Tutaj prezentujemy ustandaryzowany protokół pomiaru różnicy potencjału nosowego (NPD). Transbłonowy regulator przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i funkcja nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) są oceniane na podstawie zmiany napięcia w nabłonku nosa po superfuzji roztworów, które modyfikują aktywność kanału jonowego, zapewniając miarę wyniku.
Artykuł metodologiczny
Standaryzowany pomiar różnicy potencjału przeznabłonkowego błony nosowej (NPD)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy standaryzowany pomiar różnicy potencjału nosa (NPD). W tej technice transbłonowy regulator przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i funkcja nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) są monitorowane przez zmianę napięcia w nabłonku nosa po superfuzji roztworów modyfikujących aktywność kanału jonowego. Jest to możliwe dzięki pomiarowi różnicy potencjałów między przedziałem podskórnym a nabłonkiem dróg oddechowych w nozdrzu, przy użyciu cewnika stykającego się z małżowiną nosową dolną.
Test pozwala na pomiar stabilnego napięcia podstawowego i kolejnych zmian napięcia netto po perfuzji 100 μM amilorydu, inhibitora reabsorpcji Na+ w roztworze Ringera; bezchlorkowego roztworu zawierającego amilord do sterowania wydzielaniem chlorków i 10 μM izoproterenolu w roztworze bez chlorków z amilordem w celu stymulacji cyklicznego przewodnictwa chlorków zależnego od monofosforanu adenozyny (cAMP) związanego z CFTR.
Ta technika ma tę zaletę, że demonstruje właściwości elektrofizjologiczne dwóch kluczowych składników tworzących hydratację płynu powierzchniowego dróg oddechowych nabłonka oddechowego, ENaC i CFTR. W związku z tym jest to przydatne narzędzie badawcze w badaniach fazy 2 i próbach potwierdzających słuszność koncepcji leków, które są ukierunkowane na aktywność CFTR i ENaC w leczeniu mukowiscydozy (CF) choroby płuc. Jest to również kluczowa procedura kontrolna w celu ustalenia dysfunkcji CFTR, gdy testy genetyczne i testy potu są niejednoznaczne. W przeciwieństwie do chlorku potu, test jest stosunkowo bardziej czasochłonny i kosztowny. Wymaga również przeszkolenia i wiedzy operatora, aby skutecznie przeprowadzić test. W tej technice odnotowano zmienność między i wewnątrz osobnika, zwłaszcza u osób młodych lub niewspółpracujących. Aby pomóc w rozwiązaniu tego problemu, interpretacja została ulepszona za pomocą niedawno zweryfikowanego algorytmu.
Wprowadzenie
Ogólnym celem tej metody jest pomiar różnicy potencjałów w jamie nosowej (NPD), który ma na celu zbadanie transportu jonów przez nabłonek in vivo1. Technika ta umożliwia pomiar transportu sodu (Na+) i chlorków (Cl-). NPD jest wykorzystywana jako narzędzie badawcze od końca lat 80. XX wieku i została uznana w 1998 roku za procedurę diagnostyczną zgodnie z oświadczeniem konsensusowym Cystic Fibrosis Foundation (CFF)2, a w 2017 roku w Wytycznych Diagnostycznych Konsensusu Cystic Fibrosis Foundation (CFF)3. W rzeczywistości biologiczna dysfunkcja CFTR, która jest przyczyną mukowiscydozy, objawia się zwiększonym wchłanianiem Na+ w błonie apikalnej oraz zaburzeniem sekrecji Cl-. Ten test funkcjonalny daje korzyść w postaci dodatkowego narzędzia diagnostycznego, gdy badania genetyczne są niejednoznaczne u pacjentów z nieokreślonymi, pośrednimi wynikami testu potowego3. Choć informacje te można uzyskać również poprzez biopsje z pomiarem prądu jelitowego (ICM), metoda ICM jest jednak dostępna tylko w kilku ośrodkach na świecie i wymaga dalszej standaryzacji. NPD jest bardziej dostępna, będąc oferowaną w około 60 ośrodkach na świecie, a ponadto koncentruje się na nabłonku oddechowym, który jest głównym miejscem występowania choroby.
Ze względu na dostarczane informacje na temat aktywności CFTR, metoda ta jest również stosowana w badaniach typu proof-of-concept, mających na celu ocenę funkcjonalnego przywrócenia białka CFTR za pomocą terapii modulatorowych4,5,6,7,8. Rzeczywiście, dane z badań nad edycją mRNA/genu CFTR oraz terapiami z użyciem potencjatorów i korektorów CFTR wskazują na istotne zmiany w transporcie Cl- i Na+ po zastosowaniu terapii6,9, co potwierdza, że NPD może być reaktywnym punktem końcowym w badaniach klinicznych. Ponieważ brakuje czułych klinicznych punktów końcowych zdolnych do wykrycia subtelnych zmian w stanie klinicznym pacjenta w krótkim terminie, ten prekliniczny biomarker może być bardzo informacyjny. Dziedzina terapii modulatorowych CFTR szybko się rozwija i pilnie potrzebujemy testów in vivo, które pozwolą na szybką identyfikację aktywnych związków przed przejściem do dużych badań fazy 310.
Fizjologiczne uzasadnienie tej techniki opiera się na pomiarze różnicy potencjałów między nabłonkiem dróg oddechowych w nozdrzu a przedziałem podskórnym. Aktywność kanałów jonowych bada się poprzez pomiar stabilnej maksymalnej bazowej różnicy potencjałów (PD), jej zmian po zablokowaniu zależnego od ENaC wchłaniania Na+ oraz stymulacji sekrecji Cl- poprzez różne apikalne transportery Cl-, w tym CFTR. Dysfunkcja CFTR objawia się minimalną zmianą różnicy potencjałów po stymulacji sekrecji Cl- za pośrednictwem szlaku zależnego od cAMP oraz zwiększonym wchłanianiem Na+ za pośrednictwem ENaC, co przejawia się bardziej ujemną bazową różnicą potencjałów i nasiloną odpowiedzią na amiloryd. Podstawy mechanistyczne różnic w PD między osobami chorymi na mukowiscydozę a osobami zdrowymi przedstawiono na Rysunku 1.
