Artykuł metodologiczny

Półilościowe wykrywanie zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA ludzkiego białka odwrotnej transkryptazy telomerazy

DOI:

10.3791/57021

⸱

12 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) syntetyzuje nie tylko telomeryczne DNA, ale także dwuniciowe RNA poprzez aktywność polimerazy RNA zależnej od RNA. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany test do wykrywania zależnej od RNA aktywności polimerazy RNA endogennego TERT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odwrotna transkryptaza ludzkiej telomerazy (TERT) jest podjednostką katalityczną telomerazy i wydłuża telomery poprzez aktywność polimerazy DNA zależną od RNA. Chociaż TERT jest nazywana odwrotną transkryptazą, analizy strukturalne i filogenetyczne TERT pokazują, że TERT należy do prawoskrętnych polimeraz i odnosi się do wirusowych polimeraz RNA zależnych od RNA (RdRP), a także wirusowej odwrotnej transkryptazy. Po pierwsze, zidentyfikowaliśmy aktywność RdRP ludzkiego TERT, która generuje komplementarne RNA do matrycowego niekodującego RNA i przyczynia się do wyciszania RNA w komórkach nowotworowych. Aby przeanalizować tę niekanoniczną aktywność enzymatyczną, opracowaliśmy test RdRP z rekombinowanym TERT w 2009 roku, a następnie ustaliliśmy test RdRP in vitro dla endogennego TERT. W niniejszym manuskrypcie opisujemy tę drugą metodę. Krótko mówiąc, kompleksy immunologiczne TERT są izolowane z komórek i inkubowane z matrycowymi RNA i rNTP, w tym radioaktywnym rNTP dla reakcji RdRP. Aby wyeliminować jednoniciowe RNA, produkty reakcji są traktowane RNazą I, a produkty końcowe są analizowane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Produkty znakowane radioaktywnie RdRP można wykryć za pomocą autoradiografii po nocnej ekspozycji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy (TERT) jest dobrze znana jako katalityczna podjednostka telomerazy i wydłuża telomery za pomocą składnika telomerazy RNA (TERC), specyficznego szablonu RNA1. Chociaż TERT polimeryzuje telomerowe DNA jako składnik telomerazy, analizy strukturalne i filogenetyczne wskazują, że TERT jest ściśle związany z wirusowymi polimerazami RNA zależnymi od RNA (RdRP), a także wirusową odwrotną transkryptazą i dzieli domeny z tymi polimerazami2,3,4. RdRP jest enzymem, który generuje komplementarną nić RNA do matrycy RNA. Enzym jest kodowany nie tylko w wirusach, ale także w organizmach modelowych, takich jak rośliny, drożdże i robaki, a synteza dwuniciowego RNA przez RdRP przyczynia się do transkrypcyjnego i potranskrypcyjnego wyciszenia genów w tych organizmach5,6. Chociaż od dłuższego czasu brakowało ludzkiego RdRP, znaleźliśmy aktywność RdRP w ludzkim TERT w 20097.

Najpierw potwierdziliśmy aktywność RdRP TERT za pomocą rekombinowanego białka7, a następnie ustaliliśmy czuły test in vitro do wykrywania aktywności RdRP endogennego TERT8. Tutaj pokazujemy test RdRP in vitro (test IP-RdRP) dla endogennego TERT. Metoda ta rozpoczyna się od immunoprecypitacji (IP) endogennego TERT, a następnie następuje reakcja RdRP in vitro, w której radioaktywne rybonukleotydy są włączane do powstających nici RNA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja odczynnika

