Artykuł metodologiczny

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

23.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57001

⸱

3 października 2018

 , 
1Max Planck Institute for Molecular Biomedicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Streszczenie

Badanie trójwymiarowej architektury chromatyny dostarcza bezcennych informacji na temat mechanizmów regulacji genów. W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania techniki wychwytywania konformacji chromatyny in situ Hi-C na stadiach zarodków Drosophila melanogaster. Rezultatem jest biblioteka sekwencjonowania, która umożliwia mapowanie wszystkich oddziaływań chromatyny, które zachodzą w jądrze w jednym eksperymencie. Sortowanie zarodków odbywa się ręcznie przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego i transgenicznej linii muchowej zawierającej marker jądrowy. Za pomocą tej techniki można uzyskać populacje zarodków z każdego cyklu podziału jądrowego i o określonym statusie cyklu komórkowego z bardzo wysoką czystością. Protokół może być również dostosowany do sortowania starszych zarodków poza gastrulacją. Posortowane zarodki są wykorzystywane jako dane wejściowe do badania in situ Hi-C. Wszystkie eksperymenty, w tym przygotowanie biblioteki sekwencjonowania, można ukończyć w ciągu pięciu dni. Protokół ma niskie wymagania dotyczące nakładów i działa niezawodnie przy użyciu 20 zarodków w stadium blastodermy jako materiału wejściowego. Efektem końcowym jest biblioteka sekwencjonowania dla sekwencjonowania nowej generacji. Po sekwencjonowaniu dane można przetworzyć na mapy interakcji chromatyny w całym genomie, które można analizować przy użyciu szerokiej gamy dostępnych narzędzi w celu uzyskania informacji o strukturze domeny topologicznie asocjacyjnej (TAD), pętlach chromatyny i przedziałach chromatyny podczas rozwoju Drosophila.

Wprowadzenie

Przechwytywanie konformacji chromatyny (3C) okazało się wyjątkowo użyteczną metodą badania topologii chromatyny w jądrze1. Wariant 3C Hi-C pozwala na pomiar częstości kontaktowych wszystkich oddziaływań chromatyny, które zachodzą w jądrze w jednym eksperymencie2. Zastosowanie Hi-C odegrało ważną rolę w odkryciu i scharakteryzowaniu wielu podstawowych zasad organizacji chromatyny, takich jak TAD, przedziały i pętle3,4,5.

Badania nad architekturą chromatyny w kontekście przemian rozwojowych i różnicowania komórek są coraz częściej wykorzystywane do odkrywania mechanizmów regulacji genów podczas tych procesów6,7,8,9. Jednym z bardzo interesujących organizmów modelowych jest Drosophila melanogaster, którego rozwój i genom są dobrze scharakteryzowane. Przeprowadzono jednak niewiele badań, które badają architekturę chromatyny u Drosophila poza warunkami hodowli tkankowej in vitro10,11. W zarodkach 16–18 godzin po zapłodnieniu zidentyfikowano TAD i kompartmenty przypominające podobne struktury u ssaków10, co rodzi pytanie, jaką rolę odgrywają w regulacji genów podczas rozwoju zarodka Drosophila. Szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju, przed gastrulacją, takie badania są technicznie trudne. Przed gastrulacją zarodki Drosophila przechodzą 13 synchronicznych podziałów jądrowych, które przebiegają w niezwykle szybkim tempie 8–60 minut na cykl12,13. Ponadto brak cech wizualnych pozwalających na rozróżnienie różnych stadiów utrudnia uzyskanie ściśle zaawansowanego materiału zarodkowego w wystarczających ilościach.

W celu opracowania protokołu, który pozwala badać architekturę chromatyny we wczesnym rozwoju Drosophila w rozdzielczości cyklu jądrowego, połączyliśmy dwie istniejące techniki: in situ Hi-C, która pozwala na generowanie map kontaktowych całego genomu w wysokiej rozdzielczości5, oraz ocenę zarodka za pomocą transgenicznej linii Drosophila wyrażającej transgen eGFP-PCNA13,14. Ten transgen lokalizuje się w jądrze podczas interfazy i rozprasza się w syncytialnej blastodermie podczas mitozy. Korzystając z tej właściwości, można łatwo odróżnić różne stadia na podstawie ich gęstości jądrowej i zarodki mitotyczne na podstawie dyspersji sygnału GFP.

Razem, techniki te umożliwiają badanie trójwymiarowej struktury chromatyny w wysokiej rozdzielczości z zaledwie 20 zarodków Drosophila. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące zbierania i sortowania zarodków Drosophila w celu uzyskania populacji zarodków z pojedynczego cyklu podziału jądrowego. Dalej opisano, w jaki sposób uzyskane zarodki są wykorzystywane do wykonywania in situ Hi-C. Efektem końcowym jest biblioteka nukleotydów odpowiednia do sekwencjonowania na maszynach sekwencjonujących nowej generacji. Uzyskane odczyty sekwencjonowania można następnie przetworzyć na szczegółowe mapy interakcji chromatyny obejmujące cały genom Drosophila.

Protokół

1. Kolekcja zarodków Drosophila

UWAGA: Równoważne pobranie zarodków może być przeprowadzone, jak pokazano w poprzedniej publikacji15.

