Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57015

⸱

19 stycznia 2018

 , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Streszczenie

Obwód okołodobowego rozrusznika serca koordynuje rytmiczne behawioralne i fizjologiczne wyjścia skoordynowane ze wskazówkami środowiskowymi, takimi jak cykle dnia i nocy. Zegar molekularny w każdym neuronie rozrusznika generuje rytmy okołodobowe w ekspresji genów, które leżą u podstaw rytmicznych funkcji neuronalnych niezbędnych do działania obwodu. Badanie właściwości poszczególnych oscylatorów molekularnych w różnych podklasach neuronów rozrusznika serca i ich interakcji z sygnalizacją neuronalną pozwala lepiej zrozumieć obwód okołodobowego rozrusznika serca. W tym miejscu przedstawiamy podejście do poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej opracowane w celu monitorowania mechanizmu molekularnego w neuronach zegarowych hodowanego mózgu larwalnego Drosophila. Metoda ta pozwala na wielodniowe rejestrowanie rytmów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów okołodobowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Tę konfigurację można połączyć z manipulacjami farmakologicznymi w celu dokładnej analizy reakcji zegara molekularnego w czasie rzeczywistym na różne związki. Poza rytmami okołodobowymi, ta wielofunkcyjna metoda w połączeniu z potężnymi technikami genetycznymi Drosophila oferuje możliwość badania różnych procesów neuronalnych lub molekularnych w żywej tkance mózgowej.

Wprowadzenie

Zegary okołodobowe pomagają organizmom przystosować się do okresowych zmian środowiskowych generowanych przez 24-godzinny obrót Ziemi. Powiązane pętle transkrypcyjno-translacyjnego sprzężenia zwrotnego często leżą u podstaw molekularnej maszynerii zegarów okołodobowych u różnych gatunków1. Obwód okołodobowego rozrusznika serca, składający się z neuronów zawierających zegar, integruje informacje o porze dnia przekazywane przez sygnały środowiskowe, takie jak cykle światła/ciemności (LD) i temperatury, aby koordynować rytmy mnóstwa codziennych procesów fizjologicznych i behawioralnych2,3. Koordynacja rytmów molekularnych z wejściami i wyjściami neuronów jest niezwykle ważna dla działania obwodu okołodobowego, ale pozostaje tylko częściowo poznana.

U Drosophila, w sercu zegara molekularnego, heterodimer CLOCK/CYCLE (CLK/) aktywuje transkrypcję okresu (per) i bezczasowości (tim). PER i TIM tworzą kompleks i dostają się do jądra, gdzie hamują aktywność transkrypcyjną CLK/, a w konsekwencji własną transkrypcję. Regulacje potranskrypcyjne i potranslacyjne powodują opóźnienia między transkrypcją za pośrednictwem CLK/a represją przez PER/TIM, zapewniając generowanie około 24-godzinnych oscylacji molekularnych1,3,4. Około 150 neuronów zawierających te zegary molekularne tworzy obwód kontrolujący okołodobowe zachowanie dorosłych muszek5. Znacznie prostszy, ale w pełni funkcjonalny obwód okołodobowy składający się z 3 grup neuronów zegarowych - 5 brzusznych neuronów bocznych (LNvs; 4 PDF-dodatnie LNv i jeden PDF-ujemny LNv, patrz poniżej), 2 neurony grzbietowe 1s (DN1s) i 2 neurony grzbietowe 2s (DN2s) - jest obecny w mózgu larwy 6,7.

Prosty larwalny obwód okołodobowy stanowi doskonały model do badania interakcji między komunikacją międzyneuronalną a mechanizmem molekularnym. Korzystając z naszego nowo opracowanego fluorescencyjnego reportera PER-TDT, który naśladuje poziomy białka PER i jego subkomórkową lokalizację, staraliśmy się scharakteryzować dynamikę mechanizmu zegarowego w różnych podgrupach neuronów zegarowych w obwodzie okołodobowym larw 8. Ponadto, znając kluczową rolę czynnika dyspersyjnego pigmentu neuropeptydowego (PDF) wytwarzanego przez 4 LNvs w regulacji rytmów okołodobowych na poziomie neuronalnym9,10,11, chcieliśmy zbadać bezpośredni wpływ PDF na zegary molekularne. W tym celu opracowaliśmy metodę monitorowania okołodobowych rytmów ekspresji genów w eksplantacji mózgu larw przez wiele dni za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Protokół został również dostosowany do testów farmakologicznych w celu zbadania wpływu PDF lub innych związków na poziom PER-TDT. W związku z tym adaptacja polega na udostępnieniu hodowli eksplantatów mózgu do stosowania leków, zwiększeniu rozdzielczości czasowej i obrazowaniu przez krótszy czas.

