Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Przechwytywanie konformacji chromatyny (3C) okazało się wyjątkowo użyteczną metodą badania topologii chromatyny w jądrze¹. Wariant 3C Hi-C pozwala na pomiar częstości kontaktowych wszystkich oddziaływań chromatyny, które zachodzą w jądrze w jednym eksperymencie². Zastosowanie Hi-C odegrało ważną rolę w odkryciu i scharakteryzowaniu wielu podstawowych zasad organizacji chromatyny, takich jak TAD, przedziały i pętle^3,4,5.

Badania nad architekturą chromatyny w kontekście przemian rozwojowych i różnicowania komórek są coraz częściej wykorzystywane do odkrywania mechanizmów regulacji genów podczas tych procesów^6,7,8,9. Jednym z bardzo interesujących organizmów modelowych jest Drosophila melanogaster, którego rozwój i genom są dobrze scharakteryzowane. Przeprowadzono jednak niewiele badań, które badają architekturę chromatyny u Drosophila poza warunkami hodowli tkankowej in vitro^10,11. W zarodkach 16–18 godzin po zapłodnieniu zidentyfikowano TAD i kompartmenty przypominające podobne struktury u ssaków¹⁰, co rodzi pytanie, jaką rolę odgrywają w regulacji genów podczas rozwoju zarodka Drosophila. Szczególnie we wczesnych stadiach rozwoju, przed gastrulacją, takie badania są technicznie trudne. Przed gastrulacją zarodki Drosophila przechodzą 13 synchronicznych podziałów jądrowych, które przebiegają w niezwykle szybkim tempie 8–60 minut na cykl^12,13. Ponadto brak cech wizualnych pozwalających na rozróżnienie różnych stadiów utrudnia uzyskanie ściśle zaawansowanego materiału zarodkowego w wystarczających ilościach.

W celu opracowania protokołu, który pozwala badać architekturę chromatyny we wczesnym rozwoju Drosophila w rozdzielczości cyklu jądrowego, połączyliśmy dwie istniejące techniki: in situ Hi-C, która pozwala na generowanie map kontaktowych całego genomu w wysokiej rozdzielczości⁵, oraz ocenę zarodka za pomocą transgenicznej linii Drosophila wyrażającej transgen eGFP-PCNA^13,14. Ten transgen lokalizuje się w jądrze podczas interfazy i rozprasza się w syncytialnej blastodermie podczas mitozy. Korzystając z tej właściwości, można łatwo odróżnić różne stadia na podstawie ich gęstości jądrowej i zarodki mitotyczne na podstawie dyspersji sygnału GFP.

Razem, techniki te umożliwiają badanie trójwymiarowej struktury chromatyny w wysokiej rozdzielczości z zaledwie 20 zarodków Drosophila. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące zbierania i sortowania zarodków Drosophila w celu uzyskania populacji zarodków z pojedynczego cyklu podziału jądrowego. Dalej opisano, w jaki sposób uzyskane zarodki są wykorzystywane do wykonywania in situ Hi-C. Efektem końcowym jest biblioteka nukleotydów odpowiednia do sekwencjonowania na maszynach sekwencjonujących nowej generacji. Uzyskane odczyty sekwencjonowania można następnie przetworzyć na szczegółowe mapy interakcji chromatyny obejmujące cały genom Drosophila.

1. Kolekcja zarodków Drosophila

UWAGA: Równoważne pobranie zarodków może być przeprowadzone, jak pokazano w poprzedniej publikacji¹⁵.