Rycina 1: Podsumowanie aktywności kanałów jonowych. (A) Aktywność jonowa w nabłonku oddechowym wykazująca zrównoważoną aktywność ENaC i CFTR u osób zdrowych oraz (B) utrata aktywności CFTR skutkująca zwiększonym transportem sodu za pośrednictwem ENaC i zmniejszonym transportem chlorków zależnym od CFTR. ENaC: nabłonkowy kanał sodowy, Na+: sod, CFTR: regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie, CL-: chlorek, mV: miliwolty, PD: różnica potencjałów, min: minuta/minuty Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Jednakże test ten wykazuje pewien stopień zmienności zarówno w przypadku wielokrotnych pomiarów u tego samego pacjenta, jak i pomiędzy pacjentami o tym samym genotypie. Ma to kluczowe znaczenie dla ułatwienia interpretacji zmian po leczeniu modulatorami. Ponadto wciąż brakuje zwalidowanych progów pozwalających odróżnić osoby z CF od osób zdrowych. Może to wynikać częściowo z różnic w dostępności placówek klinicznych oraz stosowanych technikach. W związku z tym trwa znaczący międzynarodowy wysiłek mający na celu standaryzację tego testu. Zarówno amerykańska CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network), jak i ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society-Clinical Trials Network) opracowały standardową procedurę operacyjną (SOP) dla NPD do stosowania w wieloośrodkowych badaniach klinicznych i badaniach naukowych. Ta niedawna współpraca CTN i TDN doprowadziła do stworzenia wspólnej, międzynarodowej procedury SOP, łączącej doświadczenie obu organizacji (2014)11. Niniejsza praca przedstawia protokół i techniki testowe wykorzystujące NPD w diagnostyce CF lub w badaniach typu proof-of-concept inicjowanych przez badacza. Każde ośrodek wdrażający tę technikę jest odpowiedzialny za złożenie wniosku o zatwierdzenie do swojej instytucjonalnej komisji etyki badań z udziałem ludzi.
Rysunek 2: Schemat całego zalecanego układu NPD. Zauważmy, że przedstawiono zalecany układ, obejmujący sekwencyjne pompy perfuzyjne oraz układ szeregowy z 4 kranikami. Szczegółowe połączenia i przykłady komponentów zostały przedstawione w SOP. (Schemat zmodyfikowany za zgodą Solomon, G.M. Chest, 201013) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Ogólny przebieg eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2, gdzie NPD jest mierzone pomiędzy mostkiem pomiarowym umieszczonym na powierzchni nabłonka a mostkiem referencyjnym umieszczonym w przestrzeni podskórnej, z których oba są połączone z elektrodami i woltomierzem o wysokiej impedancji.
Zapewniają to dwa różne systemy: dopuszczalne są dwa rodzaje konfiguracji elektrod odniesienia: (i) zrównoważone elektrody Ag/AgCl i wypełniony kremem do elektrokardiogramu (EKG) mostek połączony z przestrzenią podskórną poprzez lekkie znieranie naskórka lub (ii) nasycone półogniwa kalomelowe i igła o rozmiarze 22–24 G wypełniona agarem, wprowadzona podskórnie. Kontakt z błoną śluzową nosa jest możliwy dzięki cewnikowi dwuświatłowemu. Jeden światło jest wypełnione agarem lub kremem do EKG i połączone z elektrodą pomiarową, natomiast drugie umożliwia perfuzję różnych roztworów na błonę śluzową nosa.
Koniec rurki badawczej zostaje umieszczony na błonie śluzowej dróg oddechowych pod dolną małżowiną nosową (Rycina 3).
Rycina 3: Umieszczanie rurki badawczej na błonie śluzowej dróg oddechowych. (A) Widok zewnętrzny przedstawiający umieszczenie. (B) Widok rynoskopowy demonstrujący umieszczenie. (C) Schemat wskazujący anatomiczną lokalizację umieszczenia cewnika. PD: różnica potencjałów
Aby zbadać odpowiedź PD na kilka leków, roztwory do superfuzji podaje się przez drugi otwór cewnika. Istnieje kilka kluczowych etapów dotyczących przygotowania i przeprowadzania pomiarów NPD, które zostały szczegółowo opisane poniżej w protokole – od wstępnego przygotowania po analizę danych.
Po przygotowaniu roztworów i elektrod, przeprowadzenie odpowiednich testów jakości elektrod i cewników umożliwia rozpoczęcie badania. Pomiary bazowe wykonuje się wzdłuż małżowiny nosowej dolnej, co pozwala na wybór optymalnego miejsca pomiaru, zazwyczaj takiego, w którym odnotowano najbardziej ujemną wartość. Następnie sekwencyjne perfuzje określają strumień jonów Na+ (zależny od ENaC) i Cl- (zależny od CFTR) poprzez zmianę napięcia w obrębie nabłonka nosowego.
Protokół
Protokół z udziałem ludzi został zatwierdzony przez komitety ds. badań wszystkich uczestniczących instytutów. Każdy ośrodek wdrażający tę technikę jest odpowiedzialny za złożenie wniosku o zatwierdzenie do swojej instytucjonalnej komisji etyki badań z udziałem ludzi.
1. Przygotowanie roztworów
- Przed przystąpieniem do procedury należy przygotować roztwory bazowe nr 1, nr 2 i nr 3 w ilościach po 1 L i przechowywać je w miejscu badań (Tabela 1).
UWAGA: Amiloryda jest światłoczuła i musi być przechowywana w ciemności (skład roztworu znajduje się w Tabeli 1) (szczegółowy sposób przygotowania roztworów opisano w SOP11).- Wszystkie roztwory należy buforować do pH 7.4 i filtrować za pomocą filtra nakrętkowego 0,22 µm.
- W przypadku roztworu nr 3 najpierw należy dodać sole zawierające fosforany i odczekać do ich jonizacji, aby zapobiec krystalizacji (skład roztworu znajduje się w Tabeli 2).
UWAGA: Kolejność mieszania w przypadku roztworu nr 3 jest krytyczna. - Roztwory te należy przechowywać w temperaturze 4 °C (stabilne przez 3 miesiące) lub w -20 °C (stabilne przez 6 miesięcy).