Hodowla ex vivo mózgów Drosophila o różnych stadiach rozwojowych została wcześniej ustalona12,13,14,15,16,17,18. Podczas gdy protokoły te były używane do obrazowania różnych zjawisk biologicznych, niektóre z nich nie są kompatybilne z obrazowaniem w rozdzielczości pojedynczej komórki lub nie wspierają hodowli przez więcej niż kilka godzin. Alternatywne metody wykonywania długoterminowego obrazowania na żywo neuronów okołodobowych u Drosophila obejmują bioluminescencyjne obrazowanie rytmów molekularnych19,20,21 oraz obrazowanie fluorescencyjne wskaźnika wapnia za pomocą mikroskopii arkuszowej22,23. Chociaż obrazowanie bioluminescencyjne może osiągnąć wyższą rozdzielczość czasową, a mikroskopia arkuszy świetlnych może być przystosowana do obrazowania in vivo, są one ograniczone pod względem rozdzielczości przestrzennej i wymagają specjalistycznych systemów mikroskopowych.

Opisana tutaj metoda jest dostosowana do wizualizacji sygnałów fluorescencyjnych w całej kulturze mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki przez wiele dni. Ta łatwa i wszechstronna metoda może zostać zaadaptowana do obrazowania mózgów dorosłych much oraz do eksperymentów farmakologicznych w celu zbadania wielu różnych problemów w neurobiologii Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów podstawowych pod kapturem hodowlanym

  1. Przygotuj 400 ml 1x Schneider Active Medium (SAM) zoptymalizowanego pod kątem hodowli ex vivo mózgów larw (zmodyfikowane z odniesienia24,25) (Tabela 1). Podwielokrotność do 5 ml i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie (LN2), przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotuj 1x roztwór soli fizjologicznej do preparowania (DSS), rozcieńczając 10x roztwór podstawowy (zmodyfikowany z reference26) (Tabela 2).
  3. Podwielokrotność fibrynogenu do 10 mg i przechowywać w temperaturze 4 °C do jednorazowego użytku.
    Uwaga: Zważ fibrynogen pod przepływem laminarnym, w rękawiczkach, ponieważ jest szkodliwy.
  4. Przygotować roztwór podstawowy trombiny w SAM (1500 NIH jednostki/mg) i podwielokrotności do 10 μl, błyskawicznie zamrozić w LN2 i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z trombiną należy nosić rękawice, ponieważ jest ona szkodliwa.
  5. Podwielokrotny roztwór podstawowy 100x penicylina-streptomycyna. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Wytnij kółka membrany politetrafluoroetylenowej (PTFE) (patrz tabela materiałów) do rozmiaru, który pasuje do wnętrza naczynia ze szklanym dnem. Opłucz je w 70% EtOH, a następnie w autoklawizowanym dH2O. Wysterylizuj i wysusz pod wpływem laminarnym promieniowaniem UV. Przechowywać na sterylnej szalce Petriego. Jednorazowego użytku.
    UWAGA: PTFE to porowata, elastyczna membrana, która umożliwia wymianę gazową i zapobiega parowaniu medium podczas długotrwałego nagrywania.

2. Konfiguracja mikroskopii poklatkowej

UWAGA: Poniższa konfiguracja dotyczy odwróconego mikroskopu konfokalnego ze skanerem tandemowym (patrz Tabela Materiałów) wyposażonego w skaner rezonansowy (8 000 Hz). System zawiera bardzo czuły detektor fotopowielaczy, który wraz ze skanerem rezonansowym zapobiega fototoksyczności i fotowybielaniu. Temperatura i wilgotność są kontrolowane w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz tabela materiałów), która obejmuje większą część mikroskopu.

