Standaryzowany pomiar różnicy potencjału przeznabłonkowego błony nosowej (NPD)

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy ustandaryzowany protokół pomiaru różnicy potencjału nosowego (NPD). Transbłonowy regulator przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i funkcja nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) są oceniane na podstawie zmiany napięcia w nabłonku nosa po superfuzji roztworów, które modyfikują aktywność kanału jonowego, zapewniając miarę wyniku.

Streszczenie

Opisujemy standaryzowany pomiar różnicy potencjału nosa (NPD). W tej technice transbłonowy regulator przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i funkcja nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) są monitorowane przez zmianę napięcia w nabłonku nosa po superfuzji roztworów modyfikujących aktywność kanału jonowego. Jest to możliwe dzięki pomiarowi różnicy potencjałów między przedziałem podskórnym a nabłonkiem dróg oddechowych w nozdrzu, przy użyciu cewnika stykającego się z małżowiną nosową dolną.

Test pozwala na pomiar stabilnego napięcia podstawowego i kolejnych zmian napięcia netto po perfuzji 100 μM amilorydu, inhibitora reabsorpcji Na⁺ w roztworze Ringera; bezchlorkowego roztworu zawierającego amilord do sterowania wydzielaniem chlorków i 10 μM izoproterenolu w roztworze bez chlorków z amilordem w celu stymulacji cyklicznego przewodnictwa chlorków zależnego od monofosforanu adenozyny (cAMP) związanego z CFTR.

Ta technika ma tę zaletę, że demonstruje właściwości elektrofizjologiczne dwóch kluczowych składników tworzących hydratację płynu powierzchniowego dróg oddechowych nabłonka oddechowego, ENaC i CFTR. W związku z tym jest to przydatne narzędzie badawcze w badaniach fazy 2 i próbach potwierdzających słuszność koncepcji leków, które są ukierunkowane na aktywność CFTR i ENaC w leczeniu mukowiscydozy (CF) choroby płuc. Jest to również kluczowa procedura kontrolna w celu ustalenia dysfunkcji CFTR, gdy testy genetyczne i testy potu są niejednoznaczne. W przeciwieństwie do chlorku potu, test jest stosunkowo bardziej czasochłonny i kosztowny. Wymaga również przeszkolenia i wiedzy operatora, aby skutecznie przeprowadzić test. W tej technice odnotowano zmienność między i wewnątrz osobnika, zwłaszcza u osób młodych lub niewspółpracujących. Aby pomóc w rozwiązaniu tego problemu, interpretacja została ulepszona za pomocą niedawno zweryfikowanego algorytmu.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest pomiar różnicy potencjału nosa (NPD), która ma na celu zbadanie trans-nabłonkowego transportu jonów in vivo¹. Technika ta pozwala na pomiar transportu sodu (Na⁺) i chlorków (Cl^-). NPD jest stosowana jako narzędzie badawcze od końca lat 80. XX wieku i została zaakceptowana w 1998 roku jako procedura diagnostyczna przez Cystic Fibrosis Foundation (CFF) consensus statement² oraz w 2017 roku w Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Consensus Diagnostic Guidelines³. Rzeczywiście, biologiczna dysfunkcja CFTR, która jest przyczyną mukowiscydozy, objawia się zwiększonym wchłanianiem Na⁺ przez błonę wierzchołkową i defektem wydzielania Cl^-. Ten test funkcjonalny ma tę zaletę, że jest dodatkowym narzędziem diagnostycznym, gdy genetyka nie jest jednoznaczna u pacjentów z nieokreślonymi pośrednimi wynikami testu potowego³. Chociaż informacje te można również uzyskać za pomocą biopsji pomiaru prądu jelitowego (ICM), ICM jest jednak dostępny tylko w kilku ośrodkach na całym świecie i wymaga dalszej standaryzacji. NPD jest bardziej dostępna w około 60 ośrodkach na całym świecie, a ponadto celuje w nabłonek dróg oddechowych, który jest główną lokalizacją choroby.

Biorąc pod uwagę informacje, które dostarcza na temat aktywności CFTR, jest on również używany w badaniach potwierdzających słuszność koncepcji, mających na celu ocenę funkcjonalnego przywrócenia białka CFTR przez terapie modulatorowe4^,5^,6,7,8. Rzeczywiście, dane z badań z edycją mRNA/genu CFTR, wzmacniaczem CFTR i terapiami korygującymi podkreślają znaczące zmiany w transporcie Cl^- i Na⁺ za pomocą terapii^{6,9 i potwierdzają,} że NPD może być responsywnym punktem końcowym w badaniach klinicznych. Ponieważ brakuje nam czułych klinicznych punktów końcowych, które byłyby w stanie wykryć subtelną zmianę w stanie klinicznym pacjenta w krótkim okresie, ten przedkliniczny biomarker może być bardzo pouczający. Dziedzina terapii modulatorami CFTR szybko się poszerza i pilnie potrzebujemy testów in vivo, które są w stanie szybko rozszyfrować związki aktywne przed przejściem do dużych badań fazy 3¹⁰.

Fizjologiczne uzasadnienie tej techniki opiera się na pomiarze różnicy potencjałów między nabłonkiem dróg oddechowych w nozdrzu a przedziałem podskórnym. Aktywność kanałów jonowych bada się poprzez pomiar stabilnej maksymalnej różnicy potencjałów linii bazowej (PD), jej zmian po zablokowaniu absorpcji Na⁺ związanej z ENaC i napędzaniu wydzielania Cl^- przez różne wierzchołkowe transportery Cl^-, w tym CFTR. Dysfunkcja CFTR objawia się minimalną zmianą różnicy potencjałów po stymulacji wydzielania Cl^- przez szlak zależny od cAMP i zwiększoną absorpcją Na⁺ za pośrednictwem ENaC, co wykryto przez bardziej ujemną różnicę potencjałów wyjściowych i zwiększoną odpowiedź na amiloryd. Mechanistyczne podstawy mukowiscydozy w porównaniu z normalnym PD są podsumowane w Rysunek 1.