  1. Odczynniki używane do synchronizacji komórek
    1. Aby wytworzyć zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającą 2,5 mM tymidyny, rozpuść 30,28 mg tymidyny na 1 ml wody klasy hodowli tkankowej, aby przygotować 125 mM tymidyny. Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawkowego modułu filtrującego 0,22 μm. Dodać 1 ml świeżo przygotowanej 125 mM tymidyny na 50 ml DMEM uzupełnionego 10% (obj. / obj.) płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. Aby wytworzyć DMEM zawierający 0,1 μg/ml nokodazolu, należy rozpuścić nokodazol w dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu przygotowania 5 μg/μl nokodazolu. Dodać 1 μl 5 μg/μl nokodazolu na 50 ml DMEM uzupełnionego 10% (vol/vol) FBS.
    3. Aby wytworzyć DMEM zawierający 0.002% (vol/vol) DMSO, dodaj 1 μL DMSO na 50 mL DMEM uzupełnionego 10% (vol/vol) FBS.
  2. Odczynniki stosowane do oznaczania IP-RdRP
    1. Przygotować bufor do lizy A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 5x bufor octanowy: 50 mM kwasu 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowego (HEPES)-KOH (pH 7,8), 500 mM octanu potasu i 20 mM MgCl2. Przechowywać odczynnik w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj bufor do płukania 1: 1x bufor octanowy, 10% (obj. / obj.) glicerol, 0,1% (obj. / obj.) Triton X-100 i 0,06x koktajl inhibitorów proteazy, wolny od kwasu etylenodiamerytooctowego (EDTA). Przygotuj bufor do płukania 1 w dniu użycia lub dzień przed użyciem. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować roztwór AGC: 1x bufor octanowy, 10% (obj./obj.) glicerol i 0,02% (wag./obj.) 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian (CHAPS). Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.
    5. Aby wytworzyć roztwór AGC zawierający 2 mM CaCl2, dodaj 100 μl 1 M CaCl2 na 50 ml roztworu AGC. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.
    6. Aby wytworzyć roztwór AGC zawierający 3 mM glikolu etylenowego bis (eteru b-aminoetylowego)-N,N,N',N'-kwasu tetraoctowego (EGTA), należy dodać 375 μl 0,4 M EGTA (pH 7,5) na 50 ml roztworu AGC. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotuj bufor do płukania 2: 1x bufor octanowy i 0,02% (wag./obj.) CHAPS. Przechowywać odczynnik w temperaturze 4 °C.
    8. Przygotować roztwór HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 i 2 mM ditiotreitol (DTT). Przechowywać odczynnik w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Roztwór gogli należy odnowić co najmniej za trzy miesiące.
    9. Przygotuj 2x bufor proteinazy K: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA i 1% (wag./obj.) dodecylosiarczanu sodu (SDS). Przechowywać odczynnik w temperaturze -20 °C.
    10. Przygotować 2x bufor ładujący: 95% (vol/vol) formamid, 20 mM EDTA i 1% (wt/vol) Orange G. Przechowywać odczynnik w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie komórek HeLa

UWAGA: Przygotuj komórki HeLa zsynchronizowane w fazie mitotycznej (manipulowane) lub dzielące się asynchronicznie (niemanipulowane). Hodować komórki w obecności 5% CO2 w temperaturze 37 °C.

  1. Synchronizacja komórek HeLa w mitozie
    1. Płytka 1 x 106 komórek HeLa z 10 ml DMEM uzupełnionymi 10% (vol/vol) FBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
    2. Dwa dni po posiewie zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 2,5 mM tymidyny i 10% (obj./obj.) FBS. Hodować komórki przez 24 godziny.
    3. Przemyć komórki trzykrotnie 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (-) i wyhodować komórki 10 ml DMEM zawierającego 10% (obj. / obj.) FBS przez 6 godzin.
    4. Zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 0,1 μg/ml nokodazolu i 10% (obj./obj.) FBS i hoduj komórki przez 14 godzin.
    5. Delikatnie wstrząśnij szalką hodowlaną i odzyskaj supernatant zawierający oderwane komórki mitotyczne. Policz liczbę komórek do testu IP-RdRP.
    6. Odwirować próbkę o masie 490 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
      UWAGA: Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotowanie niezmodyfikowanych komórek HeLa
    1. Płytka 1 x 106 komórek HeLa z 10 ml DMEM uzupełnionymi 10% (vol/vol) FBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
    2. Dwa dni po posiewie zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 10% (vol/vol) FBS. Hodować komórki przez 30 godzin.
    3. Zastąp pożywkę 10 ml DMEM zawierającym 0,002% (vol/vol) DMSO i 10% (vol/vol) FBS i hoduj komórki przez 14 godzin.
    4. Zebrać komórki przez trypsynizację przy użyciu 0,7 ml trypsyny (2,5 g/l) zawierającej 1 mM EDTA. Policz liczbę komórek do testu IP-RdRP.
    5. Odwirować próbkę o masie 490 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
      UWAGA: Osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Test IP-RdRP