  1. Umieść komorę wilgotnościową na górze sceny.
  2. Włącz regulatory temperatury i wilgotności, aby zrównoważyć komorę mikroskopu do 25 °C i 80% wilgotności.
  3. Aby przeprowadzać eksperymenty w ciągłej ciemności (DD), przykryj komorę środowiskową mikroskopu nieprzezroczystą szmatką (chyba że komora mikroskopu jest wykonana z nieprzezroczystego materiału).
  4. Jeśli używasz obiektywu do zanurzenia w wodzie, umieść mikrodozownik zanurzenia w wodzie na górze obiektywu i zaprogramuj protokół za pomocą oprogramowania Autoimmersion Objective Controller, aby dozować wodę ze stałą szybkością podczas obrazowania poklatkowego.
    UWAGA: Obiektywy zanurzone w wodzie wraz z dozownikiem wody lub suchą soczewką obiektywową są zalecane do długotrwałego obrazowania na żywo, ponieważ inne rodzaje medium zanurzeniowego wyschłyby.
  5. Umieść uchwyt na szalkę Petriego na stoliku, wewnątrz komory wilgotnościowej.
  6. Uruchom oprogramowanie mikroskopu i wybierz tryb skanera rezonansowego w pierwszym oknie dialogowym. Wybierz przycisk OK, aby zainicjować etap po wyświetleniu monitu. Przejdź do zakładki Konfiguracja i do Konfiguracja sprzętowa, aby włączyć odpowiednie linie laserowe.
  7. Przejdź do zakładki Pobieranie i do panelu XY, aby wybrać tryb dwukierunkowy i ustawić parametry akwizycji obrazu.
    UWAGA: Przedstawiony tutaj opisany układ obrazowania (Rysunek 2, Rysunek 3 i film 1) jest zoptymalizowany do obserwacji okołodobowej ekspresji określonych reporterów fluorescencyjnych. Następujące parametry zostały dobrane tak, aby jak najlepiej pasowały do naszych specyfikacji: obiektyw 40-krotny zanurzony w wodzie, 8-krotna średnia liniowa z rozdzielczością obrazu 512 × 512. W przypadku obrazowania wielobarwnego sekwencyjna akwizycja obrazu jest wymagana, gdy długość fali emisji jednego fluoroforu i długość fali wzbudzenia innego nakładają się na siebie (w tym przypadku długości fal emisji żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) i wzbudzenia pomidora nakładają się na siebie). Wybierz tryb sekwencyjny "pomiędzy stosem", ponieważ jest on najszybszy, a ruch neuronów zegarowych jest znikomy podczas pozyskiwania stosu Z. Ustawienia mikroskopii powinny być dostosowane do celu każdego eksperymentu.

3. Konfiguracja hodowli eksplantatów mózgu larwalnego

UWAGA: Cała procedura od sekcji do osadzenia eksplantatów mózgu zajmuje ~30 min.