Rysunek 1: Rysunek podsumowujący aktywność kanałów jonowych. (A) Aktywność jonów w nabłonku oddechowym wykazująca zrównoważoną aktywność ENaC i CFTR u zdrowych osób oraz (B) utrata aktywności CFTR skutkująca zwiększonym transportem sodu za pośrednictwem ENaC i zmniejszonym transportem chlorków zależnym od CFTR. ENaC: nabłonkowy kanał sodowy, Na⁺: sód, CFTR: regulator przezbłonowy mukowiscydozy, CL^-: chlorek, mV: miliwolty, PD: różnica potencjałów, min: minuta/s Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Jednak ten test wykazuje pewien stopień zmienności zarówno przy powtarzanych pomiarach u tego samego pacjenta, jak i wśród pacjentów o tym samym genotypie. Ma to ogromne znaczenie dla ułatwienia interpretacji zmian po leczeniu modulatorem. Co więcej, nadal brakuje nam zatwierdzonych progów dyskryminujących osoby chore na mukowiscydozę i osoby zdrowe. Może to częściowo wynikać z różnic między dostępnością obiektów klinicznych a stosowanymi technikami. W związku z tym trwają znaczne międzynarodowe wysiłki mające na celu standaryzację testu. Zarówno amerykańska organizacja CFF-TNN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network), jak i ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society-Clinical Trials Network) stworzyły Standardową Procedurę Operacyjną NPD (SOP) do stosowania w badaniach wieloośrodkowych i badawczych. Ta niedawna wspólna praca CTN i TDN zaowocowała połączonym, międzynarodowym SOP, łączącym wiedzę specjalistyczną CTN i TDN (2014)¹¹. W artykule przedstawiono protokół i techniki testowe umożliwiające zastosowanie NPD w diagnostyce mukowiscydozy lub w badaniach typu proof-of-concept inicjowanych przez badaczy. Każdy ośrodek wdrażający tę technikę jest odpowiedzialny za złożenie wniosku do swojej instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań klinicznych na ludziach w celu zatwierdzenia.

Rysunek 2: Schemat całej zalecanej konfiguracji NPD. Należy pamiętać, że pokazano zalecaną konfigurację, w tym sekwencyjne pompy perfuzyjne i konfigurację serii 4-odcinających. Konkretne połączenia i przykłady komponentów są pokazane w SOP. (Diagram zmodyfikowany za zgodą Solomona, G.M. Chest, 2010¹³) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ogólny przepływ eksperymentalny jest opisany w Rysunek 2, gdzie NPD jest mierzone między mostkiem eksploracyjnym umieszczonym na powierzchni nabłonka a mostkiem referencyjnym umieszczonym w przestrzeni podskórnej, oba połączone z elektrodami i woltomierzem o wysokiej impedancji.

To zapewniają 2 różne systemy: istnieją 2 akceptowalne ustawienia elektrod referencyjnych: (i) zrównoważone elektrody Ag/AgCl i wypełniony kremem mostek elektrokardiogramu (EKG) połączony z przestrzenią podskórną przez lekkie ścieranie lub (ii) nasycone półkomórki kalomelowe i wypełniona agarem igła o rozmiarze od 22 do 24 wprowadzane podskórnie. Kontakt z błoną śluzową nosa jest możliwy dzięki cewnikowi o podwójnym przeźrnicy. Jeden prześwit jest wypełniony agarem lub kremem EKG i podłączony do elektrody pomiarowej, drugi umożliwia perfuzję różnych roztworów na błonę śluzową nosa.

Końcówka rurki eksploracyjnej jest umieszczona na błonie śluzowej dróg oddechowych pod dolną małżowiną nosową (Rysunek 3).

Rycina 3: Umieszczenie rurki eksploracyjnej na błonie śluzowej dróg oddechowych. (A) Widok zewnętrzny pokazujący rozmieszczenie. (B) Widok rynoskopowy pokazujący umiejscowienie. (C) Schemat wskazujący anatomiczne umiejscowienie cewnika. PD: różnica potencjałów

Aby zbadać reakcję PD na kilka leków, roztwory superfuzyjne są stosowane przez drugie światło cewnika. Istnieje kilka kluczowych etapów związanych z przygotowaniem i przeprowadzeniem pomiarów NPD, które zostały szczegółowo opisane w protokole, od wstępnego przygotowania po analizę danych.

Po przygotowaniu roztworów i elektrod, odpowiednie testowanie jakości elektrod i cewników pozwala na podstawowe przeprowadzenie testu. Pomiary podstawowe wykonuje się wzdłuż małżowiny dolnej, co pozwala na wybór najlepszego miejsca do pomiaru, zwykle tego z najbardziej ujemnym pomiarem. Następnie sekwencyjne perfuzje określają strumień jonów Na⁺ (ENaC) i Cl^- (zależny od CFTR) poprzez zmianę napięcia w nabłonku nosa.

Protokół

Protokół z udziałem ludzi został zatwierdzony przez wszystkie uczestniczące w nim Instytuty' Research Committee. Każdy ośrodek wdrażający tę technikę jest odpowiedzialny za złożenie wniosku do swojej instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań klinicznych na ludziach w celu zatwierdzenia.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotować roztwory #1, #2 i #3, które są roztworami zasadowymi, w partiach po 1 litrze przed zabiegiem i przechowywać na miejscu (Tabela 1).
   UWAGA: Amiloryd jest wrażliwy na światło i musi być przechowywany w ciemności (patrz Tabela 1 dla składu roztworu) (patrz SOP w celu szczegółowego przygotowania roztworu¹¹).
   1. Zbuforuj wszystkie roztwory o pH 7,4 i przefiltruj za pomocą filtra butelkowego 0,22 μm.
   2. W przypadku roztworu #3 najpierw dodaj sole zawierające fosforany, pozwól im zjonizować, aby zapobiec krystalizacji (patrz Tabela 2 dla składu roztworu).
      UWAGA: Sekwencja mieszania ma kluczowe znaczenie dla roztworu #3.
   3. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze 4 °C (stabilnie przez 3 miesiące) lub w temperaturze -20 °C (stabilnie przez 6 miesięcy).
   4. Przygotuj roztwory #4 i #5, dodając czynniki w dniu testu NPD. Izoproterenol jest wrażliwy na światło i utlenianie, traci swoją aktywność w temperaturze pokojowej (wykazując 4% rozpad w ciągu 4 godzin w temperaturze 4–8 °C). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: ATP jest wrażliwy na światło i utlenianie (patrz Tabela 3).

