Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obwód okołodobowego rozrusznika serca koordynuje rytmiczne behawioralne i fizjologiczne wyjścia skoordynowane ze wskazówkami środowiskowymi, takimi jak cykle dnia i nocy. Zegar molekularny w każdym neuronie rozrusznika generuje rytmy okołodobowe w ekspresji genów, które leżą u podstaw rytmicznych funkcji neuronalnych niezbędnych do działania obwodu. Badanie właściwości poszczególnych oscylatorów molekularnych w różnych podklasach neuronów rozrusznika serca i ich interakcji z sygnalizacją neuronalną pozwala lepiej zrozumieć obwód okołodobowego rozrusznika serca. W tym miejscu przedstawiamy podejście do poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej opracowane w celu monitorowania mechanizmu molekularnego w neuronach zegarowych hodowanego mózgu larwalnego Drosophila. Metoda ta pozwala na wielodniowe rejestrowanie rytmów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów okołodobowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Tę konfigurację można połączyć z manipulacjami farmakologicznymi w celu dokładnej analizy reakcji zegara molekularnego w czasie rzeczywistym na różne związki. Poza rytmami okołodobowymi, ta wielofunkcyjna metoda w połączeniu z potężnymi technikami genetycznymi Drosophila oferuje możliwość badania różnych procesów neuronalnych lub molekularnych w żywej tkance mózgowej.
Wprowadzenie
Zegary okołodobowe pomagają organizmom przystosować się do okresowych zmian środowiskowych generowanych przez 24-godzinny obrót Ziemi. Powiązane pętle transkrypcyjno-translacyjnego sprzężenia zwrotnego często leżą u podstaw molekularnej maszynerii zegarów okołodobowych u różnych gatunków1. Obwód okołodobowego rozrusznika serca, składający się z neuronów zawierających zegar, integruje informacje o porze dnia przekazywane przez sygnały środowiskowe, takie jak cykle światła/ciemności (LD) i temperatury, aby koordynować rytmy mnóstwa codziennych procesów fizjologicznych i behawioralnych2,3.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów podstawowych pod kapturem hodowlanym
- Przygotuj 400 ml 1x Schneider Active Medium (SAM) zoptymalizowanego pod kątem hodowli ex vivo mózgów larw (zmodyfikowane z odniesienia24,25) (Tabela 1). Podwielokrotność do 5 ml i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie (LN2), przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przygotuj 1x roztwór soli fizjologicznej do preparowania (DSS), rozcieńczając 10x roztwór podstawowy (zmodyfikowany z reference26) (Tabela 2).
- Podwielokrotność fibrynogenu do 10 m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej sekcji przedstawiamy reprezentatywne wyniki długoterminowej rejestracji okołodobowego reportera fluorescencyjnego w hodowli mózgu larwy ex vivo oraz wyniki obrazowania na żywo wpływu aplikacji PDF do kąpieli na ekspresję reportera.
Nieprzemieszczające się larwy L3 wykazujące ekspresję reportera zegara molekularnego PER-TDT oraz UAS-mCD8::YFP sterowanego przez driver neuronów zegarowych Clk(856)-gal4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisaliśmy metodę długotrwałej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej hodowanych mózgów larwalnych. Powodzenie tego typu eksperymentów zależy od wielu czynników, takich jak stan zdrowia hodowli, metoda unieruchomienia eksplantu mózgu, intensywność fluorescencji i stosunek sygnału do szumu reportera, rozdzielczość czasowa i przestrzenna oraz dostępność eksplantatu. Czynniki te mogą się wzajemnie wykluczać. Na przykład rosnąca częstotliwość filmów poklatkowych wpływa na zdrowie kultury, a unieruchomienie ek.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Michaelowi Rosbashowi za jego mentoring i wsparcie podczas początkowej fazy rozwoju tej metody. Prace te zostały sfinansowane przez program JST PRESTO, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (31003A_149893 i 31003A_169548), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-StG-311194), Fundację Novartis na rzecz Badań Medyczno-Biomedycznych (13A39) oraz Uniwersytet Genewski.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | Nie jestem pewien, czy są to dokładnie te same, które mamy w laboratorium. Wybrałem "odpowiedni do hodowli komórek owadów", jeśli jest dostępny |
| 2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glukoza | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Ekstrakt drożdżowy | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Kwas jabłkowy | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-trehaloza dwuwodna | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Kwas bursztynowy | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Kwas fumarowy | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| &alfa;-kwas ketoglutarowy | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Nieinaktywowana termicznie, surowica cielęca płodu (FCS) Badania przesiewowe w kierunku Mykoplazmy i wirusów | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7,4 | E& K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrynogen z osocza bydlęcego | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | UWAGA: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Manipulować pod przepływem laminarnym |
| Trombina z osocza bydlęcego | Sigma-Aldrich | T9549 | UWAGA: Zagrożenie dla zdrowia, używać rękawic |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | na zamówienie | |
| Smar próżniowy | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Naczynie, nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekane | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Naczynia do hodowli tkankowych | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterylny filtr butelkowy z gwintem 500 ml Steritop-GP 33 mm, 0,22 μ m | Millipore | SCGPS05RE | |
| Folia politetrafluoroetylenowa (PTFE) | Dupont | 200A Teflonowa folia | |
| Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45 &mikro; m, PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0.22 &mikro; m, PVDF, 33 mm, sterylizowane promieniami gamma | Millipore | SLGV033RS | |
| Trzydołkowe szklane naczynie preparacyjne | Dowolna firma | ||
| Cienkie kleszcze, rozmiar 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Skaner tandemowy odwrócony mikroskop konfokalny TCS SP5, ze skanerem rezonansowym i detektorami fotopowielacza HyD | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Komora kontroli temperatury | Usługi obrazowania życia | CUBE & System kontroli temperatury BOX, specjalnie zaprojektowany | |
| Stage-top regulator wilgotności | Imaging Services | wykonane na zamówienie | |
| Mikro dozownik zanurzenia w wodzie: dozownik, rozszerzona mikropompa serii MP6 i oprogramowanie Autoimmersion Objective Controller | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Tworzenie stosu SUM i wtyczka dryfu korekcji 3D | Oprogramowanie | ||
| ImageJ10x iteracyjna dekonwolucja, | AutoQuant i Imaris |
Bibliografia
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
