Artykuł metodologiczny

Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

DOI:

10.3791/57016

⸱

29 stycznia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 2Department of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 3Cancer Research Summer Internship Program (CARSIP), Cancer Biology Program, University of Michigan Medical School, 4Department of Biology, University of Puerto Rico-Río Piedras Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanizmy epigenetyczne są często zmieniane w glejaku. Immunoprecypitacja chromatyny może być wykorzystana do badania konsekwencji zmian genetycznych w glejaku, które wynikają ze zmian w modyfikacjach histonów, które regulują strukturę chromatyny i transkrypcję genów. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na neurosferach mysiego guza mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje epigenetyczne mogą być zaangażowane w rozwój i progresję glejaka. Zmiany w metylacji i acetylacji promotorów i regionów regulatorowych onkogenów i supresorów nowotworów mogą prowadzić do zmian w ekspresji genów i odgrywać ważną rolę w patogenezie nowotworów mózgu. Immunoprecypitacja chromatyny natywnej (ChIP) jest popularną techniką, która umożliwia wykrywanie modyfikacji lub innych białek ściśle związanych z DNA. W przeciwieństwie do usieciowanego ChIP, w natywnym ChIP komórki nie są traktowane formaldehydem w celu kowalencyjnego połączenia białka z DNA. Jest to korzystne, ponieważ czasami sieciowanie może naprawić białka, które tylko przejściowo oddziałują z DNA i nie mają funkcjonalnego znaczenia w regulacji genów. Ponadto przeciwciała są na ogół podnoszone przeciwko nieustalonym peptydom. W związku z tym swoistość przeciwciał jest zwiększona w natywnym ChIP. Należy jednak pamiętać, że natywny ChIP ma zastosowanie tylko do badania histonów lub innych białek, które ściśle wiążą się z DNA. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na mysich neurosferach guza mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdarzenia epigenetyczne są częste w glejakach i prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w patogenezie guza. Rzeczywiście, w glejaku o wysokim stopniu złośliwości u dzieci mutacje w genach kodujących warianty histonów H3.3 i H3.1 występują często1. Mutacje wpływają na modyfikacje histonów i mają poważne konsekwencje epigenetyczne2,3. W spektrum od nastolatka do dorosłego występują nawracające mutacje w genie dehydrogenazy izocytrynianowej 1/2 (IDH1/2), mutacji hamującej zależne od α-KG histony i demetylazy DNA, oraz zmiany genetyczne w innych regulatorach chromatyny, takich jak ATRX i DAXX4. Dlatego niezwykle ważne jest zbadanie, w jaki sposób mutacje, które wpływają na regulatory epigenetyczne, zmieniają strukturę chromatyny i modyfikacje histonów regulatorowych, co z kolei ma dramatyczny wpływ na transkryptom komórek nowotworowych.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to potężne narzędzie używane do oceny wpływu modyfikacji epigenetycznych w genomie5,6,7. W natywnym ChIP chromatyna jest trawiona przez nukleazę mikrokokkową (MNazę), immunoprecypitowaną przy użyciu przeciwciała podniesionego przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania, a następnie DNA jest oczyszczane z immunoprecypitowanego kompleksu chromatyny6. Komórki nie są utrwalane podczas zabiegu, więc ta technika ma zastosowanie tylko do badania białek, które ściśle oddziałują z DNA6. Brak sieciowania wspomaga swoistość przeciwciał, ponieważ przeciwciała są zwykle wywoływane przeciwko nieustalonym peptydom lub białkom7. Ponadto, ponieważ nie ma etapu sieciowania, zmniejsza to szanse na naprawienie przejściowych interakcji białko-DNA, które są niespecyficzne i nie są regulacyjne7,8. ChIP może być używany do identyfikacji wzbogacania modyfikacji histonów w określonym regionie genomu. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wykonywania natywnego ChIP w neurosferach (NS) generowanych z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli glejaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Powstawanie guza mózgu NS i warunki hodowli.