1. Przenieś młode muchy eGFP-PCNA (w wieku <1 tygodnia) do klatek zbierania jaj z płytkami drożdży¹⁶ (1% etanolu, 1% kwasu octowego i 4% agaru).
2. Przenieść klatki do inkubatora ustawionego w temperaturze 25 °C. Inkubacja przez 1-2 dni przed pobraniem jaj znacznie poprawia wydajność jaj. Wymieniaj talerze zbiorcze dwa razy dziennie.
3. Wyjmować płytki zawierające zarodki z komory pobierania w odstępach 30–60 minut. Krótsze odstępy skutkują mniejszą liczbą zarodków, ale ściślejszym rozmieszczeniem etapów rozwojowych. Zbieraj z wielu klatek równolegle, tak aby co 30–60 minut składano >200 jaj.
4. Przechowywać płytki w temperaturze 25 °C do momentu, gdy zarodki osiągną pożądany wiek. W przypadku zarodków w stadium blastodermy (cykl jądrowy 14) inkubować przez około 2 godziny.
5. Po 2 godzinach inkubacji dodaj wodę z kranu z butelki ze spryskiwaczem do płytki zbiorczej, tak aby cała powierzchnia była pokryta wodą. Zawieś zarodki i drożdże za pomocą miękkiej szczotki.
6. Wlej zawieszone zarodki z płytki do pobierania zarodków do kosza do pobierania zarodków (dobrze sprawdzają się komercyjne sitka do komórek o wielkości porów 100 μm lub kosze domowej roboty¹⁷), dodając dodatkową wodę z kranu z butelki do spryskiwania, jeśli to konieczne. Na tym etapie połącz zarodki ze wszystkich płytek, które zostały zebrane równolegle. Próbka zbiorcza reprezentuje pojedynczą partię.
7. Dobrze umyj zarodki, płucząc kosz wodą z kranu z butelki ze spryskiwaczem przez 30 sekund, aż wszystkie pozostałości drożdży zostaną zmyte.
8. Dekorionate zarodków, umieszczając kosz do pobierania w 2,5% roztworze podchlorynu sodu w wodzie. Lekkie mieszanie przez wirowanie ułatwia usuwanie kosmówki. Kontynuuj, aż zarodki będą wystarczająco hydrofobowe, aby unosiły się na powierzchni roztworu, gdy kosz zostanie wyjęty i ponownie zanurzony, co powinno zająć ~1,75–2 min.
   Uwaga: Podchloryn sodu jest. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Roztwory zawierające <10% podchlorynu sodu można zwykle wyrzucić do zlewu, należy zapoznać się z regulaminem instytutu goszczącego.
9. Wyjmij kosz z roztworu i dokładnie spłucz wodą z kranu z butelki ze spryskiwaczem, aż zapach wybielacza przestanie być wyczuwalny.

2. Utrwalenie zarodka

UWAGA: Optymalne warunki utrwalania, przede wszystkim stężenie detergentu, formaldehydu i czas trwania, muszą być empirycznie określone, aby pasowały do stadium zarodków. W przypadku stadiów wokół blastodermy syncytialnej dobrze sprawdza się końcowe stężenie 0,5% Triton X-100 i 1,8% formaldehydu w fazie wodnej. W późniejszych stadiach po stadium 9 zarodka może być konieczna dalsza optymalizacja tych parametrów. Wszystkie roztwory używane podczas utrwalania i sortowania powinny zawierać inhibitory proteazy.

1. Odwróć kosz zbiorczy i umieść go na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać zarodki z kosza do probówki za pomocą pipety Pasteura dozującej PBS-T (PBS, 0,5% Triton X-100).
2. Pozwól zarodkom osiąść na dnie i dostosuj całkowitą objętość do 2 ml za pomocą PBS-T.
3. Dodaj 6 ml heptanu i 100 μl 37% formaldehydu do wody.
   Uwaga: Heptan i formaldehyd są toksyczne w przypadku wdychania lub po kontakcie ze skórą. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem. Odpady zawierające heptan lub formaldehyd należy utylizować oddzielnie zgodnie z przepisami instytutu przyjmującego.
4. Po dodaniu formaldehydu uruchom 15-minutowy timer i energicznie potrząsaj rurką w górę iw dół przez 1 minutę ręcznie. Faza wodna i organiczna połączą się, tworząc konsystencję przypominającą szampon.
5. Mieszać na mieszalniku rotacyjnym do 10 minut po dodaniu formaldehydu.
6. Wirować przy 500 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby zebrać zarodki na dnie probówki.
7. Odessać cały płyn podobny do szamponu i wyrzucić go, uważając, aby nie zassać żadnych zarodków. Niewielkie ilości supernatantu przypominającego szampon nie powodują problemów.
8. 15 minut po dodaniu formaldehydu ponownie zawieś zarodki w 5 ml PBS-T ze 125 mM glicyną w celu wygaszenia formaldehydu. Mieszaj energicznie, wstrząsając w górę iw dół przez 1 minutę.
9. Wirować przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę i odsysać supernatant.
10. Umyj zarodki, umieszczając je ponownie w 5 ml lodowatego PBS-T. Niech zarodki osiądą i zaaspirują cały supernatant.
11. Powtórz pranie w kroku 2.10 jeszcze dwa razy.
12. Trzymaj zarodki na lodzie do czasu sortowania. Zazwyczaj dobrym pomysłem jest zebranie 3–4 partii zarodków much przed przystąpieniem do sortowania. Jednak zarodki powinny być sortowane tego samego dnia. Dłuższe przechowywanie na lodzie lub w lodówce prowadzi do zmiany morfologii zarodka.