  1. Przenieś młode muchy eGFP-PCNA (w wieku <1 tygodnia) do klatek do zbierania jaj z płytkami do zbierania drożdży16 (1% etanolu, 1% kwasu octowego i 4% agaru).
  2. Przenieść klatki do inkubatora ustawionego w temperaturze 25 °C. Inkubacja przez 1-2 dni przed pobraniem jaj znacznie poprawia wydajność jaj. Wymieniaj talerze zbiorcze dwa razy dziennie.
  3. Wyjmować płytki zawierające zarodki z komory pobierania w odstępach 30–60 minut. Krótsze odstępy skutkują mniejszą liczbą zarodków, ale ściślejszym rozmieszczeniem etapów rozwojowych. Zbieraj z wielu klatek równolegle, tak aby co 30–60 minut składano >200 jaj.
  4. Przechowywać płytki w temperaturze 25 °C do momentu, gdy zarodki osiągną pożądany wiek. W przypadku zarodków w stadium blastodermy (cykl jądrowy 14) inkubować przez około 2 godziny.
  5. Po 2 godzinach inkubacji dodaj wodę z kranu z butelki ze spryskiwaczem do płytki zbiorczej, tak aby cała powierzchnia była pokryta wodą. Zawieś zarodki i drożdże za pomocą miękkiej szczotki.
  6. Wlej zawieszone zarodki z płytki do pobierania zarodków do kosza do pobierania zarodków (dobrze sprawdzają się komercyjne sitka do komórek o wielkości porów 100 μm lub kosze domowej roboty17), dodając dodatkową wodę z kranu z butelki do spryskiwania, jeśli to konieczne. Na tym etapie połącz zarodki ze wszystkich płytek, które zostały zebrane równolegle. Próbka zbiorcza reprezentuje pojedynczą partię.
  7. Dobrze umyj zarodki, płucząc kosz wodą z kranu z butelki ze spryskiwaczem przez 30 sekund, aż wszystkie pozostałości drożdży zostaną zmyte.
  8. Dekorionate zarodków, umieszczając kosz do pobierania w 2,5% roztworze podchlorynu sodu w wodzie. Lekkie mieszanie przez wirowanie ułatwia usuwanie kosmówki. Kontynuuj, aż zarodki będą wystarczająco hydrofobowe, aby unosiły się na powierzchni roztworu, gdy kosz zostanie wyjęty i ponownie zanurzony, co powinno zająć ~1,75–2 min.
    Uwaga: Podchloryn sodu jest. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Roztwory zawierające <10% podchlorynu sodu można zwykle wyrzucić do zlewu, należy zapoznać się z regulaminem instytutu goszczącego.
  9. Wyjmij kosz z roztworu i dokładnie spłucz wodą z kranu z butelki ze spryskiwaczem, aż zapach wybielacza przestanie być wyczuwalny.

2. Utrwalenie zarodka

UWAGA: Optymalne warunki utrwalania, przede wszystkim stężenie detergentu, formaldehydu i czas trwania, muszą być empirycznie określone, aby pasowały do stadium zarodków. W przypadku stadiów wokół blastodermy syncytialnej dobrze sprawdza się końcowe stężenie 0,5% Triton X-100 i 1,8% formaldehydu w fazie wodnej. W późniejszych stadiach po stadium 9 zarodka może być konieczna dalsza optymalizacja tych parametrów. Wszystkie roztwory używane podczas utrwalania i sortowania powinny zawierać inhibitory proteazy.

  1. Odwróć kosz zbiorczy i umieść go na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać zarodki z kosza do probówki za pomocą pipety Pasteura dozującej PBS-T (PBS, 0,5% Triton X-100).
  2. Pozwól zarodkom osiąść na dnie i dostosuj całkowitą objętość do 2 ml za pomocą PBS-T.
  3. Dodaj 6 ml heptanu i 100 μl 37% formaldehydu do wody.
    Uwaga: Heptan i formaldehyd są toksyczne w przypadku wdychania lub po kontakcie ze skórą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem. Odpady zawierające heptan lub formaldehyd należy utylizować oddzielnie zgodnie z przepisami instytutu przyjmującego.
  4. Po dodaniu formaldehydu uruchom 15-minutowy timer i energicznie potrząsaj rurką w górę iw dół przez 1 minutę ręcznie. Faza wodna i organiczna połączą się, tworząc konsystencję przypominającą szampon.
  5. Mieszać na mieszalniku rotacyjnym do 10 minut po dodaniu formaldehydu.
  6. Wirować przy 500 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać zarodki na dnie probówki.
  7. Odessać cały płyn podobny do szamponu i wyrzucić go, uważając, aby nie zassać żadnych zarodków. Niewielkie ilości supernatantu przypominającego szampon nie powodują problemów.
  8. 15 minut po dodaniu formaldehydu ponownie zawieś zarodki w 5 ml PBS-T ze 125 mM glicyną w celu wygaszenia formaldehydu. Mieszaj energicznie, wstrząsając w górę iw dół przez 1 minutę.
  9. Wirować przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i odsysać supernatant.
  10. Umyj zarodki, umieszczając je ponownie w 5 ml lodowatego PBS-T. Niech zarodki osiądą i zaaspirują cały supernatant.
  11. Powtórz pranie w kroku 2.10 jeszcze dwa razy.
  12. Trzymaj zarodki na lodzie do czasu sortowania. Zazwyczaj dobrym pomysłem jest zebranie 3–4 partii zarodków much przed przystąpieniem do sortowania. Jednak zarodki powinny być sortowane tego samego dnia. Dłuższe przechowywanie na lodzie lub w lodówce prowadzi do zmiany morfologii zarodka.

3. Sortowanie zarodków

UWAGA: Sortowanie można przeprowadzić na dowolnym fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym wyposażonym w filtr GFP przy powiększeniu 60-80X.