  1. Przygotowanie odczynników pod kapturem hodowlanym.
    1. Rozmrozić porcję trombiny i przechowywać w temperaturze pokojowej aż do etapu zatapiania (etap 3.3). Jednorazowego użytku.
    2. Szybko rozmrozić porcję SAM w temperaturze 37 °C i przechowywać na lodzie przez jednorazowe użycie.
    3. Dodać SAM do 10 mg podwielokrotności fibrynogenu do 10 mg/ml, delikatnie strzepnąć i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut oraz podczas etapu zatapiania (etap 3.3). Jednorazowego użytku.
      UWAGA: Nie inkubować roztworu fibrynogenu dłużej niż 2 godziny, gdy zaczyna polimeryzować.
    4. Rozmrozić porcję 100x zapasowej penicyliny-streptomycyny. Przygotuj 2,5 ml SAM zawierającego 1x penicylina-streptomycyna (SAM/antybiotyki). Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przechowuj pozostałe 100x zapasu penicyliny-streptomycyny w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    5. Przygotować podwielokrotność 500 μl z pozostałego SAM. Trzymaj na lodzie.
    6. W przypadku długotrwałego obrazowania nałóż autoklawowany smar próżniowy na plastikową część dna szklanego naczynia (Rysunek 1A) i sterylizuj pod wpływem laminarnego przepływu UV.
  2. Rozwarstwienie ośrodkowego układu nerwowego i brzusznego rdzenia nerwowego.
    1. Oczyść kleszcze i 2 x trzydołkowe szklane naczynia preparacyjne 70% EtOH. Wlej 400 μl DSS do 4 studzienek i 400 μl SAM do jednego dołka. Trzymaj na lodzie.
    2. Zgarnij podłoże muchowe zawierające larwy i wybierz kleszcze niewędrujące larwy 3. stadium (L3). Opłucz je kolejno w 2 studzienkach wypełnionych DSS. Trzymaj je w 3. studzience wypełnionej DSS na lodzie, który znieczula larwy.
      UWAGA: L3 wystarcza na około 2 dni w temperaturze 25 °C. Aby obserwować mózg w fizjologicznie istotnych ramach czasowych, zdecydowaliśmy się użyć niewędrujących larw L3. Inne podgrupy neuronów zegarowych, takie jak l-LNvs i DN3, zaczynają się tworzyć na etapie wędrówki L3, ale niekoniecznie jeszcze cyklicznie (dane nie pokazane). Dlatego, chociaż na tym etapie możliwe jest zobrazowanie cyklicznych neuronów zegarowych (dane nie pokazane), ważne jest, aby dokładnie odróżnić już funkcjonalne neurony zegara larwalnego od neuronów rozwijających się do analizy danych. Niewędrujące L3 pojawiają się około 4 do 4,5 dnia po złożeniu jaj w temperaturze 25 °C. Aby wykorzystać ten protokół do badania rytmów okołodobowych, należy zsynchronizować (porwać) rozwijające się larwy w 12 godzinnych/12-godzinnych cyklach LD w temperaturze 25 °C przez 3 dni przed pobraniem larw L3.
    3. Wypreparuj mózgi larw za pomocą cienkich kleszczy w czwartej studni wypełnionej DSS, która nie była używana do płukania larw, przy użyciu metody inside-out27.
      1. Krótko przetnij larwę na dwie części, delikatnie ściśnij haczyki do ust parą kleszczy i zwiń na lewą stronę ściany ciała za pomocą drugiej pary kleszczy, odsłaniając w ten sposób mózg. Uwolnij mózg, wycinając wszystkie tchawice i nerwy, które łączą go z resztą ciała.
      2. Zassać mózg w około 3 μl DSS za pomocą pipety 20 μl (wstępnie przepłukanej DSS) i dozować do studzienki wypełnionej SAM. Powtórz procedurę dla maksymalnie 7 mózgów.
        UWAGA: Sekcja powinna być wykonywana na zimnej powierzchni, aby larwy były znieczulone, a mózg schłodzony. Na przykład umieść naczynie rozwarstwiające na bloku chłodzącym podłączonym do pompy, aby cyrkulować lodowatą wodę. Procedura preparacji trwa ~30 s na mózg. Ważne jest, aby krążki wyobrażeniowe oka/czułków były przyczepione do mózgu i brzusznego rdzenia nerwowego w stanie nienaruszonym. Oderwanie tych części uszkodzi mózg i obniży jakość hodowli. Unikaj również wystawiania mózgów na działanie powietrza. Przed zasysaniem pierwszego mózgu należy pipetować w górę i w dół DSS zawierającego części wypreparowanych larw, ponieważ zapobiega to przywieraniu mózgu do ścianki końcówki.
  3. Osadzenie eksplantatów mózgu w matrycy 3D i montaż (~20 min).
    1. Zanurz wypreparowany mózg w roztworze roboczym fibrynogenu (końcowe stężenie fibrynogenu ~ 3,3 mg / ml, 10,5 μl na mózg) w następujący sposób:
    2. Odessać 3,5 μl SAM/antybiotyków (tą samą końcówką, co w sekcji 3.2.3). Odessać wypreparowany mózg z sekcji do tej samej końcówki pipety bez dozowania pożywki SAM/antybiotyków do końcówki.
    3. Dozuj mózg i pożywkę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego. Dodaj kolejne 3,5 μl SAM/antybiotyków i 3,5 μl ciepłego roztworu fibrynogenu/SAM 10 mg/ml na kroplę zawierającą mózg. Delikatnie wymieszać roztwór wokół mózgu, pipetując końcówką do pipety o pojemności 20 μl.
      UWAGA: Używanie pipety zamiast kleszczy na tym etapie pozwala uniknąć stresu dla mózgu.
    4. Weź 2 μl roztworu roboczego fibrynogenu z kropli i nałóż go na szkiełko nakrywkowe naczynia ze szklanym dnem jako małe kółko. Dodać 0,8 μl trombiny i bardzo szybko wymieszać końcówką pipety. Fibrynogen przekształca się w fibrynę i zaczyna polimeryzować.
    5. Weźmy mózg, który znajduje się w roztworze roboczym fibrynogenu (krok 3.3.1) między parą kleszczy i umieść go na matrycy, gdy widoczna jest biała matryca fibryny. Zorientuj mózg przednią stroną do dołu (do obrazowania neuronów zegarowych). Dociśnij go jak najbliżej szkła nakrywkowego. Skrzep fibrynowy składa się z warstw fibryny. Wybierz jedną warstwę i złóż ją na mózgu małymi i delikatnymi ruchami, nie odrywając matrycy.
      1. Powtórz 2 do 3 razy z różnych części skrzepu, aby ustabilizować mózg.
        UWAGA: Podczas obchodzenia się z mózgiem za pomocą kleszczy należy uważać, aby go nie wysuszyć ani nie wywierać na niego fizycznego stresu.
    6. Dodaj 20 μl SAM/antybiotyków na wierzch osadzonego mózgu, aby zatrzymać działanie trombiny.
    7. Powtórz procedurę, aby zamontować pozostałe mózgi. Możliwe jest osadzenie od 5 do 6 mózgów na naczyniu ze szklanym dnem.
    8. W przypadku długotrwałego obrazowania na żywo dodaj 600 μl SAM/antybiotyków do wewnętrznej studzienki (szklanej części). Umieść wstępnie przyciętą membranę PTFE na wierzchu medium i przyklej ją do smaru próżniowego nałożonego na plastikową część dna (3.1.5) (Rysunek 1A).
    9. W przypadku testów farmakologicznych napełnij naczynie 2 ml SAM/antybiotyków (Rysunek 1B).
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać parowania pożywki, ponieważ osmolalność pożywki ma kluczowe znaczenie dla żywotności neuronów. Dlatego w przypadku długotrwałych eksperymentów obrazowych konieczne jest uszczelnienie naczynia hodowlanego membraną PTFE. Natomiast w przypadku eksperymentów krótkoterminowych membrana uszczelniająca nie jest wymagana, o ile naczynie jest wypełnione 2 ml pożywki i monitorowane w wilgotnej komorze.