3. Sortowanie zarodków

UWAGA: Sortowanie można przeprowadzić na dowolnym fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym wyposażonym w filtr GFP przy powiększeniu 60-80X.

1. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś partię około 100 zarodków do małego szklanego naczynia odpowiedniego do sortowania, najlepiej o ciemnym kolorze, i umieść ją na lodzie.
2. Sortuj zarodki według gęstości jądrowej i statusu cyklu komórkowego (Rysunek 1), wpychając pożądane zarodki do osobnego stosu za pomocą końcówki igły lub strzykawki.
   1. Usuń wszystkie zarodki z rozproszoną, niejądrową dystrybucją eGFP-PCNA (Rysunek 1E). Również zarodki, które częściowo wykazują niejądrowy sygnał GFP, powinny zostać usunięte.
   2. Aby pomóc w sortowaniu, zbierz zestaw zarodków referencyjnych w cyklu jądrowym 12, 13 i 14 w każdej partii, korzystając z rysunków w Rysunek 1 jako przewodnika. Użyj tego składu, aby dopasować zarodki w nieznanym stadium do jednego z zarodków referencyjnych w celu określenia ich stadium zaawansowania.
   3. Aby zweryfikować stadium rozwojowe zarodków referencyjnych, należy zmierzyć gęstość jądrową, obrazując zarodek i zliczając liczbę jąder na powierzchni zarodka w obszarze 2 500 μm² za pomocą oprogramowania do obrazowania, które dostarcza informacji o odległości.
      UWAGA: Oczekiwana liczba jąder na obszarze 2 500^μm2 wynosi od 12 do 16 jąder w 12 cyklu jądrowym i od 20 do 30 jąder w cyklu jądrowym 13¹³.
3. Gdy wszystkie zarodki na odpowiednim etapie zostaną oddzielone, należy zrobić zdjęcia zarodków w celu dokumentacji i kontroli jakości. Jeśli mikroskop stereoskopowy nie jest sam w sobie wyposażony w moduł kamery, można użyć dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrami GFP.
4. Odpipetować pożądane zarodki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, przenieść do świeżej probówki i umieścić na lodzie.
5. Kontynuuj, aż zostanie posortowana wystarczająca liczba zarodków do planowanego eksperymentu. W przypadku zarodków starszych niż 9 stadium zazwyczaj 20 zarodków wystarcza do jednego eksperymentu in situ Hi-C. W 12 cyklu jądrowym dobrym punktem wyjścia jest 80 zarodków. We wcześniejszych cyklach liczba zarodków powinna być w przybliżeniu podwajana dla każdego cyklu.
6. Zebrać i podzielić zarodki na probówki o pojemności 1,5 ml w taki sposób, aby jedna probówka zawierała wystarczającą ilość zarodków do przeprowadzenia pojedynczego eksperymentu in situ Hi-C. Zaleca się stosowanie probówek o niskiej charakterystyce wiązania DNA, ponieważ ta sama probówka będzie używana do całego protokołu, a adsorpcja DNA może prowadzić do znacznych strat przy niskich stężeniach DNA.
7. Krótko zakręcić probówkami o sile 100 x g w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Zarodki powinny być jak najbardziej suche do zamrożenia.
8. Zarodki należy błyskawicznie zamrozić, zanurzając probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. In situ hi-c

