Test behawioralny do badania roli pamięci przestrzennej podczas instynktownej obrony u myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje test behawioralny, oparty na teście labiryntu Barnesa, w celu zbadania, jak instynktowne działania obronne są modyfikowane przez wiedzę o środowisku przestrzennym.

Streszczenie

Ewolucja wybrała repertuar zachowań obronnych, które są niezbędne do przetrwania u wszystkich gatunków zwierząt. Zachowania te są często stereotypowymi działaniami wywoływanymi w odpowiedzi na wrodzone awersyjne bodźce sensoryczne, ale ich sukces wymaga wystarczającej elastyczności, aby dostosować się do różnych środowisk przestrzennych, które mogą się szybko zmieniać. W tym miejscu opisujemy test behawioralny w celu oceny wpływu wyuczonej wiedzy przestrzennej na zachowania obronne u myszy. Dostosowaliśmy szeroko stosowany test pamięci przestrzennej labiryntu Barnesa, aby zbadać, w jaki sposób myszy nawigują do schronienia podczas reakcji ucieczki na wrodzone awersyjne bodźce czuciowe w nowym środowisku i jak przystosowują się do ostrych zmian w środowisku. Ten nowy test jest paradygmatem etologicznym, który nie wymaga szkolenia i wykorzystuje naturalne wzorce eksploracji i strategie nawigacyjne u myszy. Sugerujemy, że opisany tutaj zestaw protokołów jest potężnym środkiem badania zachowań ukierunkowanych na cel i nawigacji wyzwalanej przez bodźce, które powinny być interesujące zarówno dla dziedzin zachowań instynktownych, jak i pamięci przestrzennej.

Wprowadzenie

Instynktowne zachowania obronne są w dużej mierze uważane za wbudowane w bodźce reakcje, takie jak ruch C-start u ryb i, który odsuwa zwierzę od źródła zagrożenia¹. Jednak zachowania obronne mogą być bardziej adaptacyjne, jeśli elastycznie uwzględniają informacje zdobyte na temat bieżącego środowiska. Jednym z przykładów takiej elastyczności jest przejście od ucieczki do zamrożenia wykazywane przez gryzonie w obliczu zagrożenia, w zależności od wcześniejszej wiedzy na temat obecności lub braku schronienia w środowisku^2,3. Inne przykłady elastyczności w zachowaniach wrodzonych obejmują dostosowanie progu rozpoczęcia lotu lub prędkości ucieczki w zależności od odległości między ofiarą a jej schronieniem⁴, odległość do zagrożenia^5,6 i poprzednie doświadczenie^11,12, a także wybór różnych strategii obronnych w zależności od właściwości sensorycznych bodźca awersyjnego⁷, a nawet tłumienie zachowań obronnych w obliczu konkurencyjnych motywacji, takich jak głód^8,9,10. Zależność doboru działań od nabytej wiedzy o cechach przestrzennych środowiska sprawia, że instynktowne zachowania obronne u myszy są potężnym modelem do badania wyboru celów, pamięci przestrzennej i nawigacji. W tym miejscu opisujemy adaptację powszechnie stosowanego zadania behawioralnego, testu pamięci przestrzennej labiryntu Barnesa (BM) ¹³, w celu określenia wpływu środowiska przestrzennego na wybór działań obronnych u myszy i ich strategie nawigacyjne podczas ucieczki w kierunku schronienia.

Standardowy labirynt Barnesa używany do badania uczenia się i pamięci przestrzennej u myszy składa się z okrągłej platformy o średnicy ~90 cm z 20 równomiernie rozmieszczonymi otworami, z których 19 jest zamkniętych, a jeden prowadzi do podziemnego schronienia, którego myszy szukają, aby uniknąć otwartego środowiska platformy. Często słabe bodźce awersyjne (brzęczyk, jasne światło, wentylator) są używane w sposób ciągły przez cały czas trwania testu, aby środowisko było awersyjne, a tym samym ułatwiało wejście do schronu¹⁴. W najczęściej używanym teście^15,16, zwierzę przechodzi jedną próbę habituacji, w której jest kierowane do schroniska ręcznie przez eksperymentatora natychmiast po umieszczeniu na platformie. Po tym następuje 4-dniowy okres akwizycji, w którym każdego dnia mysz może swobodnie poruszać się po labiryncie przez 3 minuty, po czym jest ponownie ręcznie kierowana do schronu, jeśli nie dotrze do niego w okresie eksploracji. Ostatnim etapem testu jest jedna próba sondy w^piątym dniu (chociaż często przeprowadza się również próbę długotrwałej pamięci siedmiodniowej), podczas której zwierzę eksploruje labirynt z zamkniętymi wszystkimi otworami. Uczenie się i pamięć długotrwała są określane ilościowo na podstawie czasu potrzebnego na znalezienie schronienia i wkłucia w niewłaściwe otwory w okresie akwizycji oraz czasu spędzonego w pobliżu zamkniętego otworu w schronieniu w próbie sondy. Typowe wyniki wskazują na zmniejszenie liczby błędów i opóźnień w dotarciu do schronu podczas namierzania oraz ponadprawną proporcję czasu spędzonego w kwadrancie zawierającym zamknięty otwór docelowy w próbie sondy¹⁵.