  1. Preparat z białka A-agarozy
    1. Przenieść 1 ml (objętość złoża 500 μl) żywicy powinowactwa do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    2. Dodaj 800 μl buforu do lizy A do kulek i dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Wirować przy 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy (łącznie trzy prania).
    3. Dodać 800 μl buforu do lizy A do kulek, dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Obracać probówkę przez noc (lub przez co najmniej 4 godziny) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej.
    4. Odwirować probówkę o sile 800 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    5. Dodaj 500 μl buforu do lizy A do kulek i dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Przechowywać koraliki w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie lizatu komórkowego
    1. (Opcjonalnie) Jeśli komórki zostaną zamrożone w kroku 2, umieść i rozmroź zamrożone komórki na lodzie, aż staną się luźne.
    2. Umyj komórki raz 10 ml PBS (-). Odwirować próbkę o sile 1,450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany nad osadem.
    3. Lizować komórki lodowatym buforem do lizy A (1 ml buforu A do lizy na 1 x 107 komórek) przez delikatne pipetowanie.
    4. Sonikować próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml w następujących warunkach; ustawić amplifikację sonikatora na 25% i sonikować przez 10 s.
    5. Odwirować próbkę o masie 20 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Zebrać supernatant. Przenieść po 1 ml każdego supernatantu do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach wolnych od RNaz.
  3. Immunoprecypitacja
    1. Wstępnie oczyścić lizat z etapu 3.2.6, dodając 40 μl (objętość kulki 20 μl) wstępnie umytych kulek białkowych A-agarozy na 1 ml lizatu. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę i obracać próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odwirować próbkę o masie 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odzyskać supernatant.
    3. Do wstępnie oczyszczonego lizatu dodać 40 μl (objętość złoża 20 μl) wstępnie umytych kulek białkowych A-agarozy i 10 μg przeciwciała anty-ludzkiego TERT (klon: 10E9-2)8. Dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę i obracać próbkę w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Odwirować próbkę o sile 3 300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    5. Przemyć kulki buforem do przemywania 1: dodać 1 ml buforu do płukania 1 do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę o masie 3 300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy.
    6. Przemyć kulki raz roztworem AGC zawierającym 2 mM CaCl2: dodać 1 ml roztworu AGC zawierającego 2 mM CaCl2 do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę przy 3,300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C, i usunąć supernatant.
    7. Potraktuj kulki nukleazą mikrokokową (MNazą): przygotuj mieszaninę reakcyjną MNazy opisaną w Tabeli 1. Zawiesić kulki w 60 μl mieszaniny reakcyjnej MNazy przez delikatne pipetowanie. Delikatnie wstrząsnąć próbką (20 do 25 obr./min) na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze typu Peltiera przez 15 minut w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać falistego wytrząsarki i ściśle przestrzegać ograniczenia prędkości na tym etapie. Inne rodzaje wytrząsarek, takie jak miksery obrotowe, nie są zalecane.
    8. Odwirować próbkę o sile 3 300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    9. Przemyć kulki dwukrotnie roztworem AGC zawierającym 3 mM EGTA: dodać 1 ml roztworu AGC zawierającego 3 mM EGTA do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę w temperaturze 3,300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok raz.
    10. Przepłukać kulki raz buforem do płukania 2: dodać 1 ml buforu płuczącego 2 do kulek, dobrze wymieszać przez odwrócenie probówki i obracać próbkę przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować próbkę o sile 3,300 x g przez 0,5 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Trzymaj koraliki na lodzie podczas ustawiania reakcji RdRP.
      UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach wolnych od RNaz.
  4. Reakcja RdRP
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną RdRP w nowej probówce, jak opisano w Tabeli 2.
    2. Dodać 6 μl [α-32P]UTP (3 000 Ci/mmol) do mieszaniny i dobrze wymieszać pipetując.