1. Lizy
   1. Umieść probówki z zamrożonymi zarodkami na lodzie.
   2. Ponownie zawiesić zarodki w 500 μl lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% IGEPAL CA-630, inhibitory proteazy; rozpuszczone w wodzie). Następnie odczekaj 1 minutę, aby zarodki osiadły na dnie probówki.
   3. Zmiel zarodki za pomocą metalowego mikrotłuczka, wstępnie schłodzonego na lodzie, który jest zaprojektowany tak, aby ściśle pasował do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      1. Aby uniknąć potrząsania zarodkami, wkładaj tłuczek powoli, aż dotknie dna tuby, dociśnij, a następnie zmiel, obracając tłuczek dwukrotnie w obu kierunkach.
      2. Podnieś tłuczek bardzo lekko, ponownie dociśnij do dna rurki i powtórz mielenie.
      3. Powtórzyć 4.1.3.2 10 razy lub do momentu, gdy zarodki zostaną całkowicie zjedzone. Roztwór powinien być jednorodny i nie powinny pozostać żadne resztki dużych kawałków zarodków.
   4. Inkubować homogenizowaną zawiesinę na lodzie przez 15 minut. Wirować w temperaturze 1 000 x g, 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
   5. Przemyć osad przez ponowne zamieszanie w 500 μl lodowatego buforu do lizy, pipetując w górę iw dół.
   6. Odwirować ponownie jak w 4.1.4 i odrzucić supernatant.
   7. Ponownie zawiesić przemyty osad w 100 μl 0,5% dodecylosiarczanu sodu (SDS), pipetując w górę iw dół. Przepuszczalność jąder przez inkubację przez 10 minut w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym. Ugasić SDS dodając 50 μl 10% Triton X-100 i 120 μl wody. Wymieszaj, przesuwając rurkę.
   8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w bloku grzewczym.
2. Trawienie enzymatyczne restrykcyjne
   1. Dodać 25 μl 10x buforu enzymatycznego restrykcyjnego i 20 U 5 U/μL MboI. Wymieszaj, przesuwając rurkę.
   2. Trawić DNA przez inkubację przez 90 minut w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym przy lekkim mieszaniu (750 obr./min).
   3. Dodaj kolejne 20 j. MboI i kontynuuj inkubację przez 90 minut.
   4. Inaktywować MboI na gorąco przez inkubację w temperaturze 62 °C przez 20 min.
3. Wypełnienie zwisu
   UWAGA: Wypełnienie zwisu biotynylowanym dATP pozwala na selekcję konkretnych podwiązanych fragmentów. Biotyna-dATP na połączeniach ligacyjnych jest chroniona przed aktywnością egzonukleazy polimerazy DNA T4 (sekcja 4.6), podczas gdy biotyna-dATP na nieligowanych końcach jest skutecznie usuwana. Pulldown za pomocą kulek pokrytych streptawidyną w sekcji 4.7 jest zatem specyficznie wzbogacony o związane, chimeryczne fragmenty DNA.
   1. Dodać 18 μl 0,4 mM biotyny-14-dATP, 2,25 μl niezmodyfikowanej mieszanki dCTP/dGTP/dTTP (po 3,3 mM) i 8 μl 5 μL fragmentu polimerazy DNA I Klenowa.
   2. Wymieszać przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut w bloku grzewczym.
4. Ligacji
   1. Dodać 657 μl wody, 120 μl 10x bufor ligazy DNA T4, 100 μl 10% Triton X-100, 6 μl 20 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i wymieszać, przesuwając probówkę. Na koniec dodaj 5 μl 5 U/μL ligazy DNA T4 i wymieszaj, przesuwając probówkę.
   2. Delikatnie obracaj rurkę (20 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
   3. Dodaj drugą dawkę 5 μl ligazy DNA T4 o stężeniu 5 μl / μl i kontynuuj obracanie przez kolejne 2 godziny.
   4. Odwirowywać jądra w temperaturze 2 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
5. Ekstrakcja DNA
   1. Zawiesić osad w 500 μl buforu ekstrakcyjnego (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 1% SDS; rozpuszczony w wodzie) i dodać 20 μl 20 mg/ml proteinazy K. Wymieszać, przesuwając probówkę.
   2. Białko trawić przez inkubację w temperaturze 55 °C przez 30 minut, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min.
   3. Aby usunąć sieciowanie, dodać 130 μl 5 M NaCl i inkubować przez noc w temperaturze 68 °C, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min.
   4. Pobrać pipetę do nowej probówki o pojemności 2 ml, najlepiej o niskiej charakterystyce wiązania DNA.
   5. Dodać 0,1 x objętość (63 μl) 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 2 μl 15 mg/ml GlycoBlue. Dobrze wymieszaj, odwracając. Dodać 1,6 razy większą objętość (1,008 μl) czystego absolutnego etanolu i wymieszać przez odwrócenie.