Chociaż kilka wariantów testu BM zostało już wcześniej opisanych^17,18,19, paradygmat, który tutaj opisujemy, ma trzy fundamentalne zmiany w stosunku do standardowego testu. Po pierwsze, zwierzę pozostawia się do samodzielnego zbadania labiryntu i znalezienia schronienia, a testy są wykonywane podczas tej samej sesji, wkrótce po znalezieniu schroniska, w okresach, w których zwierzę jest zaangażowane w zachowania eksploracyjne. Chociaż to ustawienie nie testuje pamięci długotrwałej lokalizacji schronienia, zostało zaprojektowane jako naturalistyczny scenariusz, który naśladuje eksplorację nowego terytorium pod groźbą drapieżnictwa. Ponadto umożliwia badanie, w jaki sposób zwierzęta przystosowują się do gwałtownych zmian w środowisku, takich jak nagłe zmiany krajobrazu. Po drugie, kluczowym aspektem naszego testu jest to, że eksperymentator nigdy nie zmusza zwierzęcia do wejścia lub wyjścia ze schroniska, co może zdezorientować zwierzę i wykluczyć integrację ścieżki²⁰ jako realną strategię nawigacji²¹. Integracja ścieżki to strategia nawigacyjna, która wykorzystuje sygnały samoruchu, takie jak wskazówki proprioceptywne i przedsionkowe, wynikające z integracji odpływu motorycznego, aby zaktualizować aktualną pozycję zwierzęcia i nawigować w kierunku celu, co nie jest możliwe, jeśli zwierzę jest biernie poruszane przez eksperymentatora. Po trzecie, używamy wrodzonych awersyjnych bodźców visual²² i auditory²³, aby wywołać ucieczkę do schronienia, co można łatwo odróżnić od trwających zachowań związanych z żerowaniem i pozwala na ocenę i kwantyfikację konkretnych strategii nawigacyjnych stosowanych podczas obrony przed bezpośrednimi zagrożeniami. Proponujemy, że ten test będzie przydatny do analizy roli pamięci przestrzennej w selekcji i realizacji zachowań obronnych, a bardziej ogólnie do szerszego badania nawigacji ukierunkowanej na cel i krótkotrwałej pamięci przestrzennej. Opisane tutaj protokoły zostały wprowadzone przez Vale'a i wsp. w 2017 roku, do którego odsyłamy czytelników w celu bardziej szczegółowego omówienia przesłanek eksperymentów i wyników.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 roku (PPL 70/7652) po uzyskaniu lokalnej zgody etycznej.

1. Ustawianie aparatu behawioralnego

UWAGA: Głównym elementem aparatu behawioralnego jest wariant labiryntu Barnesa¹³ składający się z białej akrylowej okrągłej platformy (92 cm średnicy) z 20 równoodległymi, 5 cm średnicy, okrągłymi otworami, umieszczonymi promieniście, 5 cm od krawędzi platformy. 19 z nich należy zamknąć czarną plastikową zatyczką (głębokość 5 mm), podczas gdy pozostały otwór prowadzi do czarnego schronu z pleksiglasu (wymiary 15 x 5,8 x 4,7 cm), do którego myszy mogą łatwo wchodzić i wychodzić. Centralna część areny składa się ze stałej okrągłej platformy (o średnicy 22 cm), a obrzeża są zamontowane na ramie, która umożliwia obrót o 360 stopni za pomocą sterowanego komputerowo silnika krokowego. Platforma jest podniesiona na wysokość 45 cm od podłogi, aby zapobiec schodzeniu myszy w dół. Zobacz schematyczny rysunek w Rysunek 1.

