcu wspólnej tętnicy udowej przez jedwab 4-0 i ekspozycję przez napięcie.
- Przeciąć ścianę tętnicy (około 1 mm) prawej tętnicy udowej wspólnej za pomocą mikronożyczek w kierunku prostopadłym do tętnicy i ostrożnie wprowadzić cewnik dożylny o rozmiarze 24 od nacięcia na głębokość 1 cm w celu monitorowania ogólnoustrojowego ciśnienia tętniczego i analizy ciśnienia parcjalnego gazu we krwi tętniczej.
- Podawać heparynę sodową (500 j.m./kg) z cewnika.
- Wykonaj kroki 2.2.2 i 2.2.3, aby wprowadzić cewnik dożylny o rozmiarze 24 do lewej tętnicy udowej wspólnej jako linię infuzji tętniczej dla obwodu CPB.
- Wprowadzić angiocewnik wielootworowy o rozmiarze 17 do prawej żyły szyjnej wewnętrznej i wprowadzić go do prawego przedsionka i żyły głównej dolnej (IVC). Nie należy mocno naciskać cewnika, ponieważ naczynie może łatwo pęknąć. Podłącz cewnik do obwodu CPB w celu drenażu żylnego.
- Przykryj każdy kaniulowany obszar wilgotną gazą, aby uniknąć zanieczyszczenia.
3. Procedura podczas CPB
- Dostarczyć 100% tlenu gazowego do oksygenatora z prędkością 0,8 l/min podczas CPB i zmniejszyć częstość oddechów do 30 cykli/min. Ciśnienie parcjalne tlenu w tętnicach wynosi od 200 do 400 mmHg.
- Na początku CPB zwiększ ustawienie temperatury poduszki grzewczej do maksimum, 42 °C, aby złagodzić natychmiastowy spadek temperatury ciała po zainicjowaniu CPB. Ustaw temperaturę na 37 °C, gdy temperatura ciała powróci do 36 °C.
- Ostrożnie uruchomić przepływ CPB i zwracać uwagę na objętość krwi w zbiorniku. Pusty zbiornik może spowodować zator powietrzny. Jeśli objętość krwi w zbiorniku zmniejszy się, zmniejsz przepływ pompy, regulując wysokość stołu lub zmieniając położenie cewnika drenażowego. Nie należy ponownie zakładać cewnika do drenażu żylnego, ponieważ może to łatwo spowodować perforację prawego przedsionka i/lub arytmię.
- Zwiększ i utrzymuj przepływ pompy na poziomie 100 ml/kg/min, podczas gdy średnie ciśnienie krwi utrzymuje się na poziomie 70 mmHg. Gdy utrzymywane jest odpowiednie ciśnienie krwi, dopuszczalna jest niewielka objętość co najmniej 1 ml w zbiorniku. Jeśli w zbiorniku jest mniej niż 1 ml krwi, może to spowodować zator powietrzny w narządach.
- Jeśli ciśnienie krwi jest niestabilne, dodaj 2-3 ml roztworu gruntującego do obwodu (może to spowodować niedokrwistość po CPB).
4. Procedura po CPB
- Zacisnąć rurkę drenażu żylnego i wyjąć ją z obwodu. Pozostałą krew w obwodzie należy stopniowo wprowadzać do tętnicy, aby utrzymać ciśnienie krwi.
- Zwiększ częstość oddechów do 70 cykli/min.
- Usuń cewnik do drenażu żylnego i lewy cewnik tętniczy, a następnie podwiązaj naczynie w miejscu bliższym i dalszym.
- Usunąć linię tętniczą z prawej tętnicy udowej 60 minut po zakończeniu CPB.
- Oczyść każdą ranę solą fizjologiczną i zamknij ranę szwami.
- Zakończ znieczulenie i ekstubuj rurkę dotchawiczą po sprawdzeniu spontanicznego oddechu zwierzęcia.