  1. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś partię około 100 zarodków do małego szklanego naczynia odpowiedniego do sortowania, najlepiej o ciemnym kolorze, i umieść ją na lodzie.
  2. Sortuj zarodki według gęstości jądrowej i statusu cyklu komórkowego (Rysunek 1), wpychając pożądane zarodki do osobnego stosu za pomocą końcówki igły lub strzykawki.
    1. Usuń wszystkie zarodki z rozproszoną, niejądrową dystrybucją eGFP-PCNA (Rysunek 1E). Również zarodki, które częściowo wykazują niejądrowy sygnał GFP, powinny zostać usunięte.
    2. Aby pomóc w sortowaniu, zbierz zestaw zarodków referencyjnych w cyklu jądrowym 12, 13 i 14 w każdej partii, korzystając z rysunków w Rysunek 1 jako przewodnika. Użyj tego składu, aby dopasować zarodki w nieznanym stadium do jednego z zarodków referencyjnych w celu określenia ich stadium zaawansowania.
    3. Aby zweryfikować stadium rozwojowe zarodków referencyjnych, należy zmierzyć gęstość jądrową, obrazując zarodek i zliczając liczbę jąder na powierzchni zarodka w obszarze 2 500 μm2 za pomocą oprogramowania do obrazowania, które dostarcza informacji o odległości.
      UWAGA: Oczekiwana liczba jąder na obszarze 2 500μm2 wynosi od 12 do 16 jąder w 12 cyklu jądrowym i od 20 do 30 jąder w cyklu jądrowym 1313.
  3. Gdy wszystkie zarodki na odpowiednim etapie zostaną oddzielone, należy zrobić zdjęcia zarodków w celu dokumentacji i kontroli jakości. Jeśli mikroskop stereoskopowy nie jest sam w sobie wyposażony w moduł kamery, można użyć dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrami GFP.
  4. Odpipetować pożądane zarodki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, przenieść do świeżej probówki i umieścić na lodzie.
  5. Kontynuuj, aż zostanie posortowana wystarczająca liczba zarodków do planowanego eksperymentu. W przypadku zarodków starszych niż 9 stadium zazwyczaj 20 zarodków wystarcza do jednego eksperymentu in situ Hi-C. W 12 cyklu jądrowym dobrym punktem wyjścia jest 80 zarodków. We wcześniejszych cyklach liczba zarodków powinna być w przybliżeniu podwajana dla każdego cyklu.
  6. Zebrać i podzielić zarodki na probówki o pojemności 1,5 ml w taki sposób, aby jedna probówka zawierała wystarczającą ilość zarodków do przeprowadzenia pojedynczego eksperymentu in situ Hi-C. Zaleca się stosowanie probówek o niskiej charakterystyce wiązania DNA, ponieważ ta sama probówka będzie używana do całego protokołu, a adsorpcja DNA może prowadzić do znacznych strat przy niskich stężeniach DNA.
  7. Krótko zakręcić probówkami o sile 100 x g w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Zarodki powinny być jak najbardziej suche do zamrożenia.
  8. Zarodki należy błyskawicznie zamrozić, zanurzając probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. In situ hi-c