- Roztwory nr 4 i nr 5 należy przygotować poprzez dodanie odczynników w dniu przeprowadzenia testu NPD. Izoproterenol jest wrażliwy na światło i utlenianie oraz traci aktywność w temperaturze pokojowej (wykazując 4% rozkładu w ciągu 4 h w temperaturze 4–8 °C). Przechowywać w 4 °C.
UWAGA: ATP jest wrażliwe na światło i utlenianie (patrz Tabela 3).
| Związek | Masa cząsteczkowa | Stężenie (mM) | Skład (g/L) |
| NaCl | 58 | 148 | 8.58 |
| CaCl22 2H2O | 147 | 2.25 | 0.33 |
| KCl | 75 | 4.05 | 0.3 |
| K2HPO4 | 174 | 2.4 | 0.42 |
| KH2 PO4 | 136 | 0.4 | 0.05 |
| MgCl₂2 6 h2O | 203 | 1.2 | 0.24 |
Tabela 1: Skład roztworów.
| Związek | Masa cząsteczkowa | Stężenie (mM) | Skład (g/L) |
| glukonian sodu | 218 | 148 | 33.26 |
| Gluconian wapnia | 430 | 2.25 | 0.97 |
| glukonian K | 234 | 4.05 | 0.95 |
| K2 HPO (optymalizacja hiperparametrów)4 | 174 | 2.4 | 0.42 |
| KH2 PO4 | 136 | 0.4 | 0.05 |
| MgSO44 7H2O | 246 | 1.2 | 0.24 |
Tabela 2: Skład roztworów.
| Roztwór | Numer roztworu | Spis treści | Znacznik EDC |
| roztwór Ringera do zastrzyków | Roztwór nr 1/A | Buforowany roztwór Ringera do wstrzykiwań | roztwory Ringera |
| roztwór Ringera + amiloryd | Roztwór nr 2/B | buforowany roztwór Ringera + 100 μM amiloryd | AMIL |
| Zero Cl- + amiloryd | Roztwór nr 3/C | Buforowany roztwór zerowy Cl- + 100 μM amiloryd | OCL |
| Zero Cl- + amiloryd + izoproterenol | Roztwór nr 4/D | Buforowany roztwór zero Cl- + 100 μM amiloryd + 10 μM izoproterenol | ISO |
| Zero Cl-+ amiloryd + izoproterenol + ATP | Roztwór nr 5/E | Buforowany roztwór zero Cl- + 100 μM amiloryd + 10 μM izoproterenol + 100 μM ATP | ATP |
Tabela 3: Lista roztworów.
2. Cewnik
- Należy użyć sterylnego, jednorazowego cewnika z PVC o dwóch światłach (średnica wewnętrzna 0.7 mm) z okrągłym i gładkim zakończeniem (średnica zewnętrzna 2.5 mm), zaprojektowanego specjalnie do NPD.
- Kontakt ze śluzówką odbywa się poprzez otwór boczny, znajdujący się 2 mm od końcówki, która posiada otwór do perfuzji (patrz krok 10.1).
- Jedno z dwóch przyłączy Luer-lock cewnika należy połączyć z elektrodą pomiarową, a drugie z pompą perfuzyjną. Jako światło pomiarowe należy wykorzystać kanał oznaczony kolorem niebieskim. Cewnik należy oznakować w odstępach co 0.5 cm na długości 10 cm.
UWAGA: Przestrzeń martwa wynosi 0.3 mL. Zaleca się stosowanie powyższej procedury przygotowania cewnika; jeśli nie jest to możliwe, należy wykonać dwa następne kroki. - Należy odciąć równe odcinki (~76 cm) rurek cewnikowych PE50 i PE90.
- Należy połączyć je za pomocą 1 cm odcinka silikonowej rurki. Do przeciwległego końca rurki PE90 należy ciasno wsunąć igłę stuptową 25 G. Do przeciwległego końca rurki PE50 należy ciasno wsunąć igłę motylkową 25 G, dbając o to, aby nie przebić rurki podczas jej wprowadzania.
Rycina 4: Cewnik użyty do pomiarów NPD. Powiększenie w ramce przedstawia końcówkę cewnika z otworem pomiarowym.
3. Przygotowanie agarowego mostka skórnego (igła motylkowa) i cewnika
UWAGA: Manipulowanie roztopionym agarem może spowodować oparzenia, dlatego należy zachować ostrożność.
- Przygotować 3% agar, mieszając 3 g agaru ze 100 mL roztworu nr 1 w butelce z szerokim otworem. Topić agar w mikrofalówce do czasu rozpuszczenia (do uzyskania przezroczystości).
- Napełnić strzykawkę 10 mL ciepłym agarem.
- Następnie połączyć strzykawkę z igłą motylkową (23 G), a potem z zaznaczonym światłem cewnika. Wstrzykiwać agar, aż pojawi się on na końcówce.
- Pozostawić do ostygnięcia na co najmniej 10 min.
- Upewnić się, że mostek skórny oraz cewnik są całkowicie wypełnione i nie zawierają pęcherzyków powietrza.
- Przechowywać gotowe mostki skórne w roztworze nr 1 w temperaturze 4 °C; nie stosować po upływie 1 tygodnia.
4. W przypadku stosowania kremu do EKG
- Rozcień krem do EKG roztworem nr 1 (1:1, v/v Ringer). Pozostaw do czasu usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Napełnij strzykawkę 10 mL rozcieńczonym kremem do EKG.
- Podłącz strzykawkę do oznaczonego światła cewnika i powoli wstrzykuj krem do EKG, aż pojawi się on w dolnym otworze bocznym.
- Upewnij się, że cewnik jest całkowicie wypełniony i wolny od pęcherzyków powietrza.
5. System akwizycji danych
UWAGA: Ogólny schemat systemu akwizycji danych przedstawiono na Rysunku 5.
Rysunek 5: Konfiguracja systemu akwizycji danych. Przedstawienie połączeń bioamplifikatora i przedwzmacniacza (headstage) z interfejsem komputerowym, a także połączeń elektrod z przedwzmacniaczem11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Połączenia
- Podłącz komputer do systemu akwizycji danych (Tabela materiałów) za pomocą kabla USB.
- Aby połączyć system akwizycji danych z bioamplifikatorem, podłącz kabel BNC z wejścia kanału 1 w systemie akwizycji danych (przód) do wyjścia w bioamplifikatorze (tył).