1. Umieść wskazówki wizualne na obrzeżach platformy (symbole 2D lub 3D o różnych kształtach, kolorach i wzorach), w odległości co najmniej 2 cm od krawędzi, aby myszy nie mogły do nich dotrzeć.
   UWAGA: Przykładami wskazówek wizualnych są zwykłe niebieskie kwadraty o długości 262^cm2 lub koła (o średnicy 15,5 cm) wypełnione ukośnymi fioletowymi paskami.
2. Dodaj ~2 g ściółki z domowej klatki myszy do wnętrza schronienia, aby służyła jako lokalna wskazówka węchowa. Opcjonalnie umieść diodę elektroluminescencyjną (LED) przy wejściu do schronu, aby zapewnić lokalną wizualną wskazówkę dotyczącą punktu orientacyjnego.
3. Aby odizolować mysz od zewnętrznych, dystalnych sygnałów wizualnych, zamontuj ośmiokątną lub cylindryczną ścianę, wystającą 40 cm powyżej i 15 cm pod powierzchnią platformy, wokół areny, umieszczoną w odległości 10 cm od krawędzi platformy.
4. Umieść głośnik ultradźwiękowy 50 cm nad środkiem platformy, aby dostarczać awersyjne bodźce słuchowe.
5. Umieść półprzezroczysty ekran 64 cm nad areną, aby wyświetlać nad głową awersyjne bodźce wizualne za pomocą projektora.
6. Światło dostarczane przez projektor oświetli aparat behawioralny; skalibruj go tak, aby w środku powierzchni platformy znajdowało się 5-10 luksów. Umieść światła podczerwone i kamerę na podczerwień nad platformą z filtrem długoprzepustowym (>700 nm), aby zapobiec migotaniu projektora w pozyskanym filmie.
7. Śledź pozycję myszy w Internecie za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania lub odpowiedniego algorytmu. Do śledzenia czarnych myszy na białej arenie odpowiednia jest prosta operacja progowania, po której następuje obliczenie środka ciężkości maski.
8. Najlepiej umieścić aparaturę behawioralną w pudełku odpornym na dźwięk i światło, aby zapobiec wpływowi zewnętrznych sygnałów na eksperyment.

2. Dostarczanie wrodzonych bodźców awersyjnych

UWAGA: Bodźce opisane poniżej mogą być generowane za pomocą szerokiej gamy różnych pakietów oprogramowania, w tym LabVIEW i Matlab.

1. Bodziec wzrokowy
   1. Wyświetlaj bodźce na ekranie umieszczonym 64 cm nad areną. Bodziec składa się z liniowo rozszerzającego się ciemnego okręgu na szarym tle²² (kontrast Webera = -0,98, luminancja = 7,95 cd/m²).
      UWAGA: Standardowy okrąg powinien być idealnie wyśrodkowany bezpośrednio nad pozycją myszy, zmieniając kąt widzenia 2.6° na początku i rozszerza się liniowo z prędkością 224°/s przez 200 ms do 47.4°, przy czym pozostaje przez 250 ms przed przesunięciem.
   2. Podczas dostarczania bodźca wizualnego wyśrodkuj go nad myszą. Można to osiągnąć, czekając, aż mysz przejdzie przez predefiniowany obszar na arenie, lub śledząc pozycję myszy w trybie online i używając współrzędnych śledzenia do zdefiniowania środka okręgu.
      UWAGA: Chociaż sugerujemy projekcję bodźca wizualnego bezpośrednio nad myszą, zachowania obronne mogą być również wywołane, jeśli ten sam bodziec jest wyświetlany przed myszą (gdy jest nadal równoległy do podłogi). Z naszego doświadczenia wynika, że dzieje się tak co najmniej do 30 cm przed pozycją myszy.
2. Bodziec słuchowy
   1. Wyzwól bodziec składający się z ciągu trzech modulowanych częstotliwościowo przemiatania w górę od 17 do 20 kHz²³ przez 3 s, trwających łącznie 9 s. Poziom ciśnienia akustycznego (SPL), mierzony na poziomie platformy, powinien mieścić się w zakresie od 73 do 78 dB.
   2. Podłącz kartę dźwiękową i wzmacniacz do głośnika ultradźwiękowego umieszczonego nad areną, aby dostarczyć bodziec słuchowy.

3. Zwierzęta:

1. Używaj samców lub samic myszy C57BL/6J w wieku od 6 do 24 tygodni. Utrzymuj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu świetlnym ze swobodnym dostępem do karmy i wody.
2. Upewnij się, że myszy są trzymane w jednym pomieszczeniu co najmniej 72 godziny przed testem behawioralnym i przetestuj je podczas fazy świetlnej cyklu świetlnego.
   UWAGA: Stwierdzamy, że wyjściowe zachowanie eksploracyjne myszy trzymanych w jednej części jest bardziej porównywalne u zwierząt niż u myszy trzymanych w grupie. Ponadto zwierzęta z implantami chirurgicznymi do rejestrowania aktywności neuronalnej lub manipulacji często muszą być trzymane w jednym pomieszczeniu, dlatego korzystne może być posiadanie zestawów danych kontrolnych w tych samych warunkach inwentarskich.