      UWAGA: [α-32P]ATP, [α-32P]CTP lub [α-32P]GTP mogą być użyte do reakcji zamiast [α-32P]UTP.
    3. Dodać 1 μl matrycy RNA (1 μg/μl) do mieszaniny i dobrze wymieszać pipetując.
      UWAGA: Aby ustalić test RdRP, zalecana jest następująca matryca RNA: 5'-GGGAUCAUGUGUGUCCUAUAUAUACAUUUAAACCCA-3' 9.
    4. Zawiesić kulki z 20 μl mieszaniny reakcyjnej RdRP z kroku 3.4.3 przez pipetowanie.
    5. Delikatnie wstrząsnąć próbką (20-25 obr./min) na stole obrotowym wytrząsarki umieszczonej w inkubatorze z ogniwem Peltiera przez 2 godziny w temperaturze 32 °C.
    6. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 5,4 μl proteinazy K (20 mg/ml) i 45,4 μl buforu 2x proteinazy K. Wymieszać przez pipetowanie i wstrząsnąć (20-25 obr./min) próbką na stole obrotowym umieszczonym w inkubatorze typu Peltiera przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    7. Do próbki dodać 109,2 μl wody wolnej od RNaz.
    8. Do próbki dodać 200 μl kwaśnego chloroformu fenolowego. Dobrze wymieszać za pomocą wiru, a następnie odwirować próbkę o masie 21 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Powtórz ten krok raz.
    9. Do fazy wodnej dodać 20 μl 3 M octanu sodu (pH = 5,2), 4 μl nośnika strącającego i 250 μl etanolu. Dobrze wstrząsnąć probówką w celu wymieszania, a następnie odwirować próbkę o stężeniu 21,100 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    10. Przepłukać osad 300 μl zimnego etanolu o stężeniu 70% (obj./obj.) przechowywanego w temperaturze -20 °C. Odwirować próbkę przy 21 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Wyrzucić supernatant i wysuszyć pelety na powietrzu.
      UWAGA: Wszystkie procedury należy wykonywać w warunkach wolnych od RNaz.
      UWAGA: Granulat z kroku 3.4.11 można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 dni.
  5. Leczenie RNazy
    1. Zawiesić osad z kroku 3.4.11 w 20 μl wody wolnej od RNaz.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną RNazy w nowej probówce, jak opisano w Tabeli 3.
    3. Dodać 180 μl mieszaniny reakcyjnej RNazy do próbki i inkubować probówkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    4. Dodać 2,3 μl 10% (obj./obj.) SDS do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Dodać 2 μl proteinazy K (20 mg/ml) do próbki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Do próbki dodać 205 μl kwaśnego chloroformu fenolowego. Dobrze wymieszać przez wirowanie, a następnie odwirować próbkę o masie 21 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fazę wodną do nowej probówki.
    7. Do fazy wodnej dodać 20 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2), 4 μl nośnika strącającego i 250 μl etanolu. Dobrze wstrząsnąć probówką w celu wymieszania, a następnie odwirować próbkę o stężeniu 21,100 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    8. Przepłukać osad 300 μl zimnego etanolu o stężeniu 70% (obj./obj.) przechowywanego w temperaturze -20 °C. Odwirować próbkę przy 21 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Wyrzucić supernatant i wysuszyć pelety na powietrzu.
      UWAGA: Osad z kroku 3.5.9 można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 dni.
  6. Elektroforeza żelowa i autoradiografia
    1. Zawiesić próbkę w 20 μl wody wolnej od RNaz.
    2. Dodać 20 μL buforu załadowczego 2x.
    3. Gotować próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Próbkę rozdrobnić na lodzie.
    4. Uruchom żel. W przypadku, gdy rozmiar szablonu wynosi 34 nts (patrz również krok 3.4.3), do elektroforezy żelu żelowego denaturującego stosuje się 7 M żelu poliakryloamidowego z mocznikiem.
    5. Wysuszyć żel suszarką do żelu.
    6. Naświetlić film wysuszonym żelem w kasecie rentgenowskiej z ekranem intensyfikującym w temperaturze -80 °C.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy zalecanym szablonie RNA, radioaktywne produkty RdRP obserwuje się od 20 do 30 nukleotydów (nt) szczególnie w komórkach HeLa w fazie mitotycznej po nocnej ekspozycji (Rysunek 1A). Zazwyczaj intensywność sygnału produktów RdRP wykazuje dwa piki, które są zlokalizowane wokół 25 nt i 30 nt w zgodzie z rozkładem wielkości produktów potwierdzonym przez sekwencjonowanie nowej generacji9. W przeciwieństwie do komórek mitotycznych, komórki HeLa bez synchronizacji wykazują prawie brak 20-30 nt produktów radioaktywnych. Sygnały owalne, które znajdują się poniżej 20 nt we wszystkich próbkach, są dryftami niespecyficznymi.