  1. Lizy
    1. Umieść probówki z zamrożonymi zarodkami na lodzie.
    2. Ponownie zawiesić zarodki w 500 μl lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, inhibitory proteazy; rozpuszczone w wodzie). Następnie odczekaj 1 minutę, aby zarodki osiadły na dnie probówki.
    3. Zmiel zarodki za pomocą metalowego mikrotłuczka, wstępnie schłodzonego na lodzie, który jest zaprojektowany tak, aby ściśle pasował do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      1. Aby uniknąć potrząsania zarodkami, wkładaj tłuczek powoli, aż dotknie dna tuby, dociśnij, a następnie zmiel, obracając tłuczek dwukrotnie w obu kierunkach.
      2. Podnieś tłuczek bardzo lekko, ponownie dociśnij do dna rurki i powtórz mielenie.
      3. Powtórzyć 4.1.3.2 10 razy lub do momentu, gdy zarodki zostaną całkowicie zjedzone. Roztwór powinien być jednorodny i nie powinny pozostać żadne resztki dużych kawałków zarodków.
    4. Inkubować homogenizowaną zawiesinę na lodzie przez 15 minut. Wirować w temperaturze 1 000 x g, 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    5. Przemyć osad przez ponowne zamieszanie w 500 μl lodowatego buforu do lizy, pipetując w górę iw dół.
    6. Odwirować ponownie jak w 4.1.4 i odrzucić supernatant.
    7. Ponownie zawiesić przemyty osad w 100 μl 0,5% dodecylosiarczanu sodu (SDS), pipetując w górę iw dół. Przepuszczalność jąder przez inkubację przez 10 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym. Ugasić SDS dodając 50 μl 10% Triton X-100 i 120 μl wody. Wymieszaj, przesuwając rurkę.
    8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w bloku grzewczym.
  2. Trawienie enzymatyczne restrykcyjne
    1. Dodać 25 μl 10x buforu enzymatycznego restrykcyjnego i 20 U 5 U/μL MboI. Wymieszaj, przesuwając rurkę.
    2. Trawić DNA przez inkubację przez 90 minut w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym przy lekkim mieszaniu (750 obr./min).
    3. Dodaj kolejne 20 j. MboI i kontynuuj inkubację przez 90 minut.
    4. Inaktywować MboI na gorąco przez inkubację w temperaturze 62 °C przez 20 min.
  3. Wypełnienie zwisu
    UWAGA: Wypełnienie zwisu biotynylowanym dATP pozwala na selekcję konkretnych podwiązanych fragmentów. Biotyna-dATP na połączeniach ligacyjnych jest chroniona przed aktywnością egzonukleazy polimerazy DNA T4 (sekcja 4.6), podczas gdy biotyna-dATP na nieligowanych końcach jest skutecznie usuwana. Pulldown za pomocą kulek pokrytych streptawidyną w sekcji 4.7 jest zatem specyficznie wzbogacony o związane, chimeryczne fragmenty DNA.
    1. Dodać 18 μl 0,4 mM biotyny-14-dATP, 2,25 μl niezmodyfikowanej mieszanki dCTP/dGTP/dTTP (po 3,3 mM) i 8 μl 5 μL fragmentu polimerazy DNA I Klenowa.
    2. Wymieszać przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut w bloku grzewczym.
  4. Ligacji
    1. Dodać 657 μl wody, 120 μl 10x bufor ligazy DNA T4, 100 μl 10% Triton X-100, 6 μl 20 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i wymieszać, przesuwając probówkę. Na koniec dodaj 5 μl 5 U/μL ligazy DNA T4 i wymieszaj, przesuwając probówkę.
    2. Delikatnie obracaj rurkę (20 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    3. Dodaj drugą dawkę 5 μl ligazy DNA T4 o stężeniu 5 μl / μl i kontynuuj obracanie przez kolejne 2 godziny.
    4. Odwirowywać jądra w temperaturze 2 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  5. Ekstrakcja DNA
    1. Zawiesić osad w 500 μl buforu ekstrakcyjnego (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1% SDS; rozpuszczony w wodzie) i dodać 20 μl 20 mg/ml proteinazy K. Wymieszać, przesuwając probówkę.
    2. Białko trawić przez inkubację w temperaturze 55 °C przez 30 minut, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min.
    3. Aby usunąć sieciowanie, dodać 130 μl 5 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze 68 °C, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min.
    4. Pobrać pipetę do nowej probówki o pojemności 2 ml, najlepiej o niskiej charakterystyce wiązania DNA.
    5. Dodać 0,1 x objętość (63 μl) 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 2 μl 15 mg/ml GlycoBlue. Dobrze wymieszaj, odwracając. Dodać 1,6 razy większą objętość (1,008 μl) czystego absolutnego etanolu i wymieszać przez odwrócenie.
    6. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 15 minut. Wirować przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut. Osad DNA jest często bardzo mały, prawie niewidoczny i można go dostrzec tylko dzięki niebieskiemu kolorowi GlycoBlue.
    7. Usunąć supernatant bardzo ostrożnie, przesuwając końcówkę pipety do probówki wzdłuż przeciwnej ścianki od miejsca, w którym znajduje się osad DNA. Małe pozostałe kropelki są często łatwo usuwane podczas tego etapu i następujących po nim prań, wypychając je z probówek za pomocą końcówki P10, a nie pipetując.
    8. Umyj granulat, dodając 800 μL 70% etanolu. Mieszać przez odwrócenie i odwirowywać przy 20 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz to pranie co najmniej raz.
    9. Usuń wszelkie ślady etanolu i pozostaw probówkę z otwartą pokrywką na maksymalnie 5 minut do wyschnięcia na powietrzu. Gdy nie pozostanie żaden płyn, dodaj 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Kilkakrotnie pipetować roztwór nad obszarem na ściance probówki, w którym znajdowała się osadka, aby rozpuścić DNA.
    10. Dodać 1 μl 20 mg/ml RNazy A, wymieszać przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu strawienia RNA. Próbka może być teraz przechowywana w lodówce przez noc lub zamrożona w temperaturze -20 °C na czas nieokreślony.
    11. Sprawdź stężenie DNA za pomocą testu na bazie barwnika fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowita ilość DNA w próbce powinna wynosić co najmniej 10 ng, w przeciwnym razie dostępna jest zbyt mała ilość materiału do amplifikacji, a złożoność biblioteki będzie prawdopodobnie niska. Kiedy tak się dzieje, ilość materiału wyjściowego była prawdopodobnie niewystarczająca lub materiał został utracony po drodze, być może podczas lizy i wytrącania.
  6. Usuwanie biotyny i ścinanie DNA
    1. Dodać do siebie 12 μl 10x buforu polimerazy DNA T4, 3 μl 1 mM dATP, 3 μl 1 mM dGTP i 46 μl wody. Wymieszaj, przesuwając rurkę. Dodać 5 μl 3 U/ml polimerazy DNA T4, wymieszać przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut.
    2. Dodać 3 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję i użyć wody, aby doprowadzić próbkę do objętości około 120 μl.
    3. Ścinać DNA do wielkości 200–400 pz za pomocą urządzenia do sonikacji zgodnie z instrukcjami producenta. Używając sonikatora wymienionego w Tabeli Materiałów, odpowiedni jest następujący program: 2 cykle każdy po 50 s, 10% obciążenia, intensywność 5, 200 cykli/serię.
  7. Ściąganie biotyny
    1. Odpipetować 30 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną o sreptawidynie do nowej probówki, oddzielić je na stojaku magnetycznym i wyrzucić supernatant.
    2. Ponownie zawiesić kulki w 1x buforze czarno-białym (5 mM Tris-Cl pH 7,4, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl; rozpuszczone w wodzie) + 0,1% Triton X-100 i wymieszać przez wirowanie. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1–5 minut, aż koraliki zostaną oddzielone, w zależności od marki i modelu.
    3. Odessać i wyrzucić supernatant, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż ścianki przeciwnej do miejsca, w którym znajdują się kulki. Ponownie zawieś kulki w 120 μl 2x bufora czarno-białego (10 mM Tris-Cl pH 7,4, 1 mM EDTA i 2 M NaCl). Wymieszaj przez wirowanie.
    4. Przenieś ścięte DNA do nowej probówki o niskiej zawartości wiązania DNA i wymieszaj ze 120 μl zawiesiny kulek w buforze 2X B&W przez wirowanie. Obracaj kulki z próbką DNA z prędkością 20 obr./min przez 15 minut.
    5. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i wyrzuć supernatant.
    6. Zawiesić kulki w 600 μl 1x B&W + 0,1% Triton X-100 i inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 minuty, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min. Po rozdzieleniu odrzucić supernatant. Powtórz to pranie raz.
    7. Przemyć kulki raz 600 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0 i wyrzucić supernatant po oddzieleniu.
    8. Zawiesić kulki w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0.

5. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

UWAGA: Wszystkie kroki biblioteki są wykonywane przy użyciu komponentów z komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki DNA (zobacz Tabelę materiałów). Można jednak zastąpić je alternatywnymi zestawami lub innymi odczynnikami. Podczas przechowywania w zamrażarce w środku przygotowawczym biblioteki pojawiają się opady. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie opady zostały rozpuszczone przed użyciem odczynników.