pkt. pkt. Rozdział TGL pkt. Rozdział pkt.

związek	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)	Skład (g/L)
Zawartość NaCl	Rozdział 58	Rozdział 148	8,58
CaCl2 2H2O	Rozdział 147	Godzina 2,25	0,33
Kcl	75	Godzina 4.05	0,3
K2HPO4	174	2.4	0,42
KH2 PO4	136	0,4	0,05
MgCl2 6H2O	Rozdział 203	Rozdział 1.2	0,24

Tabela 1: Skład roztworu.

pkt. pkt. pkt. TGL pkt. Rozdział pkt.

związek	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)	Skład (g/L)
Na Glukonian	Rozdział 218	Rozdział 148	33,26
Glukonian Ca	Z numerem 430	Godzina 2,25	0,97
K Glukonian	Rozdział 234	Godzina 4.05	0,95
K2 HPO4	174	2.4	0,42
KH2 PO4	136	0,4	0,05
MgSO4 7H2O	Rozdział 246	Rozdział 1.2	0,24

Tabela 2: Skład roztworu.

rozwiązanie	Numer rozwiązania	treść	Znak EDC
Wtrysk Ringera	Rozwiązanie #1/A	Buforowane dzwonki do wstrzykiwań	Dzwonki
Dzwonki + amiloryd	Rozwiązanie #2/B	Buforowane dzwonki + amiloryd 100 μM	AMIL
Zero Cl- + amiloryd	Rozwiązanie #3/C	Buforowany zero Cl- + 100 μM amilorydu	Sieć trakcyjna (OCL)
Zero Cl- + amiloryd + izoproterenol	Rozwiązanie #4/D	Buforowany zero Cl- + 100 μM amiloryd + 10 μM izoproterenol	ISO
Zero Cl-+ amiloryd + izoproterenol + ATP	Rozwiązanie #5/E	Buforowane zero Cl- + 100 μM amiloryd + 10 μM izoproterenol + 100 μM ATP	Atp

Tabela 3: Lista rozwiązań.

2. Cewnik

1. Używać sterylnego, jednorazowego cewnika z PVC o średnicy 2 lumenów (Ø wewnętrzna 0,7 mm) z okrągłą i gładką końcówką (Ø zewnętrzna 2,5 mm), który jest specjalnie zaprojektowany do NPD.
   1. Nawiązać kontakt z błoną śluzową przez boczny otwór, w odległości 2 mm od końcówki z otworem na końcówce do perfuzji (patrz krok 10.1).
   2. Podłącz jedno z dwóch połączeń Luer-lock cewnika do elektrody pomiarowej, a drugie do pompy perfuzyjnej. Użyj kanału zabarwionego na niebiesko jako światła pomiarowego. Oznacz cewnik w odstępach co 0.5 cm dla 10 cm.
      UWAGA: Martwa przestrzeń wynosi 0,3 ml. Zaleca się zastosowanie powyższej procedury do przygotowania cewnika, jeśli nie jest to możliwe, wykonaj dwa następne kroki.
   3. Przytnij równe (~76 cm) długości rurki cewnika PE50 i PE90.
   4. Umieść je razem w 1-centymetrowym kawałku rurki z gumy silikonowej. Włóż igłę o końcówce 25 G ciasno w przeciwległy koniec rurki PE-90. Włóż igłę motylkową 25 G ciasno do przeciwległego końca rurki PE50, uważając, aby nie przebić rurki podczas jej umieszczania.

Rycina 4: Cewnik używany do pomiarów NPD. Pudełko wkładki przedstawia końcówkę cewnika z otworem pomiarowym.

3. Przygotowanie mostka ze skóry agarowej (igły motylkowej) i cewnika

UWAGA: Manipulowanie stopionym agarem może spowodować oparzenia i powinno to być wykonywane z ostrożnością.

1. Przygotuj 3% agar, mieszając 3 g agaru ze 100 ml roztworu #1 w butelce z szerokim otworem. Rozpuść agar w kuchence mikrofalowej, aż będzie rozpuszczalny (przezroczysty).
   1. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml ciepłym agarem.
   2. Następnie podłączyć strzykawkę do igły motylkowej (23 G) i do oznaczonego światła cewnika. Wstrzykiwać agar, aż pojawi się na końcu.
   3. Pozostaw do ostygnięcia na co najmniej 10 minut.
   4. Upewnij się, że most skórny i cewnik są całkowicie wypełnione i uwidocznione jako wolne od pęcherzyków powietrza.
   5. Przechowuj masowe mosty skórne w roztworze #1 w temperaturze 4 °C i nie używaj po 1 tygodniu.

4. Jeśli używasz kremu EKG

1. Rozcieńczyć krem EKG roztworem #1 (1:1, v/v Ringera). Odstaw do momentu, aż będzie wolny od pęcherzyków powietrza.
   1. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml rozcieńczonym kremem EKG.
   2. Podłączyć strzykawkę do oznaczonego światła cewnika i powoli wstrzykiwać krem EKG, aż pojawi się w dolnym bocznym otworze.
   3. Upewnij się, że cewnik jest całkowicie wypełniony i wolny od pęcherzyków powietrza.

5. System akwizycji danych

UWAGA: Ogólna konfiguracja systemu akwizycji danych jest pokazana w Rysunek 5.