W przypadku, gdy w mitotycznych komórkach HeLa znajduje się tylko produkt ~30 nt o słabym sygnale, oznacza to, że reakcja RdRP nie przebiegła dobrze. Na przykład, jeśli leczenie MNazą jest wykonywane z grubsza i niewłaściwie, intensywność sygnału w mitotycznych komórkach HeLa znacznie się zmniejsza (Figura 1B). Reakcja RdRP przeprowadzona przy użyciu starego roztworu HMD również redukuje produkty (Rysunek 1C).

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne produkty RdRP endogennego TERT w mitotycznych komórkach HeLa. (A) Trzy reprezentatywne wyniki testu IP-RdRP w komórkach HeLa traktowanych nokodazolem (manipulowane) lub DMSO (niemanipulowane). Jako matrycę użyto chemicznie zsyntetyzowanego 34 nt RNA. (B) Test IP-RdRP w mitotycznych komórkach HeLa wykonany z niewłaściwym traktowaniem MNazy. (C) Test IP-RdRP w mitotycznych komórkach HeLa przeprowadzony ze świeżym lub starym roztworem HMD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynnikigłośność
Nukleaza mikrokokowa, 20 U/μL1 μL
Bufor nukleazy mikrokokowej, 10x8 μL
Woda wolna od RNaz51 μL

Tabela 1: Składnik mieszanki reakcji MNazy.

Odczynnikigłośność
ROZDĘCIA, 0,07% (wag./obj.) 6 μL
Rozwiązanie HMD2 μl
rATP, 80 mM0,5 μL
rGTP, 8 mM1 μL
rUTP, 0,4 mM1 μL
rCTP, 8 mM1 μL
Inhibitor RNazy, 40 U/μL0,5 μL
Woda wolna od RNaz1 μL

Tabela 2: Składnik mieszanki reakcji RdRP.