- Połącz bioamplifikator z przedwzmacniaczem głowicowym za pomocą specjalnego kabla, uprzednio przykręconego do głowicy, wpinając go do sekcji wejściowej z przodu bioamplifikatora.
- Podłącz przedwzmacniacz głowicowy do elektrod oraz elektrody uziemiającej. Użyj standardowych złączy żeńsko-żeńskich 2 mm, aby połączyć przód głowicy z elektrodami.
UWAGA: Port jest wpuszczony i pasuje tylko w jednym kierunku dla kabla 2 mm: czerwony – elektroda pomiarowa do nosa pacjenta (poprzez cewnik nosowy); czarny – elektroda referencyjna do mostka skórnego pacjenta; biały – elektroda EKG uziemiona do skóry badanego. - Skonfiguruj bioamplifikator zgodnie z poniższymi ustawieniami: Offset: pociągnij, aby aktywować, obróć, aby dostosować, pozostaw w pozycji wysuniętej po regulacji; Voltage: DC; 1 mV cal: pozycja neutralna; Power: On w celu zbierania danych, off w celu ładowania akumulatora; Gain: ustaw na 10; Band pass: LoFreq (zewnętrzne pokrętło): DC; Band pass: HighFreq (wewnętrzne pokrętło): 1kHz; Volume: Off.
6. Regulacja offsetu głowicy
- Połącz laptop i wzmacniacz w kolejności wskazanej w SOP11. Włącz system akwizycji danych, a następnie laptop (kolejność ta jest istotna, aby oprogramowanie rozpoznało aparat używany do pozyskiwania danych).
- Wyreguluj przesunięcie stopnia głowicy (Head-Stage Offset) zgodnie z procedurą SOP.
7. Przesunięcia
UWAGA: Należy przetestować kilka przesunięć, aby zapewnić stabilność systemu pomiarów elektrycznych (patrz Rysunek 6).
- Aby ustawić offset elektrod, umieść elektrodę odniesienia (ujemną) oraz elektrodę pomiarową (dodatnią) razem w rozcieńczonym kremie do EKG lub w 3 M KCl. Upewnij się, że odczyt różnicy potencjałów między elektrodami na wzmacniaczu wejściowym (headstage) jest bliski zeru.
- W celu ustawienia offsetu cewnika i/lub mostka skórnego, umieść koniec Luer-lock cewnika nosowego lub koniec Luer-lock mostka skórnego w kąpieli z elektrodą pomiarową (dodatnią). Umieść drugi koniec cewnika w kąpieli z kremem do EKG lub 3 M KCl zawierającej elektrodę odniesienia (ujemną), upewniając się, że różnica potencjałów na wzmacniaczu wejściowym jest bliska zeru.
- Aby ustawić offset pętli zamkniętej, upewnij się, że obwód jest zamknięty podczas umieszczania cewnika nosowego w kąpieli z elektrodami. Sprawdź, czy odczyt offsetu pętli zamkniętej wynosi blisko 0 mV (='offset'; ±2,5 mV). Przekręć pokrętło offsetu wzmacniacza wejściowego, aby ustawić offset na 0 mV.
UWAGA: Potwierdza to, że wszystkie połączenia w obwodzie są nienaruszone. Jeśli tak nie jest, cewnik nosowy może być uszkodzony (pęcherzyki powietrza w agarze lub kremie do EKG). Wymień mostek agarowy lub dociśnij krem do EKG w układzie. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić ustawienie offsetu elektrod, a następnie systemu zamkniętego (offset pętli zamkniętej) z elektrodą i mostkiem (Rycina 6).
Rysunek 6: Konfiguracja (A) przesunięcia elektrody, (B) przesunięcia cewnika (lub mostka), (C) przesunięcia pętli zamkniętej.
8. Przygotowanie strzykawki
UWAGA: Poniżej znajduje się zalecana konfiguracja.
- Rozmrozić roztwory nr 1, nr 2 i nr 3 około 1 h przed pomiarem.
- Podłączyć linię przedłużającą do kurka znajdującego się najbliżej cewnika.
- Włączyć wszystkie pompy i przepłukać cewnik roztworem nr 1 do całkowitego oczyszczenia cewnika, aż kurki będą wolne od pęcherzyków powietrza.
9. Umieszczenie elektrody odniesienia i pomiarowej
Rycina 7: Obiekt z elektrodą pomiarową i mostkiem podskórnym gotowy do pomiarów.
- Poproś badanego o zajęcie pozycji siedzącej przodem do operatora NPD. Dla większego komfortu należy postawić stopy na opcjonalnej macie antystatycznej, a głowę oprzeć na ortoptycznym podbródku.
- Podłącz elektrodę przewodu uziemiającego do elektrody ECG umieszczonej na ramieniu badanego (Rysunek 7).
- Wprowadź igłę podskórną w grzbiet przedramienia (system z agarem) lub przyłóż elektrodę odniesienia do kremu ECG w uprzednio minimalnie zrogowaciałym obszarze przedramienia (patrz punkty od 7 do 10 poniżej).
- Sprawdź połączenie z przestrzenią podskórną, mierząc różnicę potencjałów względem skóry (Finger PD) i prosząc badanego o „zamknięcie otworu pomiarowego” poprzez uciśnięcie cewnika między końcówką kciuka a palcem wskazującym.
- Jeśli Finger PD nie wynosi -30 mV lub wartości bardziej ujemnej, sprawdź wprowadzenie igły motylkowej. Powtórz ścieranie naskórka (dla konfiguracji z kremem ECG) i sprawdź mostki.
- Uruchom pompę strzykawkową z roztworem #1 z przepływem 80 mL/h. Zacznij od prawego nozdrza.
- Zmierz Finger PD jako stałe ujemne napięcie (typowy zakres od -40 do -80 mV).
- W przypadku korzystania z systemu z kremem ECG: rozcieńcz krem ECG w stosunku 1:1 i wypełnij cewnik po całkowitym wypłukaniu otworu sondy, tak jak wcześniej pokazano dla agaru.
- Podłącz cewnik do strzykawki 50 mL wypełnionej w połowie kremem ECG, aby obmyć elektrody, co umożliwi sprawdzenie przesunięcia elektrody i przesunięcia mostka.