  1. Zakończ naprawę
    1. Przenieś zawiesinę kulek w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0 do nowej probówki do PCR.
    2. Dodać 3 μl mieszanki enzymatycznej end prep i 7 μl buforu reakcyjnego end prep. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
    3. Przenieś rurkę do termocyklera i uruchom następujący program: 20 °C przez 30 min, 65 °C przez 30 min i trzymaj w temperaturze 4 °C.
  2. Podwiązanie adaptera
    1. Do zawiesiny perełek dodać 30 μl Ligation Master Mix, 2,5 μl 1,5 μM adaptera do sekwencjonowania (rozcieńczyć do 1,5 μM z magazynu) i 1 μl Ligation Enhancer. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
    2. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut w termocyklerze.
    3. Dodać 3 μl enzymu USER. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w termocyklerze.
    5. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
    6. Aby umyć kulki, ponownie zamów je w 100 μl 1x B&W buffer + 0,1% Triton X-100. Wymieszać przez wirowanie i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
    7. Powtórz to płukanie raz, używając 600 μl tego samego buforu.
    8. Ponownie zawiesić kulki w 600 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0, wymieszać przez wirowanie i przenieść kulki do nowej probówki.
    9. Oddziel kulki na stojaku magnetycznym, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0.
  3. Amplifikacja PCR
    1. Przygotuj dwie probówki PCR i w każdej z nich wymieszaj 25 μl Polymerase Master Mix, 1,5 μl 10 μM (nieindeksowanego) startera PCR i 1,5 μl 10 μM odwróconego (indeksowanego) startera PCR.
      UWAGA: Starter PCR do przodu (nieindeksowany):
      5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3'.
      Odwrócony (indeksowany) starter PCR:
      5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATC*T-3'. * wskazuje wiązania fosforopianianowe i Ns w indeksowanym starterze PCR.
    2. Do każdej probówki dodać 22 μl zawiesiny kulek i mieszać, pipetując w górę i w dół.
    3. Uruchom PCR za pomocą następującego programu: 98 °C przez 1 min, (98 °C przez 15 s, 65 °C przez 75 s, wzrost 1,5 °C/s) powtórzone 9-12 razy, 65 °C przez 5 minut i przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Liczba cykli amplifikacji musi być określona empirycznie. Okazało się jednak, że biblioteki, które wymagały więcej niż 12 cykli, były na ogół mało skomplikowane i nie dawały wysokiej jakości map Hi-C. Z drugiej strony, biblioteki, które wymagały mniej niż 12 cykli, nie miały negatywnego wpływu na amplifikację przez pełne 12 cykli. Dlatego możliwe jest domyślne ustawienie na 12 cykli wzmocnienia.
    4. Zebrać dwie reakcje PCR w jednej probówce do mikrowirówki, oddzielić kulki na stojaku magnetycznym i przenieść supernatant zawierający bibliotekę do nowej probówki.
  4. Wybór rozmiaru
    1. Doprowadź zawiesinę kulek Ampure XP do temperatury pokojowej i dobrze wymieszaj, potrząsając.
    2. Doprowadzić objętość zbiorczej reakcji PCR dokładnie do 200 μl z wodą. Podczas PCR i separacji magnetycznej część pierwotnej objętości jest zwykle tracona. Sprawdzić objętość, ustawiając pipetę na 200 μl i odessać całą objętość reakcji. Jeśli powietrze jest zasysane, należy dodać więcej wody. Jeśli objętość przekracza 200 μl, dostosuj proporcjonalnie objętość kulek dodanych w krokach 5.4.3 i 5.4.6.
      UWAGA: Objętości w nawiasach są ważne, jeśli całkowita objętość połączonych reakcji PCR wynosi dokładnie 200 μl.
    3. Dodać 0,55 razy więcej objętości (110 μl) zawiesiny perełkowej Ampure XP i mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min, oddzielać koraliki na stojaku magnetycznym przez 5 minut.
    5. Przenieść supernatant do nowej probówki. Wyrzuć probówkę zawierającą koraliki. Koraliki mają związane DNA >700 pz, które jest zbyt duże, aby można je było zsekwencjonować.
    6. Do supernatantu dodać 0,2 x objętość (40 μl, co daje w sumie 0,75 x bufor Ampure w próbce) zawiesiny kulek Ampure XP i wymieszać pipetując w górę i w dół 10 razy.
    7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min, oddzielać koraliki na stojaku magnetycznym przez 5 minut.
    8. Odrzuć supernatant zawierający DNA <200 pz, który zawiera wolne startery, dimery starterów i fragmenty zbyt małe, aby można je było zsekwencjonować.
    9. Pozostaw rurkę na stojaku magnetycznym. Aby umyć kulki, dodaj 700 μl 80% etanolu, uważając, aby nie naruszyć granulki kulek i inkubuj przez 30 sekund.
    10. Wyrzuć supernatant, a następnie zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 100 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Wymieszać pipetując w górę i w dół 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
    11. Dodać 0,8x objętość (80 μl) zawiesiny do perełek Ampure XP. Wymieszać pipetując w górę i w dół 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ta druga runda wyboru dolnego rozmiaru ogranicza zapewnia, że ostateczna biblioteka jest całkowicie wolna od starterów i dimerów starterów.
    12. Oddziel kulki na stojaku magnetycznym na 5 minut i wyrzuć supernatant.
    13. Umyj granulkę kulki dwukrotnie 700 μl 80% etanolu przez 30 s każdy, pozostawiając probówkę na stojaku magnetycznym, jak wyżej.
    14. Trzymając rurkę nadal na stojaku magnetycznym, usuń wszelkie ślady etanolu. Pomaga wypchnąć kropelki etanolu z rurki za pomocą pipety P10. Pozostawić resztki etanolu do odparowania przez maksymalnie 5 minut.
    15. Zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
    16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie oddzielić kulki na stojaku magnetycznym.
    17. Przenieść supernatant do świeżej probówki. Jest to ostatnia biblioteka Hi-C, gotowa do ilościowego oznaczania i sekwencjonowania na maszynach sekwencjonujących nowej generacji, zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

Posortowane populacje embrionów w cyklach jądrowych 12, 13 i 14 (odpowiednio 1:30, 1:45 i 2:10 godzin po zapłodnieniu12) oraz 3–4 h po zapłodnieniu (hpf) uzyskano zgodnie z procedurami opisanymi w protokole. Poprzez wykonanie zdjęć sygnału eGFP-PCNA każdej posortowanej partii embrionów możliwe jest udokumentowanie precyzyjnego stadium i stanu cyklu komórkowego każdego pojedynczego embrionu wykorzystanego w dalszych eksperymentach. Przykładowe zdjęcia embrionów z posortowanych populacji przedstawiono na Rysunku 1B-E. Wynikiem protokołu in situ Hi-C jest biblioteka nukleotydowa gotowa do sekwencjonowania na platformach sekwencjonowania nowej generacji. W tym celu zazwyczaj wymagane jest końcowe stężenie biblioteki wynoszące co najmniej 2–4 nM. Stosując zalecane ilości materiału wejściowego, stężenie to jest osiągane w sposób powtarzalny (Tabela 1).