Odczynnikigłośność
RNaza JEDNA Rybonukleaza, 10 U/μL0,2 μl
Bufor reakcyjny, 10x20 μL
Woda wolna od RNaz159,8 μl

Tabela 3: Składnik mieszanki reakcji rybonukleazy.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test IP-RdRP jest czułą metodą wykrywania aktywności RdRP ludzkiego TERT. Białko TERT ulega silnej ekspresji w mitotycznych komórkach HeLa, w których TERT tworzy kompleks RdRP 8,9,10. Sugeruje to, że mitotyczne komórki HeLa są optymalnym materiałem do wykrywania aktywności RdRP. W opisanym powyżej protokole mitotyczne i niezsynchronizowane komórki HeLa są uwzględnione odpowiednio jako pozytywny i negatywny przykład. Jak pokazano na rysunku 1A, produkty testowe RdRP z zalecanej matrycy RNA w mitotycznych komórkach HeLa wykazują szerokie sygnały radioaktywne od 20 do 30 nt. Oprócz komórek HeLa przeprowadziliśmy test z różnymi typami linii komórkowych i stwierdziliśmy, że wzór sygnału można zmienić w różnych typach komórek9: niektóre wykazują silny sygnał tylko około 30 nt, niektóre wykazują podobny wzór z komórkami HeLa. Przeprowadziliśmy również test z matrycami RNA innymi niż matryca 34 nt8, krótkimi i długimi (~300 nt) RNA o różnych sekwencjach i z powodzeniem uzyskaliśmy produkty RdRP z tych matryc, chociaż mogą istnieć pewne preferencje. W pierwszym badaniu zalecamy jednak użycie komórek HeLa w fazie mitotycznej i matrycy RNA 34 nt. RdRP mogą generować dwuniciowy RNA zarówno w sposób zależny od startera, jak i niezależny od startera11. Informowaliśmy, że TERT zachowuje tę właściwość jako ludzki RdRP 7,9; TERT syntetyzuje dsRNA z matrycy RNA o strukturze 3'-krotnej poprzez mechanizm wstecznegogruntowania 7. W przypadku matrycy RNA 34 nt TERT syntetyzuje nici komplementarne bez użycia starterów9. Aby specyficznie wykryć produkty RdRP syntetyzowane w sposób niezależny od starterów, tj. produkty RNA syntetyzowane de novo, [α-32 P]NTP można zastąpić [γ-32P]NTP w reakcji RdRP9.

Leczenie MNazy kompleksów immunologicznych TERT na kulkach jest krytycznym krokiem do osiągnięcia pożądanych rezultatów. Jeśli leczenie MNazą jest wykonywane zbyt długo lub z intensywnym wstrząsaniem, produkty RdRP zostaną znacznie zmniejszone. Aby uniknąć takich problemów, zdecydowanie zalecamy ścisłe przestrzeganie protokołu. Rozwiązanie HMD to kolejny kluczowy czynnik sukcesu. Jeśli stwierdzisz, że sygnały są bardzo słabe, wymień roztwór HMD na nowo przygotowany.

W całym protokole należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą. Zabieg rybonukleazy powinien być wykonywany przy użyciu dedykowanego sprzętu. Po manipulacji rybonukleazą należy natychmiast wyrzucić końcówki i rurki z RNazą, wyeliminować RNazę specjalistycznym roztworem (np. RNase Quiet) i zmienić gajki.