  1. Przygotuj pożywkę dla neuronalnych komórek macierzystych (NSC) z suplementem Modified Eagle Medium/F12B27 firmy Dulbecco (1x), suplementem N2 (1x) i odczynnikiem przeciwdrobnoustrojowym. W dniu stosowania należy uzupełnić pożywkę NSC ludzkim rekombinowanym śródbłonkowym czynnikiem wzrostu (EGF) i zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF) w końcowym stężeniu 20 ng/ml każdy.
  2. Indukuj guz mózgu u myszy za pomocą systemu transpozonów Śpiąca Królewna, w którym plazmidy kodujące onkogeny lub shRNA ukierunkowane na supresory guza są wstrzykiwane do bocznych komór noworodków w celu wygenerowania spontanicznych guzów mózgu9. Wybierz mysz z dużym guzem, co potwierdza obrazowanie bioluminescencyjne.
    UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje na temat Systemu Transpozonów Śpiącej Królewny i zastosowanych konstruktów plazmidowych można znaleźć w Calinescu et al.9.
    1. Aby zobrazować myszy, wstrzyknij 100 μl roztworu lucyferyny 30 mg / ml dootrzewnowo za pomocą igły o rozmiarze 26.
    2. 5 minut po wstrzyknięciu lucyferyny znieczulić zwierzę za pomocą komory anestezjologicznej z przepływem tlenu/izofluranu ustawionym na 2% izofluranu.
    3. Po znieczuleniu zwierząt (zwykle 2-3 min) umieść je w komorze bioluminescencyjnej z izofluranem tlenu ustawionym na 2% izofluranu. Jeśli zwierzęta będą pod narkozą dłużej niż 5 minut, użyj maści okulistycznej, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    4. Zobrazuj myszy za pomocą systemu obrazowania optycznego in vivo o następujących parametrach: automatyczna ekspozycja, duże binning i przysłona f=1. Parametrem pozwalającym uznać go za duży nowotwór, jest bioluminescencja >106 fotonów/s/cm, 2/sr.
  3. Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania znieczulenia wziewnego izofluranu w zamkniętej komorze, sprawdź przez uszczypnięcie palca, czy zwierzę jest znieczulone i odetnij głowę myszy.
  4. Wyodrębnij mózg i przeprowadź jego sekcję zgodnie z wcześniejszym opisem w Calinescu i wsp.9.
  5. Umieść mózg na 10-centymetrowej szalce Petriego. Jeśli indukowany guz wykazuje ekspresję białka fluorescencyjnego, użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego ustawionego na odpowiedni kanał fluorescencyjny i powiększenie 0,3x, w przeciwnym razie zidentyfikuj masę guza na podstawie różnic w kolorze i teksturze tkanki. Użyj skalpela i kleszczy, aby oddzielić tkankę nowotworową od normalnego mózgu.
  6. Zmiel guz na małe kawałki na szalce Petriego. Umieść wypreparowany guz w probówce o pojemności 1,5 ml z 300 μl pożywki NSC.
  7. Użyj jednorazowego plastikowego tłuczka do granulek, który pasuje do ścianek stożkowej probówki do mikrowirówki, aby delikatnie homogenizować guz. Dodać 1 ml pożywki do oddzielania komórek i inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Użycie tłuczka może zabić niektóre komórki. Jeśli czytelnik chce zmaksymalizować żywotność komórki, można pominąć użycie tłuczka.
  8. Przepuścić zawiesinę komórek z kroku 1.7 przez sitko do komórek o wielkości 70 μm i przemyć sitko 25 ml pożywki NSC.
  9. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 6 ml pożywki NSC.
  10. Zawiesinę komórek nowotworowych z kroku 1.9 umieścić na płytce w kolbie hodowlanej T-25 i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2. Zwykle po 3 dniach pojawi się mieszanina niektórych martwych komórek, komórek przylegających i niektórych komórek tworzących NS, które unoszą się w pożywce.
  11. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zebrać tylko te komórki, które opadają na dno, za pomocą mikropipety i ponownie umieścić je w kolbie do hodowli tkankowej T-75.