Oczekiwany rozkład wielkości fragmentów DNA po selekcji wielkości wynosi od 300–600 bp, z maksimum w okolicach 500 bp (Rycina 2A), w zależności od dokładnych parametrów fragmentacji i selekcji wielkości. Do sekwencjonowania zalecamy odczyty par końcowych (paired-end) o długości co najmniej 75 bp, aby zminimalizować liczbę nieprzypisanych fragmentów restrykcyjnych w genomie. Mapy o wysokiej rozdzielczości z rozmiarem bin 1–2 kb można uzyskać z 400 milionów odczytów. Zalecamy sekwencjonowanie wielu powtórzeń biologicznych przy niższej głębokości ~150 milionów odczytów dla każdego z nich, zamiast sekwencjonowania pojedynczego powtórzenia przy bardzo wysokiej głębokości. Pozwala to na ocenę zmienności biologicznej i prowadzi do mniejszej liczby odrzuconych odczytów z powodu duplikacji PCR. Do reprezentacji wizualnej powtórzenia można połączyć. Przed podjęciem decyzji o sekwencjonowaniu próbki z wysoką głębokością, zalecamy przeprowadzenie sekwencjonowania płytkiego (kilka milionów odczytów na próbkę) w celu określenia podstawowych parametrów jakości biblioteki, jak pokazano na Rycina 2B.

Analiza danych Hi-C wymaga znacznych zasobów obliczeniowych oraz wiedzy z zakresu bioinformatyki. W uproszczeniu, odczyty sparowane są mapowane niezależnie do genomu referencyjnego, a wynikowe dopasowania są filtrowane pod kątem jakości i orientacji, po czym z przefiltrowanych dopasowań można wygenerować macierz kontaktów dla danej rozdzielczości binów lub na poziomie fragmentów. Macierz kontaktów stanowi podstawę do wszystkich dalszych analiz w celu badania domen TAD, pętli i przedziałów. Do wstępnej analizy odczytów sekwencjonowania dostępnych jest kilka potoków bioinformatycznych, które umożliwiają przetwarzanie surowych odczytów w macierze kontaktów bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy bioinformatycznej18,19,20,21,22,23. Sposób przeprowadzenia dalszych analiz zależy w dużej mierze od konkretnego pytania biologicznego i może wymagać znacznego doświadczenia w programowaniu oraz tworzeniu skryptów w językach R lub Python. Dostępnych jest jednak kilka narzędzi i algorytmów do wyznaczania domen TAD5,24,25,26,27,28, a także oprogramowanie do analizy i eksploracji danych Hi-C w przeglądarce internetowej oraz w formie samodzielnych aplikacji desktopowych29,30,31,32.

Po przetworzeniu jakość biblioteki można określić za pomocą różnych wskaźników (Rysunek 2B). Po pierwsze, wskaźnik duplikacji PCR, czyli liczba zsekwencjonowanych par odczytów pochodzących z tej samej oryginalnej cząsteczki, powinien być jak najniższy, aby ograniczyć liczbę zmarnowanych odczytów sekwencji. Jednakże, nawet biblioteki z duplikacją PCR >40% mogą zostać przetworzone na wysokiej jakości mapy kontaktów, jeśli duplikaty zostaną odfiltrowane. Po drugie, odsetek odczytów odfiltrowanych ze względu na ich orientację, zgodnie z opisem w4, powinien być konsekwentnie niższy niż 10% dopasowanych par odczytów.

Podczas rozwoju przedgastrulacyjnego Drosophila między 12. a 14. cyklem jądrowym architektura jądra ulega drastycznej przebudowie33 (Rysunek 3). W 12. cyklu jądrowym wykrywa się niewiele TAD, a ogólny rozkład kontaktów jest bardzo jednolity, bez wielu wyraźnych cech. Sytuacja ta ulega gwałtownej zmianie w 13. i 14. cyklu jądrowym, kiedy TAD stają się coraz bardziej wyraźne, a nieswoiste kontakty dalekozasięgowe ulegają redukcji.

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywne zdjęcia zarodków eGFP-PCNA podczas sortowania. (A) sygnał eGFP-PCNA z niesortowanej populacji zarodków po 60 min zbierania i 2 h inkubacji w 25 °C (B-E) przykłady zarodków z populacji sortowanych w cyklu jądrowym 12 (B), cyklu jądrowym 13 (C), cyklu jądrowym 14 (D) oraz z zarodków przechodzących synchroniczną mitozę (E). Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykłady wskaźników jakości bibliotek Hi-C in situ. (A) Profile Bioanalizatora przedstawiające rozkład wielkości fragmentów DNA z udanej biblioteki Hi-C (Biblioteka 1, góra) oraz z biblioteki wykazującej szczyt fragmentów zbyt dużych do sekwencjonowania (Biblioteka 2, dół). Biblioteka 2 została pomyślnie zsekwencjonowana, jednak jeszcze większe ilości niepożądanych fragmentów DNA mogą prowadzić do obniżenia wydajności sekwencjonowania. (B) Statystyki filtrowania dwóch bibliotek Hi-C: przedstawiono liczbę dopasowanych par odczytów, które zostały wykluczone z dalszej analizy ze względu na orientację i odległość odczytów (do wewnątrz, na zewnątrz)4 lub duplikację PCR (duplikaty). Na każdym słupku naniesiono liczbę odczytów przechodzących przez filtr (pozostałe) i odrzuconych (przefiltrowane). Procent odczytów przechodzących przez filtr jest dodatkowo wskazany w formie tekstu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Mapy oddziaływań Hi-C z embrionów na różnych etapach rozwoju. Mapy oddziaływań Hi-C zostały podzielone na przedziały o rozdzielczości 10 kb i zbalansowane zgodnie z wcześniejszym opisem33. Przedstawiono region na chromosomie 2L. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