Rysunek 5: Konfiguracja systemu gromadzenia danych. Demonstracja połączeń biowzmacniacza i sceny głównej z interfejsem komputera, a także połączeń elektrod z sceną główną¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Połączenia
   1. Podłącz komputer do systemu akwizycji danych (Tabela materiałów) za pomocą USB.
   2. Aby podłączyć układ akwizycji danych do biowzmacniacza, należy podłączyć BNC z wejścia kanału 1 w systemie akwizycji danych (przód) do wyjścia w biowzmacniaczu (tył).
   3. Podłącz bioamplifier do headstage za pomocą niestandardowego wstępnie podłączonego do headstage w części wejściowej z przodu bioamplifier.
   4. Podłącz stopień górny do elektrod i elektrody uziemiającej. Użyj standardowych złączy żeńsko-żeńskich 2 mm, aby podłączyć przód sceny czołowej do elektrod.
      UWAGA: Port jest wpuszczony i pasuje tylko w jednym kierunku 2 mm: Czerwona elektroda pomiarowa do nosa pacjenta (przez cewnik do nosa); elektroda referencyjna do mostka skórnego pacjenta; Biała elektroda EKG uziemiona do skóry pacjenta.
   5. Ustaw biowzmacniacz zgodnie z opisem: Przesunięcie: pociągnij, aby aktywować, obróć, aby wyregulować, pozostaw w pozycji ciągniętej po regulacji; Napięcie: prąd stały; 1 mV cal: pozycja neutralna; Zasilanie: włączone, aby zbierać dane, wyłączone, aby naładować baterię; Wzmocnienie: ustawione na 10; Pasmo przepustowe: LoFreq (pokrętło zewnętrzne): DC; Przepust pasma: HighFreq (pokrętło wewnętrzne): 1kHz; Głośność: Wył.

6. Regulacja przesunięcia stopnia głównego

1. Podłącz laptopa i wzmacniacz w kolejności wskazanej w SOP¹¹. Włącz system akwizycji danych, a następnie laptopa (sekwencja jest ważna, aby oprogramowanie rozpoznało aparaturę używaną do akwizycji danych).
   1. Dostosuj przesunięcie stopnia czołowego zgodnie z sekwencją SOP.

7. Przesunięcia

UWAGA: Istnieje kilka przesunięć, które należy przetestować, aby zapewnić stabilność elektrycznego systemu pomiarowego. (patrz Rysunek 6)

1. W przypadku przesunięcia elektrody umieść elektrodę odniesienia (ujemną) i elektrodę pomiarową (dodatnią) razem w rozcieńczonym kremie EKG lub 3 M KCl. Upewnij się, że odczyt różnicy potencjałów między elektrodami jest bliski zeru na głowicy.
   1. W celu ustawienia przesunięcia cewnika i/lub mostka skórnego, umieść końcówkę Luer-lock cewnika nosowego lub końcówkę Luer-lock mostka skórnego w kąpieli z elektrodą pomiarową (dodatnią). Umieść drugi koniec cewnika w kąpieli kremowej EKG lub 3 M KCL zawierającym elektrodę odniesienia (ujemną), upewniając się, że różnica potencjałów na scenie głowy jest bliska zeru.
   2. Aby ustawić przesunięcie w pętli zamkniętej, upewnij się, że obwód jest zamknięty podczas wymiany cewnika nosowego w kąpieli elektrod. Sprawdź, czy przesunięcie w pętli zamkniętej wskazuje blisko 0 mV (='offset'; ±2.5 mV). Wyreguluj pokrętło przesunięcia headstage, aby ustawić przesunięcie na 0 mV.
      UWAGA: Potwierdza to, że wszystkie połączenia w obwodzie są nienaruszone. Jeśli tak nie jest, cewnik do nosa może nie być nienaruszony (pęcherzyki powietrza w agarze lub kremie EKG). Zmień mostek agarowy lub wciśnij krem EKG do ustawienia. Najpierw należy wykonać przesunięcie elektrody, a następnie system zamknięty (offset w pętli zamkniętej) z elektrodą i mostkiem (Rysunek 6).

Rysunek 6: Ustawienie (A) przesunięcia elektrody, (B) przesunięcia cewnika (lub mostka), (C) przesunięcia w pętli zamkniętej.

8. Konfiguracja strzykawki

UWAGA: Poniżej znajduje się zalecana konfiguracja.

1. Rozmrozić roztwory #1, #2 i #3 około 1 godzinę przed pomiarem.
   1. Podłącz przedłużacz do kranu znajdującego się najbliżej cewnika.
   2. Włącz wszystkie pompy i przepłucz cewnik roztworem #1, aby całkowicie spłukać cewnik, aż kurki oczyszczą się z pęcherzyków.

9. Umiejscowienie elektrody referencyjnej i pomiarowej

Ryc. 7: Pacjent z elektrodą pomiarową i mostkiem podskórnym gotowym do pomiarów.

1. Poproś uczestnika badania o zajęcie pozycji siedzącej przodem do operatora NPD. Dla większego komfortu połóż stopy na opcjonalnej macie antystatycznej, a głowę na ortoptycznej podpórce pod podbródek.
   1. Podłącz elektrodę przewodu uziemiającego do elektrody EKG umieszczonej na ramieniu osoby badanej (Rysunek 7).
   2. Albo wprowadzić igłę podskórną do grzbietowego przedramienia (system agarowy), albo przyłożyć elektrodę referencyjną do kremu EKG na uprzednio minimalnie starty obszar przedramienia (patrz punkty od 7 do 10 poniżej).
   3. Sprawdź połączenie z przestrzenią podskórną, mierząc różnicę potencjałów ze skórą (palec PD) i prosząc pacjenta o zamknięcie "otworu pomiarowego" poprzez ściśnięcie cewnika między czubkiem kciuka a palcem wskazującym.
   4. Jeśli PD palca nie jest ujemne -30 mV lub więcej, sprawdź wkłucie igły motylkowej. Powtórz ścieranie (w celu założenia kremu EKG) i sprawdź mostki.
   5. Uruchomić pompę strzykawkową z roztworem #1 z prędkością 80 ml/h. Zacząć od prawego nozdrza.
   6. Zmierz PD palca jako stałe napięcie ujemne (typowy zakres od -40 do -80 mV).
   7. W przypadku korzystania z systemu kremu EKG: rozcieńczyć krem EKG w stosunku 1:1 i napełnić cewnik po całkowitym wypłukaniu z otworu sondy, jak to wcześniej zaobserwowano w przypadku agaru.
   8. Podłącz cewnik do strzykawki o pojemności 50 ml wypełnionej do połowy kremem EKG, aby wykąpać elektrody, umożliwiając sprawdzenie przesunięcia elektrody i przesunięcia mostka.
   9. Podłącz elektrodę referencyjną Ag/Cl do przestrzeni podskórnej przez niewielkie wcześniejsze minimalne otarcie skóry, skóra będzie wyglądać na "różową i błyszczącą", gdy zostanie osiągnięty poziom skóry właściwej.
   10. Umieść elektrodę pomiarową, pokrytą kremem EKG, na startej skórze. Sprawdź PD palca, jak pokazano wcześniej dla systemu Agar
   .