4. Akwizycja zdjęć poklatkowych

  1. Umieść naczynie ze szklanym dnem na uchwycie szalki Petriego w komorze wilgotnościowej stage-top.
  2. Przejdź do panelu z-stack w zakładce Acquire i ustaw kroki przekroju z poziomu oprogramowania mikroskopu (2 μm × ~40 w eksperymentach pokazanych w Rysunek 2 i Rysunek 3 i Film 1). Ustaw początek stosu z w płaszczyźnie najbardziej oddalonej od szkiełka nakrywkowego, a koniec na powierzchni eksplantatu mózgu, blisko szkiełka nakrywkowego. Chociaż ruchy mózgu są znikome, dodaj dodatkowe sekcje z na początku i na końcu stosu z.
  3. Przejdź do panelu Mark & Find i skonfiguruj wielopozycyjne pobieranie obrazów. Dzięki obiektywowi 40X można uchwycić 1 półkulę mózgu w polu widzenia
  4. Przejdź do panelu Tryb akwizycji i wybierz xyzt (z-stack time-lapse). Przejdź do panelu Akwizycja czasu i ustaw preferowany przedział czasowy i parametry częstotliwości.
    UWAGA: Uzyskuj obrazy poklatkowe z żądaną częstotliwością. Należy zauważyć, że długoterminowe obrazowanie na żywo (24-72 godziny) z odstępem poklatkowym krótszym niż 2 godziny ma tendencję do zmniejszania liczby neuronów cyklicznych, prawdopodobnie dlatego, że zmniejsza żywotność neuronów. Ilość danych zwiększa się wraz ze wzrostem szybkości pozyskiwania obrazów, co sprawia, że analiza i przechowywanie danych jest trudniejsze.