- Podłącz elektrodę odniesienia Ag/Cl do przestrzeni podskórnej poprzez uprzednie delikatne, minimalne ścieranie skóry; skóra powinna stać się „różowa i błyszcząca” po osiągnięciu poziomu skóry właściwej.
- Umieść elektrodę pomiarową, pokrytą kremem ECG, na startej skórze. Sprawdź Finger PD w sposób opisany wcześniej dla systemu z agarem.
10. Pomiar bazowego PD
- Wprowadź cewnik do prawego otworu nosowego, używając oświetlonego rynoskopu (lub odpowiednika), aby zwizualizować małżowinę nosową dolną. Wykorzystując przedni koniec jako punkt orientacyjny, posuń cewnik, celując w dolny obszar małżowiny nosowej dolnej na błonie śluzowej oddechowej. Alternatywnie, jeśli wprowadzenie jest utrudnione, otwór sondy można umieścić w kontakcie z dnem jamy nosowej.
UWAGA: Cewnik jest wystarczająco sztywny, aby operator mógł go wprowadzić do otworu nosowego. Aby ułatwić pozycjonowanie, jeden kanał cewnika jest zabarwiony na niebiesko i zawiera otwór od strony sondy, który styka się z małżowiną nosową dolną. Zapobiega to obrotowi cewnika. Znaczniki na cewniku od 1 do 10 cm stanowią łatwe punkty odniesienia.- Zmierz PD w obrębie małżowiny nosowej dolnej. W tym celu upewnij się, że otwór pomiarowy cewnika jest zamknięty poprzez jego przyłożenie do błony śluzowej małżowiny nosowej dolnej (oznacz Right Basal AT).
- Zmierz PD w odległościach 3,0, 2,0, 1,5, 1,0 i 0,5 cm (odległość w obrębie przecięgu dolnego od małżowiny nosowej dolnej): oznacz Right Basal PDs.
- Utrzymuj każdy pomiar w określonej odległości przez około 5 s, aby zapewnić stabilny odczyt (± 1 mV) i ułatwić dokładną interpretację podstawowych wartości PD.
- Powtórz powyższe kroki w lewym otworze nosowym, używając klawisza funkcyjnego do oznaczenia Left Basal PDs (3 cm, 2 cm, itp.) oraz Left Basal AT.
- Kierując się pomiarami podstawowego PD, wprowadź sondę cewnika nosowego do miejsca o najbardziej ujemnym sygnale (do 3 cm od przedniego końca małżowiny nosowej dolnej) i zabezpiecz ją małym kawałkiem taśmy na czubku nosa (lub odpowiednikiem).
11. Sekwencyjne perfuzje do śledzenia NPD
- Dla prawej nozdrzy
- Upewnij się, że roztwór wycieka z nosa pacjenta. Poproś badanego o przyjęcie wygodnej pozycji z głową skierowaną w dół (często ułatwia to oparcie głowy na dłoni, użycie podpieraczka do brody lub innego urządzenia unieruchamiającego). Przypomnij badanemu, aby ograniczył ruchy, nie dotykał nosa ani cewników oraz nie mówił.
- Włącz pompę z roztworem nr 1 (płyn Ringera) (5 mL/min lub 300 mL/h). Rejestruj pomiary do momentu uzyskania stabilnej wartości (zmiana <1 mV/30 s).
UWAGA: Osiągnięcie stabilizacji trwa około 3 min. - Wyłącz perfuzję roztworem nr 1.
- Rozpocznij perfuzję roztworem nr 2 (amiloryda). Rejestruj NPD przez minimum 3 min (jeśli napięcie na poziomie plateau budzi wątpliwości, kontynuuj rejestrację do łącznie 5 min).
- Rozpocznij perfuzję roztworem nr 3 (Zero Chloride). Rejestruj NPD przez minimum 3 min (jeśli napięcie na poziomie plateau nie jest stabilne, kontynuuj rejestrację do łącznie 5 min).
- Rozpocznij perfuzję roztworem nr 4 (izoproterenol). Rejestruj NPD przez minimum 3 min [jeśli napięcie na poziomie plateau nie jest stabilne (stały zapis napięcia przez co najmniej 30 s z dryftem < 1 mV), kontynuuj rejestrację do łącznie 5 min].
- Rozpocznij perfuzję roztworem nr 5 (ATP). Rejestruj NPD przez minimum 1 min, aż do uzyskania szczytowej odpowiedzi hiperpolaryzacyjnej.
- Włącz perfuzję roztworem nr 1 (płyn Ringera) i odczekaj 30 s w celu przepłukania cewnika.
- Wyłącz perfuzję roztworem nr 1.
- Powtórz procedurę dla lewej nozdrzy.
12. Zakończenie testu
- Ponownie sprawdź i zarejestruj stabilny PD palca („Post Finger”) przez 5 s.
- Usuń mostek skórny pacjenta oraz opatrunek z miejsca wkłucia w skórze. W przypadku systemu AgCl/ECG Cream, usuń elektrodę z ramienia.
- Zarejestruj napięcie „Final Closed Loop Offset” zgodnie z opisem pomiaru początkowego przesunięcia pętli zamkniętej (patrz krok 7.1.3).
- Oznacz końcowe przesunięcie za pomocą klawisza Function.
- Zatrzymaj akwizycję danych (naciśnij „Start").
UWAGA: Obecna procedura SOP zaleca stosowanie 100 µM ATP w celu aktywacji purinergicznej zależnej od wapnia sekrecji Cl-, aby służyła jako kontrola pozytywna testu; jest to jednak test opcjonalny.
Wyniki
W prawidłowym nabłonku dróg oddechowych główną aktywnością transportu jonów jest absorpcja Na+. Skutkuje to ujemną różnicą potencjałów na powierzchni dróg oddechowych w stosunku do śródmiąższu. Perfuzja amilorydu, blokera kanału ENaC, prowadzi do zmniejszenia ujemnej różnicy potencjałów. Następnie superfuzja roztworu wolnego od Cl- tworzy gradient chemiczny dla Cl-, co powoduje zwiększenie ujemnej różnicy potencjałów i aktywuje wszystkie transportery Cl-, w tym CFTR. Isoproterenol, który zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP, dodatkowo zwiększa sekrecję Cl- poprzez specyficzną aktywację CFTR i zwiększa różnicę potencjałów.