   6. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 15 minut. Wirować przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut. Osad DNA jest często bardzo mały, prawie niewidoczny i można go dostrzec tylko dzięki niebieskiemu kolorowi GlycoBlue.
   7. Usunąć supernatant bardzo ostrożnie, przesuwając końcówkę pipety do probówki wzdłuż przeciwnej ścianki od miejsca, w którym znajduje się osad DNA. Małe pozostałe kropelki są często łatwo usuwane podczas tego etapu i następujących po nim prań, wypychając je z probówek za pomocą końcówki P10, a nie pipetując.
   8. Umyj granulat, dodając 800 μL 70% etanolu. Mieszać przez odwrócenie i odwirowywać przy 20 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz to pranie co najmniej raz.
   9. Usuń wszelkie ślady etanolu i pozostaw probówkę z otwartą pokrywką na maksymalnie 5 minut do wyschnięcia na powietrzu. Gdy nie pozostanie żaden płyn, dodaj 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Kilkakrotnie pipetować roztwór nad obszarem na ściance probówki, w którym znajdowała się osadka, aby rozpuścić DNA.
   10. Dodać 1 μl 20 mg/ml RNazy A, wymieszać przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu strawienia RNA. Próbka może być teraz przechowywana w lodówce przez noc lub zamrożona w temperaturze -20 °C na czas nieokreślony.
   11. Sprawdź stężenie DNA za pomocą testu na bazie barwnika fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowita ilość DNA w próbce powinna wynosić co najmniej 10 ng, w przeciwnym razie dostępna jest zbyt mała ilość materiału do amplifikacji, a złożoność biblioteki będzie prawdopodobnie niska. Kiedy tak się dzieje, ilość materiału wyjściowego była prawdopodobnie niewystarczająca lub materiał został utracony po drodze, być może podczas lizy i wytrącania.
6. Usuwanie biotyny i ścinanie DNA
   1. Dodać do siebie 12 μl 10x buforu polimerazy DNA T4, 3 μl 1 mM dATP, 3 μl 1 mM dGTP i 46 μl wody. Wymieszaj, przesuwając rurkę. Dodać 5 μl 3 U/ml polimerazy DNA T4, wymieszać przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut.
   2. Dodać 3 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję i użyć wody, aby doprowadzić próbkę do objętości około 120 μl.
   3. Ścinać DNA do wielkości 200–400 pz za pomocą urządzenia do sonikacji zgodnie z instrukcjami producenta. Używając sonikatora wymienionego w Tabeli Materiałów, odpowiedni jest następujący program: 2 cykle każdy po 50 s, 10% obciążenia, intensywność 5, 200 cykli/serię.
7. Ściąganie biotyny
   1. Odpipetować 30 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną o sreptawidynie do nowej probówki, oddzielić je na stojaku magnetycznym i wyrzucić supernatant.
   2. Ponownie zawiesić kulki w 1x buforze czarno-białym (5 mM Tris-Cl pH 7,4, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl; rozpuszczone w wodzie) + 0,1% Triton X-100 i wymieszać przez wirowanie. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1–5 minut, aż koraliki zostaną oddzielone, w zależności od marki i modelu.
   3. Odessać i wyrzucić supernatant, przesuwając końcówkę pipety wzdłuż ścianki przeciwnej do miejsca, w którym znajdują się kulki. Ponownie zawieś kulki w 120 μl 2x bufora czarno-białego (10 mM Tris-Cl pH 7,4, 1 mM EDTA i 2 M NaCl). Wymieszaj przez wirowanie.
   4. Przenieś ścięte DNA do nowej probówki o niskiej zawartości wiązania DNA i wymieszaj ze 120 μl zawiesiny kulek w buforze 2X B&W przez wirowanie. Obracaj kulki z próbką DNA z prędkością 20 obr./min przez 15 minut.
   5. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i wyrzuć supernatant.
   6. Zawiesić kulki w 600 μl 1x B&W + 0,1% Triton X-100 i inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 minuty, wstrząsając z prędkością 1 000 obr./min. Po rozdzieleniu odrzucić supernatant. Powtórz to pranie raz.
   7. Przemyć kulki raz 600 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0 i wyrzucić supernatant po oddzieleniu.
   8. Zawiesić kulki w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0.

5. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

UWAGA: Wszystkie kroki biblioteki są wykonywane przy użyciu komponentów z komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki DNA (zobacz Tabelę materiałów). Można jednak zastąpić je alternatywnymi zestawami lub innymi odczynnikami. Podczas przechowywania w zamrażarce w środku przygotowawczym biblioteki pojawiają się opady. Dlatego ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie opady zostały rozpuszczone przed użyciem odczynników.

1. Zakończ naprawę
   1. Przenieś zawiesinę kulek w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0 do nowej probówki do PCR.
   2. Dodać 3 μl mieszanki enzymatycznej end prep i 7 μl buforu reakcyjnego end prep. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
   3. Przenieś rurkę do termocyklera i uruchom następujący program: 20 °C przez 30 min, 65 °C przez 30 min i trzymaj w temperaturze 4 °C.
2. Podwiązanie adaptera
   1. Do zawiesiny perełek dodać 30 μl Ligation Master Mix, 2,5 μl 1,5 μM adaptera do sekwencjonowania (rozcieńczyć do 1,5 μM z magazynu) i 1 μl Ligation Enhancer. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
   2. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut w termocyklerze.
   3. Dodać 3 μl enzymu USER. Mieszać, pipetując w górę i w dół.
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w termocyklerze.
   5. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
   6. Aby umyć kulki, ponownie zamów je w 100 μl 1x B&W buffer + 0,1% Triton X-100. Wymieszać przez wirowanie i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.
   7. Powtórz to płukanie raz, używając 600 μl tego samego buforu.
   8. Ponownie zawiesić kulki w 600 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0, wymieszać przez wirowanie i przenieść kulki do nowej probówki.
   9. Oddziel kulki na stojaku magnetycznym, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś kulki w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0.
3. Amplifikacja PCR
   1. Przygotuj dwie probówki PCR i w każdej z nich wymieszaj 25 μl Polymerase Master Mix, 1,5 μl 10 μM (nieindeksowanego) startera PCR i 1,5 μl 10 μM odwróconego (indeksowanego) startera PCR.
      UWAGA: Starter PCR do przodu (nieindeksowany):
      5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3'.
      Odwrócony (indeksowany) starter PCR:
      5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATC*T-3'. * wskazuje wiązania fosforopianianowe i Ns w indeksowanym starterze PCR.
   2. Do każdej probówki dodać 22 μl zawiesiny kulek i mieszać, pipetując w górę i w dół.
   3. Uruchom PCR za pomocą następującego programu: 98 °C przez 1 min, (98 °C przez 15 s, 65 °C przez 75 s, wzrost 1,5 °C/s) powtórzone 9-12 razy, 65 °C przez 5 minut i przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Liczba cykli amplifikacji musi być określona empirycznie. Okazało się jednak, że biblioteki, które wymagały więcej niż 12 cykli, były na ogół mało skomplikowane i nie dawały wysokiej jakości map Hi-C. Z drugiej strony, biblioteki, które wymagały mniej niż 12 cykli, nie miały negatywnego wpływu na amplifikację przez pełne 12 cykli. Dlatego możliwe jest domyślne ustawienie na 12 cykli wzmocnienia.
   4. Zebrać dwie reakcje PCR w jednej probówce do mikrowirówki, oddzielić kulki na stojaku magnetycznym i przenieść supernatant zawierający bibliotekę do nowej probówki.
4. Wybór rozmiaru
   1. Doprowadź zawiesinę kulek Ampure XP do temperatury pokojowej i dobrze wymieszaj, potrząsając.
   2. Doprowadzić objętość zbiorczej reakcji PCR dokładnie do 200 μl z wodą. Podczas PCR i separacji magnetycznej część pierwotnej objętości jest zwykle tracona. Sprawdzić objętość, ustawiając pipetę na 200 μl i odessać całą objętość reakcji. Jeśli powietrze jest zasysane, należy dodać więcej wody. Jeśli objętość przekracza 200 μl, dostosuj proporcjonalnie objętość kulek dodanych w krokach 5.4.3 i 5.4.6.
      UWAGA: Objętości w nawiasach są ważne, jeśli całkowita objętość połączonych reakcji PCR wynosi dokładnie 200 μl.
   3. Dodać 0,55 razy więcej objętości (110 μl) zawiesiny perełkowej Ampure XP i mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min, oddzielać koraliki na stojaku magnetycznym przez 5 minut.
   5. Przenieść supernatant do nowej probówki. Wyrzuć probówkę zawierającą koraliki. Koraliki mają związane DNA >700 pz, które jest zbyt duże, aby można je było zsekwencjonować.
   6. Do supernatantu dodać 0,2 x objętość (40 μl, co daje w sumie 0,75 x bufor Ampure w próbce) zawiesiny kulek Ampure XP i wymieszać pipetując w górę i w dół 10 razy.
   7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min, oddzielać koraliki na stojaku magnetycznym przez 5 minut.
   8. Odrzuć supernatant zawierający DNA <200 pz, który zawiera wolne startery, dimery starterów i fragmenty zbyt małe, aby można je było zsekwencjonować.
   9. Pozostaw rurkę na stojaku magnetycznym. Aby umyć kulki, dodaj 700 μl 80% etanolu, uważając, aby nie naruszyć granulki kulek i inkubuj przez 30 sekund.
   10. Wyrzuć supernatant, a następnie zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 100 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Wymieszać pipetując w górę i w dół 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
   11. Dodać 0,8x objętość (80 μl) zawiesiny do perełek Ampure XP. Wymieszać pipetując w górę i w dół 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ta druga runda wyboru dolnego rozmiaru ogranicza zapewnia, że ostateczna biblioteka jest całkowicie wolna od starterów i dimerów starterów.
   12. Oddziel kulki na stojaku magnetycznym na 5 minut i wyrzuć supernatant.
   13. Umyj granulkę kulki dwukrotnie 700 μl 80% etanolu przez 30 s każdy, pozostawiając probówkę na stojaku magnetycznym, jak wyżej.
   14. Trzymając rurkę nadal na stojaku magnetycznym, usuń wszelkie ślady etanolu. Pomaga wypchnąć kropelki etanolu z rurki za pomocą pipety P10. Pozostawić resztki etanolu do odparowania przez maksymalnie 5 minut.
   15. Zdejmij probówkę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś kulki w 50 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
   16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie oddzielić kulki na stojaku magnetycznym.
   17. Przenieść supernatant do świeżej probówki. Jest to ostatnia biblioteka Hi-C, gotowa do ilościowego oznaczania i sekwencjonowania na maszynach sekwencjonujących nowej generacji, zgodnie z instrukcjami producenta.