4. Standardowy test behawioralny:

1. Skrupulatnie oczyść powierzchnię platformy 70% etanolem lub kwasem octowym, aby usunąć niechciane sygnały węchowe. Opłucz schronienie wodą i umyj je 70% etanolem, po czym należy je ponownie spłukać wodą, aby zmniejszyć zapach etanolu.
2. Dokładnie osusz zarówno platformę, jak i schronienie, ponieważ mysz może uniknąć wejścia do schronu, jeśli jest mokry.
3. Losowo określ lokalizację schronu na platformie dla każdej próby, obracając platformę przed eksperymentem. Lokalizacja schronu będzie zakotwiczona w arenie, ale będzie obrócona w stosunku do obudowy aparatury behawioralnej.
4. Przynieś mysz do pokoju eksperymentalnego w jej domowej klatce i umieść klatkę na platformie testowej na 10-minutowy okres aklimatyzacji.
5. Wyjmij mysz z jej domowej klatki i unikaj aportowania za ogon: albo ją przytul, albo pozwól jej wspiąć się na przedmiot wzbogacający, który można podnieść. Wykazano, że wybieranie myszy za ogon zwiększa poziom lęku, a tym samym może wpływać na reakcje behawioralne na zagrożenie²⁴.
6. Delikatnie umieść mysz na środku areny i rozpocznij akwizycję wideo.
7. Pozwól na 7-minutowy okres przyzwyczajenia, podczas którego nie występuje żaden bodziec awersyjny. Upewnij się, że mysz ma wystarczająco dużo czasu, aby przynajmniej raz znaleźć i wejść do schronu. Potraktuj to jako wejście, jeśli wszystkie cztery kończyny znajdują się w schronie. 7 minut powinno wystarczyć, aby większość myszy znalazła i weszła do schronienia, ale w przypadku, gdy tak się nie stanie, przedłuż okres przyzwyczajenia o dodatkowe okresy 5 minut, aż przynajmniej jedno wejście zostanie zweryfikowane.
8. Uruchom dostarczanie bodźca awersyjnego (słuchowego lub wzrokowego) ręcznie, obserwując obraz wideo na żywo, lub automatycznie, śledząc pozycję zwierzęcia w Internecie i wstępnie definiując obszar zainteresowania na arenie, aby wyzwolić dostarczanie bodźców, gdy zwierzę do niego dotrze. Bodziec wizualny jest zwykle dostarczany bezpośrednio nad zwierzęciem za pomocą współrzędnych śledzenia wideo online.
9. Aby wywołać więcej niż jedną reakcję ucieczki w tej samej sesji, pozwól myszy dobrowolnie opuścić schronienie. Jeśli mysz nie zdołała uciec do schronienia po ostatnim bodźcu awersyjnym, odczekaj co najmniej 60 s przed zaprezentowaniem kolejnego bodźca.
10. Po zakończeniu testu należy zwrócić zwierzę do jego klatki domowej. W przypadku, gdy wymagane jest dalsze testowanie tej samej myszy, odczekaj co najmniej 48 godzin przed ponownym testowaniem.
11. Oczyść platformę i schronienie zgodnie z opisem w krokach 4.1 i 4.2 przed przetestowaniem następnego zwierzęcia.

UWAGA: Kroki 5, 6 i 7 są niezależnymi odmianami standardowego testu behawioralnego i każdy z nich może być wykonywany indywidualnie.

5. Test behawioralny 'Strategia nawigacji':

UWAGA: Celem tego testu jest określenie, jakich wskazówek używają myszy, aby kierować zachowaniem ucieczki. W tym teście ruchoma zewnętrzna część platformy jest obracana, podczas gdy mysz znajduje się na stałym środku areny, który promieniście przesuwa schronienie, wskazówki węchowe znajdujące się wewnątrz schronu i proksymalne wskazówki wizualne przymocowane do platformy. Jeśli mysz podąża za którąkolwiek ze wskazówek, które zostały obrócone, aby przejść do schronu, poprawnie ucieknie do nowej lokalizacji schronu, ale jeśli użyje innych wskazówek, które pozostały na miejscu, przejdzie do poprzedniej lokalizacji schronu.

1. Wykonaj kroki od 4.1 do 4.8 standardowego testu behawioralnego opisanego powyżej, wywołując co najmniej jedną reakcję lotu, która ma być wykorzystana jako punkt odniesienia.
2. Pozwól myszy aktywnie opuścić schronienie i poczekać, aż przejdzie do centralnej części platformy. Umieść małe naczynie z pościelą pośrodku, aby zachęcić do eksploracji i trzymaj zwierzę na środkowej platformie wystarczająco długo, aby umożliwić obrót zewnętrznej części platformy. Dodaj naczynie i ściółkę, gdy mysz znajduje się w schronie i po udanej ucieczce, która poprzedza obrót platformy. Jeśli mysz nie wejdzie do schronu podczas reakcji ucieczki, poczekaj, aż dobrowolnie wejdzie do schronu, a następnie dodaj naczynie i ściółkę.
3. Użyj silnika krokowego, aby obrócić platformę o co najmniej 36 stopni (2 otwory), a następnie natychmiast użyj bodźca sensorycznego, aby wywołać reakcję ucieczki. Możliwe, że rotacja wywoła przerażenie, a nawet zainicjuje reakcję ucieczki.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że ~55% myszy będzie biegać poza centralną (nieobracającą się) platformą, podczas gdy zewnętrzna część nadal się obraca, a te próby powinny być wyłączone z analizy.
4. Wyczyść platformę i schronienie, a następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej zgodnie z opisem w krokach 4.10 i 4.11.