10. Pomiar podstawowej PD

1. Wprowadź cewnik nosowy do prawego nozdrza za pomocą oświetlającego rynoskopu (lub jego odpowiednika), aby uwidocznić małżowinę uszną dolną. Używając przedniej końcówki jako punktu orientacyjnego, przesuń cewnik celując w dolne miejsce małżowiny dolnej na błonie śluzowej dróg oddechowych. Alternatywnie, jeśli umieszczenie jest trudne, otwór sondy można umieścić w kontakcie z dnem nozdrza.
   UWAGA: Cewnik jest na tyle sztywny, że operator może go wprowadzić do nozdrza. Aby ułatwić umieszczenie, jeden kanał cewnika jest pokolorowany na niebiesko i zawiera otwór po stronie sondy stykający się z dolną małżowiną. Zapobiega to obracaniu się cewnika. Oznaczenia wskazane na cewniku od 1 do 10 cm zapewniają łatwe punkty odniesienia.
   1. Zmierz PD na małżowinie dolnej. W tym celu należy upewnić się, że otwór pomiarowy cewnika jest zamknięty poprzez przyłożenie go do błony śluzowej małżowiny usznej dolnej (oznaczenie Prawy Podstawowy AT).
   2. Zmierz PD na 3,0, 2,0, 1,5, 1,0 i 0,5 cm (odległość w przewodzie dolnym od małżowiny usznej): zaznacz prawe podstawowe PD.
   3. Utrzymuj każdy pomiar w określonej odległości przez około 5 sekund, aby zapewnić stały odczyt (± 1 mV) i ułatwić dokładną interpretację podstawowych wartości wyładowań niezupełnych.
   4. Powtórz powyższe kroki w lewym nozdrzu, używając funkcyjnego, aby zaznaczyć lewe podstawowe PD (3 cm, 2 cm itp.) i lewe podstawowe AT.
   5. Używając podstawowych pomiarów PD jako przewodnika, włóż sondę cewnika nosowego do miejsca najbardziej negatywnego sygnału (do 3 cm od przedniego końca dolnej małżowiny nosowej) i zabezpiecz małym kawałkiem taśmy na czubku nosa (lub jego odpowiednikiem).

11. NPD Śledzenie sekwencyjnych perfuzji

1. Do prawego nozdrza
   1. Sprawdzić, czy roztwór kapie z nosa pacjenta. Poproś badanego, aby przyjął wygodną pozycję z głową w dół (często pomaga w tym poproszenie osoby o oparcie głowy na dłoni lub użycie podbródka lub innego urządzenia unieruchamiającego). Przypomnij osobie, aby zminimalizowała ruch i unikała dotykania nosa lub rurki oraz unikała mówienia.
   2. Włącz pompę roztworu #1 (Ringers) (5 ml/min lub 300 ml/h). Nagrywaj aż do uzyskania stabilnej wartości (zmiana <1 mV/30 s).
      UWAGA: Osiągnięcie stabilności zajmuje około 3 minut.
   3. Wyłącz perfuzję roztworem #1.
   4. Rozpocznij perfuzję od roztworu #2 (amiloryd). Rejestruj NPD przez co najmniej 3 minuty (jeśli plateau voltage jest wątpliwe, kontynuuj zapis łącznie do 5 minut).
   5. Rozpocznij perfuzję od roztworu #3 (Zero chlorków). Nagrywaj NPD przez co najmniej 3 minuty (jeśli napięcie plateau nie jest stabilne, kontynuuj nagrywanie łącznie do 5 minut).
   6. Rozpocznij perfuzję od roztworu #4 (Izoproterenol). Zapisuj NPD przez co najmniej 3 minuty [jeżeli napięcie na stabilnym poziomie nie jest stabilne (stałe śledzenie napięcia przez co najmniej 30 s < dryft 1 mV), kontynuuj zapis łącznie przez maksymalnie 5 minut].
   7. Rozpocznij perfuzję od roztworu #5 (ATP). Rejestruj NPD przez co najmniej 1 minutę, aż do uzyskania szczytowej odpowiedzi hiperpolaryzacyjnej.
   8. Włącz perfuzję roztworem #1 (Ringers) i odczekaj 30 sekund na przepłukanie cewnika.
   9. Wyłącz roztwór #1 perfuzja.
   10. Powtórz procedurę dla lewego nozdrza.

12. Koniec testu

1. Ponownie sprawdź i zapisz stabilne PD palca ("Post Finger") przez 5 s.
   1. Usuń mostek skórny i bandaż pacjenta z miejsca wprowadzenia na skórze. W przypadku systemu kremowego AgCl/ECG wyjmij elektrodę z ramienia.
   2. Zapisać napięcie "Końcowe przesunięcie w pętli zamkniętej" zgodnie z opisem pomiaru początkowego przesunięcia w pętli zamkniętej (patrz krok 7.1.3).
   3. Zaznacz końcowe przesunięcie za pomocą funkcyjnego.
   4. Zatrzymaj pobieranie danych (naciśnij "Start").
      UWAGA: Obecna SOP zaleca stosowanie 100 μM ATP do aktywacji purynergicznego wydzielania Cl^- zależnego od wapnia, które ma służyć jako kontrola pozytywna dla testu; Jest to jednak test fakultatywny.