  12. Utrzymuj komórki w stosunkowo dużej gęstości (1-3 X 10,6 komórek w T-25). Przejdź przez komórki, gdy się zlewają.
    UWAGA: Konfluencja zależy od wielkości sfer. Czarne środki dużych kul oznaczają, że w środku znajdują się martwe komórki i wskazują, że komórki powinny zostać natychmiast przepuszczone.
  13. Dodawaj czynniki wzrostu (EGF i zasadowe-FGF; po 20 ng/ml każdy) co trzy dni. Zmień pożywkę, gdy komórki nie zlewają się, a podłoże zmienia kolor na jasnopomarańczowy.
  14. Aby zmienić pożywkę, zebrać starą pożywkę i odwirować ją przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce NSC z dodatkiem EGF i FGF w stężeniu określonym w kroku 1.1.
    UWAGA: Jeśli kule znajdują się w średnim lub wysokim zbiegu, ale nie są gotowe do przejścia (rozmiar kuli jest mały < średnicy 100 μm), wówczas osad można podzielić na dwie kolby.
  15. W celu przejścia komórek należy odwirować komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zdekantować supernatant i inkubować komórki w pożywce oddzielającej komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    1. Dodać 5 ml zbilansowanego roztworu soli do rozcieńczenia pożywki oddzielającej i odwirować w sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 18 ml pożywki NSC i równo podzielić zawiesinę na trzy kolby T-25.
  16. Aby zamrozić porcje komórek, należy rozdzielić komórki jak w kroku 1.15 i zamrozić komórki w 1 ml porcji 90% płodowej surowicy bydlęcej z 10% dimetylosulfotlenkiem. Powoli schładzaj komórki, umieszczając je na lodzie na 10 minut, a następnie utrzymuj komórki w temperaturze -20 °C przez 30 minut i -80 °C przez 1 dzień. Następnego dnia przenieś komórki do pojemnika do przechowywania ciekłego azotu.

2. Natywny ChIP

  1. Przygotowanie chromatyny
    1. Po sporządzeniu zapasów pochodnych NS, hodować NS w T-75 w 15 ml pożywki NSC w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2 aż do zlewania się NS. Jedna zlewająca się płytka T-75 da 3-5 X 106 komórek.
    2. Gdy komórki zaczną się zlewać, odwirować NS przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i dodać 1 ml pożywki do dysocjacji komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 5 ml pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru10.
      UWAGA: 1 x 106 komórek jest potrzebnych na reakcję immunoprecypitacji (IP). Należy pamiętać, że należy również dołączyć surowicę przedimmunologiczną lub kontrolę IgG11.
    3. Odwirować NS w jednej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad NS z 1 ml zbilansowanego roztworu soli i przenieść zawiesinę do probówek mikrowirówek o niskiej wiązalności białka 1,5 ml.
    4. Odwirować NS przy 300 x g przez 5 min, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 95 μl buforu wytrawiającego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2, 0,2% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego) na 1 x 106 komórek uzupełnionych koktajlem inhibitorów proteazy w wysokim stężeniu (1:100). Natychmiast pipetuj komórki w górę iw dół, aby zapobiec zbrylaniu się i tworzeniu pęcherzyków.
    5. Ponownie zawiesić MNazę w 50% glicerolu, aby uzyskać roztwór 1 mg/ml (1,15 jednostki/μl, przechowywany w temperaturze -20 °C), który będzie określany jako "1x" zapas. Zrób zapas "0,1x", wykonując drugie rozcieńczenie 1:9 z 50% glicerolem (np. 900 μl "1x" MNazy i 100 μl 50% glicerolu) i przechowuj go w temperaturze -20 °C.
    6. Wymieszać 5 μl "0,1x" MNazy i 145 μl buforu wytrawiającego. Utrzymuj enzym na lodzie przez cały czas. Dodać 5 μl rozcieńczonej MNazy do buforu wytrawiającego na 1 x 106 komórek. Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę w bloku o temperaturze 37 °C dokładnie na 12 minut. Przetwarzaj próbki pojedynczo, aby zapewnić dokładny czas inkubacji wynoszący 12 minut.
    7. Dodaj 10 μL 10x buforu zatrzymującego MNazę (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM EDTA) na 1 x 106 komórek. Począwszy od tego momentu, próbki muszą być przechowywane na lodzie.