Posortowane populacje zarodków w cyklu jądrowym 12, 13 i 14 (odpowiadającym odpowiednio 1:30, 1:45 i 2:10 godziny po zapłodnieniu12) i 3–4 godziny po zapłodnieniu (HPF) uzyskano zgodnie z procedurami opisanymi w protokole. Wykonując zdjęcia sygnału eGFP-PCNA z każdej posortowanej partii zarodków, możliwe jest udokumentowanie dokładnego etapu i statusu cyklu komórkowego każdego pojedynczego zarodka, który jest wykorzystywany w dalszych eksperymentach. Przykładowe zdjęcia zarodków z posortowanych populacji są pokazane w Rysunek 1B-E. Wynikiem protokołu Hi-C in situ jest biblioteka nukleotydów gotowa do sekwencjonowania na maszynach sekwencjonujących nowej generacji. W tym celu zwykle wymagane jest końcowe stężenie biblioteczne wynoszące co najmniej 2–4 nM. Przy użyciu zalecanych ilości materiału wsadowego stężenie to jest niezawodnie osiągane (tabela 1).

Oczekiwany rozkład wielkości fragmentów DNA po wybraniu rozmiaru wynosi od 300 do 600 pz, z maksimum około 500 pz (Rysunek 2A), w zależności od dokładnych parametrów ścinania i wyboru rozmiaru. Do sekwencjonowania zalecamy odczyty sparowanych końców o długości co najmniej 75 pz, aby zminimalizować liczbę niemożliwych do zmapowania fragmentów restrykcyjnych w genomie. Mapy o wysokiej rozdzielczości i rozmiarze kosza 1–2 kb można uzyskać z 400 milionów odczytów. Zalecamy sekwencjonowanie wielu powtórzeń biologicznych na mniejszej głębokości ~150 milionów odczytów każdy, zamiast sekwencjonowania pojedynczej repliki na bardzo dużej głębokości. Pozwala to na ocenę zmienności biologicznej i prowadzi do mniejszej liczby odrzuconych odczytów z powodu duplikacji PCR. W celu reprezentacji wizualnej repliki można łączyć. Przed podjęciem decyzji o sekwencjonowaniu próbki na dużej głębokości zalecamy uruchomienie próbek przy użyciu płytkiego sekwencjonowania (kilka milionów odczytów na próbkę) w celu określenia podstawowych parametrów jakości biblioteki, jak w Rysunek 2B.