W przeciwieństwie do tego, u osób z CF brak lub dysfunkcja CFTR prowadzi do zwiększonego wchłaniania Na+ za pośrednictwem ENaC12. W rezultacie bazowa różnica potencjałów jest bardziej ujemna. Depolaryzacja obserwowana po zastosowaniu amilorydu jest większa, podczas gdy po stymulacji sekrecji Cl- drogami zależnymi od CFTR różnica potencjałów ulega minimalnej zmianie lub nie zmienia się wcale. Można to zaobserwować na reprezentatywnych zapisach na Ryc. 8, przedstawiających zapisy „zdrowe” w porównaniu z zapisami „CF”.
Rysunek 8: Reprezentatywne zapisy dla osoby „zdrowej” oraz osoby z CF. PD: różnica potencjałów, ΔAmiloride: delta amilorydu, 0 Cl-/Iso-: niskie stężenie chlorków: zmiana PD między zakończeniem perfuzji roztworem nr 2 a roztworem nr 4, S1-S4: etapy 1-4, zielona linia na wykresach A i B wskazuje zapis NPD, a czarne strzałki wskazują różnicę w różnicy potencjałów
Dyskusja
In vivo NPD zapewnia unikalny pomiar, który może być wykonywany wielokrotnie w ujęciu podłużnym i pokazuje, że przy powtarzających się pomiarach obserwuje się podobne wyniki podłużne na poziomie grupowym i indywidualnym14,15. Istnieją mocne dowody na to, że NPD ma doskonałą trafność dyskryminacyjną w odróżnianiu mukowiscydozy od osób niezwiązanych z mukowiscydozą. 25 badań konsekwentnie wykazało statystycznie istotną różnicę w przewodności Cl- i Na+ między pacjentami z mukowiscydozą a zdrową grupą kontrolną10. Chociaż kilka wcześniej opracowanych indeksów wykazuje tę zdolność, przewidujemy, że ze względu na niedawne standaryzacje metodologii 7,8 konieczne będą nowe aktualizacje.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Ten test wymaga kilku kluczowych kroków, aby zapewnić dokładne pomiary. Obejmuje to przesunięcie elektrod i cewników w zamkniętej pętli, aby zapewnić, że system działa zgodnie z zalecanymi standardami. Pacjenci muszą pozostać w bezruchu i powstrzymać się od mówienia, ponieważ minimalizuje to artefakty i przemieszczenie cewnika. To sprawia, że test jest trudny u pacjentów niewspółpracujących, a technika ta została opisana tylko w jednym badaniu z udziałem dzieci w wieku poniżej6 lat 7.
Wstępna kontrola nabłonka nosa jest konieczna, aby upewnić się, że na nabłonku nie ma strupów ani śluzu, które mogą wpływać na pomiary.
Co bardzo ważne, należy podkreślić, że miejsce umieszczenia cewnika jest przedmiotem dyskusji. Przedstawiony tutaj SOP wykorzystuje pomiar pod małżowiną dolną (IT). Umieszczenie cewnika pod IT zostało ustandaryzowane i przeprowadzone w badaniach wieloośrodkowych, dlatego jest to zalecana technika. Pomiar pod IT wykonuje się za pomocą cewnika z bocznym otworem, który może być trudny do utrzymania w stałym kontakcie z błoną śluzową nosa, podczas gdy jest w kontakcie z roztworami. Inne grupy mogą mierzyć PD na dnie nosa, co jest technicznie łatwiejsze. Co ważne, Vermeulen (2011) wykazał, że te 2 metody są porównywalne16.
Ocieplenie rozwiązań pozostaje kwestią sporną między ośrodkami europejskimi i amerykańskimi17,18. Zaleca się, aby stosowanie roztworów w temperaturze 37 °C zamiast 22 °C zwiększało obserwowaną całkowitą odpowiedź chlorkową o około 25%, a zależną od izoproterenolu odpowiedź chlorkową o około 95%18. Jednak ocieplenie zwiększa zmienność, co ocenia się za pomocą większego odchylenia standardowego całkowitej odpowiedzi chlorkowej17. Dlatego, ponieważ ogrzewanie roztworów jest dodatkowym czynnikiem zmienności, zaleca się, aby nie podgrzewać roztworów, chyba że jest to wymagane na podstawie badań.
Wcześniej porównaliśmy obie techniki elektrod i stwierdziliśmy, że zarówno systemy elektrod AgCl, jak i Calomel działały podobnie w prądach podstawowych i stymulowanych u zdrowych osób13.
Ograniczenia techniki
Ten test podlega znacznej zmienności wewnątrzobiektowej. Zmienność punktacji jest szczególnie powszechna u pacjentów z nieokreślonymi śladami i należy to uwzględnić w zastosowaniu diagnostycznym19. Do czynników zmienności zalicza się ostre zakażenia górnych dróg oddechowych, rozległe polipy nosa, przebytą operację zatok oraz stany zapalne związane z mukowiscydozą, które zmniejszają jego swoistość i wrażliwość20,10. Ponadto interpretacja śladów może być różna u różnych czytelników, chociaż czytelnicy eksperci wykazują doskonałą zgodność w zakresie ilościowej punktacji i interpretowalności w śledzeniu mukowiscydozy i bez mukowiscydozy, co kontrastuje ze znaczną zmiennością w pewności śledzenia19.
Wewnętrzna zmienność a znaczące progi
Co bardzo ważne, fizjologiczna zmienność pomiaru jest znaczna, co ilustrują różne badania10, takie jak badania terapii genowej CFTR, które wykazały znaczną zmienność zmian w całkowitym transporcie chlorków i zakresie amilorydów21,22. Ocena przekrojowa sugeruje, że zerowa odpowiedź Cl- plus izoproterenol powyżej progu od -5 do -7 mV jest punktem odcięcia między osobami z mukowiscydozą a osobami bez mukowiscydozy10.
Niemniej jednak brakuje nam jasnej wiedzy na temat wielkości zmiany tego parametru stanowiącego skuteczną korektę CFTR w badaniach fazy II z terapiami modyfikującymi przebieg choroby. Aby ocenić indywidualną reakcję, może być konieczne powtórzenie testów monitorujących odpowiedź na interwencję w celu odróżnienia istotnych zmian od wewnętrznej zmienności. Co bardzo ważne, przyszłe długoterminowe badania nad lekami modyfikującymi przebieg choroby muszą wykazać, że poprawa funkcji CFTR koreluje z poprawą klinicznie istotnych wyników lub wyników zastępczych (takich jak poprawa FEV1) choroby z mukowiscydozą. Rzeczywiście, niedawne badanie fazy II iwakaftoru wykazało wyraźne korzyści kliniczne pomimo niewielkiej poprawy wydzielania chlorków23.