    8. Dodać 110 μl "2x bufor RIPA" (280 mM NaCl, 1,8% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 0,2% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,2% Na-deoksycholanu, 5 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA); przechowywany w temperaturze 4 °C) uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy w wysokim stężeniu (1:100) na 1 x 106 komórek. Przesuń rurkę, aby wymieszać.
    9. Odwirować probówki przez 15 minut w mikrofugach w temperaturze 4 °C i 1700 x g. Przenieść supernatant do nowych zwykłych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (probówki do mikrowirówek o niskiej zawartości wiązania białek nie są już potrzebne) i przechowywać je na lodzie. Wyrzuć granulkę.
  2. Immunoprecypitacja (IP)
    1. Wymieszaj kulki magnetyczne Białko A i Białko G w stosunku 1:1. Na każdy IP przygotuj 25 μl koralików.
    2. Przemyć kulki, dodając 1 ml buforu RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoksycholanu; przechowywanego w temperaturze 4 °C) uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000).
    3. Użyj magnesu, aby kulki oddzieliły się od roztworu myjącego i zdekantuj roztwór myjący (około 1 minuty). Wykonaj krok prania dwukrotnie.
    4. Ponownie zawiesić kulki do pierwotnej objętości za pomocą buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy (1:1000).
    5. W razie potrzeby rozcieńczyć chromatynę za pomocą buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy (1:1000) tak, aby każdy IP miał objętość 100-200 μL. Na wejście należy zarezerwować 10% objętości chromatyny zużytej na IP.
      UWAGA: Na przykład, jeśli stosuje się 200 μl na IP, 20 μl rozcieńczonej chromatyny powinno być zarezerwowane na wejście. W przypadku łącznie czterech IP całkowitą objętość chromatyny należy rozcieńczyć do 820 μl.
    6. Przygotuj dane wejściowe. Dodać 100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) uzupełnionego proteinazą K (0,5 mg/ml) do wejścia i inkubować wejście w temperaturze 55 °C przez 1 h.
      UWAGA: Kroki 2.2.6-2.2.7 można wykonać razem z krokami 2.3.4 i 2.4.1.
    7. Oczyścić wejście za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta i wymyć w 50 μl buforu elucyjnego dostarczonego w zestawie.
    8. Zmierz stężenie materiału wejściowego za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i zapisz wyniki w notatniku. Ślepa próba z buforem elucyjnym z zestawu.
      UWAGA: W neurosferach myszy użyliśmy około 6 μg DNA dla każdego IP.
    9. Uruchom dane wejściowe na 1% żelu lub załaduj 1 μl do bioanalizatora DNA przy użyciu standardowych ustawień. Pozostałą część należy przechowywać do wykorzystania jako dane wejściowe w dalszych aplikacjach.
    10. Dodać 10 μl przemytych kulek magnetycznych białkowych A i G na każdy IP i inkubować IP przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Na przykład dodaj 30 μl kulek magnetycznych z białka A i G na trzy IP.
    11. Umieść próbki na magnesie i poczekaj, aż koraliki się rozdzielą. Podziel chromatynę, przenosząc wcześniej ustaloną ilość do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    12. Dodaj przeciwciało i owiń nakrętki plastikową folią parafinową, aby uniknąć parowania. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min.
      UWAGA: Stężenie należy określić empirycznie zgodnie z zaleceniami producenta.
    13. Następnego dnia wiruj probówki za pomocą mini wirówki w temperaturze pokojowej, 2000 x g, przez 10 s. Następnie dodać 10 μl kulek do każdego IP i inkubować IP przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z obrotem z prędkością 20 obr./min.
  3. Mycie IP i trawienie białek
    1. Dodać 150 μl buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000) do każdego IP i inkubować IP w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i pozwolić kulkom magnetycznym rozdzielić się. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Powtórz to tep pięć prań.
    2. Dodać 150 μl buforu LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% Na-deoksycholanu; przechowywać w temperaturze 4 °C) uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000) do każdego IP i inkubować IP w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i odczekać, aż kulki magnetyczne się oddzielą. Za pomocą pipety usunąć supernatant.