5. Farmakologiczne leczenie eksplantatów mózgu za pomocą krótkotrwałego obrazowania na żywo

UWAGA: Poniższa procedura jest zasadniczo taka sama jak w przypadku obrazowania długoterminowego, ale nie wymaga membrany PTFE. Aby uniknąć wystawiania mózgów na działanie niebieskiego światła, gdy substancja chemiczna jest dodawana do kultury, mikroskop należy umieścić w ciemnym pomieszczeniu z czerwonym światłem.

  1. Przejdź do panelu Time Acquisition i ustaw żądany przedział czasu i liczbę skanowania, aby uzyskać dane wyjściowe przed zastosowaniem leku. Rozpocznij skanowanie.
  2. Po zakończeniu skanowania linii bazowej podnieś głowicę skanującą systemu mikroskopu. Zdejmij pokrywę regulatora wilgotności stage-top i bardzo ostrożnie zdejmij pokrywkę naczynia ze szklanym dnem, nie przesuwając jej.
  3. W razie potrzeby usunąć odpowiednią ilość pożywki hodowlanej. Dodać roztwór doświadczalny do pożywki i ostrożnie i bardzo delikatnie wymieszać sterylną pipetą Pasteura, nie dotykając eksplantatów mózgu.
    UWAGA: Do aplikacji PDF w kąpieli należy użyć roztworu podstawowego PDF 2 μM (w 10% DMSO).
  4. Załóż pokrywki naczynia ze szklanym dnem i wilgotnej komory oraz głowicy skanującej. Jeśli używasz, zmień położenie czarnej nieprzezroczystej tkaniny wokół komory mikroskopu.
  5. Sprawdź, czy mózgi są w swoich pierwotnych pozycjach w trybie skanowania na żywo. W razie potrzeby dostosuj.
  6. Przejdź do panelu Time Acquisition (Pobieranie czasu) i ustaw żądany przedział czasu oraz liczbę skanowań. Uruchom Scan.
    UWAGA: Tutaj testowaliśmy zdjęcia poklatkowe robione co godzinę przez maksymalnie 10 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym materiale przedstawiamy reprezentatywne wyniki długoterminowego obrazowania okołodobowego reportera fluorescencyjnego w kulturze mózgu larw ex vivo oraz wyniki obrazowania na żywo wpływu aplikacji PDF do kąpieli na ekspresję reportera.

Larwy L3 o niskiej mobilności, wykazujące ekspresję reportera zegara molekularnego PER-TDT oraz UAS-mCD8::YFP sterowanego przez driver neuronów zegarowych Clk(856)-gal4