6. Test behawioralny 'Dynamicznego środowiska':

UWAGA: Ten test ma na celu ocenę, jak myszy dostosowują swoje zachowania obronne do nagłych zmian w środowisku. W tych eksperymentach, po wywołaniu co najmniej jednej reakcji ucieczki, lokalizacja schronienia jest zmieniana i mysz może go odwiedzić raz, zanim zostanie uruchomiona kolejna reakcja ucieczki. Jeśli mysz idealnie zaktualizuje nową lokalizację schronu i obliczy brak schronu w poprzedniej lokalizacji, powinien uciec do nowej lokalizacji. W przeciwnym razie albo nie zapamiętał nowej lokalizacji schronu, albo zapamiętał obie lokalizacje, ale woli uciec do starej.

1. Wykonać ten test po krokach od 4.1 do 4.8 opisanych powyżej, wywołując co najmniej jedną reakcję lotu jako kontrolę.
2. Gdy mysz dobrowolnie opuści schronienie, usuń schronienie i umieść je ponownie w nowym otworze na przeciwległym końcu platformy.
3. Pozwól myszy eksplorować otoczenie, dopóki nie wejdzie do schronu w nowym miejscu.
4. Kiedy mysz dobrowolnie wyjdzie ze schronienia, zaprezentuj jej bodziec awersyjny i obserwuj jej reakcję.
5. Użyj bodźca słuchowego w tym eksperymencie ze względu na jego dłuższy czas trwania, ponieważ przy długotrwałym zagrożeniu zwierzęta mogą wykonywać dodatkowe reakcje ucieczki do innych miejsc, jeśli na początku nie znajdą schronienia.
6. Wyczyść platformę i schronienie, a następnie umieść mysz w klatce domowej zgodnie z opisem w krokach 4.10 i 4.11.

7. Test behawioralny 'Brak schronienia':

UWAGA: Celem tego testu jest zrozumienie, jak brak schronienia w środowisku wpływa na ekspresję zachowań obronnych.

1. Zatkaj wszystkie 20 otworów. W tym eksperymencie na arenie nie ma dostępnego schronienia.
2. Po oczyszczeniu i wysuszeniu platformy (kroki 4.1 i 4.2) wykonaj kroki 4.4-4.6.
3. Odczekaj 7-minutowy okres przyzwyczajenia.
4. Przedstaw bodziec wizualny i obserwuj reakcję obronną. Brak schronienia sprzyja zachowaniom zamrożeniowym, zwykle trwającym przez czas trwania bodźca wzrokowego. Użyj powoli rozszerzającego się punktu (np. okręgu, który na początku osiąga kąt widzenia 2,6° i rozszerza się liniowo z prędkością 11,2°/s w ciągu 4 s do 47,4°, przy czym pozostaje przez 1 s przed przesunięciem), aby ułatwić obserwację reakcji zamrożenia.
5. Jeśli wymagana jest więcej niż jedna odpowiedź na mysz, należy zastosować interwał między bodźcami wynoszący co najmniej 60 s.
6. Po uzyskaniu wymaganej liczby odpowiedzi w przypadku braku schronienia, wprowadź schronienie pod jeden z otworów i pozwól myszce eksplorować otoczenie przez co najmniej 5 minut. 5 minut to wystarczająco dużo czasu, aby większość myszy znalazła i weszła do nowo wprowadzonego schronienia, ale w przypadku, gdy tak się nie stanie, Wydłuż ten okres o dodatkowe bloki 5 min, aż przynajmniej jeden wpis zostanie zweryfikowany.
7. Powtórz kroki 4.8 i 4.9 i obserwuj reakcje ucieczki wykonywane w obecności schronienia w środowisku.
8. Wyczyść platformę i schronienie, a następnie umieść mysz w klatce domowej zgodnie z opisem w krokach 4.10 i 4.11.

8. Analiza danych:

UWAGA: Każdy z poniższych kroków analizy danych może być wykonany niezależnie.