    3. Dodać 150 μl zimnego TE (bez inhibitorów proteazy) i inkubować próbkę w temperaturze 4 °C z rotacją z prędkością 20 obr./min przez 5 min. Umieścić próbkę na stojaku magnetycznym i odczekać, aż kulki magnetyczne się rozdzielą. Użyć pipety, aby usunąć supernatant.
    4. Po ostatnim etapie przemywania ponownie zawiesić próbkę w 100 μl buforu TE uzupełnionego proteinazą K (0,5 mg/ml) i inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.
  4. Oczyszczanie DNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ChIP
    1. Oczyść immunologicznie wytrącone DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Po dodaniu buforu wiążącego DNA z zestawu do każdej próbki, umieść probówkę na magnesie i poczekaj, aż kulki magnetyczne się zagregują, a następnie przenieś supernatant do kolumny czyszczącej. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i wymyj 50 μl buforu elucyjnego znajdującego się w zestawie.
    2. Aby sprawdzić, czy adres IP się powiódł, wykonaj qPCR. Idealnie byłoby, gdyby startery były zaprojektowane dla regionów kontroli dodatniej i ujemnej.
      UWAGA: Na przykład w przypadku IP wykonanego z H3K4me3 i H3K27me3 następujące próbki należy przeprowadzić na qPCR: H3K4me3, H3K27me3 i IgG ChIP DNA, wejściowe DNA i kontrolę bez matrycy (NTC) przy użyciu starterów dla regionów, które mają być wzbogacone H3K4me3 (kontrola pozytywna) i regionów, które mają być wzbogacone H3K4me3 (kontrola ujemna); podobnie jest w przypadku H3K27me3.
    3. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami, aby wykonać qPCR12. Krótko mówiąc, wykonaj qPCR przy użyciu zielonej mieszanki wzorcowej SYBR, 0,5 μl 10 μM stężenia roboczego każdego startera do przodu i do tyłu oraz 2 μl ChIP lub wejściowego DNA. Odczyt płytek za pomocą systemu Real Time PCR. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 2. Sekwencje starterów Gapdh od Hwanga i wsp. były używane13.
    4. Analizuj dane ChIP względem danych wejściowych, tj. metody procentowego wprowadzania (% IP)14. Oblicz procentowy wkład, korzystając z następujących wzorów:
      Skorygowane wejście = średnia ct(wejście)-log2(DF)
      gdzie DF jest współczynnikiem rozcieńczenia początkowego wkładu i
      DF = całkowita głośność adresu IP/ głośność wejścia
      % IP = 100×2^(Skorygowane wejście - Ct (IP))
      gdzie Ct jest współczynnikiem progowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie guza NS wygenerowanego z guza mózgu, gdzie komórki guza mózgu są Katushka dodatnie, jest przedstawione w Rysunek 1. Rysunek 2 jest schematycznym przedstawieniem całej techniki ChIP. Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wyniki chromatyny z guza mózgu NS trawionego MNazą przez 12 minut, dając większość mono, di- i trinukleosomów. Po ChIP można przeprowadzić qPCR na ChIP i wejś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół umożliwi użytkownikowi wykonanie natywnego ChIP na NS pochodzącym z genetycznie modyfikowanych guzów mózgu. W przeciwieństwie do sieciowania ChIP, protokół ten jest ograniczony do badania białek, które ściśle wiążą się z DNA6. Liczba używanych komórek może być modyfikowana w razie potrzeby, a protokół może być skalowany w górę. Użyliśmy 1 X 106 komórek na adres IP, jednak natywny ChIP może być również wykonywany z zaledwie 4 x 104 komórkami

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders & Stroke (NIH/NINDS) Granty R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 dla M.G.C.; NIH/NINDS przyznaje R01-NS076991, R01-NS082311 i R01-NS096756 dla P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; Klinika Neurochirurgii; Leah's Happy Hearts i Chad Though Foundation to M.G.C. and P.R.L. R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 dla M.G.C. F.M.M. jest wspierany przez F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. jest wspierany przez grant NIH/NIGMS 5T34GM007821-37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bioanalizator Agilent 2100 BioanalizatorAgilentG2946-90004