- Podawaj podgrzane sterylne płyny izotoniczne i używaj maty grzewczej i elektrycznej lampy grzewczej, aby utrzymać zwierzęta w cieple. Często sprawdzaj stan zwierzęcia, aż do wyzdrowienia ze znieczulenia. W razie potrzeby zapewnij wsparcie oddechowe. UWAGA: Gdy zwierzę zacznie się poruszać, źródło ciepła należy usunąć z części klatki, aby zwierzę mogło wybrać ciepłą lub chłodną stronę.
- Trzymaj zwierzę z dala od towarzystwa innych zwierząt, aż do całkowitego odzyskania oddychania. Nie zwracaj zwierzęcia do firmy do czasu pełnego wyzdrowienia.
- Sprawdź spożycie pokarmu i wody po wyzdrowieniu ze znieczulenia i zapewnij odpowiednie wsparcie żywieniowe. Podawaj leki przeciwbólowe i sprawdzaj, czy nie ma oznak dyskomfortu lub bólu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia cały układ CPB. Zmienne fizjologiczne w tym modelu pokazano na Rycini 2; obejmują one temperaturę rektalną, średnie ciśnienie tętnicze oraz częstotliwość akcji serca. Rycina 3 przedstawia analizy gazometryczne krwi tętniczej podczas CPB, w tym ciśnienie parcjalne tlenu w krwi tętniczej, ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla w krwi tętniczej, hematokryt, nadwyżkę zasad, stężenie pot...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym szczurzym modelu CPB poziomy ekspresji cytokin zapalnych i HMGB-1 w surowicy i płucach dramatycznie wzrosły po CPB. Wcześniejsze badania kliniczne wykazały, że wydzielanie HMGB-1 w surowicy jest podwyższone u pacjentów poddawanych operacji sercowo-naczyniowej11, a szczytowy poziom HMGB-1 w surowicy podczas CPB był związany z cięższym zespołem układowej odpowiedzi zapalnej i upośledzeniem utlenowania płuc po CPB12. Ponadto poziom HMGB-1 w surowicy jest niezależnym biom...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia na temat wsparcia komercyjnego.
Podziękowania
Podziękowania należą się Dr. T. Taki i Dr. M. Funamoto za ich wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wentylator gryzoni 7025 | Ugo Basile | 7025 | Wentylator |
| OxiQuant B | ENVITEC | 46-00-0023 | Czujnik tlenu |
| CMA 450 Regulator temperatury | CMA | 8003759 | Regulator temperatury |
| CMA 450 Poduszka grzewcza | CMA | 8003763 | |
| CMA 450 Sonda doodbytnicza | CMA | 8003761 | |
| DIN(8) do Jednorazowy przetwornik ciśnienia krwi | ADInstruments | MLAC06 | |
| Jednorazowy przetwornik ciśnienia krwi | ADInstruments MLT0670 | ||
| IX-214 Rejestrator danych | iWorx Systems | Wzmacniacz IWX-214 | |
| Oprogramowanie LabScribe Oprogramowanie | iWorx Systems | ||
| Pompa rolkowa | Furue Science | Model Pompa RP-VT | |
| Happy Cath | Medikit | EB 19G 4HCLs PP | 17-gwiedźowy cewnik naczyniowy |
| SURFLO ETFE IV | Cewnik naczyniokątny | Terumo | SR-OX2419CA |
| Natleniacz | Mera | HPO-002 | |
| Obwód CPB | Mera | wykonany | |
| roztwór płynu Hespander | Fresenius Kabi | 3319547A4035 | Skrobia hydroksyetylowa |
Bibliografia
- Gibbon, J. H. Application of a mechanical heart and lung apparatus to cardiac surgery. Minn Med. 37 (3), 171-185 (1954).
- Apostolakis, E., Filos, K. S., Koletsis, E., Dougenis, D. Lung dysfunction following cardiopulmonary bypass. J Cardiac Surg. 25 (1), 47-55 (2010).
- Popovic, P., Horecky, J., Popovic, V. P. Instrumental responses in rats after hypothermic cardiopulmonary by-pass. P Soc Exp Biol Med. 126 (1), 225-228 (1967).