1. Reakcje ucieczki można łatwo zidentyfikować jako nagłe przyspieszenie po prezentacji bodźca awersyjnego. Określ ilościowo opóźnienie ucieczki jako czas między prezentacją bodźca a rozpoczęciem ruchu obrotowego głowy skierowanego na cel ucieczki lub początkiem ruchu przyspieszenia, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
2. Reakcje zamrożenia można scharakteryzować jako całkowity bezruch zwierzęcia, z wyjątkiem ruchów oddechowych²⁵, trwających co najmniej 0,5 s⁷. Zmierz opóźnienie do zamrożenia jako czas między wystąpieniem bodźca awersyjnego a początkiem okresu bezruchu.
3. Dla każdej reakcji ucieczki określ ilościowo liniowość toru lotu, obliczając stosunek odległości między myszą a schronieniem do rzeczywistego przemieszczenia podczas lotu.
4. Dla każdej reakcji ucieczki oblicz dokładność, mierząc odległość między otworem, do którego zwierzę skierowało swój lot, a otworem prowadzącym do schronienia. Ponieważ jest 20 dołków, każdy dołek poza celem oznacza spadek dokładności o 10% (np. 2 dołki poza celem można wyrazić jako 80% dokładności)
5. W przypadku testu behawioralnego "strategii nawigacji" należy określić ilościowo dokładność odpowiedzi w odniesieniu do lokalizacji schronu przed obrotem platformy. Średnia dokładność, która nie różni się znacząco od dokładności sprzed obrotu, wskazuje, że zwierzę nie używa żadnych wskazówek sensorycznych, które zostały obrócone w celu nawigacji do celu ucieczki.
6. W przypadku testu behawioralnego "dynamicznego środowiska" należy sklasyfikować każdą wywołaną reakcję ucieczki jako skierowaną do nowej lub starej lokalizacji schronienia lub do żadnej z nich. Oceń, w jaki sposób wzorzec ewoluuje wraz z iteracjami wywołanych zachowań obronnych.
7. W przypadku testu behawioralnego "bez schronienia" porównaj prędkość myszy po prezentacji awersyjnego bodźca wizualnego w obecności i braku schronienia i oblicz opóźnienie do zainicjowania reakcji obronnej. Dodatkowo oblicz prawdopodobieństwo wywołania reakcji zamrożenia w odpowiedzi na bodziec dla każdej sytuacji.

Wyniki

Myszy wystawione na bodźce słuchowe lub wzrokowe inicjowały szybkie reakcje ucieczki z krótkimi opóźnieniami między początkiem stymulacji a rozpoczęciem lotu. Średnie opóźnienie ucieczki od bodźca wzrokowego wynosiło 202 ± 16 ms (n = 51 odpowiedzi od 26 zwierząt) i znacznie dłuższe w przypadku stymulacji słuchowej: 510 ± 61 ms (n = 36 odpowiedzi od 15 zwierząt, test t<0,0001 między stymulacją wzrokową a słuchową; Rysunek 2A) (krok 8.1). Reakcje ucieczki były dokładnie kierowane do schronu (średnia dokładność dla bodźca wzrokowego: 97,2 ± 1,4% i 95,0 ± 1,4% dla bodźca słuchowego, nie różniąc się istotnie między tymi dwoma typami bodźców, p = 0,1655 test t; Rysunek 2B) (krok 8.4), a trajektorie lotu były bliskie linii prostej (średni stosunek przemieszczenia do odległości do schronienia dla bodźca wzrokowego 107,3 ± 1,3% i 113,9 ± 1,5% dla bodźca słuchowego; Rysunek 2C) (krok 8.3). Obserwacja krótkiego opóźnienia od bodźca jest ważna dla odróżnienia zachowania wywołanego bodźcem od naprowadzania się, a wysoka liniowość trajektorii lotu pokazuje, że reakcja ucieczki ma na celu dotarcie do schronienia, a nie tylko oddalenie się od bodźca.

Prezentacja bodźca po obróceniu zewnętrznej części labiryntu, podczas gdy mysz była nieruchoma na środkowej platformie (zakres = 36°-90°, średnio 56°) skutecznie wywołała reakcje ucieczki (krok 5). Wszystkie myszy uciekły w kierunku poprzedniej lokalizacji schronu, bez spadku dokładności i liniowości trajektorii lotu w porównaniu z próbami przed rotacją. Średnia dokładność, mierzona w odniesieniu do pierwotnej pozycji schronienia, wynosiła 96,3 ± 1,3% przed rotacją (n = 25 odpowiedzi od 8 myszy), a nawet nieco wyższa po rotacji (100 ± 0%, p = 0,009 t-test między obrotem przed i po rotacji). Średnia liniowość w stosunku do pierwotnej lokalizacji schronienia wynosiła 109,4 ± 5,0% przed rotacją (25 odpowiedzi od 8 myszy) i 109,1 ± 2,1%, po rotacji (n = 8 odpowiedzi od 8 myszy), p = 0,957 test t między przed i po rotacji, Rysunek 3A i B). Wyniki te pokazują, że proksymalne wskazówki wizualne nie są wykorzystywane do kierowania lotem do schronu (kroki 8.3-8.5).