Wyniki

W normalnym nabłonku dróg oddechowych, absorpcja Na⁺ jest podstawową aktywnością transportu jonów. Powoduje to ujemną różnicę potencjałów powierzchniowych dróg oddechowych w stosunku do śródmiąższu. Perfuzja amilorydu blokującego kanał ENaC prowadzi do mniej ujemnej różnicy potencjałów. Następnie superfuzja roztworu wolnego ^{od Cl tworzy} gradient chemiczny dla Cl^-, który tworzy bardziej ujemną różnicę potencjałów i aktywuje wszystkie transportery Cl^-, w tym CFTR. Izoproterenol, który zwiększa wewnątrzkomórkowy cAMP, dodatkowo zwiększa wydzielanie Cl^- poprzez specyficzną aktywację CFTR i zwiększa różnicę potencjałów.

Natomiast u osób z mukowiscydozą, brak lub dysfunkcja CFTR powoduje zwiększoną absorpcję Na⁺ za pośrednictwem ENaC¹². W rezultacie bazowa różnica potencjałów jest bardziej ujemna. Depolaryzacja obserwowana przy zastosowaniu amilorydu jest większa, podczas gdy różnica potencjałów jest minimalna lub nie ma jej wcale po stymulacji wydzielania Cl^- przez szlaki zależne od CFTR. Można to zobaczyć w reprezentatywnych śladach w Rysunek 8, pokazujący ślady "zdrowe" i "mukowiscydozę".

Rycina 8: Reprezentatywne dane osoby "zdrowej" i osoby z mukowiscydozą. PD: różnica potencjałów, ΔAmiloride: amilorek delta, 0 Cl^-/Iso^-: niska zawartość chlorku: zmiana PD między zakończeniem roztworu #2 a perfuzją roztworu #4, S1-S4: etapy 1-4, Zielona linia na wykresach A i B wskazuje śledzenie NPD, a czarne strzałki wskazują różnicę w różnicy potencjałów

Dyskusja

In vivo NPD zapewnia unikalny pomiar, który może być wykonywany wielokrotnie w ujęciu podłużnym i pokazuje, że przy powtarzających się pomiarach obserwuje się podobne wyniki podłużne na poziomie grupowym i indywidualnym^14,15. Istnieją mocne dowody na to, że NPD ma doskonałą trafność dyskryminacyjną w odróżnianiu mukowiscydozy od osób niezwiązanych z mukowiscydozą. 25 badań konsekwentnie wykazało statystycznie istotną różnicę w przewodności Cl^- i Na⁺ między pacjentami z mukowiscydozą a zdrową grupą kontrolną¹⁰. Chociaż kilka wcześniej opracowanych indeksów wykazuje tę zdolność, przewidujemy, że ze względu na niedawne standaryzacje metodologii ^7,8 konieczne będą nowe aktualizacje.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Ten test wymaga kilku kluczowych kroków, aby zapewnić dokładne pomiary. Obejmuje to przesunięcie elektrod i cewników w zamkniętej pętli, aby zapewnić, że system działa zgodnie z zalecanymi standardami. Pacjenci muszą pozostać w bezruchu i powstrzymać się od mówienia, ponieważ minimalizuje to artefakty i przemieszczenie cewnika. To sprawia, że test jest trudny u pacjentów niewspółpracujących, a technika ta została opisana tylko w jednym badaniu z udziałem dzieci w wieku poniżej^{6 lat 7}.

Wstępna kontrola nabłonka nosa jest konieczna, aby upewnić się, że na nabłonku nie ma strupów ani śluzu, które mogą wpływać na pomiary.

Co bardzo ważne, należy podkreślić, że miejsce umieszczenia cewnika jest przedmiotem dyskusji. Przedstawiony tutaj SOP wykorzystuje pomiar pod małżowiną dolną (IT). Umieszczenie cewnika pod IT zostało ustandaryzowane i przeprowadzone w badaniach wieloośrodkowych, dlatego jest to zalecana technika. Pomiar pod IT wykonuje się za pomocą cewnika z bocznym otworem, który może być trudny do utrzymania w stałym kontakcie z błoną śluzową nosa, podczas gdy jest w kontakcie z roztworami. Inne grupy mogą mierzyć PD na dnie nosa, co jest technicznie łatwiejsze. Co ważne, Vermeulen (2011) wykazał, że te 2 metody są porównywalne¹⁶.

Ocieplenie rozwiązań pozostaje kwestią sporną między ośrodkami europejskimi i amerykańskimi^17,18. Zaleca się, aby stosowanie roztworów w temperaturze 37 °C zamiast 22 °C zwiększało obserwowaną całkowitą odpowiedź chlorkową o około 25%, a zależną od izoproterenolu odpowiedź chlorkową o około 95%¹⁸. Jednak ocieplenie zwiększa zmienność, co ocenia się za pomocą większego odchylenia standardowego całkowitej odpowiedzi chlorkowej¹⁷. Dlatego, ponieważ ogrzewanie roztworów jest dodatkowym czynnikiem zmienności, zaleca się, aby nie podgrzewać roztworów, chyba że jest to wymagane na podstawie badań.

Wcześniej porównaliśmy obie techniki elektrod i stwierdziliśmy, że zarówno systemy elektrod AgCl, jak i Calomel działały podobnie w prądach podstawowych i stymulowanych u zdrowych osób¹³.

Ograniczenia techniki

Ten test podlega znacznej zmienności wewnątrzobiektowej. Zmienność punktacji jest szczególnie powszechna u pacjentów z nieokreślonymi śladami i należy to uwzględnić w zastosowaniu diagnostycznym¹⁹. Do czynników zmienności zalicza się ostre zakażenia górnych dróg oddechowych, rozległe polipy nosa, przebytą operację zatok oraz stany zapalne związane z mukowiscydozą, które zmniejszają jego swoistość i wrażliwość^20,10. Ponadto interpretacja śladów może być różna u różnych czytelników, chociaż czytelnicy eksperci wykazują doskonałą zgodność w zakresie ilościowej punktacji i interpretowalności w śledzeniu mukowiscydozy i bez mukowiscydozy, co kontrastuje ze znaczną zmiennością w pewności śledzenia¹⁹.