Takie badania pomogą ustalić, czy wartość graniczna poprawy transnabłonkowego przewodnictwa Cl może być parametrem zastępczym dla korzyści klinicznej. Byłby to ważny parametr dla ukierunkowania rozwoju terapii modyfikujących CFTR.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod: Test Potu i Pomiary Prądu Jelitowego (ICM)
U pacjentów z "wątpliwą" mukowiscydozą, ocenianą na podstawie pośredniego stężenia Cl- w pocie między 30 a 60 mM, wyniki złożone NPD stanowiły bardzo czułe narzędzie do diagnozowania pacjentów z "prawdopodobieństwem mukowiscydozy" i "nieprawdopodobnym mukowiscydozą"10. Pomiar prądu jelitowego (ICM), który zapewnia pomiar ex vivo strumieni netto Cl- w nabłonku odbytnicy, umożliwia również określenie resztkowej funkcji CFTR z wysoką czułością, ponieważ CFTR ulega silnej ekspresji w tym nabłonku.
Biorąc pod uwagę modyfikację funkcji CFTR przez modulatory CFTR, związek między tymi różnymi zmianami biomarkerów CFTR jest obecnie niejasny. Chociaż niedawne prace oparte na produkcie Ivacaftor wykazały, że NPD i test potu są ze sobą skorelowane4, nie ustalono jeszcze, czy pomiar w drogach oddechowych jest lepszym predyktorem wyniku oddechowego niż na przykład test potu24,25 lub zmiana ICM. Co więcej, leki modyfikujące mogą również różnić się skutecznością w zależności od narządu. W odniesieniu do NPD ważne jest, aby zauważyć, że zmiany w podstawowej odpowiedzi PD i amilorydowej wyrażają transport Na+, podczas gdy zmiany w odpowiedzi 0 Cl- i izoproterenolu wyrażają transport Cl-. Nie ustalono jeszcze, który z nich jest ważniejszy dla złagodzenia choroby.
Przyszłe zastosowanie tej techniki
Oczekuje się, że zastosowanie tej techniki będzie miało miejsce poza obszarem mukowiscydozy. Ponieważ technika ta jest wyjątkowo odpowiednia do wykazania kanału jonowego Na+ i Cl- , może być stosowana do wykazania dysfunkcji w chorobach dróg oddechowych, w tym astmie26, przewlekłym zapaleniu oskrzeli27, rozstrzeniu oskrzeli bez mukowiscydozy28 i nawracającym zapaleniu trzustki29. Ponadto modyfikacje tej techniki zastosowano w dolnych drogach oddechowych (LAPD) w celu wykazania dysfunkcji CFTR skoncentrowanej na dolnych drogach oddechowych u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP) z przewlekłym zapaleniem oskrzeli30.
NPD dostarcza czułego biomarkera funkcji CFTR in vivo , który może być wykorzystany zarówno do diagnozy, jak i do badań potwierdzających słuszność koncepcji mających na celu skorygowanie aktywności kanału CFTR i ENaC w badaniach translacyjnych. Pozwala to na podłużną ocenę funkcji przeznabłonkowej i jest obiecującą strategią dla medycyny spersonalizowanej w celu dostosowania najskuteczniejszego korektora dla każdego pacjenta z mukowiscydozą.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Grupę Roboczą ds. Funkcji CFTR Komitetu Normalizacyjnego (Sieć Badań Klinicznych, Europejskie Towarzystwo Mukowiscydozy) oraz Grupę Roboczą Centrum Zasobów Narodowych (Sieć Rozwoju Terapii, Fundacja Mukowiscydozy). Dodatkowego wsparcia udzieliła CF Foundation (Clancy FY09 dla GMS) oraz NIH (DK072482 dla SMR i GMS).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KD Naukowa pompa infuzyjna (lub odpowiednik – taki jak programowalne pompy infuzyjne dostarczone przez instytucję/szpital) | Fisher Scientific | ||
| Powerlab 4/30 | AD Instruments | ||
| BMA-200 Przenośny biowzmacniacz AC/DC | AD Instruments | ||
| Izolacyjna głowica IS0-Z do BMA-200 | AD Instruments | ||
| Komputer kompatybilny z systemem Windows - Minimalne wymagania systemu Windows XP lub nowszego | Różne | ||
| programy AD Instruments: GLP Client V6 (Windows) lub nowszy | AD Instruments Elektroda | ||
| EKG (uziemienie dla badanego uczestnika) | Standard | ||
| 2 mini kalomelowe elektrody referencyjne | Fisher Scientific | 13-620-79 | |
| Chlorek potasu KCl, granulowany – USP, waga formuły 76, ilość: 500 g | Spectrum | ||
| Sterylny pojemnik (taki jak pojemnik do pobierania próbek lub podobny) do stosowania do kąpieli kalomelowej KCl, z otworami wyciętymi w pokrywie do utrzymywania elektrod na miejscu. (Jeśli nie jest dostarczony przez producenta elektrody.) | Standardowe | ||
| 2 elektrody szpitalne: Ag/AgCl 8 mm elektroda TP | BIOPAC Systems | UNSHLD-EL258 | |
| 2 elektrody Ag/AgCl, B0194, wtyczka 4 mm | SLE Instruments | ||
| Signacreme® Elektroda przewodząca w kremie | Fisher Scientific | Parker Labs nr ref # 17-05 | |
| Urządzenie do ścierania skóry | PROMED Feeling | Ref 374901 | |
| Hi Di 541 M, Frezy dentystyczne z diamentową końcówką | Ash Instruments | ||
| Rurka Becton Dickinson PE 50 | Fisher Scientific | 427411 | |
| Rurka Becton Dickinson PE 90 | Fisher Scientific | 427421 | |
| Rurki krzemowe, 0,062" Identyfikator, 0,095" OD | Fisher Scientific | 508-007 | |
| Taśma chirurgiczna z mikroporami (25 mm x 9,1 m) | 3M | 1530-1 | |
| Cewnik dwukanałowy Marquat Długość: 80 cm; Średnica zewnętrzna: 2,5 mm; Średnica wewnętrzna kanałów: 0,8 mm; Odległość bocznych otworów od końcówki: 2 mm. Etykieta UE Umowa na NPD: I0202US | Marquat | I0202US | |
| Taśma jedwabna 1" X 10 jardów Rurka | 3M Durapore | 1538-1 | |
| IV (30", 50/pudełko) | International Limited | IMN30 | |
| Zawór trójdrogowy (50/pudełko) | Medex | MX5311L | |
| Sterylne filtry strzykawkowe (ANOTOP 25 sterylne 50 pk; 0,22-μ m lub mniejsze filtry; lub równoważny) | Fisher Scientific | 09-926-7 | |
| Adapter klocka Becton Dickinson Intramedic Luer (20 G, do podłączenia do PE90 w przypadku używania cewnika do nosa wyprodukowanego w ośrodku badawczym) | Fisher Scientific | 427564 | |