BibliotekaEtapLiczba embrionówIlość DNA przed fragmentacją (ng)Cykle PCRKońcowe stężenie biblioteki (nM)
1cykl jądrowy 1271461228.2
2cykl jądrowy 1246401222.2
3cykl jądrowy 1260131312.3
4cykl jądrowy 1336391222.2
5cykl jądrowy 133510125.0
6cykl jądrowy 134818128.7
7cykl jądrowy 1433301239.8
8cykl jądrowy 1424361220.4
9cykl jądrowy 14148124.2
103–4 hpf17301224.0
113-4 hpf18421119.1
123–4 hpf22631148.4

Tabela 1: Lista reprezentatywnych statystyk bibliotek sekwencjonowania. Dla każdej biblioteki na liście wskazano liczbę embrionów wykorzystanych do jej przygotowania, ilość całkowitego DNA przed wyciąganiem biotynylowym i ścinaniem zmierzoną za pomocą Qubit, liczbę cykli PCR użytych do amplifikacji oraz końcowe stężenie biblioteki sekwencjonowania po oczyszczaniu i selekcji wielkości.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół jest bardzo skuteczny w generowaniu wysokiej jakości map architektury chromatyny we wczesnych zarodkach Drosophila . W porównaniu z wcześniejszym protokołem34, opisane tutaj podejście wykorzystuje aktualną procedurę Hi-C in situ 5, co skutkuje szybszym przetwarzaniem, wyższą rozdzielczością i mniejszym zużyciem odczynników. Oczekuje się, że cała procedura, w tym protokół Hi-C in situ , będzie działać na wielu etapach i systemach eksperymentalnych poza Drosophila. Ponieważ protokół ma niskie wymagania dotyczące danych wejściowych, może być również stosowany w izolowanych populacjach komórek. U Drosophila, w przypadku stosowania protokołu dla zarodków spoza opisanego tutaj zakresu, niektóre parametry, w szczególności utrwalenie materiału, mogą wymagać dostosowania. Ponieważ u starszych zarodków rozwija się wysoce nieprzepuszczalny naskórek, właściwe może być zwiększenie stężenia formaldehydu i przedłużenie utrwalenia. W przypadku pobierania zarodków na etapach innych niż cykl jądrowy 14, czas inkubacji zarodków w temperaturze 25 °C na etapie 1.4 należy dostosować w następujący sposób: cykl jądrowy 12, 70 min; cykl jądrowy 13, 90 min; 3–4 HPF, 3:30 godz.

Podczas 13 podziałów rozszczepienia (etap 1-4) gęstość jąder z grubsza podwaja się z każdym podziałem. Jądra można łatwo zidentyfikować po ich jasnej fluorescencji GFP. Podczas mitozy eGFP-PCNA nie znajduje się w jądrze, a jego sygnał jest rozpraszany w całym zarodku. Cecha ta umożliwia identyfikację zarodków, które przechodzą synchroniczny podział rozszczepienia. Do badania konformacji chromatyny te mitotyczne zarodki zwykle nie są pożądane, ponieważ mitotyczna organizacja chromatyny jest drastycznie różna niż organizacja interfazowa35. Możliwe jest dostosowanie protokołu do specyficznej selekcji zarodków poddawanych synchronicznemu podziałowi mitotycznemu. W takim przypadku należy zachować tylko zarodki z rozproszoną, niejądrową dystrybucją eGFP-PCNA, a wszystkie inne zarodki należy wyrzucić. Ponieważ nie można określić gęstości jądrowej, należy zastosować alternatywne metody oceny stopnia zarodków na podstawie ich morfologii oglądanej w mikroskopii światła przechodzącego. Obecność komórek biegunowych i jąder na obrzeżach zarodka wskazuje, że zarodek zakończył co najmniej cykl jądrowy 9, podczas gdy widoczna celularyzacja na obrzeżach wskazuje na cykl jądrowy 1412.

Eksperymenty Hi-C mogą być z powodzeniem przeprowadzane przy użyciu szerokiej gamy enzymów restrykcyjnych5. Obecne podejścia zazwyczaj wykorzystują enzymy, które rozpoznają sekwencję 4-zasadową, taką jak MboI, lub miejsce rozpoznawania 6-zasad, takie jak HindIII. Przewagą frezów 4-zasadowych w porównaniu z frezami 6-bazowymi jest to, że oferują one wyższą potencjalną rozdzielczość, biorąc pod uwagę wystarczającą głębokość sekwencjonowania i bardziej równomierne pokrycie miejsc restrykcyjnych w całym genomie. Nie ma wyraźnej przewagi w wyborze jednego noża z 4 podstawami w stosunku do innych 5,23,36,37. Dwa najczęściej stosowane enzymy, MboI i DpnII, rozpoznają to samo miejsce rozpoznawania GATC. DpnII jest mniej wrażliwy na metylację CpG, co nie stanowi problemu u Drosophila. Przedstawiony tutaj protokół można również z powodzeniem zrealizować przy użyciu DpnII jako enzymu restrykcyjnego. W sekcji 4.2. enzym restrykcyjny i bufor muszą być dostosowane do kompatybilności z DpnII, zgodnie z zaleceniami producenta.

Jeśli rozmiar fragmentu biblioteki sekwencjonowania znacznie odbiega od zakresu pokazanego na rysunku 2A, tworzenie klastrów podczas sekwencjonowania może być mniej wydajne lub całkowicie zakończyć się niepowodzeniem. W takim przypadku należy sprawdzić rozkład wielkości po ścinaniu i odpowiednio dostosować parametry ścinania. Piki w rozmieszczeniu fragmentów DNA o bardzo małych (<100 pz) lub bardzo dużych (>1000 pz) rozmiarach wskazują na problemy z doborem wielkości, takie jak przenoszenie kulek lub supernatantu, które powinny zostać odrzucone. Często te biblioteki z małymi pikami w tych niepożądanych rozmiarach, takie jak ta na zdjęciu, są nadal sekwencjonowane z powodzeniem z niewielkim spadkiem wydajności klastrowania.