Zmiana lokalizacji schronu po wywołaniu jednej udanej reakcji ucieczki (krok 6) spowodowała, że myszy odwiedziły nową lokalizację schronu wkrótce po zmianie (średni czas wizyty w nowym schronie = 33,1 s, zasięg = 4-82 s). Kolejne sekwencyjne próby stymulacji dźwiękiem spowodowały stopniowy wzrost prawdopodobieństwa ucieczki do nowego miejsca (44,4% w pierwszym badaniu), osiągając 100% u wszystkich zwierząt w piątym badaniu (n = 9 zwierząt, Rysunek 3C). Eksperymenty te badają dynamikę aktualizacji pamięci lokalizacji schronu w celu dostosowania się do zmian w środowisku (krok 8.6).

Po 7-minutowym okresie aklimatyzacji do labiryntu bez schronienia (krok 7), prezentacja 5-sekundowego bodźca wizualnego spowodowała zatrzymanie zamiast ucieczki (prawdopodobieństwo zamrożenia = 95,2%, średni czas zamrożenia = 7,9 ± 2,7 s, n = 7 zwierząt). Późniejsze wprowadzenie schronienia w tej samej sesji i prezentacja długiego bodźca wizualnego wywołały niezawodne reakcje ucieczki, pokazując, że myszy mogą elastycznie zmieniać strategie obronne w zależności od obecności schronienia (Rysunek 3D) (kroki 8.1 i 8.7).

Rysunek 1: Schemat areny behawioralnej. Rysunek głównych elementów areny behawioralnej oglądany z góry (po prawej) i z boku (po lewej). Dużą część platformy można obracać, w tym wiatę i dołączone wskazówki wizualne. Cienie w widoku z góry to otwory, do których można przymocować schronienie, które są identyczne (wskazana jest przykładowa lokalizacja schronu). Cała arena zamknięta jest w obudowie wygłuszającej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reakcje ucieczki to szybkie i dokładne zachowania ukierunkowane na cel. (A) Opóźnienie ucieczki przed początkiem stymulacji wzrokowej lub słuchowej. (B) Dokładność nawigacji do schronu podczas ucieczki, mierzona w taki sposób, że wartość wynosi 100%, jeśli mysz biegnie bezpośrednio do schronu, i 10% mniejsza dla każdego dołka oddalonego od schronu (np. 80%, jeśli otwór, do którego dotarła jako pierwsza, był oddalony o dwa otwory od właściwego). (C) Przemieszczenie myszy podczas ucieczki wykreślone w stosunku do odległości liniowej między początkową pozycją zwierzęcia a miejscem docelowym, co pokazuje, że lot jest bliski liniowemu. Ramka i wąsy pokazują dane z 10–90 percentyla, a pozostałe punkty danych są wyświetlane jako okręgi. Wykresy koloru czerwonego to dane ze stymulacji słuchowej (n = 36 odpowiedzi od 15 zwierząt), a czarne to dane ze stymulacji wzrokowej (n = 51 odpowiedzi od 26 zwierząt). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Myszy nie używają proksymalnych wskazówek wizualnych ani wskazówek związanych ze schronieniem, aby kierować reakcjami ucieczki. (A) Wykres przemieszczenia jak w Rysunek 2C, dla odpowiedzi przed i po obrocie platformy. (B) Dokładność nawigacji podczas ewakuacji w warunkach przed i po obrocie. Dokładność po rotacji jest mierzona w odniesieniu do początkowej lokalizacji schronienia i pokazuje, że myszy wracają do pierwotnej lokalizacji schronienia zamiast do nowej pozycji. (C) Ułamek reakcji ucieczki skierowanych w stronę nowej lokalizacji schronu w stosunku do liczby stymulacji. Po^{5 prezentacji} bodźca wszystkie zwierzęta uciekają bezpośrednio w kierunku nowej lokalizacji schroniska (n = 9 zwierząt). (D) Średnia prędkość zwierząt w odpowiedzi na stymulację wzrokową z dostępnym schronieniem (kolor czerwony) lub nieobecnym (kolor niebieski), wykazująca odpowiednio reakcje ucieczki i zamrożenia. Prędkość została znormalizowana do wartości wyjściowej i dostosowana do czasu reakcji (zdefiniowanego jako początek lotu lub reakcja na zamrożenie, linia przerywana). Zacienione obszary pokazują SEM. (n = 7 zwierząt). W przypadku pozycji 2A i 2B ramka i wąsy pokazują dane z zakresu 10–90 percentyla, a pozostałe punkty danych są wyświetlane jako okręgi. Wykresy w kolorze czerwonym to dane ze stymulacji słuchowej przed obrotem platformy (n = 25 odpowiedzi od 8 zwierząt), a niebieskie to dane po obróceniu platformy (n = 8 odpowiedzi od 8 zwierząt). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Testy, które tutaj opisujemy, są technicznie proste do wykonania i, z wyjątkiem eksperymentów z rotacją platformy, można je łatwo wdrożyć w standardowym labiryncie Barnesa. Niemniej jednak może pojawić się kilka komplikacji: z jednej strony mysz może wydawać się przestraszona wejściem do schronienia, co może być spowodowane tym, że schronienie nie jest wystarczająco oczyszczone lub wysuszone. Z drugiej strony mysz może przebywać w schronie przez bardzo długi czas. W tych eksperymentach bardzo ważne jest, aby zwierzęta nigdy nie były usuwane ze schroniska ręcznie, ponieważ może to zakłócić integrację ścieżek, a także niepokoić zwierzęta i zmienić ich reakcję na zagrożenie. Sugerujemy zakończenie eksperymentu po 90 minutach i ponowne przeprowadzenie testu po 48 godzinach, jeśli to konieczne. Inną istotną kwestią praktyczną jest to, że gdy mysz bada krawędź platformy, może nie wykryć bodźców wizualnych, jeśli jej głowa jest pochylona nad krawędzią, dlatego zalecamy wstrzymanie bodźców w takich sytuacjach. Ponadto myszy mogą w rzadkich przypadkach zeskakiwać z platformy. Sugerujemy zakończenie eksperymentu i ponowne badanie po 48 godzinach. Myszy, które raz aktywnie opuszczą platformę, prawdopodobnie zrobią to ponownie w przyszłości i być może będą musiały zostać wykluczone z badania. Wreszcie, z naszego doświadczenia, większość myszy zareaguje na bodziec wzrokowy (34/36 myszy). Jeśli jednak myszy nie wykazują żadnej reakcji na bodziec wzrokowy (ani przerażenia, ucieczki, ani zamrożenia), powinny zostać wykluczone z badania.