Wewnętrzna zmienność a znaczące progi

Co bardzo ważne, fizjologiczna zmienność pomiaru jest znaczna, co ilustrują różne badania¹⁰, takie jak badania terapii genowej CFTR, które wykazały znaczną zmienność zmian w całkowitym transporcie chlorków i zakresie amilorydów^21,22. Ocena przekrojowa sugeruje, że zerowa odpowiedź Cl^- plus izoproterenol powyżej progu od -5 do -7 mV jest punktem odcięcia między osobami z mukowiscydozą a osobami bez mukowiscydozy¹⁰.

Niemniej jednak brakuje nam jasnej wiedzy na temat wielkości zmiany tego parametru stanowiącego skuteczną korektę CFTR w badaniach fazy II z terapiami modyfikującymi przebieg choroby. Aby ocenić indywidualną reakcję, może być konieczne powtórzenie testów monitorujących odpowiedź na interwencję w celu odróżnienia istotnych zmian od wewnętrznej zmienności. Co bardzo ważne, przyszłe długoterminowe badania nad lekami modyfikującymi przebieg choroby muszą wykazać, że poprawa funkcji CFTR koreluje z poprawą klinicznie istotnych wyników lub wyników zastępczych (takich jak poprawa FEV₁) choroby z mukowiscydozą. Rzeczywiście, niedawne badanie fazy II iwakaftoru wykazało wyraźne korzyści kliniczne pomimo niewielkiej poprawy wydzielania chlorków²³.

Takie badania pomogą ustalić, czy wartość graniczna poprawy transnabłonkowego ^{przewodnictwa} Cl może być parametrem zastępczym dla korzyści klinicznej. Byłby to ważny parametr dla ukierunkowania rozwoju terapii modyfikujących CFTR.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod: Test Potu i Pomiary Prądu Jelitowego (ICM)

U pacjentów z "wątpliwą" mukowiscydozą, ocenianą na podstawie pośredniego stężenia Cl^- w pocie między 30 a 60 mM, wyniki złożone NPD stanowiły bardzo czułe narzędzie do diagnozowania pacjentów z "prawdopodobieństwem mukowiscydozy" i "nieprawdopodobnym mukowiscydozą"¹⁰. Pomiar prądu jelitowego (ICM), który zapewnia pomiar ex vivo strumieni netto Cl^- w nabłonku odbytnicy, umożliwia również określenie resztkowej funkcji CFTR z wysoką czułością, ponieważ CFTR ulega silnej ekspresji w tym nabłonku.

Biorąc pod uwagę modyfikację funkcji CFTR przez modulatory CFTR, związek między tymi różnymi zmianami biomarkerów CFTR jest obecnie niejasny. Chociaż niedawne prace oparte na produkcie Ivacaftor wykazały, że NPD i test potu są ze sobą skorelowane⁴, nie ustalono jeszcze, czy pomiar w drogach oddechowych jest lepszym predyktorem wyniku oddechowego niż na przykład test potu^24,25 lub zmiana ICM. Co więcej, leki modyfikujące mogą również różnić się skutecznością w zależności od narządu. W odniesieniu do NPD ważne jest, aby zauważyć, że zmiany w podstawowej odpowiedzi PD i amilorydowej wyrażają transport Na⁺, podczas gdy zmiany w odpowiedzi 0 Cl^- i izoproterenolu wyrażają transport Cl^-. Nie ustalono jeszcze, który z nich jest ważniejszy dla złagodzenia choroby.

Przyszłe zastosowanie tej techniki

Oczekuje się, że zastosowanie tej techniki będzie miało miejsce poza obszarem mukowiscydozy. Ponieważ technika ta jest wyjątkowo odpowiednia do wykazania kanału jonowego Na⁺ i Cl^- , może być stosowana do wykazania dysfunkcji w chorobach dróg oddechowych, w tym astmie²⁶, przewlekłym zapaleniu oskrzeli²⁷, rozstrzeniu oskrzeli bez mukowiscydozy²⁸ i nawracającym zapaleniu trzustki²⁹. Ponadto modyfikacje tej techniki zastosowano w dolnych drogach oddechowych (LAPD) w celu wykazania dysfunkcji CFTR skoncentrowanej na dolnych drogach oddechowych u pacjentów z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP) z przewlekłym zapaleniem oskrzeli³⁰.