Analiza danych Hi-C wymaga znacznych zasobów obliczeniowych i wiedzy bioinformatycznej. Z grubsza rzecz biorąc, sparowane odczyty są mapowane niezależnie do genomu referencyjnego, wynikowe wyrównania są filtrowane pod kątem jakości i orientacji, a następnie z przefiltrowanych dopasowań można wygenerować macierz kontaktów o danej rozdzielczości przedziału lub poziomie fragmentu. Macierz kontaktowa jest podstawą do wszystkich dalszych analiz eksplorujących TAD, pętle i przedziały. Do wstępnej analizy odczytów sekwencjonowania dostępnych jest kilka potoków bioinformatycznych, które umożliwiają przetwarzanie surowych odczytów na matryce kontaktowe bez dużej specjalistycznej wiedzy bioinformatycznej18,19,20,21,22,23. Sposób przeprowadzenia dalszej analizy zależy w dużej mierze od dokładnego badanego zagadnienia biologicznego i może wymagać znacznego doświadczenia w programowaniu i pisaniu skryptów w języku R lub Python. Dostępnych jest jednak kilka narzędzi i algorytmów do wywoływania TADów5,24,25,26,27,28, a także oprogramowanie do analizy i eksploracji danych Hi-C w przeglądarce internetowej oraz jako samodzielne aplikacje komputerowe29,30,31,32.

Po przetworzeniu, jakość biblioteki można określić za pomocą różnych wskaźników (Rysunek 2B). Po pierwsze, wskaźnik duplikatów PCR, czyli liczba sekwencjonowanych par odczytu pochodzących z tej samej oryginalnej cząsteczki, powinien być jak najniższy, aby ograniczyć ilość marnowanych odczytów sekwencji. Jednak nawet biblioteki z duplikacją >40% PCR mogą zostać przetworzone na wysokiej jakości mapy kontaktów, jeśli duplikaty są filtrowane. Po drugie, współczynnik filtrowanych odczytów ze względu na ich orientację, zgodnie z opisem w4, powinien być konsekwentnie niższy niż 10% wyrównanych par odczytu.

Podczas rozwoju przedżołądkowego Drosophila między 12 a 14 cyklem jądrowym, architektura jądrowa ulega drastycznej przebudowie33 (Rysunek 3). W 12 cyklu jądrowym wykrywanych jest niewiele TAD, a ogólny rozkład kontaktów jest bardzo płynny bez wielu dostrzegalnych cech. Sytuacja zmienia się dramatycznie w 13. i 14. cyklu jądrowym, kiedy TAD stają się coraz bardziej widoczne, a niespecyficzne kontakty dalekiego zasięgu są wyczerpane.

Rycina 1: Reprezentatywne zdjęcia zarodków eGFP-PCNA podczas sortowania. (A) sygnał eGFP-PCNA z niesortowanej populacji zarodków po 60 minutach pobierania i 2 godzinach inkubacji w temperaturze 25 °C (B-E) Przykłady zarodków z posortowanych populacji w cyklu jądrowym 12 (B), cyklu jądrowym 13 (C), cyklu jądrowym 14 (D) oraz z zarodków poddawanych synchronicznej mitozie (E). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady metryk jakości biblioteki Hi-C in situ. (A) Ślady bioanalizatora pokazujące rozkład rozmiarów fragmentów DNA z udanej biblioteki Hi-C (Biblioteka 1, u góry) oraz z biblioteki, która wyświetla szczyt fragmentów, które są zbyt duże do sekwencjonowania (Biblioteka 2, na dole). Biblioteka 2 została pomyślnie zsekwencjonowana, ale nawet większe ilości niepożądanych fragmentów DNA mogą prowadzić do zmniejszenia wydajności sekwencjonowania. (B) Statystyki filtrowania dwóch bibliotek Hi-C: wyświetlana jest liczba wyrównanych par odczytu, które są wyłączone z dalszej analizy ze względu na orientację i odległość odczytu (do wewnątrz, na zewnątrz)4 lub duplikacja PCR (duplikat). Na każdym pasku wykreślana jest liczba odczytów przechodzących przez filtr (pozostały) i zakończonych niepowodzeniem (przefiltrowanych). Procent odczytów przechodzących przez filtr jest dodatkowo wyświetlany jako tekst. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Mapy interakcji Hi-C z zarodków w stadium zaawansowania. Mapy interakcji Hi-C są binowane w rozdzielczości 10 kb i równoważone zgodnie z wcześniejszym opisem33. Pokazany jest region na chromosomie 2L. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista reprezentatywnych statystyk biblioteki sekwencjonowania. Dla każdej biblioteki w wykazie wskazuje się liczbę zarodków, które zostały użyte do jej wytworzenia, ilość całkowitego DNA przed pobraniem biotyny i ścinaniem mierzoną za pomocą kubitu, liczbę cykli PCR użytych do amplifikacji oraz końcowe stężenie biblioteki sekwencjonowania po oczyszczeniu i wyborze wielkości.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.