AccuSpin Micro 17R, chłodzonyFisher Scientific13-100-676
C57BL/6TaconicB6-fC57BL/6 mysz
Chlorek wapniaAldrich22350-6odczynnik buforowy
D-Lucyferyna, Sól Potasowa GoldbioLuckK-1g
Stojak magnetyczny DiaMag1.5DiagenodeB04000003do mycia kulek magnetycznych
DiaMag Rotator EUDiagenodeB05000001rotator
DMEM/F-12Gibco11330-057Komponent NSC
Dynabeads Białko AThermo Fisher Scientific10001Dbiałko A kulki magnetyczne
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10003Dbiałko G Koraliki magnetyczne
EGFPeproTechAF-100-15przygotuj 20 μ g/ml zapas w 0,1% BSA i podwielokrotności.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)SigmaE-4884odczynnik buforowy
glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy)-N,N,N',N'--kwas tetraoctowy) (EGTA)SigmaE-4378odczynnik buforowy
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385612odczynnik qPCR
Płodowa surowica bydlęcaGibco10437028do zamrażania komórek
FGFPeproTech100-18bPrzygotuj 20 μ g/ml zapas w 0,1% BSA i podwielokrotności.
KleszczeFine Science Tools11008-13do rozwarstwiania guza
Glicerol, MB GradeEMD- Milipore356352
H3K4me3AbcamAb8580
H3K27me3Millipore07-449
HBSSGibco14175-103zrównoważony roztwór soli
FlurisoVETone501017znieczulenie wziewne
Ivis SpectrumPerkin-Elmer124262system obrazowania optycznego in vivo
HyqtaseHyClonSV3003001oddzielenia komórek
Odczynnik buforowychlorku lituSigmaL8895
Mikroprobówki o niskim poziomie wiązaniaCorning CostarCLS3207rurka do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania białek
Probówka do mikrowirówekFisher21-402-903zwykła probówka do mikrowirówek
Nukleaza mikrokokkowaThermo Fisher Scientific, Affymetrix70196YKażda partia może się różnić; Kup wystarczającą ilość do eksperymentów i podwielokrotności.
N2Gibco17502-048Składnik NSC
Normal Rabbit IgGMillipore12-372
NormocinInvivogenNOL-36-063środek przeciwdrobnoustrojowy, stosować w dawce 0,1 mg/ml.
NP-40 (Igepal CA-630)Sigma18896-50MLodczynnik buforowy
Kimble Kontes Pellet PestleFisher ScientificK749515-0000
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP8340podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & stopni C.
Protinase KSigma-AldrichP2308przygotować zapas 10 mg/ml w wodzie; podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Zestawoczyszczania DNAQiagen28104
SkalpelFine Science Tools10007-16do rozwarstwienia guza
Odczynnik buforowychlorku soduVWR0241-5KG
Deoksycholan soduSigma-AldrichD670-25G
Siarczan sodu Dodecyl (SDS)SigmaL-4390odczynnik buforowy
Tris BaseThermo Fisher ScientificBp152-1odczynnik buforowy
Triton X-100Thermo Fisher ScientificBP 151-500eter oktylofenylowy glikolu polietylenowego
Standardowa mini wirówkaFisherbrand12-006-901standardowa mini wirówka
mikroskop SZX16fluorescencyjnyOlympusSZX16
System ViiA 7 do PCR w czasie rzeczywistym z szybkimi 96-dołkowymi biosystemamiblokowymi4453535
Nanodrop OneThermo-Fisher ScientificND-ONEC-W
do Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
  2. Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
  3. Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
  4. Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy? Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
  5. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  6. Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
  7. Turner, B. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  8. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  9. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
  10. Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  11. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  12. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
  13. Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439(2014).
  14. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wzbogacanie znacznik w histonowychtrawienie nukleaz mikrokokkalnfragmentacja chromatynymagnetyczne kulki z bia kiem A Gprzemycia buforem RIPAelucja buforem TEwalidacja qPCRmodyfikacje histon w

Powiązane artykuły