NPD dostarcza czułego biomarkera funkcji CFTR in vivo , który może być wykorzystany zarówno do diagnozy, jak i do badań potwierdzających słuszność koncepcji mających na celu skorygowanie aktywności kanału CFTR i ENaC w badaniach translacyjnych. Pozwala to na podłużną ocenę funkcji przeznabłonkowej i jest obiecującą strategią dla medycyny spersonalizowanej w celu dostosowania najskuteczniejszego korektora dla każdego pacjenta z mukowiscydozą.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
KD Naukowa pompa infuzyjna (lub odpowiednik – taki jak programowalne pompy infuzyjne dostarczone przez instytucję/szpital)	Fisher Scientific
Powerlab 4/30	AD Instruments
BMA-200 Przenośny biowzmacniacz AC/DC	AD Instruments
Izolacyjna głowica IS0-Z do BMA-200	AD Instruments
Komputer kompatybilny z systemem Windows - Minimalne wymagania systemu Windows XP lub nowszego	Różne
programy AD Instruments: GLP Client V6 (Windows) lub nowszy	AD Instruments Elektroda
EKG (uziemienie dla badanego uczestnika)	Standard
2 mini kalomelowe elektrody referencyjne	Fisher Scientific	13-620-79
Chlorek potasu KCl, granulowany – USP, waga formuły 76, ilość: 500 g	Spectrum
Sterylny pojemnik (taki jak pojemnik do pobierania próbek lub podobny) do stosowania do kąpieli kalomelowej KCl, z otworami wyciętymi w pokrywie do utrzymywania elektrod na miejscu. (Jeśli nie jest dostarczony przez producenta elektrody.)	Standardowe
2 elektrody szpitalne: Ag/AgCl 8 mm elektroda TP	BIOPAC Systems	UNSHLD-EL258
2 elektrody Ag/AgCl, B0194, wtyczka 4 mm	SLE Instruments
Signacreme® Elektroda przewodząca w kremie	Fisher Scientific	Parker Labs nr ref # 17-05
Urządzenie do ścierania skóry	PROMED Feeling	Ref 374901
Hi Di 541 M, Frezy dentystyczne z diamentową końcówką	Ash Instruments
Rurka Becton Dickinson PE 50	Fisher Scientific	427411
Rurka Becton Dickinson PE 90	Fisher Scientific	427421
Rurki krzemowe, 0,062" Identyfikator, 0,095" OD	Fisher Scientific	508-007
Taśma chirurgiczna z mikroporami (25 mm x 9,1 m)	3M	1530-1
Cewnik dwukanałowy Marquat Długość: 80 cm; Średnica zewnętrzna: 2,5 mm; Średnica wewnętrzna kanałów: 0,8 mm; Odległość bocznych otworów od końcówki: 2 mm. Etykieta UE Umowa na NPD: I0202US	Marquat	I0202US
Taśma jedwabna 1" X 10 jardów Rurka	3M Durapore	1538-1
IV (30", 50/pudełko)	International Limited	IMN30
Zawór trójdrogowy (50/pudełko)	Medex	MX5311L
Sterylne filtry strzykawkowe (ANOTOP 25 sterylne 50 pk; 0,22-μ m lub mniejsze filtry; lub równoważny)	Fisher Scientific	09-926-7
Adapter klocka Becton Dickinson Intramedic Luer (20 G, do podłączenia do PE90 w przypadku używania cewnika do nosa wyprodukowanego w ośrodku badawczym)	Fisher Scientific	427564
Becton Dickinson 23 G, 0,75" Vacutainer (" motyl") igły (0,6 mm x 19 mm; 50 U/pudełko) (do podłączenia do PE50) w przypadku stosowania cewnika do nosa wyprodukowanego w ośrodku badawczym)	Fisher Scientific	367283
Becton Dickinson Strzykawka 60 ml bez igły Końcówka Luer-Lok (40/pudełko)	Fisher Scientific	309653
Strzykawka Becton Dickinson 10 ml bez igły Końcówka Luer-Lok (100/pudełko)	Fisher Scientific	309604
Sterylne chusteczki jednorazowego użytku (w zależności od dostępności w instytucji)	Standard
70% EtOH (1 litr), numer katalogowy Aaper Alcohol and Chemical Co. NC9274019 (lub równoważny)	Jednorazowe
Corning, 0,22 i mu; m wielkość porów (dopuszczalne objętości 0,15 – 1,0 l)	Fisher Scientific	430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – do kalibracji pH-metru	Fisher Scientific
Buffer Cert 4.00 (1 L Sn04327) – do kalibracji pH-metru	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – do kalibracji pH-metru	Fisher Scientific
Jednorazowe podkładki (Blue Pads; 23" x 36" 150/pudełko; lub odpowiednik zgodny ze standardem szpitalnym)	SureCare
23 G, 0,75" Odkurzacz " motyl" igły (0,6 mm x 19 mm; 50 U/pudełko)	Becton Dickinson	367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; lub równoważny)	Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (lub odpowiednik)	Fisher Scientific
Convertible Handle Welch Allyn Bateria 72300 (lub odpowiednik) LUB Otoskop z baterią	Fisher Scientific
Podpórka pod głowę i podbródek (lub odpowiednik; opcjonalnie)	Richmond Products, Inc	629R
Rozpraszająca ładunki elektrostatyczne maty przeciwzmęczeniowe  (lub równoważny)	Fisher Scientific	No. 791
ODCZYNNIKI DO ROZTWORÓW ZMIESZANYCH NA MIEJSCU
Chlorek SODU, granulowany – Formuła widma			Waga: 58; Rozmiar: 500 g
chlorku wapnia CaCl2 i byk; 2H2O –	Formuła widma		Waga: 147; Rozmiar: 500 g
sześciowodnego kryształu chlorku magnezu, MgCl2• 6H2O –	Formuła widma		Waga: 203; Rozmiar: 500 g
fosforanu potasu dwuzasadowego, bezwodnego, granulowanego, KH2PO4 –	Formuła widma		Waga: 174; Rozmiar: 500 g
monopodstawowych kryształów fosforanu potasu – NF (KH2PO4)	Widmo		Formuła Waga: 136; Rozmiar: 500 g
Glukonian sodu - USP (sól monosodowa)	Formuła spektrum		Waga: 218; Rozmiar: 500 g
glukonianu wapnia – USP (bezwodny proszek)	Formuła spektrum		Waga: 430; Rozmiar: 500 g
glukonianu potasu - USP (bezwodny)	Formuła spektrum		Waga: 234; Rozmiar: 500 g
siarczanu magnezu siedmiowodnego – USP MgSO4• 7H2O	Formuła widma		Waga: 246; Rozmiar: 500 g
amilorydu HCl –	Formuła widma		Waga: 302; Rozmiar: 5gm
adenozyno-5'-trifosforan (ATP) (sól disodowa)	Formuła widma		Waga: 551; Rozmiar: 5 g
chlorku magnezu, sześciowodnego, kryształu – USP MgCl2• 6H2O	Formuła widma		Waga: 203; Rozmiar: 500 g
Woda podwójnie destylowana (ddH2O)	Apteka		Formuła Waga: NA; Rozmiar: 1 l
Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg / 5 mL Ampułka	Apteka		Szpitalna Formuła Waga: 248; Rozmiar: jednorazowy Ringers
Injection, USP lub Ringers Irrigation	Hospital Pharmacy		Formuła Waga: NA; Rozmiar: 5 L