Ważną kwestią do rozważenia jest to, że kontrola sygnałów sensorycznych jest zazwyczaj problemem w testach pamięci przestrzennej, ponieważ często trudno jest wyeliminować wszystkie możliwe źródła sygnałów zanieczyszczających. Nasza eksperymentalna konfiguracja redukuje zewnętrzne sygnały wizualne, otaczając labirynt ścianą i jest umieszczona w obudowie tłumiącej dźwięk w celu izolacji dźwięku. Aby zminimalizować sygnały węchowe, zalecamy dokładne czyszczenie zestawu 70% etanolem lub kwasem octowym między eksperymentami.

Nasz test behawioralny uzupełnia poprzednie metody badania nawigacji przestrzennej²⁶ , wykorzystując instynktowne zachowania obronne do badania pamięci przestrzennej i skupiając się na scenariuszach etologicznych. Zasadniczą różnicą między opisanymi tutaj procedurami a standardowym testem BM jest brak sesji szkoleniowych. W naszych testach okres przyzwyczajenia zapewnia, że mysz odwiedza schronienie co najmniej raz, a często znacznie więcej razy, co, jak wykazaliśmy wcześniej, jest wystarczające do zapamiętania lokalizacji schronienia². Uważamy, że ważnym powodem wysokiego wskaźnika sukcesu i dokładności w znalezieniu schronienia pomimo braku szkolenia jest to, że nigdy nie przemieszcza się biernie zwierzę podczas eksperymentu, co sprawia, że integracja ścieżki jest realną strategią nawigacyjną. Zauważamy jednak, że nasz test dotyczy pamięci tworzonej i ocenianej podczas jednej sesji i że nie testowaliśmy pamięci długotrwałej lokalizacji schronienia, co zwykle jest celem standardowych eksperymentów BM. Wreszcie, używając dyskretnych, wrodzonych bodźców awersyjnych, a nie powszechnie używanych wentylatorów lub brzęczeń przez cały czas trwania sesji, nasz test zapewnia bardzo dobrą eksperymentalną kontrolę nad dwoma zachowaniami, które mogą wykorzystywać różne strategie nawigacyjne: żerowanie i ucieczkę skierowaną do schronienia. Uważamy, że zastosowanie tych testów w połączeniu z nowoczesnymi technikami neuronauki do rejestrowania i manipulowania aktywnością neuronalną może dostarczyć ważnych informacji na temat tego, jak obwody neuronalne obliczają zachowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Iluminatory podczerwieni TV6700	Projektor	Abus-DLP
Infocus IN3126	Infocus	0001740992-00000001
Głośnik ultradźwiękowy Pettersson L60	Pettersson	Elektronik-Amplifier
QTX PRO240	QTX-Karta
dźwiękowa Xonar D2	Asus	90-YAA021-1UAN00Z
HP Z840 biurkowa	folia	F5G73AV
100 mikronów	Xerox	3R98145
Kamera bliskiej podczerwieni: Basler acA1300-60gmNIR	Basler	106202
National Instruments BNC-2110	Instrumenty krajowe	777643-01
LabVIEW 2015 64-bitowe	instrumenty narodowe	-
labirynt	Barnesa wykonany na zamówieniePracownia mechaniczna MRC Laboratorium Biologii Molekularnej	-