TERT oddziałuje nie tylko z Terc , ale także z wieloma rodzajami endogennych RNA, a my opisaliśmy część z nich7. Modyfikacja w teście IP-RdRP, taka jak test IP-RdRP bez leczenia MNazą, zapewni pełną listę endogennych matryc RNA dla aktywności RdRP związanej z TERT oraz przewodnik bioinformatyczny dotyczący ich cech sekwencji. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół do lizatu tkankowego. Ponieważ TERT ulega ekspresji w różnych tkankach normalnych i nowotworowych, test ten może być przydatny do zbadania niekanonicznej funkcji enzymatycznej TERT u człowieka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Projekt Rozwoju Innowacyjnych Badań nad Rakiem (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) oraz Projekt Badań nad Rakiem i Ewolucją Terapeutyczną (P-CREATE) (16cm01061150001, K.M.) z Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego, AMED; Fundację Naukową Takeda (Y.M.); Stypendium Funduszu Badań nad Rakiem im. Księżniczki Takamatsu (13-24520, Y.M.); oraz JSPS KAKENHI Grant Number JP16K07133 (Y.M.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Wako044-29765
Płodowa surowica bydlęca (FBS)CORNING35-010-CV
Mieszanina penicyliny i streptomycynyroztwór nacalai tesque26253-84
Roztwór kwasu trypsyna-etylenodiamentetraoctowego (EDTA)nacalai tesque32777-44
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS(-))Wako166-23555
Tymidynanacalai tesque07147-61
NokodazoleSigmaM1404
Dimetylosulfotlenek (DMSO)nacalai tesque08904-85
Chlorek sodunacalai tesque31333-45
Tris(hydroksymetylo)aminometannacalai tesque35434-21
Kwassolnynacalai tesque18321-05
Nonidet P-40 (NP-40)nacalai tesque25223-04
Pierce Protein A Plus AgaroseThermo scientific22812
Kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo]etanosulfonowy (HEPES)nacalai tesque17514-15
Wodorotlenek potasuWako168-21815
Potas octannacalai tesque28405-05
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2• 6H2O)Wako135-00165
Glicerolnacalai tesque17045-65
Eter oktylofenylowy polioksyetylenowy(10) (Triton X-100)Wako169-21105
cKompletny, wolny od EDTARoche Applied Science11 873 580 001
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2• 2H2O)nacalai tesque06731-05
Nukleaza mikrokokkowa (MNaza)Takara Bio2910A
Glikol etylenowy bis (eter b-aminoetylowy)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas (EGTA)nacalai tesque15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimetyloamonio]-1-propanosulfonian (CHAPS)nacalai tesque07957-64
Ditiothreitol (DTT)nacalai tesque14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM każdyPromegaE6000
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol)PerkinElmerNEG507HUżyj świeżego RI do testu
Inhibitor RNazyTOYOBOSIN-201
Proteinaza KTakara9033
Kwas-fenol:Chloroform, pH 4,5 ( z IAA, 125:24:1)Life TechnologiesAM9720
3 M Octan soduNIPPON GENE316-90081
Etanol (99.5)nacalai tesque14713-95
Dr. GenTLE Precipitation CarrierTakara Bio9094
RNase One RybonukleazaPromegaM4265
Dodecyl siarczan sodu (SDS)nacalai tesque02873-75
Formamid, dejonizowanynacalai tesque16345-65
Kwas etylenodiaminotetraoctowy Sól disodowa dwuwodna (EDTA)nacalai tesque15130-95
Pomarańczowy GNacalai tesque25401-22
Inkubator CO2, np. ASTECSCA-325DRS
Wirówka, np. TOMYEX-135Dla kroku B)
Wirówka z mikrochłodzeniem, np. KUBOTA3740Dla kroku 6.2
SonikatorQsonicaQ125Ustaw mikrokońcówkę (#4422) na sonikatorze, dla kroku 6.4
Wirówka z mikrochłodzeniem, np. TOMYMX-305Dla kroku 6.5
Inkubator z chłodzeniem, np. PanasonicMIR-154-PJUstaw wytrząsarkę obrotową w środku
Wytrząsarka obrotowa, np.RT-5
 np. TAITECBR-43FLZestaw wytrząsarki " MINI FALA" wewnątrz, dla kroku 7.7
MINI WAVEAS ONEWEV-03Wytrząsarka do stopni 7.7, 8.5 i 8.6
Inkubatornp. TAITECHB-80Ustaw wytrząsarkę " MINI FALA" wewnątrz, dla kroku 8.5 i 8.6
Inkubator blokowy, np. ASTECBI-516S
inkubator z chłodzeniem TAITEC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).
  5. Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA dependent RNA Polymerase ActivityHuman Telomerase Reverse TranscriptaseRdRP AssayTERT Immune Complex IsolationPolyacrylamide Gel ElectrophoresisAutoradiography DetectionRNase I TreatmentRadioactive rNTP IncubationProtein A agarose BeadsAnti human TERT Antibody

Powiązane artykuły