- Fabre, O., et al. A recovery model of partial cardiopulmonary bypass in the rat. Perfusion. 16 (3), 215-220 (2001).
- Hirao, S., Masumoto, H., Minatoya, K. Rat cardiopulmonary bypass models to Investigate multi-organ injury. Clin Surg. 2, 1-6 (2017).
- Jungwirth, B., et al. Neurologic outcome after cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest in rats: description of a new model. J Thorac Cardiov Sur. 131 (4), 805-812 (2006).
- de Lange, F., Yoshitani, K., Podgoreanu, M. V., Grocott, H. P., Mackensen, G. B. A novel survival model of cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass in rats: a methodology paper. J Cardiothorac Surg. 3, 51(2008).
- Peters, S., et al. An experimental model of myocardial infarction and controlled reperfusion using a miniaturized cardiopulmonary bypass in rats. Interact Cardiovasc Th. 19 (4), 561-564 (2014).
- Engels, M., et al. A cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest rat model for the investigation of the systemic inflammation response and induced organ damage. J Inflamm. 11 (26), (2014).
- Pinto, A., et al. The extracellular isoform of superoxide dismutase has a significant impact on cardiovascular ischaemia and reperfusion injury during cardiopulmonary bypass. Eur J Cardio-Thorac. 50 (6), 1035-1044 (2016).
- Zhang, Z., Wu, Y., Zhao, Y., Xiao, X., Liu, J., Zhou, X. Dynamic changes in HMGB1 levels correlate with inflammatory responses during cardiopulmonary bypass. Exp Ther Med. 5 (5), 1523-1527 (2013).
- Kohno, T., et al. Impact of serum high-mobility group box 1 protein elevation on oxygenation impairment after thoracic aortic aneurysm repair. Heart Vessels. 26 (3), 306-312 (2011).
- Tseng, C. C., et al. Impact of serum biomarkers and clinical factors on intensive care unit mortality and 6-month outcome in relatively healthy patients with severe pneumonia and acute respiratory distress syndrome. Dis Markers. 2014, (2014).
- Paparella, D., Yau, T. M., Young, E. Cardiopulmonary bypass induced inflammation: pathophysiology and treatment. An update. Eur J Cardio-Thorac. 21 (2), 232-244 (2002).
- Hirao, S., et al. Recombinant human soluble thrombomodulin prevents acute lung injury in a rat cardiopulmonary bypass model. J Thorac Cardiov Sur. , In Press. (2017).
- Yamazaki, S., Inamori, S., Nakatani, T., Suga, M. Activated protein C attenuates cardiopulmonary bypass-induced acute lung injury through the regulation of neutrophil activation. J Thorac Cardiov Sur. 141 (5), 1246-1252 (2011).
- Wang, C. T., Zhang, L., Wu, H. W., Wei, L., Xu, B., Li, D. M. Doxycycline attenuates acute lung injury following cardiopulmonary bypass: involvement of matrix metalloproteinases. Int J Clin Exp Patho. 7 (11), 7460-7468 (2014).
- Liu, K., et al. Curcumin attenuates cardiopulmonary bypass-induced lung oxidative damage in rats. J Cardiovasc Pharm T. 17 (4), 395-402 (2012).
- Taki, T., et al. Fetal mesenchymal stem cells ameliorate acute lung injury in a rat cardiopulmonary bypass model. J Thorac Cardiov S. 153 (3), 726-734 (2017).
- Zhu, X., et al. Establishment of a novel rat model without blood priming during normothermic cardiopulmonary bypass. Perfusion. 29, 63-69 (2014).
- Inoue, K., et al. Deep anesthesia worsens outcome of rats with inflammatory responses. Inflamm Res. 65 (7), 563-571 (2016).
- Bradfield, J. F., Schachtman, T. R., McLaughlin, R. M., Steffen, E. K. Behavioral and physiologic effects of inapparent wound infection in rats. Lab Anim Sci. 42 (6), 572-578 (1992).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