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy metodę długotrwałej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej hodowanych mózgów larwalnych. Powodzenie tego typu eksperymentów zależy od wielu czynników, takich jak stan zdrowia hodowli, metoda unieruchomienia eksplantu mózgu, intensywność fluorescencji i stosunek sygnału do szumu reportera, rozdzielczość czasowa i przestrzenna oraz dostępność eksplantatu. Czynniki te mogą się wzajemnie wykluczać. Na przykład rosnąca częstotliwość filmów poklatkowych wpływa na zdrowie kultury, a unieruchomienie ek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Michaelowi Rosbashowi za jego mentoring i wsparcie podczas początkowej fazy rozwoju tej metody. Prace te zostały sfinansowane przez program JST PRESTO, Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (31003A_149893 i 31003A_169548), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-StG-311194), Fundację Novartis na rzecz Badań Medyczno-Biomedycznych (13A39) oraz Uniwersytet Genewski.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KH2PO4Sigma-AldrichP5655Nie jestem pewien, czy są to dokładnie te same, które mamy w laboratorium. Wybrałem "odpowiedni do hodowli komórek owadów", jeśli jest dostępny
2Sigma-AldrichC7902
MgSO4.7H2OSigma-Aldrich230391
NaClSigma-AldrichS5886
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
D-(+) GlukozaSigma-AldrichG7021
Ekstrakt drożdżowySigma-AldrichY1000
InsulinaSigma-AldrichI0516-5ML
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
BIS-TRISSigma-AldrichB4429
L-(−)-Kwas jabłkowySigma-AldrichM7397
D-(+)-trehaloza dwuwodnaSigma-AldrichT0167
Kwas bursztynowySigma-AldrichS9512
Kwas fumarowySigma-AldrichF8509
&alfa;-kwas ketoglutarowySigma-AldrichK1128
Nieinaktywowana termicznie, surowica cielęca płodu (FCS) Badania przesiewowe w kierunku Mykoplazmy i wirusówBioConcept Ltd. Amimed2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7,4E& K Scientific ProductsEK-654011
KClSigma-AldrichP5405
NaH2PO4Sigma-AldrichS5011
SacharozaSigma-AldrichS7903
Fibrynogen z osocza bydlęcegoCalbiochem (Merck)341573-1GMUWAGA: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Manipulować pod przepływem laminarnym
Trombina z osocza bydlęcegoSigma-AldrichT9549UWAGA: Zagrożenie dla zdrowia, używać rękawic
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OHChi Scientificna zamówienie
Smar próżniowySigma-Aldrich18405
35 mm Naczynie, nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 20 mm, niepowlekaneMatTekP35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Naczynia do hodowli tkankowychfisherscientific08-772A
Sterylny filtr butelkowy z gwintem 500 ml Steritop-GP 33 mm, 0,22 μ mMilliporeSCGPS05RE
Folia politetrafluoroetylenowa (PTFE)Dupont200A Teflonowa folia
Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45  &mikro; m, PVDF, 33  mm, sterylizowany promieniami gammaMilliporeSLHV033RS
Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0.22  &mikro; m, PVDF, 33  mm, sterylizowane promieniami gammaMilliporeSLGV033RS
Trzydołkowe szklane naczynie preparacyjneDowolna firma
Cienkie kleszcze, rozmiar 5, DumontFine Science Tools11254-20
Skaner tandemowy odwrócony mikroskop konfokalny TCS SP5, ze skanerem rezonansowym i detektorami fotopowielacza HyDLeica microsystem CMS GmbH
Komora kontroli temperaturyUsługi obrazowania życiaCUBE & System kontroli temperatury BOX, specjalnie zaprojektowany
Stage-top regulator wilgotnościImaging Serviceswykonane na zamówienie
Mikro dozownik zanurzenia w wodzie: dozownik, rozszerzona mikropompa serii MP6 i oprogramowanie Autoimmersion Objective ControllerLeica microsystem CMS GmbH
Tworzenie stosu SUM i wtyczka dryfu korekcji 3DOprogramowanie
ImageJ10x iteracyjna dekonwolucja,AutoQuant i Imaris
FEP Life oprogramowanie

Bibliografia

  1. Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella? Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
  2. Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
  3. Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , Elsevier. San Diego. 513-551 (2012).
  4. Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
  5. Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
  6. Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
  7. Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
  8. Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560(2017).
  9. Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
  10. Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
  11. Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
  12. Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
  13. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
  15. Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699(2014).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
  17. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  18. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
  19. Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
  20. Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
  21. Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
  22. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
  23. Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
  24. Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
  25. Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
  26. Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85(2006).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327(2015).
  30. Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
  31. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
  32. Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497(2015).
  33. Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
  34. Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
  35. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
  36. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

M zg larwy Drosophilamikroskopia poklatkowaneurony zegara oko odobowegozatapianie w matrycy fibrynowejgenetyczne reportery fluorescencyjneanaliza maksymalnej entropiimanipulacje farmakologicznehodowla m zgu ex vivo
Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.