Należy unikać wysokich wskaźników duplikacji PCR, ponieważ drastycznie zmniejsza to liczbę użytecznych odczytów sekwencji. Częstość duplikatów PCR jest bezpośrednio związana z ilością materiału wejściowego. Użycie większej ilości danych wejściowych zwykle łagodzi zatem problemy z duplikacją PCR.

Większa liczba odczytów przefiltrowanych ze względu na orientację odczytu (ryc. 2B) wskazuje na niewystarczające trawienie, co może być wynikiem użycia zbyt małej ilości enzymu, zbyt dużej ilości materiału wejściowego lub niepełnej homogenizacji zarodków.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Towarzystwo Maxa Plancka. C.B.H. było wspierane przez stypendium z Międzynarodowej Szkoły Badawczej Maxa Plancka - Biomedycyna Molekularna. Dziękujemy Shelby Blythe i Ericowi Wieschhausowi za uprzejme dostarczenie linii eGFP-PCNA Drosophila melanogaster.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biotin-14-dATPLife Technologies19524016
MboINew England BiolabsR0147L
Polimeraza DNA I Fragment KlenowaNew England BiolabsM0210L
T4 DNA LigazaThermo FisherEL0012T4 DNA Ligaza w zestawie
Polimeraza DNA T4New England BiolabsM0203L
Proteinaza KAppliChemA4392
GlycoBlueLife TechnologiesAM9516
Kompletne inhibitory proteazy wolne od ultra EDTARoche5892791001
NEBNext Multiplex Oligos dla Illumina ( Zestaw starterów indeksowych 1)New England BiolabsE7335Adapter do sekwencjonowania, starter do PCR do przodu (nieindeksowany) i starter do PCR do odwróconego (indeksowany) oraz enzym USER używane w sekcji przygotowania biblioteki są składnikami tego zestawu
NEBNext Ultra II DNA Library Prep PrepEngland BiolabsE7645End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix i Polymerase Master Mix używane w sekcji Przygotowanie biblioteki to Składniki tego zestawu
Covaris S2 AFA SystemCovaris
DNA LoBind Probówki, 1,5 mlsitko do komórek Eppendorf0030108051
Falcon 100 µ mCorning352360Kosze do pobierania zarodków
37% formaldehyduVWR437536C
HeptanAppliChem122062.1612
M165 FC fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyAparat DFC Leica
M165 FCLeica
MetalCarl RothP985.1Służy do lizy zarodków w Krok 4.1.4
RNaza AAppliChemA3832,0050
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65002Koraliki magnetyczne powlekane streptawidyną
Koraliki Ampure XPBeckman CoulterA63881
Fluorometr Qubit 3.0Thermo Fisher ScientificQ33216
Probówki do testów kubitowychThermo Fisher ScientificQ32856
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP4417
eGFP-PCNA muchyPrezent od S. Blythe i E. Wieschaus
Podchloryn sodu 13%Thermo FisherAC219255000
Triton X-100AppliChemA4975
Bufor Tris pH 8,0 (1 M) dla biologii molekularnejAppliChemA4577
NaClAppliChemA2942
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896
1,5 ml probówki do mikrowirówekGreiner Bio-One616201
SDS dla biologii molekularnejAppliChemA2263
10x buforCutSmartNew England BiolabsB7204SBufor enzymatyczny restrykcyjny
PCR Mieszanka nukleotydówSigma-Aldrich11814362001Niezmodyfikowany dCTP, dGTP, dTTP
BSA, klasa biologii molekularnejNew England BiolabsB9000S
EDTA 0,5 M roztwór do biologii molekularnejAppliChemA4892
Octan sodu 3 M pH 5,2Sigma-AldrichS7899
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321DStojak magnetyczny
Intelli-Mixer RM-2LOmnilab5729802Rotator
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012Mixer
Małe klatki do pobierania zarodkówFlystuff.com59-100Klatka do zbierania jaj
Wirówka 5424  REppendorf5404000413
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851148
Paski probówki PCRGreiner Bio-One673275
NEBuffer 2.1New England BiolabsB7202ST4 Bufor polimerazy DNA
New Mikrotłuczek

Bibliografia

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Jin, F., et al. A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells. Nature. , (2013).
  5. Rao, S. S. P., et al. A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  6. Darbellay, F., Duboule, D. Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci. Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).
  7. Beagan, J. A., et al. Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming. Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).
  8. Andrey, G., et al. Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding. Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).
  9. Krijger, P. H. L., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  10. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  11. Ghavi-Helm, Y., et al. Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase. Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).
  12. Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).
  13. Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition. Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).
  14. Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis. eLife. 5, e20148(2016).
  15. JoVE Science Education Database. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , JoVE, Cambridge, MA. (2017).
  16. Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos. Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).
  17. Shermoen, A. W. Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).
  18. Ay, F., Noble, W. S. Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome. Genome biology. 16 (1), 183(2015).
  19. Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking. BMC Genomics. 18 (1), (2017).
  20. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing. Genome Biology. 16 (1), (2015).
  21. Durand, N. C., et al. Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments. Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).
  22. Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines. Methods. 72, 65-75 (2015).
  23. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  24. Shin, H., et al. TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes. Nucleic Acids Res. 44 (7), e70(2016).
  25. Kruse, K., Hug, C. B., Hernández-Rodríguez, B., Vaquerizas, J. M. TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms. Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).
  26. Lévy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data. Bioinformatics. 30 (17), Oxford, England. i386-i392 (2014).
  27. Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. Identification of alternative topological domains in chromatin. Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14(2014).
  28. Crane, E., et al. Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation. Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).
  29. Durand, N. C., et al. Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom. Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).
  30. Zhou, X., et al. Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser. Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).
  31. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. bioRxiv. , 115063(2017).
  32. Kerpedjiev, P., et al. HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps. bioRxiv. , 121889(2017).
  33. Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription. Cell. 169 (2), (2017).
  34. Berkum, N. L., et al. Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).
  35. Naumova, N., et al. Organization of the mitotic chromosome. Science. 342 (6161), 948-953 (2013).
  36. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  37. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok Hi Csortowanie embrion wmikroskopia fluorescencyjnamarker j drowyHi C in situbiblioteka sekwencjonowaniadomena asocjacyjna topologiczniep tle chromatyny

Powiązane artykuły