| Becton Dickinson 23 G, 0,75" Vacutainer (" motyl") igły (0,6 mm x 19 mm; 50 U/pudełko) (do podłączenia do PE50) w przypadku stosowania cewnika do nosa wyprodukowanego w ośrodku badawczym) | Fisher Scientific | 367283 | |
| Becton Dickinson Strzykawka 60 ml bez igły Końcówka Luer-Lok (40/pudełko) | Fisher Scientific | 309653 | |
| Strzykawka Becton Dickinson 10 ml bez igły Końcówka Luer-Lok (100/pudełko) | Fisher Scientific | 309604 | |
| Sterylne chusteczki jednorazowego użytku (w zależności od dostępności w instytucji) | Standard | ||
| 70% EtOH (1 litr), numer katalogowy Aaper Alcohol and Chemical Co. NC9274019 (lub równoważny) | Jednorazowe | ||
| Corning, 0,22 i mu; m wielkość porów (dopuszczalne objętości 0,15 – 1,0 l) | Fisher Scientific | 430624 | |
| Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – do kalibracji pH-metru | Fisher Scientific | ||
| Buffer Cert 4.00 (1 L Sn04327) – do kalibracji pH-metru | Fisher Scientific | ||
| Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – do kalibracji pH-metru | Fisher Scientific | ||
| Jednorazowe podkładki (Blue Pads; 23" x 36" 150/pudełko; lub odpowiednik zgodny ze standardem szpitalnym) | SureCare | ||
| 23 G, 0,75" Odkurzacz " motyl" igły (0,6 mm x 19 mm; 50 U/pudełko) | Becton Dickinson | 367283 | |
| Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; lub równoważny) | Fisher Scientific | ||
| Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (lub odpowiednik) | Fisher Scientific | ||
| Convertible Handle Welch Allyn Bateria 72300 (lub odpowiednik) LUB Otoskop z baterią | Fisher Scientific | ||
| Podpórka pod głowę i podbródek (lub odpowiednik; opcjonalnie) | Richmond Products, Inc | 629R | |
| Rozpraszająca ładunki elektrostatyczne maty przeciwzmęczeniowe (lub równoważny) | Fisher Scientific | No. 791 | |
| ODCZYNNIKI DO ROZTWORÓW ZMIESZANYCH NA MIEJSCU | |||
| Chlorek SODU, granulowany – Formuła widma | Waga: 58; Rozmiar: 500 g | ||
| chlorku wapnia CaCl2 i byk; 2H2O – | Formuła widma | Waga: 147; Rozmiar: 500 g | |
| sześciowodnego kryształu chlorku magnezu, MgCl2• 6H2O – | Formuła widma | Waga: 203; Rozmiar: 500 g | |
| fosforanu potasu dwuzasadowego, bezwodnego, granulowanego, KH2PO4 – | Formuła widma | Waga: 174; Rozmiar: 500 g | |
| monopodstawowych kryształów fosforanu potasu – NF (KH2PO4) | Widmo | Formuła Waga: 136; Rozmiar: 500 g | |
| Glukonian sodu - USP (sól monosodowa) | Formuła spektrum | Waga: 218; Rozmiar: 500 g | |
| glukonianu wapnia – USP (bezwodny proszek) | Formuła spektrum | Waga: 430; Rozmiar: 500 g | |
| glukonianu potasu - USP (bezwodny) | Formuła spektrum | Waga: 234; Rozmiar: 500 g | |
| siarczanu magnezu siedmiowodnego – USP MgSO4• 7H2O | Formuła widma | Waga: 246; Rozmiar: 500 g | |
| amilorydu HCl – | Formuła widma | Waga: 302; Rozmiar: 5gm | |
| adenozyno-5'-trifosforan (ATP) (sól disodowa) | Formuła widma | Waga: 551; Rozmiar: 5 g | |
| chlorku magnezu, sześciowodnego, kryształu – USP MgCl2• 6H2O | Formuła widma | Waga: 203; Rozmiar: 500 g | |
| Woda podwójnie destylowana (ddH2O) | Apteka | Formuła Waga: NA; Rozmiar: 1 l | |
| Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg / 5 mL Ampułka | Apteka | Szpitalna Formuła Waga: 248; Rozmiar: jednorazowy Ringers | |
| Injection, USP lub Ringers Irrigation | Hospital Pharmacy | Formuła Waga: NA; Rozmiar: 5 L |
Bibliografia
- Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis? Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
- Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
- Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
- Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (2), 139-147 (2014).
- Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
- Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65 (6), 539-544 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787794(2006).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (7), 929-936 (2010).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint? European Respiratory Journal. 14, 38(2013).
- US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). , (2014).
- Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1493 (1981).
- Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
- Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
- Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 24-28 (2014).
- Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter? Pediatric Pulmonology. 46 (2), 145-152 (2011).
- Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
- Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124 (2), 482-489 (2003).
- Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (5), 573-578 (2017).
- Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
- Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
- Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (2), 139-147 (2014).
- Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (2), 175-184 (2014).
- Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (7), 527-538 (2014).
- Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (5), 641-644 (2016).
- Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7 (6), e39809(2012).
- Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (10), 1078-1083 (2010).
- Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60 (5), 675-679 (2015).
- Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144 (2), 498-506 (2013).
Przedruki i uprawnienia
